DE602004004988T2

DE602004004988T2 - Methylierungsstatus-Detektionsassays mittels methylierungsspezifischer Primerextension (MSPE)

Info

Publication number: DE602004004988T2
Application number: DE602004004988T
Authority: DE
Inventors: Zheng Li; Jeanne Harvey
Original assignee: Bayer Healthcare LLC
Current assignee: Siemens Healthcare Diagnostics Inc
Priority date: 2003-12-16
Filing date: 2004-12-16
Publication date: 2008-01-10
Anticipated expiration: 2024-12-17
Also published as: EP1544309A1; ES2281743T3; JP2005204652A; US20080213789A1; EP1544309B1; US20050214812A1; ATE355390T1; DE602004004988D1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft im Allgemeinen Verfahren zur Bestimmung des Zustandes der DNA-Methylierung von CpG-Bereichen in Genen. Darüber hinaus betrifft die vorliegende Erfindung Verfahren zur Diagnose einer Störung oder einer Krankheit durch Bestimmung des Zustandes der DNA-Methylierung von Nukleinsäuren in einem Probanden.
Hintergrund der Erfindung
In Säugetieren tritt die DNA-Methylierung üblicherweise bei Cytosinen auf, die in 5'-Richtung von Guaninen gelegen sind und als CpG-Dinukleotide bekannt sind. DNA-Cytosin-5-Methyltransferase (DNA-Mtase) katalysiert diese Reaktion, indem sie eine Methylgruppe von S-Adenosyl-L-methionin auf das Kohlenstoffatom Nr. 5 des Cytosins überträgt (Chiang, P. K. et al., „S-Adenosylmethionine and methylation", FASER J., 10: 471–480, 1996). Die meisten Cytosine innerhalb der CpG-Dinukleotide sind im humanen Genom methyliert, jedoch verbleiben manche in spezifischen GC-reichen Abschnitten im nicht-methylierten Zustand. Diese Abschnitte werden als CpG-Inseln bezeichnet (Antequera, F. et al., „High levels of de novo methylation and altered chromatin structure at CpG islands in cell lines", Cell, 62: 503–514, 1990). CpG-Inseln betragen typischerweise zwischen 0,2 bis etwa 1 kb in der Länge und sind aufwärts von vielen organisatorischen (housekeeping) und gewebespezifischen Genen gelegen, sie können sich jedoch ebenso in die Gen-kodierenden Abschnitte erstrecken (Antequera, F. et al., „High levels of de novo methylation and altered chromatin structure at CpG islands in cell lines", Cell, 62: 503–514, 1990).
Die DNA-Methylierung ist erblich, umkehrbar und unterliegt einer epigenetischen Veränderung; sie hat das Potential, die Genexpression zu verändern, was grundlegende, die Entwicklung und die Genetik betreffende Folgen hat. Die DNA-Methylierung ist dafür bekannt, eine Rolle bei der Regulation der Genexpression während der Zellentwicklung zu spielen. Dieses epigenetische Ereignis ist häufig mit dem transkriptionalen Abschalten von geprägten Genen, einigen sich wiederholenden Elementen und Genen auf dem inaktiven X-Chromosom, verknüpft (Li, E. et al., „Role for DNA methylation in genomic imprinting", Nature, 366: 362–365, 1993; Singer-Sam, J. und Riggs, A. D., „X chromosome inactivation and DNA methylation", in Jost, J. P. und Saluz, H. P. (Eds.): DNA Methylation: Molecular Biology and Biological Significance, Birkhäuser Verlag, Basel, Schweiz, pp. 358–384, 1993). In neoplastischen Zellen wurde beobachtet, dass die normalerweise nicht-methylierten CpG-Inseln irrtümlich methyliert oder hypermethyliert werden können (Jones, P. A., „DNA methylation errors and cancer", Cancer Res., 56: 2463–2467, 1996).
Irrtümlich methyliertes Cytosin bei CpG-Dinukleotiden ist eine weit verbreitete Erscheinung bei Krebs (Jones, P. A. und Laird, P. W., „Cancer epigenetics comes of age", Nat. Genet. 21: 163–167, 1999). Als ein Ergebnis der Hypermethylierung von CpG-Inseln kann die Chromatinstruktur in dem Promotor verändert werden, so dass die normale Wechselwirkung mit dem Transkriptionsapparat verhindert wird (Baylin, S. B. et al., „Alterations in DNA methylation: A fundamental aspect of neoplasia", in Advances in cancer research (Eds.: G. F. Vande Woude und G. Klein), Vol. 72: 141–196, 1998, Academic Press, San Diego, CA). Wenn dieses Phänomen bei Genen auftritt, die für die Hemmung des Wachstums entscheidend sind, könnte das sich ergebende Abschalten der Transkription das Fortschreiten des Tumorwachstums verhindern. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass die Hypermethylierung der CpG-Insel des Promotors einen gewöhnlichen Mechanismus zur transkriptionalen Inaktivierung von klassischen Tumorsupressor-Genen und von Genen darstellt, die für die Regulation des Zellzyklus' und für die Reparatur der DNA-Fehlpaarung bedeutsam sind.
Auf der Grundlage dieser Befunde kann man sagen, dass die Methylierung von Cytosin eine erhebliche Rolle bei der Kontrolle der Genexpression spielt, und dass die Veränderung des Methylierungs-Musters oder -Zustands Krankheiten verursachen sollte.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Bestimmung des Zustandes der DNA-Methylierung oder des Zustandes von einem spezifischen CpG-Bereich oder von wichtigen Bereichen bereit. Dieses Verfahren umfasst:

(a) Gewinnen und/oder Verwenden von DNA aus einer zu untersuchenden Probe;
(b) in Kontakt bringen der DNA mit einem Mittel, das nicht-methyliertes Cytosin in Uracil überführt, während es ein 5'-methyliertes Cytosin unverändert belässt;
(c) Amplifizieren der DNA unter Verwendung von strang-spezifischen Primern;
(d) Durchführen einer Primerverlängerungs-Reaktion unter Verwendung von mindestens einem Paar von Primern, die für die methylierungs-spezifische Primerverlängerung (methylation specific primer extension; MSPE) vorgesehen sind und mit dem oberen Strang der amplifizierten DNA hybridisieren, sowie von markierten dNTPs und einer DNA-Polymerase, wobei das 3'-Ende des ersten MSPE-Primers in dem Paar eine Polynukleotid-Sequenz umfasst, die für den oberen Strang der methylierten DNA spezifisch ist, wobei der am nächsten zum 3'-Ende gelegene Abschnitt des Primers mit dem Cytosin-Rest des zu untersuchenden CpG-Bereichs hybridisiert, und wobei das 5'-Ende des ersten MSPE-Primers eine erste einzigartige Sequenz umfasst, die nicht mit irgendwelchen DNA-Sequenzen in der Probe hybridisiert; wobei das 3'-Ende des zweiten MSPE-Primers in dem Paar eine Polynukleotid-Sequenz umfasst, die für den oberen Strang der nicht-methylierten DNA-Sequenz spezifisch ist, wobei der am nächsten zum 3'-Ende gelegene Abschnitt des Primers mit dem Thymin-Rest hybridisiert, der aus dem Cytosin des zu untersuchenden CpG-Bereichs stammt, und wobei das 5'-Ende des zweiten MSPE-Primers eine zweite einzigartige Sequenz umfasst, die nicht mit irgendwelchen DNA-Sequenzen in der Probe hybridisiert;
(e) Hybridisieren der Primerverlängerungs-Produkte aus (d) mit mindestens einem Paar von Oligonukleotiden, wobei das erste Oligonukleotid in dem Paar komplementär zur ersten einzigartigen Sequenz ist, und das zweite Oligonukleotid in dem Paar komplementär zur zweiten einzigartigen Sequenz ist; und
(f) Bestimmen des 5'-Methylierungs-Zustands am Cytosin-Rest des CpG-Bereichs durch Vergleich der Hybridisierungs-Intensität der methylierten DNA mit der Hybridisierungs-Intensität der nicht-methylierten DNA in der Probe.

Unter einem weiteren Gesichtspunkt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung des Zustandes der DNA-Methylierung oder des Zustandes von einem spezifischen CpG-Bereich oder von wichtigen Bereichen bereit, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:

(a) Gewinnen und/oder Verwenden von DNA aus einer zu untersuchenden Probe;
(b) in Kontakt bringen der DNA mit einem Mittel, das nicht-methyliertes Cytosin in Uracil überführt, während es ein 5'-methyliertes Cytosin unverändert belässt;
(c) Amplifizieren der DNA unter Verwendung von strang-spezifischen Primern;
(d) Durchführen einer Primerverlängerungs-Reaktion unter Verwendung von mindestens einem Paar von MSPE-Primern, die mit dem unteren Strang der amplifizierten DNA hybridisieren, sowie von markierten dNTPs und einer DNA-Polymerase, wobei das 3'-Ende des ersten MSPE-Primers in dem Paar eine Polynukleotid-Sequenz umfasst, die für den unteren Strang der methylierten DNA spezifisch ist, wobei der am nächsten zum 3'-Ende gelegene Abschnitt des Primers mit dem Guanin-Rest hybridisiert, der zu dem Cytosin des CpG-Bereichs auf dem oberen Strang komplementär ist, und wobei das 5'-Ende des ersten MSPE-Primers eine erste einzigartige Sequenz umfasst, die nicht mit irgendwelchen DNA-Sequenzen in der Probe hybridisiert; wobei das 3'-Ende des zweiten MSPE-Primers in dem Paar eine Polynukleotid-Sequenz umfasst, die für den unteren Strang der nicht-methylierten DNA-Sequenz spezifisch ist, wobei der am nächsten zum 3'-Ende gelegene Abschnitt des Primers mit dem Adenin-Rest hybridisiert, der von dem Cytosin des CpG-Bereichs auf dem oberen Strang stammt, und wobei das 5'-Ende des zweiten MSPE-Primers eine zweite einzigartige Sequenz umfasst, die nicht mit irgendwelchen DNA-Sequenzen in der Probe hybridisiert;
(e) Hybridisieren der Primerverlängerungs-Produkte aus (d) mit mindestens einem Paar von Oligonukleotiden, wobei das erste Oligonukleotid in dem Paar komplementär zur ersten einzigartigen Sequenz ist, und das zweite Oligonukleotid in dem Paar komplementär zur zweiten einzigartigen Sequenz ist; und
(f) Bestimmen des 5'-Methylierungs-Zustands am Cytosin-Rest des CpG-Bereichs durch Vergleich der Hybridisierungs-Intensität der methylierten DNA mit der Hybridisierungs-Intensität der nicht-methylierten DNA in der Probe.

(a) Gewinnen und/oder Verwenden von DNA aus einer zu untersuchenden Probe;
(b) in Kontakt bringen der DNA mit einem Mittel, das nicht-methyliertes Cytosin in Uracil überführt, während es ein 5'-methyliertes Cytosin unverändert belässt;
(c) Amplifizieren der DNA unter Verwendung von strang-spezifischen Primern;
(d) Durchführen einer Primerverlängerungs-Reaktion unter Verwendung von mindestens einem Paar von MSPE-Primern, die für die Methylierungs-spezifische Primerverlängerung vorgesehen sind und mit dem oberen Strang der amplifizierten DNA hybridisieren, sowie von dNTPs, markiertem ddCTP und einer DNA-Polymerase, wobei das 3'-Ende des ersten MSPE-Primers in dem Paar eine Polynukleotid-Sequenz umfasst, die für den oberen Strang der methylierten DNA spezifisch ist, wobei der am nächsten zum 3'-Ende gelegene Abschnitt des Primers mit dem Cytosin-Rest des zu untersuchenden CpG-Bereichs hybridisiert, und wobei das 5'-Ende des ersten MSPE-Primers eine erste einzigartige Sequenz umfasst, die nicht mit irgendwelchen DNA-Sequenzen in der Probe hybridisiert; wobei das 3'-Ende des zweiten MSPE-Primers in dem Paar eine Polynukleotid-Sequenz umfasst, die für den oberen Strang der nicht-methylierten DNA-Sequenz spezifisch ist, wobei der am nächsten zum 3'-Ende gelegene Abschnitt des Primers mit dem Thymin-Rest hybridisiert, der von dem Cytosin des zu untersuchenden CpG-Bereichs stammt, und wobei das 5'-Ende des zweiten MSPE-Primers eine zweite einzigartige Sequenz umfasst, die nicht mit irgendwelchen DNA-Sequenzen in der Probe hybridisiert;
(e) Hybridisieren der Primerverlängerungs-Produkte aus (d) mit mindestens einem Paar von Oligonukleotiden, wobei das erste Oligonukleotid in dem Paar komplementär zur ersten einzigartigen Sequenz ist, und das zweite Oligonukleotid in dem Paar komplementär zur zweiten einzigartigen Sequenz ist; und
(f) Bestimmen des 5'-Methylierungs-Zustands am Cytosin-Rest des CpG-Bereichs durch Vergleich der Hybridisierungs-Intensität der methylierten DNA mit der Hybridisierungs-Intensität der nicht-methylierten DNA in der Probe.

In alternativer Weise stellt die vorliegende Erfindung unter einem weiteren Gesichtspunkt ein Verfahren zur Bestimmung des Zustandes der DNA-Methylierung oder des Zustandes von einem spezifischen CpG-Bereich oder von wichtigen Bereichen bereit, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:

(a) Gewinnen und/oder Verwenden von DNA aus einer zu untersuchenden Probe;
(b) in Kontakt bringen der DNA mit einem Mittel, das nicht-methyliertes Cytosin in Uracil überführt, während es ein 5'-methyliertes Cytosin unverändert belässt;
(c) Amplifizieren der DNA unter Verwendung von strang-spezifischen Primern;
(d) Durchführen einer Primerverlängerungs-Reaktion unter Verwendung von mindestens einem Paar von MSPE-Primern, die für die Methylierungs-spezifische Primerverlängerung vorgesehen sind und mit dem oberen Strang der amplifizierten DNA hybridisieren, sowie von einer Mischung von markierten dNTPs und ddNTPs, einer Mischung von nicht-markierten dNTPs und ddNTPs, und einer DNA-Polymerase, wobei das 3'-Ende des ersten MSPE-Primers in dem Paar eine Polynukleotid-Sequenz umfasst, die für den oberen Strang der methylierten DNA spezifisch ist, wobei der am nächsten zum 3'-Ende gelegene Abschnitt des Primers mit dem Cytosin-Rest des zu untersuchenden CpG-Bereichs hybridisiert, und wobei das 5'-Ende des ersten MSPE-Primers eine erste einzigartige Sequenz umfasst, die nicht mit irgendwelchen DNA-Sequenzen in der Probe hybridisiert; wobei das 3'-Ende des zweiten MSPE-Primers in dem Paar eine Polynukleotid-Sequenz umfasst, die für den oberen Strang der nicht-methylierten DNA-Sequenz spezifisch ist, wobei der am nächsten zum 3'-Ende gelegene Abschnitt des Primers mit dem Thymin-Rest hybridisiert, der von dem Cytosin des zu untersuchenden CpG-Bereichs stammt, und wobei das 5'-Ende des zweiten MSPE-Primers eine zweite einzigartige Sequenz umfasst, die nicht mit irgendwelchen DNA-Sequenzen in der Probe hybridisiert;
(e) Hybridisieren der Primerverlängerungs-Produkte aus (d) mit mindestens einem Paar von Oligonukleotiden, wobei das erste Oligonukleotid in dem Paar komplementär zur ersten einzigartigen Sequenz ist, und das zweite Oligonukleotid in dem Paar komplementär zur zweiten einzigartigen Sequenz ist; und
(f) Bestimmen des 5'-Methylierungs-Zustands am Cytosin-Rest des CpG-Bereichs durch Vergleich der Hybridisierungs-Intensität der methylierten DNA mit der Hybridisierungs-Intensität der nicht-methylierten DNA in der Probe.

(a) Gewinnen und/oder Verwenden von DNA aus einer zu untersuchenden Probe;
(b) in Kontakt bringen der DNA mit einem Mittel, das nicht-methyliertes Cytosin in Uracil überführt, während es ein 5'-methyliertes Cytosin unverändert belässt;
(c) Amplifizieren der DNA unter Verwendung von strang-spezifischen Primern;
(d) Durchführen einer Primerverlängerungs-Reaktion unter Verwendung von mindestens einem Paar von MSPE-Primern, die mit dem unteren Strang der amplifizierten DNA hybridisieren, sowie von einer Mischung von markierten dNTPs und ddNTPs, einer Mischung von nicht-markierten dNTPs und ddNTPs, und einer DNA-Polymerase, wobei das 3'-Ende des ersten MSPE-Primers in dem Paar eine Polynukleotid-Sequenz umfasst, die für den unteren Strang der methylierten DNA spezifisch ist, wobei der am nächsten zum 3'-Ende gelegene Abschnitt des Primers mit dem Guanin-Rest hybridisiert, der komplementär zu dem Cytosin des CpG-Bereichs auf dem oberen Strang ist, und wobei das 5'-Ende des ersten MSPE-Primers eine erste einzigartige Sequenz umfasst, die nicht mit irgendwelchen DNA-Sequenzen in der Probe hybridisiert; wobei das 3'-Ende des zweiten MSPE-Primers in dem Paar eine Polynukleotid-Sequenz umfasst, die für den unteren Strang der nicht-methylierten DNA-Sequenz spezifisch ist, wobei der am nächsten zum 3'-Ende gelegene Abschnitt des Primers mit dem Adenin-Rest hybridisiert, der von dem Cytosin des CpG-Bereichs auf dem oberen Strang stammt, und wobei das 5'-Ende des zweiten MSPE-Primers eine zweite einzigartige Sequenz umfasst, die nicht mit irgendwelchen DNA-Sequenzen in der Probe hybridisiert;
(e) Hybridisieren der Primerverlängerungs-Produkte aus (d) mit mindestens einem Paar von Oligonukleotiden, wobei das erste Oligonukleotid in dem Paar komplementär zur ersten einzigartigen Sequenz ist, und das zweite Oligonukleotid in dem Paar komplementär zur zweiten einzigartigen Sequenz ist; und
(f) Bestimmen des 5'-Methylierungs-Zustands am Cytosin-Rest des CpG-Bereichs durch Vergleich der Hybridisierungs-Intensität der methylierten DNA mit der Hybridisierungs-Intensität der nicht-methylierten DNA in der Probe.

(a) Gewinnen und/oder Verwenden von DNA aus einer zu untersuchenden Probe;
(b) in Kontakt bringen der DNA mit einem Mittel, das nicht-methyliertes Cytosin in Uracil überführt, während es ein 5'-methyliertes Cytosin unverändert belässt;
(c) Amplifizieren der DNA unter Verwendung von strang-spezifischen Primern;
(d) Durchführen einer Primerverlängerungs-Reaktion unter Verwendung von mindestens einem Paar von MSPE-Primern, die mit dem oberen Strang der amplifizierten DNA hybridisieren, sowie von mindestens einem markierten Reverse-Primer, dNTPs und einer DNA-Polymerase, wobei das 5'-Ende des ersten MSPE-Primers in dem Paar eine erste einzigartige Sequenz umfasst, die nicht mit irgendwelchen DNA-Sequenzen in der Probe hybridisiert, und wobei das 3'-Ende des ersten MSPE-Primers eine Polynukleotid-Sequenz umfasst, die für den oberen Strang der methylierten DNA-Sequenz spezifisch ist, wobei der am nächsten zum 3'-Ende gelegene Abschnitt des Primers mit dem Cytosin-Rest des zu untersu chenden CpG-Bereichs hybridisiert; wobei das 5'-Ende des zweiten MSPE-Primers in dem Paar eine zweite einzigartige Sequenz umfasst, die nicht mit irgendwelchen DNA-Sequenzen in der Probe hybridisiert, und wobei das 3'-Ende des zweiten MSPE-Primers in dem Paar eine Polynukleotid-Sequenz umfasst, die für den oberen Strang der nicht-methylierten DNA spezifisch ist, und wobei der am nächsten zum 3'-Ende gelegene Abschnitt des Primers mit dem Thymin-Rest hybridisiert, welcher von dem Cytosin des zu untersuchenden CpG-Bereichs stammt;
(e) Hybridisieren der Primerverlängerungs-Produkte aus (d) mit mindestens einem Paar von Oligonukleotiden, wobei das erste Oligonukleotid in dem Paar das gleiche ist wie die erste einzigartige Sequenz, und das zweite Oligonukleotid in dem Paar das gleiche ist wie die zweite einzigartige Sequenz; und
(f) Bestimmen des 5'-Methylierungs-Zustands am Cytosin-Rest des CpG-Bereichs durch Vergleich der Hybridisierungs-Intensität der methylierten DNA mit der Hybridisierungs-Intensität der nicht-methylierten DNA in der Probe.

Unter einem weiteren Gesichtspunkt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung des Zustands der DNA-Methylierung oder des Zustands von einem spezifischen CpG-Bereich oder von wichtigen Bereichen bereit, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:

(a) Gewinnen und/oder Verwenden von DNA aus einer zu untersuchenden Probe;
(b) in Kontakt bringen der DNA mit einem Mittel, das nicht-methyliertes Cytosin in Uracil überführt, während es ein 5'-methyliertes Cytosin unverändert belässt;
(c) Amplifizieren der DNA unter Verwendung von strang-spezifischen Primern;
(d) Durchführen einer Primerverlängerungs-Reaktion unter Verwendung von mindestens einem Paar von MSPE-Primern, die mit dem unteren Strang der amplifizierten DNA hybridisieren, sowie von mindestens einem markierten Reverse-Primer, dNTPs, und einer DNA-Polymerase, wobei das 5'-Ende des ersten MSPE-Primers in dem Paar eine erste einzigartige Sequenz umfasst, die nicht mit irgendwelchen DNA-Sequenzen in der Probe hybridisiert, und wobei das 3'-Ende des ersten MSPE-Primers eine Polynukleotid-Sequenz umfasst, die für den unteren Strang der methylierten DNA-Sequenz spezifisch ist, wobei der am nächsten zum 3'-Ende gelegene Abschnitt des Primers mit dem Guanin-Rest hybridisiert, welcher komplementär zu dem Cytosin des CpG-Bereichs auf dem oberen Strang ist; wobei das 5'-Ende des zweiten MSPE-Primers in dem Paar eine zweite einzigartige Sequenz umfasst, die nicht mit irgendwelchen DNA-Sequenzen in der Probe hybridisiert, und wobei das 3'-Ende des zweiten MSPE-Primers in dem Paar eine Polynukleotid-Sequenz umfasst, die für den unteren Strang der nicht methylierten DNA spezifisch ist, und wobei der am nächsten zum 3'-Ende gelegene Abschnitt des Primers mit dem Adenin-Rest hybridisiert, welcher von dem Cytosin des CpG-Bereichs auf dem oberen Strang stammt;
(e) Hybridisieren der Primerverlängerungs-Produkte aus (d) mit mindestens einem Paar von Oligonukleotiden, wobei das erste Oligonukleotid in dem Paar das gleiche ist wie die erste einzigartige Sequenz, und das zweite Oligonukleotid in dem Paar das gleiche ist wie die zweite einzigartige Sequenz; und
(f) Bestimmen des 5'-Methylierungs-Zustands am Cytosin-Rest des CpG-Bereichs durch Vergleich der Hybridisierungs- Intensität der methylierten DNA mit der Hybridisierungs-Intensität der nicht-methylierten DNA in der Probe.

Gemäß der vorliegenden Erfindung ist es bevorzugt, dass die DNA in Schritt (a) eine genomische DNA ist.
Gemäß der vorliegenden Erfindung ist es bevorzugt, dass das Mittel, welches zur Überführung des nicht-methylierten Cytosins in Uracil verwendet wird, eine Bisulfit-Verbindung ist. Vorzugsweise ist das Mittel, welches für die Modifikation des nicht-methylierten Cytosins verwendet wird, Natriumbisulfit.
Gemäß der vorliegenden Erfindung ist es bevorzugt, dass die Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) verwendet wird, um die chemisch behandelten Nukleinsäuren zu amplifizieren. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Amplifikation mittels PCR mit mindestens einem Paar von PCR-Primern durchgeführt, und die PCR-Primer sollten sowohl die methylierten als auch die nicht-methylierten DNA-Template erkennen. Die PCR-Primer können eine Sequenz umfassen, welche unter stringenten Bedingungen mit mindestens mit etwa 7, bevorzugt mit etwa 12, bevorzugt mit etwa 15, stärker bevorzugt mit etwa 25, 50, 75, 100 oder mehr Nukleotiden, in idealer Weise mit etwa 17 bis 40 Nukleotiden, hybridisiert. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden viele verschiedene Paare von PCR-Primern verwendet, die viele verschiedene CpG-Bereiche erkennen, und viele verschiedene PCR-Reaktionen werden durchgeführt, um die DNA-Template gleichzeitig zu amplifizieren.
Entsprechend der vorliegenden Erfindung werden die MSPE-Reaktionen zur Analyse des Methylierungs-Grades von einem oder mehreren CpG-Bereichen auf einem oder mehreren Nukleinsäure-Molekülen durchgeführt. In einer bevorzugten Ausführungsform werden einige einzelne oder viele verschiedene PCR-Reaktionen zusammen ausgeführt, während die MSPE-Reaktionen durchgeführt werden. In einer Ausführungsform werden die MSPE-Primer, die in der Primerverlängerungs-Reaktion verwendet werden, so gestaltet, dass sie mit den Sequenzen hybridisieren, welche ursprünglich CpG-Dinukleotide enthalten.
Zur Analyse eines definierten CpG-Bereichs werden mindestens zwei Klassen von MSPE-Primern in der Verlängerungsreaktion eingesetzt. Eine Klasse eines MSPE-Primers ist spezifisch für die Methylierung und hybridisiert mit den methylierten CpG-Bereichen, und die andere Klasse von MSPE-Primern ist spezifisch für nicht-methylierte CpG-Bereiche und hybridisiert mit den nicht-methylierten CpG-Bereichen der amplifizierten Nukleinsäuren. Jede Klasse von MSPE-Primern besteht aus zwei Hälften. Der Abschnitt am 3'-Ende hybridisiert mit einem definierten CpG-Bereich (Bereichen) auf den amplifizierten Nukleinsäuren, und der Abschnitt am 5'-Ende hybridisiert mit einer einzigartigen Sequenz bzw. einer Adaptersequenz, welche nicht mit irgendwelchen amplifizierten Nukleinsäuren hybridisiert.
In einer Ausführungsform wird die Primerverlängerungs-Reaktion durch Verwendung von MSPE-Primern, die mit dem oberen Strang der amplifizierten DNA hybridisieren, sowie durch Verwendung von markierten dNTPs durchgeführt, wobei dATP, dTTP und dCTP markiert sein können. In einer weiteren Ausführungsform wird die Primerverlängerungs-Reaktion durch Verwendung von MSPE-Primern, die mit dem oberen Strang der amplifizierten DNA hybridisieren, sowie durch Verwendung von markiertem ddCTP durchgeführt. In einer weiteren Ausführungsform wird die Primerverlängerungs-Reaktion durch Verwendung von MSPE-Primern, die mit dem oberen Strang der amplifizierten DNA hybridisieren, sowie durch Verwendung einer Mischung von markierten dNTPs und ddNTPs, und einer Mischung von nicht-markierten dNTPs und ddNTPs durchgeführt. In einer weiteren Ausführungsform wird die Primerverlängerungs-Reaktion durch Verwendung von MSPE-Primern, die mit dem unteren Strang der Templat-DNA hybridisieren, sowie durch Verwendung von markierten dNTPs durchgeführt, wobei dATP, dTTP und dGTP markiert sein können. In einer weiteren Ausführungsform wird die Primerverlängerungs-Reaktion durch Verwendung von MSPE-Primern, die mit dem unteren Strang der amplifizierten DNA hybridisieren, sowie durch Verwendung einer Mischung von markierten dNTPs und ddNTPs und einer Mischung von nicht-markierten dNTPs und ddNTPs durchgeführt. In einer weiteren Ausführungsform wird die Primerverlängerungs-Reaktion durch Verwendung von markierten Reverse-Primern, die mit dem oberen Strang der amplifizierten DNA hybridisieren, sowie durch Verwendung von nicht-markierten dNTPs durchgeführt. In einer weiteren Ausführungsform wird die Primerverlängerungs-Reaktion durch Verwendung von markierten Reverse-Primern, die mit dem unteren Strang der amplifizierten DNA hybridisieren, sowie unter Verwendung von nicht-markierten dNTPs durchgeführt.
Die dNTPs, ddNTPs oder Reverse-Primer, die in die Verlängerungsprodukte eingebaut werden, können mit einer nachweisbaren Markierung markiert sein. Nachweisbare Markierungen sind im Stand der Technik gut bekannt. Jede Art von nachweisbarer Markierung kann verwendet werden. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Markierung ein radioaktives Isotop. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist die Markierung ein fluoreszierendes Mittel. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die Markierung eine bindende Gruppe, wie zum Beispiel Biotin.
Die nachweisbare Markierung kann entweder eine primäre Markierung sein, die direkt nachgewiesen werden kann, oder eine sekundäre Markierung, die indirekt nachgewiesen werden kann.
Unter einem Gesichtspunkt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung und Quantifizierung des relativen Methylierungs-Grades von einem oder mehreren CpG-Bereichen bereit, indem die Signalintensität des MSPE-Reaktionsproduktes analysiert wird, das einen oder mehrere CpG-Bereiche enthält. In einer bevorzugten Ausführungsform kann eine große Zahl von CpG-Bereichen in Bezug auf ihren relativen Methylierungs-Grad gleichzeitig bestimmt werden; zum Beispiel kann die Bestimmung und Quantifizierung des relativen Methylierungs-Grades von einem oder mehreren CpG-Bereichen mit einem hohen Durchsatz oder auf einem Mikroarray durchgeführt werden.
Ein weiterer Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung liefert ebenso einen Kit zum Nachweis des relativen Methylierungs-Grades von einem oder mehreren CpG-Bereichen. Der Kit kann umfassen: (1) ein Mittel, das nicht-methylierte Cytosin-Nukleotide modifiziert, (2) Primer für die Amplifikation des Nukleinsäuremoleküls, (3) MSPE-Primer, wie in Anspruch 1 definiert, für die methylierte, CpG-enthaltende Nukleinsäure (entweder markiert oder nicht-markiert), (4) MSPE-Primer, wie in Anspruch 1 definiert, für die nicht-methylierte, CpG-enthaltende Nukleinsäure (entweder markiert oder nicht-markiert), (5) markierte und nicht-markierte dNTPs, (6) markierte und nicht-markierte ddNTPs, und (7) markierte oder nicht-markierte Reverse-Primer. Der Kit kann darüber hinaus einen Puffer für die Amplifikation der Nukleinsäure, sowie Reagenzien für MSPE-Reaktionen umfassen. Vorzugsweise ist das Mittel, das nicht-methyliertes Cytosin modifiziert, eine Bisulfit-Verbindung.
Ein weiterer Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung stellt ebenso ein Verfahren für die Verwendung des vorliegenden Verfahrens und/oder einen Kit zur Bestimmung einer Veranlagung für eine Krankheit oder Störung oder für eine Diagnose und/oder eine Prognose einer Krankheit oder Störung oder für die Beobachtung einer therapeutischen Reaktion auf ein Arzneimittel oder eine Verbindung in einem Probanden bereit, welches Verfahren die Bestimmung des relativen Methylierungs-Grades von einem oder mehreren CpG-Bereichen auf einem Nukleinsäuremolekül, und den Vergleich des relativen Methylierungs-Grades in dem Probanden mit dem relativen Methylierungs-Grad dieses Nukleinsäure-Moleküls aus einem Probanden zur Kontrolle (oder Standard), der keine Veranlagung für die Krankheit oder Störung besitzt, bereit, wobei ein erheblicher Unterschied im relativen Methylierungs-Grad einen Hinweis auf die Veranlagung für die Störung oder Krankheit in dem Probanden darstellt.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt ein Fluoreszenz-Diagramm sowohl von einem methylierten als auch von einem nicht-methylierten DNA-Templat.
2 zeigt das Verhältnis der erwarteten Methylierung im Verhältnis zur beobachteten Methylierung.
3 zeigt das Vermögen des Assays zur Vorhersage (berechnetes Verhältnis in Bezug auf das erwartete Verhältnis).
4 zeigt eine schematische Beschreibung der Erfindung.
Genaue Beschreibung der Erfindung
I. Allgemeines
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Bestimmung des DNA-Methylierungs-Zustands oder -Status' in Proben. Im Allgemeinen umfasst der erste Schritt der Verfahren die chemische Modifikation der CpG-Bereiche, wobei die nicht-methylierten Cytosine in Uracil überführt werden, und die 5'-methylierten Cytosine in unverändertem Zustand belassen werden. Die chemisch behandelte DNA kann anschließend durch herkömmliche molekularbiologische Verfahren, einschließlich der PCR-Amplifikation, amplifiziert werden. Der Methylierungs-Zustand oder der Methylierungs-Status in den amplifizierten DNA-Produkten kann anschließend durch eine Primerverlängerungs-Reaktion durch Verwendung markierter Primer oder dNTPs oder ddNTPs analysiert werden. Ein weiterer Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung betrifft die klinischen Anwendungen des Methylierungs-Zustandes oder -Status' als einen Krankheits-Marker oder als eine Grundlage für Behandlungen. Insbesondere inaktiviert eine abnormale Methylierung an den CpG-Bereichen die Genexpression. Daher dienen die relativen Methylierungs-Grade von einem oder mehreren bestimmten CpG-Bereichen im Vergleich mit dem Grad der nicht erfolgten Methylierung von denselben Bereichen als ein diagnostisches, prognostisches oder therapeutisches Instrument.
Definitionen
Der Ausdruck „Methylierung", wie er hier verwendet wird, bezeichnet die kovalente Verknüpfung einer Methylgruppe an der C5-Position der Nukleotidbase Cytosin innerhalb der CpG-Dinukleotide des genregulatorischen Bereichs. Der Ausdruck „Methylierungs-Zustand" oder „Methylierungs-Status" betrifft das Vorliegen oder das Fehlen von 5-Methylcytosin („5-mCyt") bei einem oder bei einer Mehrzahl von CpG-Dinukleotiden innerhalb einer DNA-Sequenz. Die Ausdrücke „Methylierungs-Status" und „Methylierungs-Zustand" werden gegenseitig austauschbar verwendet. Ein Methylierungs-Bereich ist eine Sequenz von benachbarten, verknüpften Nukleotiden, die von einer Sequenz-spezifischen Methylase erkannt und methyliert werden. Eine Methylase ist ein Enzym, das ein oder mehrere Nukleotide in einem Methylierungs-Bereich methyliert (d.h. eine Methylgruppe kovalent verknüpft).
Der Ausdruck „CpG-Insel", wie er hier verwendet wird, bezeichnet kurze DNA-Sequenzen, die reich an CpG-Dinukleotiden sind und in der 5'-Region von etwa der Hälfte aller humanen Gene gefunden werden kann. Der Ausdruck „CpG-Bereich" bezeichnet CpG-Dinukleotide innerhalb von CpG-Inseln. CpG-Inseln betragen typischerweise zwischen etwa 0,2 bis etwa 1 kb in der Länge; jedoch ist dies nicht immer der Fall.
Der Ausdruck „Probe", wie er hier verwendet wird, wird in seinem breitesten Sinn verwendet, und bezeichnet jede Pflanze, jedes Tier oder ein virales Material, das DNA oder RNA enthält, wie zum Beispiel Gewebe oder Flüssigkeit, die aus einem Individuum (einschließlich, Plasma, Serum, cerebrospinale Flüssigkeit, Lymphe, Tränen, Speichel und Gewebeschnitte) oder aus Bestandteilen einer in vitro Zellkultur, sowie aus Proben aus der Umgebung isoliert werden; der Ausdruck ist jedoch nicht darauf beschränkt. Der Ausdruck „Probe" bezeichnet ebenso eine „biologische Probe". Der Ausdruck „eine biologische Probe", wie er hier verwendet wird, betrifft einen gesamten Organismus oder eine Teilmenge seiner Gewebe, Zellen oder Bestandteile (zum Beispiel Körperflüssigkeiten, einschließlich Blut, Schleim, Lymphflüssigkeit, Synovialflüssigkeit, cerebrospinale Flüssigkeit, Speichel, Nabelschnurflüssigkeit, Nabelschnurblut, Urin, Vaginalflüssigkeit und Samen; er ist jedoch nicht darauf beschränkt). Der Ausdruck „eine biologische Probe" bezeichnet darüber hinaus ein Homogenat, Lysat oder einen Extrakt, der aus einem ganzen Organismus oder einer Teilmenge seiner Gewebe, Zellen oder Bestandteile oder einem Teil oder einem Abschnitt derselben hergestellt wird, einschließlich zum Beispiel Plasma, Serum, Rückenmarksflüssigkeit, Lymphflüssigkeit, die äußeren Abschnitte der Haut, der Atemwege, des Verdauungs- und des Genitourinal-Traktes, Tränen, Speichel, Milch, Blutzellen, Tumore, Organe; der Ausdruck ist jedoch nicht darauf beschränkt. Am häufigsten wurde die Probe aus einem Tier entnommen, jedoch kann sich der Ausdruck „biologische Probe" ebenso auf Zellen oder Gewebe beziehen, die bzw. das in vivo analysiert werden bzw. wird, d.h. ohne sie bzw. es aus einem Tier zu entnehmen. Typischerweise wird eine „eine biologische Probe" Zellen aus dem Tier enthalten, jedoch kann sich der Ausdruck ebenso auf nicht-zelluläres, biologisches Material beziehen, wie zum Beispiel nicht-zelluläre Fraktionen von Blut, Speichel oder Urin, die verwendet werden können, um die Krebs-assoziierten Polynukleotid- oder Polypeptid-Niveaus zu messen. Eine „biologische Probe" bezeichnet darüber hinaus ein Medium, wie zum Beispiel ein Nährmedium oder ein Gel, indem sich ein Organismus vermehrt hat, welches Medium zelluläre Bestandteile, wie zum Beispiel Proteine oder Nukleinsäure-Moleküle enthält.
Der Ausdruck „Mittel", wie er hier verwendet wird, bezeichnet eine beliebige Verbindung, die die Eigenschaft besitzt, nicht-methyliertes Cytosin in ein anderes Nukleotid zu überführen, während es ein beliebiges 5'-methyliertes Cytosin unverändert belässt. Die Modifikation wird zwischen dem nicht-methylierten und dem methylierten Cytosin unterscheiden. Vorzugsweise modifiziert das Mittel nicht-methyliertes Cytosin zu Uracil. Vorzugsweise ist das Mittel, das zur Modifikation von nicht- methyliertem Cytosin verwendet wird, Natriumbisulfit. Jedoch können auch andere Mittel, die in ähnlicher Weise nicht-methyliertes Cytosin, nicht jedoch methyliertes Cytosin modifizieren, ebenso in der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Der Ausdruck „Primer", wie er hier verwendet wird, bezeichnet ein Polynukleotid, das, sei es aus einem Verdau einer Nukleinsäure-Restriktion gereinigt oder synthetisch hergestellt, in der Lage ist, als ein Startpunkt der Nukleinsäure-Synthese zu wirken, wenn es unter Bedingungen gesetzt wird, mittels derer die Synthese eines Primerverlängerungs-Produktes, das zu einem Nukleinsäure-Strang komplementär ist, eingeleitet wird, d.h. in Gegenwart von Nukleotiden und einem Mittel zur Polymerisation, wie zum Beispiel einer DNA-Polymerase, einer reversen Transkriptase und dergleichen, und bei einer geeigneten Temperatur und einem geeigneten pH-Wert. Der Primer ist vorzugsweise einzelsträngig wegen der maximalen Effizienz, jedoch kann er in alternativer Weise doppelsträngig sein. Falls er doppelsträngig ist, wird der Primer zunächst behandelt, um seine Stränge zu trennen, ehe er dazu verwendet wird, um Verlängerungsprodukte herzustellen. Vorzugsweise ist der Primer ein Polydesoxyribonukleotid. Der Primer muss ausreichend lang sein, um die Synthese der Verlängerungsprodukte in Gegenwart der Mittel für die Polymerisation anzustoßen. Die exakten Längen der Primer werden von vielen Faktoren abhängen, einschließlich der Temperatur und der Quelle der Primer. In Abhängigkeit von der Komplexität der Zielsequenz enthält ein Polynukleotid-Primer zum Beispiel typischerweise 15 bis 25 oder mehr Nukleotide, obwohl er weniger Nukleotide enthalten kann. Kürzere Primermoleküle erfordern im Allgemeinen kühlere Temperaturen, um ausreichend stabile Hybrid-Komplexe mit dem Templat zu bilden.
Der Ausdruck „ein MSPE-Primer", wie er hier verwendet wird, bezeichnet ein Oligonukleotid, das an den CpG-Bereich hybridisiert, der untersucht werden soll. „Ein MSPE-Primer" enthält zwei Hälften. Das 5'-Ende des MSPE-Primers enthält eine ein zigartige Sequenz, die nicht mit einer beliebigen DNA-Sequenz in der Probe, die untersucht werden soll, hybridisiert, und das 3'-Ende des MSPE-Primers enthält eine Sequenz, die komplementär zu einer Region ist, welche die zu untersuchenden CpG-Bereiche enthält.
Der Ausdruck „einzigartige Sequenz", ebenso als „Zip-Code" oder „Adapter-Sequenz" bezeichnet, wie er hier verwendet wird, ist eine Sequenz, die in der Regel außerhalb der Zielsequenzen liegt, zum Beispiel eine künstliche Sequenz. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Adaptersequenz so gestaltet, dass sie im Wesentlichen komplementär (und vorzugsweise vollständig komplementär) zu einer Fangsonde von Mikrokügelchen oder Mikroarrays für Nachweiszwecke ist. Vorzugsweise ist die Fangsonde auf einem festen Träger immobilisiert, der Mikrokügelchen oder ebene Substrate umfassen kann, wie zum Beispiel Plastik- oder Glasplättchen, wie sie hier für Array-Träger beschrieben sind. Ein nicht begrenzendes Beispiel sind Oligonukleotide, deren Amin am 3'-Ende modifiziert ist:
CP32: 5' CGA ACG CTC TGA GGT CAC AGC GTC 3' (SEQ ID Nr. 1),
CP33: 5' GTG CTC CAG AGG CTG ATG CCG C 3' (SEQ ID Nr. 2),
CE32: 5' GAC GCT GTG ACC TCA GAG CGT TCG 3' (SEQ ID Nr. 13)
und CE33: 5' GCG GCA TCA GCC TCT GGA GCA C 3' (SEQ ID Nr. 14).
Der Ausdruck „amplifizieren", wie er hier verwendet wird, bezeichnet das Verfahren der Synthese von Nukleinsäure-Molekülen, die zu einem oder beiden Strängen des Nukleinsäure-Templats komplementär sind. Das Amplifizieren eines Nukleinsäure-Moleküls umfasst typischerweise das Denaturieren des Nukleinsäure-Templats, das Hybridisieren der Primer mit dem Nukleinsäure-Templat bei einer Temperatur, die unterhalb der Schmelztemperaturen der Primer liegt, und das enzymatische Verlängern, ausgehend von den Primern, um ein Amplifikations-Produkt zu erzeugen. Die Schritte der Denaturierung, der Hybridisierung und der Verlängerung können jeweils einmal durchgeführt werden. Im Allgemeinen werden jedoch die Schritte der Denaturierung, des Hybridisierens und der Verlängerung mehrfach durchgeführt, so dass die Menge des Amplifikationsprodukts zunimmt, häufig exponentiell, obwohl eine exponentielle Amplifikation durch die vorliegenden Verfahren nicht erforderlich ist. Die Amplifikation erfordert typischerweise das Vorliegen von Desoxyribonukleosid-Triphosphaten, und eines DNA-Polymerase-Enzyms, und eines geeigneten Puffers und/oder der Cofaktoren für die optimale Aktivität des Polymerase-Enzyms. Der Ausdruck „Amplifikations-Produkt" bezeichnet Nukleinsäure-Sequenzen, die durch das hier definierte Amplifikations-Verfahren hergestellt wurden.
Der Ausdruck „Markierung", wie er hier verwendet wird, bezeichnet ein beliebiges Atom oder Molekül, das verwendet werden kann, um einen nachweisbaren (vorzugsweise quantifizierbaren) Effekt bereitzustellen, und das mit einer Nukleinsäure oder einem Protein verknüpft werden kann. Die Markierungen umfassen Farbstoffe und radioaktive Markierungen, wie zum Beispiel ³²P; bindende Gruppen, wie zum Beispiel Biotin; Haptene, wie zum Beispiel Digoxigenin; luminogene, phosphoreszierende oder fluorogene Gruppen; und Fluoreszenzfarbstoffe allein oder in Kombination mit Gruppen, die die Emissionsspektren durch Fluoreszenzresonanz-Energietransfer (FRET) unterdrücken oder verschieben können; sie sind jedoch nicht darauf beschränkt. Die Markierungen können Signale bereitstellen, die durch Fluoreszenz, Radioaktivität, Kolorimetrie, Gravimetrie, Röntgenbeugung oder Absorption, Magnetismus, Enzymaktivität und dergleichen nachweisbar sind. Eine Markierung kann eine geladene Gruppe (positive oder negative Ladung) darstellen, oder in alternativer Weise kann sie ladungsneutral sein. Die Markierungen können eine Nukleinsäure- oder Protein-Sequenz umfassen bzw. aus ihnen bestehen, sofern die Sequenz, welche die Markierung umfasst, nachweisbar ist. Der Ausdruck „markierte dNTPs" bezeichnet solche dNTPs, die durch die damit verknüpften Markierungen modifiziert wurden. Der Ausdruck „markierte ddNTPs" bezeichnet solche ddNTPs, die durch die damit verknüpften Markierungen modifiziert wurden.
Der Ausdruck „Hybridisieren", wie er hier verwendet wird, bezeichnet ein Verfahren, bei dem ein Nukleinsäure-Strang unter normalen Hybridisierungs-Bedingungen mit einem zweiten komplementären Nukleinsäure-Strang hybridisiert, und damit einen stabilen Doppelstrang, entweder einen Homoduplex-Strang oder einen Heteroduplex-Strang, bildet, und unter denen der Nukleinsäure-Strang keinen stabilen Doppelstrang mit fremden Nukleinsäure-Molekülen unter denselben normalen Hybridisierungs-Bedingungen bildet. Die Bildung eines Doppelstrangs geht einher mit der Hybridisierung zweier komplementärer Nukleinsäure-Strange in einer Hybridisierungs-Reaktion. Die Hybridisierungs-Reaktion kann so gewählt werden, dass sie durch Einstellung der Hybridisierungs-Bedingungen (häufig als Stringenz der Hybridisierung bezeichnet) in hohem Maße spezifisch wird, unter denen die Hybridisierungs-Reaktion stattfindet, so dass die Hybridisierung zwischen zwei Nukleinsäure-Strängen keinen stabilen Doppelstrang bildet, zum Beispiel einen Doppelstrang, der einen Abschnitt der Doppelsträngigkeit unter den Bedingungen von normaler Stringenz beibehält, wenn nicht die zwei Nukleinsäure-Stränge eine gewisse Anzahl von Nukleotiden in spezifischen Sequenzen enthalten, die im Wesentlichen oder vollständig komplementär zueinander sind. Der Ausdruck „normale Hybridisierung oder normale Stringenz-Bedingungen" werden leicht für eine beliebige gegebene Hybridisierungs-Reaktion bestimmt. Siehe zum Beispiel Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York, oder Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Die Ausdrücke "Hybridisieren" oder "Hybridisierung", wie sie hier verwendet werden, bezeichnen ein beliebiges Verfahren, durch das ein Strang einer Nukleinsäure mit einem komplementären Strang aufgrund der Basenpaarung bindet.
Der Ausdruck „eine DNA-Polymerase", wie er hier verwendet wird, bezeichnet ein Enzym, das die Polymerisation von Desoxynukleotiden katalysiert. Im Allgemeinen wird das Enzym mit der Synthese am 3'-Ende des Primers beginnen, der mit der DNA- Templat-Sequenz hybridisiert ist, und die Synthese wird in 5'-Richtung entlang des Templats fortschreiten. Bekannte DNA-Polymerasen umfassen zum Beispiel die DNA-Polymerase von Pyrococcus furiosus (Pfu), DNA-Polymerase I von E. coli, T7 DNA-Polymerase, DNA-Polymerase von Thermus thermophilus (Tth), DNA-Polymerase von Bacillus stearothermophilus, DNA-Polymerase von Thermococcus litoralis (Tli) (auch als Vent DNA-Polymerase bezeichnet), DNA-Polymerase von Thermotoga maritima (UlTma), DNA-Polymerase von Thermus aquaticus (Taq) und DNA-Polymerase von Pyrococcus GB-D (PGB-D). Die Polymerase-Aktivität von einem der vorstehenden Enzyme kann anhand von Mitteln definiert werden, die im Stand der Technik gut bekannt sind. Entsprechend der vorliegenden Erfindung wird eine Einheit der Aktivität der DNA-Polymerase als diejenige Menge des Enzyms definiert, die den Einbau von 10 nMol der gesamten dNTPs in die polymere Form innerhalb von 30 Minuten bei 72°C katalysiert. Bevorzugte thermostabile DNA-Polymerasen, die in der Erfindung verwendet werden können, umfassen Taq, Tne, Tma, Pfu, Tfl, Tth, Stoffel-Fragment, VENT^® und DEEPVENT^® DNA-Polymerasen und Mutanten, Varianten und Derivate derselben. Siehe US-Patent Nr. 5 436 149 ; US-Patent Nr. 4 889 818 ; US-Patent Nr. 4 965 188 ; US-Patent Nr. 5 079 352 ; US-Patent Nr. 5 614 365 ; US-Patent Nr. 5 374 553 ; US-Patent Nr. 5 270 179 ; US-Patent Nr. 5 047 342 ; US-Patent Nr. 5 512 462 ; US-Patent Nr. 6 015 668 ; US-Patent Nr. 5 939 301 ; US-Patent Nr. 5 948 614 ; US-Patent Nr. 5 912 155 ; WO 97/09451 ; WO 98/35060 ; WO 92/06188 ; WO 92/06200 ; WO 96/10640 ; Barnes, W. M., Gene 112: 29–35, 1992; Lawyer, F. C., et al., PCR Meth. Appl. 2: 275–287, 1993; Flaman, J.-M., et al., Nucl. Acids Res. 22 (15): 3259–3260, 1994.
Der Ausdruck „nachweisen", wie er hier verwendet wird, bezeichnet die Identifikation des Vorliegens oder des Fehlens eines Moleküls in einer Probe. Wenn das nachzuweisende Molekül ein Ligand ist, kann der Schritt des Nachweises durch Bindung des Liganden mit einem Antikörper durchgeführt werden, der in nachweisbarer Weise markiert ist. Eine nachweisbare Markierung ist ein Molekül, das in der Lage ist, entweder unabhängig oder als Reaktion auf einen Anreiz, ein beobachtbares Signal zu erzeugen. Eine nachweisbare Markierung kann eine fluoreszierende Markierung, eine farberzeugende Markierung, eine lumineszierende Markierung oder eine radioaktive Markierung sein; sie ist jedoch nicht darauf beschränkt. Die Verfahren zum „Nachweis" einer Markierung umfassen quantitative und qualitative Verfahren, die für die Standard- oder konfokale Mikroskopie eingerichtet wurden, FACS-Analyse und solche Verfahren, die für Verfahren mit hohem Durchsatz unter Verwendung von Mikrotiterplatten, Arrays oder Mikroarrays eingerichtet wurden. Ein Fachmann kann in geeigneter Weise Filtersätze und Quellen für die Anregungsenergie zum Nachweis der Fluoreszenz-Emission aus einem gegebenen fluoreszierenden Liganden oder Farbstoff auswählen. Der Ausdruck „nachweisen", wie er hier verwendet wird, kann ebenso die Verwendung von vielerlei Antikörpern für einen nachzuweisenden Liganden umfassen, wobei die multiklonalen Antikörper an verschiedene Epitope des nachzuweisenden Liganden binden. Die auf diese Weise verwendeten Antikörper können zwei oder mehrere nachweisbare Markierungen tragen, und sie können zum Beispiel ein FRET-Paar umfassen. Ein Polypeptid-Molekül wird im Sinne der vorliegenden Erfindung „nachgewiesen", wenn das Niveau des nachweisbaren Signals überhaupt oberhalb des Hintergrundniveaus der nachweisbaren Markierung liegt, oder wenn das Niveau der gemessenen Nukleinsäure überhaupt oberhalb des Niveaus liegt, das in einer Kontrollprobe gemessen wird.
Der Ausdruck „nachweisen", wie er hier verwendet wird, bezeichnet ebenso den Nachweis des Vorliegens eines bestimmten Nukleinsäure-Moleküls (zum Beispiel des betreffenden Nukleinsäure-Moleküls) und betrifft ein Verfahren, bei dem das Signal gemessen oder beobachtet wird, das durch eine direkt oder indirekt markierte Sonde eines Nukleinsäure-Moleküls, (das in der Lage ist, mit dem Ziel-Molekül in einer Probe zu hybridisieren), erzeugt wird. Somit ist der Nachweis der als Sonde dienenden Nukleinsäure ein direkter Hinweis auf das Vorliegen und somit auf den Nachweis der Ziel-Nukleinsäure, wie zum Beispiel einer Sequenz, die für ein Marker-Gen kodiert. Falls die nachweisbare Markierung zum Beispiel eine fluoreszierende Markierung darstellt, wird die Ziel-Nukleinsäure nachgewiesen, indem das Licht, das durch die fluoreszierende Markierung auf der als Sonde dienenden Nukleinsäure emittiert wird, beobachtet oder gemessen wird, wenn die Markierung durch eine geeignete Wellenlänge angeregt wird, oder wenn die nachweisbare Markierung ein Fluoreszenz-Quencher-Paar darstellt, wird die Ziel-Nukleinsäure „nachgewiesen", indem das Licht beobachtet oder gemessen wird, das bei der Assoziation oder Dissoziation des auf der als Sonde dienenden Nukleinsäure vorhandenen Fluoreszenz-Quencher-Paares emittiert wird, wobei der Nachweis der als Sonde dienenden Nukleinsäure auf den Nachweis der Ziel-Nukleinsäure hinweist. Falls die nachweisbare Markierung eine radioaktive Markierung darstellt, wird die Ziel-Nukleinsäure nach der Hybridisierung mit einer radioaktiv markierten Sonde „nachgewiesen", zum Beispiel durch Autoradiographie. Die Verfahren und Methoden zum „Nachweis" von fluoreszierenden, radioaktiven oder anderen chemischen Markierungen können gefunden werden in: Ausubel et al., „Short Protocols in Molecular Biology", 3. Ed., John Wiley and Sons, Inc., 1995. In alternativer Weise kann eine Nukleinsäure indirekt „nachgewiesen" werden, wobei eine Gruppe mit einer als Sonde dienenden Nukleinsäure verknüpft wird, die mit der Ziel-Nukleinsäure hybridisieren wird, wie zum Beispiel einer Enzymaktivität, die einen Nachweis in Gegenwart eines geeigneten Substrats ermöglicht, oder mit einem spezifischen Antigen oder einem anderen Marker, der den Nachweis durch Zugabe eines Antikörpers oder eines anderen spezifischen Indikators ermöglicht. In alternativer Weise kann das Ziel-Nukleinsäure-Molekül nachgewiesen werden, indem eine Probe einer Nukleinsäure amplifiziert wird, die aus einer Probe eines Patienten aus einer Klinik gewonnen wurde, wobei Oligonukleotid-Primer verwendet werden, die spezifisch so gestaltet wurden, dass sie mit einem Abschnitt der Ziel-Nukleinsäure-Sequenz hybridisieren. Die Verfahren zur quantitativen Amplifikation, wie zum Beispiel TaqMan, können ebenso dazu verwendet werden, die Ziel-Nukleinsäure gemäß der Erfindung „nachzuweisen"; das Verfahren ist jedoch nicht darauf beschränkt. Ein Nukleinsäure-Molekül wird in dem hier verwendeten Sinn „nachgewiesen", wenn das Niveau der gemessenen Nukleinsäure (wie zum Beispiel durch quantitative PCR), oder das Niveau des nachweisbaren Signals, welches durch die nachweisbare Markierung geliefert wird, überhaupt oberhalb des Hintergrund-Niveaus liegt.
Der Ausdruck „nachweisen", wie er hier verwendet wird, bezeichnet darüber hinaus den Nachweis des Methylierungs-Zustandes oder -Status' auf einem spezifischen CpG-Bereich des Ziel-Nukleinsäure-Moleküls, der als ein Hinweis auf einen Krankheits-Zustand in einer Zelle oder in einem Gewebe dient. Der Methylierungs-Zustand oder -Status auf einem spezifischen CpG-Bereich des Ziel-Nukleinsäure-Moleküls kann eine nützliche Information für die Diagnose, das Überwachen einer Krankheit und für eine therapeutische Vorgehensweise liefern. Zahlreiche Verfahren, die im Stand der Technik bekannt sind, können verwendet werden, um den Methylierungs-Zustand von spezifischen CpG-Dinukleotiden zu bestimmen. Solche Verfahren umfassen das genomische Scannen zur Kartierung durch Verdau (restriction landmark genomic scanning), siehe Kawai et al.: „Comparison of DNA methylation patterns among mouse cell lines by restriction landmark genomic scanning", Mol. Cell Biol. 14 (11): 7421–7427, 1994; die Amplifikation methylierter CpG-Inseln, siehe Toyota et al.: "Identification of differentially methylated sequences in colorectal cancer by methylated CpG island amplification", Cancer Res. 59: 2307–2312, 1999, siehe auch WO 00/26401 A1 ; die differenzielle Methylierungs-Hybridisierung, siehe Huang et al.: "Methylation profiling of CpG islands in human breast cancer cells", Hum. Mol. Genet. 8: 459–470, 1999; die Methylierungs-spezifische PCR (MSP), siehe Herman et al.: „Methylation-specific PCR: a novel PCR assay for methylation status of CpG islands", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 9821–9826, 1992, siehe auch US-Patent Nr. 5 786 146 ; die Verlängerung mit einem Methylierungs-empfindlichen, einzelnen Nukleotid-Primer (Ms-SnuPE), siehe US-Patent Nr. 6 251 594 ; die kombinierte Analyse mit Bisulfit und Verdau (Combined Bisulfite Restriction Analysis; COBRA), siehe Xiong und Laird: „COBRA: a sensitive and quantitative DNA methylation assay", Nucleic Acids Research 25 (12): 2532–2534, 1997; die genomische Sequenzierung unter Berücksichtigung einer Bisulfit-Reaktion, siehe Frommer et al.: „A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methycytosine residues in individual DNA strands", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 1827–1831, 1992; und die Methylierungs-spezifische Primerverlängerung (MSPE) und dergleichen; sie sind jedoch nicht darauf beschränkt.
Der Ausdruck „nachweisen", wie er hier verwendet wird, bezeichnet darüber hinaus einen frühen Nachweis oder eine Prognose oder eine therapeutische Reaktion auf eine Krankheit oder Störung in einem Patienten. Der Ausdruck „nachweisen", wie er hier verwendet wird, bezeichnet den Nachweis des Wiederauftretens einer Krankheit in einem Individuum, wobei die gleichen Nachweiskriterien wie vorstehend angegeben verwendet werden. Der Ausdruck „nachweisen", wie er hier verwendet wird, betrifft darüber hinaus die Messung einer Veränderung im Schweregrad einer Krankheit oder Störung vor und/oder nach der Behandlung mit einer therapeutischen Verbindung. In diesem Fall weist eine Veränderung im Schweregrad von kolorektalem Krebs als Reaktion auf eine therapeutische Verbindung auf die Zunahme oder Abnahme des Methylierungs-Grades von CpG-Bereichen um mindestens 10% als Reaktion auf die Anwesenheit einer therapeutischen Verbindung hin, in Bezug auf den Expressions-Grad in Abwesenheit der therapeutischen Verbindung.
Der Ausdruck „Nukleinsäure", wie er hier verwendet wird, betrifft Polynukleotide, wie zum Beispiel Desoxyribonukleinsäure (DNA), und wenn es geeignet erscheint, eine Ribonukleinsäure (RNA). Der Ausdruck sollte so verstanden werden, als umfasse er – als Äquivalente – sowohl Analoga von RNA als auch von DNA, die aus Nukleotid-Analoga zusammengesetzt sind, und sofern sie für die beschriebene Ausführungsform geeignet erscheinen, einzelsträngige (Sens oder Antisens-Orientierung) oder doppelsträngige Polynukleotide. ESTs, Chromosomen, cDNAs, mRNAs und rRNAs sind repräsentative Beispiele für Moleküle, die als Nukleinsäuren bezeichnet werden können.
Die Ausdrücke „krebsartige Zelle" oder „Krebszelle", wie sie hier verwendet werden, die entweder in der Einzahl oder in der Mehrzahl verwendet werden, bezeichnen Zellen, die eine bösartige Transformation durchgemacht haben, die sie für den Wirtsorganismus pathologisch macht. Eine bösartige Transformation ist ein einzelstufiger oder vielstufiger Vorgang, der zum Teil eine Veränderung des genetischen Aussehens der Zelle und/oder des Genexpressions-Profils beinhaltet. Eine bösartige Transformation kann entweder spontan oder aufgrund eines Ereignisses oder einer Kombination von Ereignissen, wie zum Beispiel durch eine Behandlung mit einem Arzneimittel oder einer Chemikalie, durch Strahlung, durch Fusion mit anderen Zellen, durch eine virale Infektion, oder durch Aktivierung oder Inaktivierung von besonderen Genen auftreten. Eine maligne Transformation kann in vivo oder in vitro auftreten, und sie kann experimentell eingeleitet werden, falls notwendig. Bösartige Zellen können innerhalb der gut definierten Tumormasse gefunden werden, oder sie können an andere physikalische Orte metastasiert sein. Ein Merkmal der Krebszellen ist ihre Neigung, in einer Weise zu wachsen, die durch den Wirt nicht zu kontrollieren ist, jedoch kann die mit einem besonderen Krebs einhergehende Pathologie jede beliebige Form annehmen. Primäre Krebszellen (d.h. Zellen, die aus der Nähe einer Stelle einer bösartigen Transformation gewonnen werden) können leicht von nicht-krebsartigen Zellen anhand von gut eingeführten pathologischen Verfahren unterschieden werden, insbesondere durch histologische Untersuchung. Die Definition einer Krebszelle, wie sie hier verwendet wird, umfasst nicht nur primäre Krebszellen, sondern auch Zellen, die vom Vorläufer einer Krebszelle stammen. Diese umfassen metastasierte Krebszellen, und in vitro Kulturen sowie Zell-Linien, die von Krebszellen stammen.
Der Ausdruck „Oligonukleotid", wie er hier verwendet wird, betrifft ein Molekül, das zwei oder mehrere Desoxyribonukleotide oder Ribonukleotide umfasst, vorzugsweise mindestens fünf Nukleotide, stärker bevorzugt mindestens etwa 10 bis 15 Nukleotide und noch stärker bevorzugt mindestens etwa 15 bis 30 oder mehr Nukleotide. Die exakte Größe wird von vielen Faktoren abhängen, welche wiederum von der schließlichen Funktion oder der Verwendung des Oligonukleotides abhängen. Das Oligonukleotid kann in einer beliebigen Weise hergestellt werden, einschließlich der chemischen Synthese, der DNA-Replikation, der reversen Transkription, durch PCR oder einer Kombination derselben.
Der Ausdruck „isolieren", wie er hier verwendet wird, bezeichnet ein Verfahren, bei dem das Material aus seiner ursprünglichen Umgebung entfernt wird (zum Beispiel die natürliche Umgebung, falls es in der Natur vorkommt). Zum Beispiel ist ein natürlich vorkommendes Polynukleotid oder Polypeptid, das in einem lebenden Tier vorkommt, nicht isoliert, jedoch ist das gleiche Polynukleotid oder die gleiche DNA oder das gleiche Polypeptid, das von einem Teil oder den gesamten koexistierenden Materialien in dem natürlichen System getrennt worden ist, isoliert. Ein solches Polynukleotid könnte ein Teil eines Vektors und/oder ein solches Polynukleotid oder Polypeptid könnte ein Teil einer Zusammensetzung sein, und nach wie vor isoliert in dem Sinn sein, dass der Vektor oder die Zusammensetzung nicht Teil seiner bzw. ihrer natürlichen Umgebung ist. zum Beispiel ist ein natürlich vorkommendes Polynukleotid, das in einem lebenden Tier vorkommt, nicht isoliert; jedoch ist das gleiche Polynukleotid, das von einem Teil oder den gesamten koexistierenden Materialien in dem natürlichen System getrennt worden ist, isoliert. Insbesondere sind folgende Begriffe von der Definition des Begriffes „isoliert" ausgeschlossen: natürlich vorkommende Chromosomen (wie zum Beispiel verteilte Chromosomen (chromosome spreads)), Bibliotheken aus künstlichen Chromosomen, genomische Bibliotheken, und cDNA-Bibliotheken, die entweder als eine Nukleinsäure-Präparation in vitro oder als eine Präparation, die in Wirtszellen transfiziert bzw. transformiert worden ist, vorliegen, wobei die Wirtszellen entweder eine heterogene Präparation in vitro darstellen oder als eine heterogene Population einzelner Kolonien plattiert wurden. Ebenso sind die vorstehenden Bibliotheken spezifisch ausgeschlossen, wobei ein spezifisches Polynukleotid weniger als 5% der Nukleinsäure-Inserts in den Vektor-Molekülen ausmacht. Darüber hinaus sind insbesondere die genomische DNA aus der gesamten Zelle oder RNA-Präparationen aus der gesamten Zelle ausgeschlossen (einschließlich der Präparationen aus ganzen Zellen, welche mechanisch geschert oder enzymatisch verdaut wurden). Darüber hinaus sind spezifisch ausgeschlossen die vorstehend erwähnten Präparationen aus ganzen Zellen, sowohl als eine in vitro Präparation oder als eine heterogene Mischung, die durch Elektrophorese (einschließlich eines Blot-Transfers derselben) aufgetrennt wurden, wobei das Polynukleotid der Erfindung nicht weiter von den heterologen Polynukleotiden in dem Elektrophorese-Medium abgetrennt wurde (zum Beispiel eine Abtrennung durch Ausschneiden einer einzelnen Bande aus einer Population von heterogenen Banden in einem Agarosegel oder in einem Nylon-Blot).
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Bestimmung des Zustandes oder des Status' der DNA-Methylierung von einem spezifischen CpG-Bereich innerhalb der CpG-Inseln bereit. Dieses Verfahren umfasst:

(a) Gewinnen und/oder Verwenden von DNA aus einer zu untersuchenden Probe;
(b) in Kontakt bringen der DNA mit einem Mittel, das nicht-methyliertes Cytosin in Uracil überführt, während es ein 5'-methyliertes Cytosin unverändert belässt;
(c) Amplifizieren der DNA unter Verwendung von strang-spezifischen Primern;
(d) Durchführen einer Primerverlängerungs-Reaktion unter Verwendung von mindestens einem Paar von Primern, die für die methylierungs-spezifische Primerverlängerung (methylation specific primer extension; MSPE) vorgesehen sind und mit dem oberen Strang der amplifizierten DNA hybridisieren, sowie von markierten dNTPs und einer DNA-Polymerase, wobei das 3'-Ende des ersten MSPE-Primers in dem Paar eine Polynukleotid-Sequenz umfasst, die für den oberen Strang der methylierten DNA spezifisch ist, wobei der am nächsten zum 3'-Ende gelegene Abschnitt des Primers mit dem Cytosin-Rest des zu untersuchenden CpG-Bereichs hybridisiert, und wobei das 5'-Ende des ersten MSPE-Primers eine erste einzigartige Sequenz umfasst, die nicht mit irgendwelchen DNA-Sequenzen in der Probe hybridisiert; wobei das 3'-Ende des zweiten MSPE-Primers in dem Paar eine Polynukleotid-Sequenz umfasst, die für den oberen Strang der nicht-methylierten DNA-Sequenz spezifisch ist, wobei der am nächsten zum 3'-Ende gelegene Abschnitt des Primers mit dem Thymin-Rest hybridisiert, der aus dem Cytosin des zu untersuchenden CpG-Bereichs stammt, und wobei das 5'-Ende des zweiten MSPE-Primers eine zweite einzigartige Sequenz umfasst, die nicht mit irgendwelchen DNA-Sequenzen in der Probe hybridisiert;
(e) Hybridisieren der Primerverlängerungs-Produkte aus (d) mit mindestens einem Paar von Oligonukleotiden, wobei das erste Oligonukleotid in dem Paar komplementär zur ersten einzigartigen Sequenz ist, und das zweite Oligonukleotid in dem Paar komplementär zur zweiten einzigartigen Sequenz ist; und
(f) Bestimmen des 5'-Methylierungs-Zustands am Cytosin-Rest des CpG-Bereichs durch Vergleich der Hybridisierungs- Intensität der methylierten DNA mit der Hybridisierungs-Intensität der nicht-methylierten DNA in der Probe.

(a) Gewinnen und/oder Verwenden von DNA aus einer zu untersuchenden Probe;
(b) in Kontakt bringen der DNA mit einem Mittel, das nicht-methyliertes Cytosin in Uracil überführt, während es ein 5'-methyliertes Cytosin unverändert belässt;
(c) Amplifizieren der DNA unter Verwendung von strang-spezifischen Primern;
(d) Durchführen einer Primerverlängerungs-Reaktion unter Verwendung von mindestens einem Paar von MSPE-Primern, die mit dem unteren Strang der amplifizierten DNA hybridisieren, sowie von markierten dNTPs und einer DNA-Polymerase, wobei das 3'-Ende des ersten MSPE-Primers in dem Paar eine Polynukleotid-Sequenz umfasst, die für den unteren Strang der methylierten DNA spezifisch ist, wobei der am nächsten zum 3'-Ende gelegene Abschnitt des Primers mit dem Guanin-Rest hybridisiert, der zu dem Cytosin des CpG-Bereichs auf dem oberen Strang komplementär ist, und wobei das 5'-Ende des ersten MSPE-Primers eine erste einzigartige Sequenz umfasst, die nicht mit irgendwelchen DNA-Sequenzen in der Probe hybridisiert; wobei das 3'-Ende des zweiten MSPE-Primers in dem Paar eine Polynukleotid-Sequenz umfasst, die für den unteren Strang der nicht-methylierten DNA-Sequenz spezifisch ist, wobei der am nächsten zum 3'-Ende gelegene Abschnitt des Primers mit dem Adenin-Rest hybridisiert, der von dem Cytosin des CpG-Bereichs auf dem obe ren Strang stammt, und wobei das 5'-Ende des zweiten MSPE-Primers eine zweite einzigartige Sequenz umfasst, die nicht mit irgendwelchen DNA-Sequenzen in der Probe hybridisiert;
(e) Hybridisieren der Primerverlängerungs-Produkte aus (d) mit mindestens einem Paar von Oligonukleotiden, wobei das erste Oligonukleotid in dem Paar komplementär zur ersten einzigartigen Sequenz ist, und das zweite Oligonukleotid in dem Paar komplementär zur zweiten einzigartigen Sequenz ist; und
(f) Bestimmen des 5'-Methylierungs-Zustands am Cytosin-Rest des CpG-Bereichs durch Vergleich der Hybridisierungs-Intensität der methylierten DNA mit der Hybridisierungs-Intensität der nicht-methylierten DNA in der Probe.

(a) Gewinnen und/oder Verwenden von DNA aus einer zu untersuchenden Probe;
(b) in Kontakt bringen der DNA mit einem Mittel, das nicht-methyliertes Cytosin in Uracil überführt, während es ein 5'-methyliertes Cytosin unverändert belässt;
(c) Amplifizieren der DNA unter Verwendung von strang-spezifischen Primern;
(d) Durchführen einer Primerverlängerungs-Reaktion unter Verwendung von mindestens einem Paar von MSPE-Primern, die mit dem oberen Strang der amplifizierten DNA hybridisieren, sowie von mindestens einem markierten Reverse-Primer, dNTPs und einer DNA-Polymerase, wobei das 5'-Ende des ersten MSPE-Primers in dem Paar eine erste einzigartige Sequenz umfasst, die nicht mit irgendwelchen DNA-Sequenzen in der Probe hybridisiert, und wobei das 3'-Ende des ersten MSPE-Primers eine Polynukleotid-Sequenz umfasst, die für den oberen Strang der methylierten DNA-Sequenz spezifisch ist, wobei der am nächsten zum 3'-Ende gelegene Abschnitt des Primers mit dem Cytosin-Rest des zu untersuchenden CpG-Bereichs hybridisiert; wobei das 5'-Ende des zweiten MSPE-Primers in dem Paar eine zweite einzigartige Sequenz umfasst, die nicht mit irgendwelchen DNA-Sequenzen in der Probe hybridisiert, und wobei das 3'-Ende des zweiten MSPE-Primers in dem Paar eine Polynukleotid-Sequenz umfasst, die für den oberen Strang der nicht-methylierten DNA spezifisch ist, und wobei der am nächsten zum 3'-Ende gelegene Abschnitt des Primers mit dem Thymin-Rest hybridisiert, welcher von dem Cytosin des zu untersuchenden CpG-Bereichs stammt;
(e) Hybridisieren der Primerverlängerungs-Produkte aus (d) mit mindestens einem Paar von Oligonukleotiden, wobei das erste Oligonukleotid in dem Paar das gleiche ist wie die erste einzigartige Sequenz, und das zweite Oligonukleotid in dem Paar das gleiche ist wie die zweite einzigartige Sequenz; und
(f) Bestimmen des 5'-Methylierungs-Zustands am Cytosin-Rest des CpG-Bereichs durch Vergleich der Hybridisierungs- Intensität der methylierten DNA mit der Hybridisierungs-Intensität der nicht-methylierten DNA in der Probe.

(a) Gewinnen und/oder Verwenden von DNA aus einer zu untersuchenden Probe;
(b) in Kontakt bringen der DNA mit einem Mittel, das nicht-methyliertes Cytosin in Uracil überführt, während es ein 5'-methyliertes Cytosin unverändert belässt;
(c) Amplifizieren der DNA unter Verwendung von strang-spezifischen Primern;
(d) Durchführen einer Primerverlängerungs-Reaktion unter Verwendung von mindestens einem Paar von MSPE-Primern, die mit dem unteren Strang der amplifizierten DNA hybridisieren, sowie von mindestens einem markierten Reverse-Primer, dNTPs, und einer DNA-Polymerase, wobei das 5'-Ende des ersten MSPE-Primers in dem Paar eine erste einzigartige Sequenz umfasst, die nicht mit irgendwelchen DNA-Sequenzen in der Probe hybridisiert, und wobei das 3'-Ende des ersten MSPE-Primers eine Polynukleotid-Sequenz umfasst, die für den unteren Strang der methylierten DNA-Sequenz spezifisch ist, wobei der am nächsten zum 3'-Ende gelegene Abschnitt des Primers mit dem Guanin-Rest hybridisiert, welcher komplementär zu dem Cytosin des CpG-Bereichs auf dem oberen Strang ist; wobei das 5'-Ende des zweiten MSPE-Primers in dem Paar eine zweite einzigartige Sequenz umfasst, die nicht mit irgendwelchen DNA-Sequenzen in der Probe hybridisiert, und wobei das 3'-Ende des zweiten MSPE-Primers in dem Paar eine Polynukleotid-Sequenz umfasst, die für den unteren Strang der nicht-methylierten DNA spezifisch ist, und wobei der am nächsten zum 3'-Ende gelegene Abschnitt des Primers mit dem Adenin-Rest hybridisiert, welcher von dem Cytosin des CpG-Bereichs auf dem oberen Strang stammt;
(e) Hybridisieren der Primerverlängerungs-Produkte aus (d) mit mindestens einem Paar von Oligonukleotiden, wobei das erste Oligonukleotid in dem Paar das gleiche ist wie die erste einzigartige Sequenz, und das zweite Oligonukleotid in dem Paar das gleiche ist wie die zweite einzigartige Sequenz; und
(f) Bestimmen des 5'-Methylierungs-Zustands am Cytosin-Rest des CpG-Bereichs durch Vergleich der Hybridisierungs-Intensität der methylierten DNA mit der Hybridisierungs-Intensität der nicht-methylierten DNA in der Probe.

Jede Nukleinsäure-Probe, sei es in gereinigter oder nicht gereinigter Form, kann in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden, mit der Maßgabe, dass sie eine Nukleinsäure-Sequenz enthält oder zu enthalten verdächtigt wird, welche die CpG enthaltenden Nukleinsäuren enthält. In vielen Genen beginnen die CpG-Inseln genau stromaufwärts von einem Promotor und erstrecken sich stromabwärts in den transkribierten Bereich. Die Methylierung einer CpG-Insel an einem Promotor verhindert üblicherweise die Expression des Gens. Die Insel kann ebenso den 5'-Abschnitt des kodierenden Abschnitts des Gens sowie den 3'-Abschnitt des kodierenden Abschnitts umgeben. Somit können CpG-Inseln in vielen verschiedenen Abschnitten einer Nukleinsäure-Sequenz gefunden werden, einschließlich stromaufwärts von kodierenden Sequenzen in einem regulatorischen Bereich, einschließlich einem Promotor-Bereich, in den kodierenden Abschnitten (zum Beispiel Exons), stromabwärts von kodierenden Abschnitten, zum Beispiel in Verstärker-Bereichen, und in Introns. Im Allgemeinen ist die CpG enthaltende Nukleinsäure eine DNA. Jedoch können die erfindungsgemäßen Verfahren zum Beispiel Proben verwenden, die DNA oder DNA und RNA enthalten, einschließlich Boten-RNA (messenger RNA), wobei DNA oder RNA einzelsträngig oder doppelsträngig sein können, oder ein DNA-RNA-Hybrid kann in der Probe enthalten sein. Eine Mischung von Nukleinsäuren kann ebenso verwendet werden. Die spezifische nachzuweisende Nukleinsäure-Sequenz kann eine Fraktion aus einem größeren Molekül sein, oder sie kann anfänglich als ein eigenständiges Molekül vorliegen, so dass die spezifische Sequenz die gesamte Nukleinsäure ausmacht. Es ist nicht notwendig, dass die zu untersuchende Sequenz anfänglich in reiner Form vorliegt; die Nukleinsäure kann ein geringer Bruchteil einer komplexen Mischung sein, wie sie zum Beispiel in der gesamten menschlichen DNA enthalten ist. Die Nukleinsäuren können in der Natur vorkommen, oder sie können nicht in der Natur vorkommen. Darüber hinaus kann ihr Methylierungs-Zustand das Ergebnis eines in vivo Prozesses sein, oder das Ergebnis experimenteller Manipulationen (zum Beispiel absichtliche Aussetzung gegenüber einem Mittel, das vermeintlich die DNA schädigt, oder einem vermeintlichen Methylierungs-Mittel). In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Nukleinsäuren in der Probe genomische DNA.
Die Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäuren sind im Stand der Technik gut bekannt, und geeignete Verfahren können in Standard-Textbüchern über Molekularbiologie gefunden werden.
Die DNA enthaltende Probe für den Nachweis von methyliertem CpG kann aus einer beliebigen Quelle erhalten werden. Vorzugsweise kann die Probe aus Zell-Linien, Blut, Auswurf, Stuhl, Harn, Serum, cerebrospinaler Flüssigkeit, Haaren, und aus in Paraffin eingebettetem Gewebe erhalten werden, zum Beispiel aus dem Gewebe der Augen, des Magen-Darm-Traktes, der Nieren, des Gehirns, des Herzens, der Prostata, der Lunge, der Brüste oder Leber, aus histologischen Schnitten und allen möglichen Kombinationen derselben.
Gemäß der vorliegenden Erfindung ist es bevorzugt, dass das Mittel, welches zur Umsetzung des nicht-methylierten Cytosins in Uracil verwendet wird, eine Bisulfit-Verbindung ist. Vorzugsweise ist das Mittel, das zur Modifikation von nicht-methyliertem Cytosin verwendet wird, Natriumbisulfit. Jedoch können andere Mittel, die in ähnlicher Weise nicht-methyliertes Cytosin, nicht jedoch methyliertes Cytosin modifizieren, ebenso in den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Bisulfit (NaHSO₃) reagiert bereitwillig mit der 5,6-Doppelbindung von Cytosin, jedoch schlecht mit methyliertem Cytosin. Cytosin reagiert mit dem Bisulfit-Ion, um ein Reaktions-Zwischenprodukt eines sulfonierten Cytosins zu bilden, welches für die Deamination empfänglich ist, so dass es zur Bildung von sulfoniertem Uracil kommt. Die Sulfonat-Gruppe kann unter alkalischen Bedingungen entfernt werden, so dass es zur Bildung von Uracil kommt. Das Uracil wird von der Taq-Polymerase wie ein Thymin erkannt, und daher enthält das erhaltene, amplifizierte Produkt während der PCR-Reaktion Cytosin nur an denjenigen Positionen, an denen 5-Methylcytosin in der ursprünglichen Templat-DNA auftritt.
In Schritt (c) der Verfahren der vorliegenden Erfindung können verschiedene Verfahren, die im Stand der Technik bekannt sind, verwendet werden, um die Nukleinsäuren zu amplifizieren. Die Amplifikations-Verfahren, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, umfassen PCR und LCR und dergleichen; sie sind jedoch nicht darauf beschränkt. Darüber hinaus sind andere Amplifikations-Verfahren, die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, die isothermale Amplifikation, die Primerverlängerungs-Reaktionen, die „rolling-circle" Amplifikation und alle anderen Amplifikations-Reaktionen, die dem Fachmann bekannt sind.
Die PCR oder Polymerase-Ketten-Reaktion, wie sie in den US-Patenten Nr. 4 683 195 und 4 683 202 beschrieben ist, ist ein Verfahren zur Steigerung der Konzentration eines Segments einer bestimmten Ziel-Nukleinsäure-Sequenz in einer Mischung von Nukleinsäuren ohne Klonierung oder Reinigung. Dieses Verfahren stellt eine Möglichkeit zur Bewältigung der Probleme dar, die mit einer geringen Konzentration der Ziel-Sequenz einhergehen. Die PCR kann verwendet werden, um die Konzentration der Ziel-Sequenz bis zu einem leicht nachweisbaren Grad zu steigern. Dieses Verfahren zur Amplifikation der Ziel-Sequenz beinhaltet das Einführen eines molaren Überschusses von zwei Oligonukleotid-Primern, die zu ihren jeweiligen Strängen der doppelsträngigen Zielsequenz in der DNA-Mischung komplementär sind, welche die gewünschte Zielsequenz enthält. Die Mischung wird denaturiert, und anschließend lässt man Hybridisieren. Nach der Hybridisierung werden die Primer mit Polymerase verlängert, um so die komplementären Stränge zu bilden. Die Schritte der Denaturierung, Hybridisierung und der Verlängerung durch Polymerase können so oft wie nötig wiederholt werden, um verhältnismäßig hohe Konzentrationen eines Segments der gewünschten Ziel-Sequenz zu erhalten. Die Länge des Segments der gewünschten Ziel-Sequenz wird durch die relativen Positionen der Primer in Bezug aufeinander bestimmt, und somit ist diese Länge ein kontrollierbarer Parameter. Da die gewünschten Segmente der Ziel-Sequenz zu den dominierenden Sequenzen in der Mischung werden (in Bezug auf die Konzentration), so spricht man davon, sie seien „PCR-amplifiziert".
Die Ligase-Kettenreaktion (LCR; manchmal auch als „Ligase-Amplifikations-Reaktion" (LAR) bezeichnet und beschrieben von Barany, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 189, 1991; Barany, PCR Methods and Applic. 1: 5, 1991; Wu und Wallace, Genomics 4: 560, 1989) hat sich zu einem gut anerkannten, alternativen Verfahren zur Amplifikation von Nukleinsäuren entwickelt. In der LCR werden vier Oligonukleotide, davon zwei benachbarte Oligonukleotide, die in einzigartiger Weise mit einem Strang der Ziel-DNA hybridisieren, und ein komplementärer Satz von benachbarten Oligonukleotiden, die mit dem gegenüberliegenden Strang hybridisieren, gemischt, und DNA-Ligase wird zu der Mischung gegeben. Unter der Voraussetzung, dass es eine vollständige Komplementarität an der Verknüpfungsstelle gibt, wird die Ligase jeden Satz von hybridisierten Molekülen kovalent verknüpfen. Es ist wichtig, dass in der LCR zwei Sonden nur miteinander ligiert werden, wenn sie eine Basenpaarung mit den Sequenzen in der Ziel-Probe ohne Lücken oder Fehlpaarungen eingehen. Wiederholte Zyklen der Denaturierung, Hybridisierung und Ligation amplifizieren ein kurzes Segment der DNA. Die LCR wurde ebenso in Verbindung mit der PCR verwendet, um einen verbesserten Nachweis von Veränderungen einer einzelnen Base zu erzielen (Segev, PCT Veröffentlichungs-Nr. WO 90/01069 A1 , 1990). Da jedoch vier Oligonukleotide, die in diesem Assay verwendet werden, sich paarweise anordnen können, um zwei kurze, ligierbare Fragmente zu bilden, besteht die Möglichkeit, dass ein Ziel-unabhängiges Hintergrundsignal erzeugt wird. Die Verwendung der LCR zum Screening von Mutanten ist auf die Überprüfung spezifischer Nukleinsäure-Positionen begrenzt.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die PCR verwendet, um chemisch behandelte Nukleinsäuren zu amplifizieren. Die PCR-Amplifikation kann anhand von Standardprotokollen durchgeführt werden. Zum Beispiel werden annähernd 1–2 μl der chemisch behandelten DNA als ein Templat für eine Strang-spezifische PCR-Amplifikation in dem betreffenden Bereich verwendet. In einem PCR-Reaktionsprofil zur Amplifikation eines Abschnitts einer 5'-CpG-Insel kann zum Beispiel ein Verfahren mit einer anfänglichen Denaturierung von 94–95°C für 3–10 Minuten durchgeführt werden, gefolgt von einem Zyklus von 94–95°C von 30 Sekunden, 60°C für 30 Sekunden, 72°C für 30 Sekunden, für insgesamt 30–40 Zyklen. Die PCR-Reaktionen werden in Volumina von 10–50 μl unter folgenden Bedingungen durchgeführt: etwa 50 ng mit Bisulfit umgesetzte DNA (weniger für Mikro-präparierte Proben), 10 mM Tris-HCl, pH 8,3, 1,5–2,5 mM MgCl₂, 50 mM KCl, 200 μM von jedem dNTP, 0,4 μM Endkonzentration eines jeden Primers, und 1 Einheit Taq-Polymerase.
In einer Ausführungsform wird die PCR-Amplifikation mit mindestens einem Paar von PCR-Primern durchgeführt. Die PCR-Pri mer, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, sollten sowohl methylierte als auch nicht-methylierte DNA-Template erkennen. Mit anderen Worten sollten die PCR-Primer so gestaltet werden, dass sie an Bereiche hybridisieren, die keine methylierten CpG-Bereiche enthalten, falls möglich. Die zwei PCR-Primer sollten sich jedoch über die CpG-Bereiche erstrecken. Gemäß der vorliegenden Erfindung sind die PCR-Primer vorzugsweise einzelsträngig, um eine maximale Wirksamkeit bei der Amplifikation zu erreichen. Vorzugsweise sind die PCR-Primer einzelsträngige DNA- oder RNA-Moleküle, die mit einer als Templat dienenden Nukleinsäure-Sequenz hybridisieren und die enzymatische Synthese des komplementären Nukleinsäure-Stranges anstoßen. Darüber hinaus sind die PCR-Primer komplementär zu einem Abschnitt des Zielmoleküls, das in einer Mischung von Nukleinsäure-Molekülen vorhanden ist.
Die PCR-Primer der vorliegenden Erfindung sollten eine ausreichende Länge besitzen. In einer Ausführungsform können die PCR-Primer eine Sequenz umfassen, die unter stringenten Bedingungen mit mindestens etwa 7, bevorzugt mit etwa 12, bevorzugt mit etwa 15, stärker bevorzugt mit etwa 25, 50, 75, 100 oder mehr Nukleotiden, in idealer Weise mit etwa 17 bis 40 Nukleotiden hybridisiert. Der Ausdruck „hybridisiert unter stringenten Bedingungen", wie er hier verwendet wird, soll die Bedingungen für die Hybridisierung und das Waschen beschreiben, unter denen Nukleotid-Sequenzen, die zu mindestens 75%, 80%, 85%, vorzugsweise zu 90% miteinander identisch sind, typischerweise miteinander im hybridisierten Zustand verbleiben. Solche stringenten Bedingungen sind dem Fachmann bekannt, und können in den Abschnitten 6.3.1–6.3.6 von _"Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, NY, 1989 gefunden werden. In einer anderen Ausführungsform kann der PCR-Primer eine Sequenz umfassen, die unter gemäßigt stringenten Bedingungen mit mindestens etwa 7, bevorzugt mit etwa 12, bevorzugt mit etwa 15, stärker bevorzugt mit etwa 25, 50, 75, 100 oder mehr Nukleotiden hybridisiert. Für Zwecke der Erläuterung umfassen geeignete, mäßig stringente Bedingungen zum Testen der Hybridisierung eines Polynukleotids dieser Erfindung mit anderen Polynukleotiden das Vorwaschen in einer Lösung von 5 × SSC, 0,5% SDS, 1,0 mM EDTA, (pH 8,0); das Hybridisieren bei 50°C bis 60°C, 5 × SSC über Nacht; gefolgt von einem zweimaligen Waschen bei 65°C für 20 Minuten mit jeweils 2 × SSC, 0,5 × SSC und 0,2 × SSC, der 0,1% SDS enthält. Ein Fachmann wird verstehen, dass die Stringenz der Hybridisierung leicht manipuliert werden kann, wie zum Beispiel durch Veränderung des Salzgehalts der Hybridisierungs-Lösung und/oder der Temperatur, bei der die Hybridisierung durchgeführt wird.
Eine positive wechselseitige Beziehung gibt es zwischen der Primerlänge und sowohl der Effizienz als auch der Genauigkeit, mit der ein Primer mit der Ziel-Sequenz hybridisieren wird. Insbesondere besitzen längere Sequenzen eine höhere Schmelztemperatur (Tm) als kürzere Sequenzen, und sie neigen weniger dazu, sich in einer gegebenen Zielsequenz zu wiederholen, so dass sie dadurch eine wahllose Hybridisierung minimieren. Die Primer-Sequenzen mit einem hohen G-C-Gehalt oder jene, die palindromische Sequenzen umfassen, neigen zur Selbsthybridisierung wie auch ihre vorgesehenen Zielbereiche, da eine unimolekulare Hybridisierungs-Kinetik im Allgemeinen in Lösung bevorzugt ist, im Vergleich mit einer bimolekularen Kinetik. Jedoch ist es ebenso wichtig, einen Primer zu entwerfen, der eine ausreichende Zahl von G-C-Nukleotid-Paaren enthält, da jedes G-C-Paar durch drei Wasserstoffbrücken-Bindungen gebunden wird, im Vergleich mit zwei Wasserstoffbrücken-Bindungen, die in einem A-T-Basenpaar gefunden werden.
Die PCR-Primer der vorliegenden Erfindung werden auch so gestaltet, dass sie eine bestimmte Schmelztemperatur (Tm) gemäß dem Verfahren zur Abschätzung der Schmelztemperatur aufweisen. Im Handel erhältliche Programme, einschließlich Oligo^TM, Primer Design und Programme, die über das Internet verfügbar sind, einschließlich Primer 3 und Oligo Calculator, können dazu verwendet werden, um die Schmelztemperatur eines Primers zu berechnen. Vorzugsweise liegt die Schmelztemperatur eines PCR-Primers bevorzugt zwischen etwa 45°C und 70°C, und stärker bevorzugt zwischen etwa 55°C und 65°C. Vorzugsweise ist die Schmelztemperatur eines Primers etwa 3–5°C höher als die Schmelztemperatur der entsprechenden PCR-Primer.
Es wird davon ausgegangen, dass die PCR-Primer der vorliegenden Erfindung durch synthetische Verfahren, entweder chemisch oder enzymatisch, hergestellt werden. In alternativer Weise kommen solche Moleküle oder Fragmente derselben in der Natur vor, und sie werden aus ihrer natürlichen Quelle isoliert oder von einem kommerziellen Lieferanten gekauft.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung in einem Gefäß viele verschiedene Paare von Primern bereit, die jeweils mit einem definierten CpG-Bereich innerhalb eines Nukleinsäure-Moleküls hybridisieren. Die vielen verschiedenen Paare von Primern erlauben die gleichzeitige Amplifikation von unterschiedlichen CpG-Bereichen in einem Gefäß und ergeben viele verschiedene amplifizierte Nukleinsäure-Fragmente. Die vielen verschiedenen amplifizierten Nukleinsäure-Fragmente können anschließend nachgewiesen und nach Art eines hohen Durchsatzes quantitativ bestimmt werden.
Die amplifizierten Nukleinsäuren werden vorzugsweise entweder im methylierten oder im nicht-methylierten Zustand durch eine Methylierungs-spezifische Primer-Verlängerungsreaktion (MSPE) identifiziert. Die Primer-Verlängerungsreaktion wird unter Verwendung von Standardverfahren durchgeführt, die im Stand der Technik bekannt sind, jedoch mit MSPE-Primern. Zum Beispiel werden in einer Ausführungsform die MSPE-Reaktionen bei 95°C für 10 Minuten durchgeführt, gefolgt von 95°C für 30 Sekunden, 60°C für 30 Sekunden, und 72°C für 30 Sekunden, für 30–40 Zyklen. In dem Schritt, indem die MSPE-Reaktionen mit den amplifizierten Nukleinsäuren durchgeführt werden, wird ein Satz von MSPE-Primern entweder getrennt in verschiedenen Gefäßen oder gleichzeitig in einem Gefäß verwendet. Im Allgemeinen werden MSPE-Primer, die in der Primer-Verlängerungs- Reaktion verlängert werden, so gestaltet, dass sie mit denjenigen Sequenzen hybridisieren, die ursprünglich die zu untersuchenden CpG-Dinukleotide enthalten. Die Auswahl und die Gestaltung der MSPE-Primer für die optimale Verlängerungsreaktion sind einem durchschnittlichen Fachmann auf dem Gebiet des Standes der Technik gut vertraut. Vorzugsweise umfassen die MSPE-Primer Sequenzen, die unter stringenten Bedingungen mit mindestens etwa 7, bevorzugt mit etwa 12, stärker bevorzugt mit etwa 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200 oder mehr aufeinander folgenden Nukleinsäure-Sequenzen hybridisieren.
Man geht davon aus, dass die vorliegende Erfindung mehr als eine Klasse von MSPE-Primern umfassen sollte. Zur Analyse von einem definierten CpG-Bereich werden vorzugsweise mindestens zwei Klassen von MSPE-Primern in der Verlängerungsreaktion enthalten sein. Zum Beispiel ist eine Klasse eines MSPE-Primers spezifisch für den methylierten Zustand und hybridisiert mit dem methylierten CpG-Bereich (CpG-Bereichen), und die andere Klasse von MSPE-Primern ist spezifisch für den nicht-methylierten Zustand und hybridisiert mit dem nicht-methylierten CpG-Bereich (den Bereichen) der amplifizierten Nukleinsäuren. Jede Klasse von MSPE-Primern besteht aus zwei Hälften. Der Abschnitt am 5'-Ende hybridisiert mit einer einzigartigen Sequenz bzw. einer Adaptersequenz, die nicht mit irgendeiner der amplifizierten Nukleinsäuren hybridisiert, und der Abschnitt am 3'-Ende hybridisiert mit dem zu untersuchenden CpG-Bereich (den Bereichen) auf den amplifizierten Nukleinsäuren. In einer Ausführungsform hybridisiert der am nächsten zum 3'-Ende gelegene Abschnitt des MSPE-Primers mit dem zu untersuchenden CpG-Bereich (den Bereichen). Der Ausdruck „am nächsten zum 3'-Ende gelegen", wie er hier verwendet wird, bezeichnet die letzten wenigen Nukleotide am 3'-Ende des MSPE-Primers, vorzugsweise die letzten vier Nukleotide, stärker bevorzugt die letzten beiden Nukleotide, und am meisten bevorzugt das letzte Nukleotid, wobei das letzte Nukleotid des MSPE-Primers an der Cytosin-Position des zu untersuchenden CpG-Bereichs (der Bereiche) hybridisiert. Zum Beispiel hybridi siert das letzte Nukleotid in einem MSPE-Primer, der für den methylierten Zustand spezfisch ist, mit dem Cytosin eines CpG-Bereichs auf dem oberen Strang oder mit dem Guanin auf dem unteren Strang, während in einem MSPE-Primer, der für den nicht-methylierten Zustand spezifisch ist, das letzte Nukleotid mit dem Thymin von TpG auf dem oberen Strang oder mit dem Adenin auf dem unteren Strang hybridisiert, da nicht-methyliertes Cytosin des CpG-Bereichs zu Uracil umgesetzt und als Thymin amplifiziert wurde.
Die einzigartige Sequenz bzw. Adaptersequenz (manchmal im Stand der Technik als „Zipcode" bezeichnet) ist eine Sequenz, die im Allgemeinen außerhalb der Zielsequenzen liegt, d.h. eine künstliche Sequenz, die so gestaltet ist, dass sie im Wesentlichen komplementär (und vorzugsweise vollständig komplementär) zu einer Fangsonde auf der Nachweisvorrichtung ist. Insbesondere wird die Fangsonde auf einem festen Träger immobilisiert, der Mikrokügelchen oder planare Substrate, wie zum Beispiel Plastik- oder Glasplättchen, umfassen kann. Die Länge der Adaptersequenz wird in Abhängigkeit von der gewünschten „Stärke" der Bindung und der Zahl der gewünschten unterschiedlichen Adapter abhängen. In einer bevorzugten Ausführungsform liegt die Länge der Adaptersequenz in einem Bereich von etwa 6 bis etwa 500 Nukleotiden, stärker bevorzugt von etwa 8 bis etwa 100 Nukleotiden, und am meisten bevorzugt von etwa 10 bis etwa 25 Nukleotiden. Im Allgemeinen identifiziert jede Adaptersequenz in einzigartiger Weise ein amplifiziertes Nukleinsäure-Fragment. Der Nachweis dieser Adaptersequenz wird nach erfolgter Hybridisierung mit einer Fangsonde bewerkstelligt, die komplementär zur Adaptersequenz ist.
In einer Ausführungsform wird die Primerverlängerungs-Reaktion durch Verwendung von MSPE-Primern, die mit dem oberen Strang der amplifizierten DNA hybridisieren, und durch Verwendung von markierten dNTPs durchgeführt, wobei dATP, dTTP und dCTP markiert sind. In einer anderen Ausführungsform wird die Primerverlängerungs-Reaktion durch Verwendung von MSPE-Primern, die mit dem unteren Strang der amplifizierten DNA hybridisieren, sowie durch Verwendung von markierten dNTPs durchgeführt, wobei dATP, dTTP und dGTP markiert sind.
In einer anderen Ausführungsform wird die Primerverlängerungs-Reaktion durch Verwendung von MSPE-Primern, die mit dem oberen Strang der amplifizierten DNA hybridisieren, sowie durch Verwendung von markiertem ddCTP durchgeführt. In einer anderen Ausführungsform wird die Primerverlängerungs-Reaktion durch Verwendung von MSPE-Primern, die mit dem oberen Strang der amplfizierten DNA hybridisieren, sowie durch Verwendung einer Mischung von markierten dNTPs und ddNTPs und einer Mischung von nicht-markierten dNTPs und ddNTPs durchgeführt. In einer anderen Ausführungsform wird die Primerverlängerungs-Reaktion durch Verwendung von MSPE-Primern, die mit dem unteren Strang der amplifizierten DNA hybridisieren, sowie durch Verwendung von gemischten markierten und nicht-markierten dNTPs und ddNTPs durchgeführt.
In einer anderen Ausführungsform wird in alternativer Weise die Primerverlängerungs-Reaktion durch Verwendung von MSPE-Primern, die mit dem oberen Strang der amplifizierten DNA hybridisieren, den markierten Reverse-Primern und den nicht-markierten dNTPs durchgeführt. Der Ausdruck „Revers-Primer", wie er hier verwendet wird, bezeichnet einen Primer, der komplementär zu dem Strang ist, der durch die MSPE-Primer verlängert wird. Die markierten Revers-Primer werden sich in die entgegengesetzte Richtung zu dem MSPE-Primer erstrecken, wobei der MSPE-Verlängerungsstrang als Templat verwendet wird, und sie werden am 5'-Ende der MSPE-Primer stoppen. In einer anderen Ausführungsform wird die Primerverlängerungs-Reaktion durch Verwendung von MSPE-Primern, die mit dem unteren Strang der amplifizierten DNA hybridisieren, von markierten Revers-Primern und von nicht-markierten dNTPs durchgeführt.
Die dNTPs, ddNTPs oder Revers-Primer, die in die Verlängerungs-Produkte eingebaut werden, können mit einer nachweis baren Markierung markiert werden. Die nachweisbare Markierung kann eine radioaktive Markierung, eine fluoreszierende Markierung, eine lumineszierende Markierung, einen Antikörper, der mit einem Nukleotid verbunden ist, das nachgewiesen werden kann, ein Hapten, das mit einem Nukleotid verbunden ist, das nachfolgend nachgewiesen werden kann, oder irgendein anderes Nukleotid oder modifiziertes Nukleotid umfassen, das entweder direkt oder indirekt nachgewiesen werden kann. In einer Ausführungsform werden dNTPs, ddNTPs oder Reverse-Primer mit radioaktiven Isotopen markiert. Das radioaktiv markierte Verlängerungs-Produkt kann durch das Vorliegen der Radioaktivität nachgewiesen werden. Zum Beispiel können dNTPs, ddNTPs oder Reverse-Primer mit ³²P markiert werden, und das Verlängerungs-Produkt kann durch ein denaturierendes Polyacrylamid-Gel und Phosphor-Bildanalyse analysiert werden. In einer anderen Ausführungsform werden dNTPs, ddNTPs oder Reverse-Primer mit fluoreszierenden Mitteln markiert. In einer bevorzugten Ausführungsform werden dNTPs, ddNTPs oder Reverse-Primer mit Cyanin 3, Cyanin 5, Phycoerythrin, Alexa 532, Fluorescein, TAMRA, Tetramethylrhodamin, fluoreszierenden Nukleotiden, Digoxigenin oder dergleichen markiert. In einer weiteren, stärker bevorzugten Ausführungsform werden die dNTPs, ddNTPs oder Reverse-Primer mit Biotin markiert. Wenn Biotin für die Markierung verwendet wird, kann das Verlängerungs-Produkt durch Mikrokügelchen, an denen eine Fangsonde angebracht ist, abgefangen und durch Fluoreszenzverfahren quantitativ bestimmt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die nachweisbare Markierung eine Primärmarkierung, die direkt nachgewiesen werden kann, wie zum Beispiel ein Fluorophor. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist die nachweisbare Markierung eine Sekundärmarkierung, die indirekt nachgewiesen werden kann. Eine solche Markierung umfasst eines der folgenden Bindungspaare, wie zum Beispiel Biotin/Streptavidin, chemisch modifizierbare Gruppen, Nuklease-Inhibitoren, Enzyme, wie zum Beispiel Meerrettich-Peroxidase, alkalische Phosphatase, Lucife rasen und dergleichen; sie sind jedoch nicht darauf beschränkt. Geeignete Bindungspaare umfassen Antigene und Antikörper, Proteine und kleine Moleküle, Enzyme und Substrate oder Inhibitoren, Rezeptoren und Liganden, Kohlenhydrate und ihre Bindungspartner, sowie Nukleinsäuren und Nukleinsäure bindende Proteine, und dergleichen; sie sind jedoch nicht darauf beschränkt. Im Allgemeinen ist das kleinere Element des Bindungspaares mit den NTPs oder dNTPs zum Einbau in die Nukleinsäuren verknüpft. Vorzugsweise umfassen die Bindungspaare Biotin (oder Imino-Biotin) und Streptavidin, Digoxigenin und Antikörper, und „Prolinx"-Reagenzien. Stärker bevorzugt umfassen die Bindungspaare Biotin oder Imino-Biotin und Streptavidin.
Das MSPE-Verlängerungs-Produkt wird darüber hinaus zur relativen quantitativen Bestimmung der Methylierung des Cytosins in einer Probe analysiert. Die quantitative Bestimmung umfasst zunächst die Hybridisierung des MSPE-Verlängerungs-Produkts mit Fangsonden, die komplementär zu den Adapter-Sequenzen auf dem MSPE-Verlängerungs-Produkt sind. Verschiedene Hybridisierungs-Verfahren sind gut im Stand der Technik bekannt, und die vorliegende Erfindung ist nicht auf irgendein bestimmtes Hybridisierungs-Verfahren beschränkt. Im Allgemeinen wird die Hybridisierung üblicherweise in Lösungen von hoher Ionenstärke (6 × SSC oder 6 × SSPE) bei einer Temperatur von 20–25°C unterhalb der Schmelztemperatur durchgeführt. Konkrete Beispiele für stringente Hybridisierungs-Bedingungen umfassen 5 × SSPE, 50% Formamid bei 42°C oder 5 × SSPE bei 68°C. Stringente Waschbedingungen werden häufig in vorläufigen Experimenten empirisch bestimmt, sie beinhalten üblicherweise jedoch eine Kombination einer Salzkonzentration und einer Temperatur, die annähernd 12–25°C unterhalb der Schmelztemperatur liegt. Ein Beispiel für hochgradig stringente Waschbedingungen ist 1 × SSC bei 60°C. Ein Beispiel für Waschbedingungen von sehr hoher Stringenz ist 0,1 × SSPE, 0,1% SDS bei 42°C (Meinkoth und Wahl, Anal. Biochem., 138: 267–284, 1984). Ein Beispiel für Waschbedingungen von extremer Stringenz ist 0,1 × SSPE, 0,1% SDS bei 50–65°C. In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein Waschschritt von hoher Stringenz unter den Bedingungen von 1 × SSC und 60°C durchgeführt. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform wird die Hybridisierung bei 40°C unter Verwendung von 0,5 × Hybridisierungs-Puffer durchgeführt, der aus 13,0 g/l HEPES (Natriumsalz), 12,0 g/l HEPES (freie Säure), 10 g/l Lithiumlaurylsulfat, 21,2 g/l LiCl, 10,0 g/l Rinderserumalbumin, 1,5 g/l Casein, 10,0 g/l BRIJ-35, 2,0 g/l MgCl₂, 0,00136 g/l ZnCl₂, 0,50 g/l Natriumazid, 0,50 g/l Proclin-300, pH 7,5 hergestellt wird. Anschließend wird der Waschpuffer (0,4 × SSC, 1,0 g/l SDS, 0,50 g/l Natriumazid, 0,50 g/l Proclin-300, pH 7,7) einige Male bei Raumtemperatur für die Reaktion verwendet. Wie im Stand der Technik gut bekannt ist, können verschiedene Kombinationen von Faktoren zu Bedingungen von im Wesentlichen gleichwertiger Stringenz führen. Solche gleichwertigen Bedingungen liegen innerhalb des Rahmens der vorliegenden erfinderischen Entdeckung.
In einer Ausführungsform werden die Fangsonden mit den markierten Polynukleotiden unter stringenten Bedingungen hybridisiert, stärker typisch unter hochgradig stringenten oder sehr stringenten oder äußerst stringenten Bedingungen. Die Fangsonden umfassen Polynukleotide von etwa 5 bis etwa 100, bevorzugt etwa 6 bis etwa 75, oder etwa 8 bis etwa 65, oder etwa 10 bis etwa 50, oder etwa 15 bis etwa 40, oder etwa 16 bis etwa 35, oder etwa 18 bis etwa 30 Nukleotiden in der Länge. Die Fangsonden können leicht durch Verfahren synthetisiert werden, die im Stand der Technik für die Synthese von Polynukleotiden gut bekannt sind, wie zum Beispiel solche, die im US-Patent Nr. 4 973 679 beschrieben sind. In alternativer Weise können die Fangsonden von zahlreichen kommerziellen Lieferanten bezogen werden.
In einer weiteren Ausführungsform können die Fangsonden mit einem festen Träger verknüpft werden, wie zum Beispiel einem Mikrokügelchen, einem chromatographischen Kügelchen, einem Affinitäts-Kügelchen, einem Gen-Chip, einem ebenen Wellenlei ter, einer Membran, einer Mikrotiterplatte, einer Glasplatte, einer Plastikplatte oder dergleichen; sie sind jedoch nicht darauf beschränkt. In einer stärker bevorzugten Ausführungsform sind die Fangsonden mit einem Mikrokügelchen verbunden, vorzugsweise mit einem Luminex-Mikrokügelchen. In einer Ausführungsform werden die Fangsonden mit einzelnen Mikrokügelchen durch das gut bekannte Carbodiimid-Kopplungsverfahren verknüpft. Die Luminex-Mikrokügelchen werden ausführlich beschrieben im US-Patent Nr. 6 268 222 . Die Mikrokügelchen oder Mikrokugeln sind kleine einzelne Teilchen. Die Zusammensetzung der Kügelchen schwankt in Abhängigkeit von der Klasse der Fangsonde und dem Verfahren zur Synthese. Geeignete Zusammensetzungen der Kügelchen umfassen solche, die in der Peptid- und Nukleinsäure-Synthese sowie in der Synthese organischer Gruppen verwendet werden, und umfassen Plastik, Keramik, Glas, Polystyrol, 5-Methylstyrol, Acrylpolymere, paramagnetische Materialien, Thorial-Sol, Graphit aus Kohlenstoff, Titandioxid, Latex oder vernetzte Dextrane, wie zum Beispiel Sepharose, Cellulose, Nylon, vernetzte Mizellen und Teflon; sie sind jedoch nicht darauf beschränkt. Die Mikrokügelchen umfassen polymere Nanopartikel, die mit einem oder mehreren fluoreszierenden Farbstoffen gefärbt sind. Alle Nanopartikel in einer gegebenen Population sind mit derselben Konzentration eines Farbstoffs, sowie durch den Einbau einer bekannten Menge dieser Nanopartikel in die Mikrokügelchen gefärbt. Durch Variation der Menge und des Verhältnisses der unterschiedlichen Populationen der Nanopartikel ist es möglich, eine große Zahl einzelner Populationen von Mikrokügelchen (Mikrokugeln) mit einzigartigen Emissionsspektren zu erstellen und zu unterscheiden. Die verwendeten, fluoreszierenden Farbstoffe sind von einer allgemeinen Verbindungsklasse, die unter dem Namen „Cyanin"-Farbstoffe bekannt sind, wobei sie Emissions-Wellenlängen zwischen 550 nm und 900 nm aufweisen. Diese Farbstoffe können Methin-Gruppen enthalten; die Anzahl der Methin-Gruppen beeinflusst die spektralen Eigenschaften des Farbstoffs. Die Monomethin-Farbstoffe, welche Pyridine enthalten, besitzen typischerweise eine blaue bis blau-grüne Fluoreszenz-Emission, während Chinoline eine grüne bis gelb-grüne Fluoreszenz-Emission aufweisen. Die analogen Trimethin-Farbstoffe sind im Wesentlichen zu roten Wellenlängen verschoben, und die Pentamethin-Farbstoffe sind noch weiter verschoben, und zeigen häufig eine Fluoreszenz-Emission im infraroten Bereich. Jedoch kann ein beliebiger Farbstoff, der mit der Zusammensetzung der Kügelchen verträglich ist, verwendet werden.
Wenn eine Anzahl unterschiedlicher Mikrokügelchen bei der Durchführung der hier beschriebenen Verfahren verwendet wird, ist es vorzuziehen, jedoch nicht erforderlich, dass die Farbstoffe die gleichen oder überlappende Anregungsspektren aufweisen, jedoch unterschiedliche Emissionsspektren besitzen. Viele verschiedene Klassen von Populationen von Partikeln können aus lediglich zwei Farbstoffen hergestellt werden. Das Verhältnis der Populationen der Nanopartikel mit roten und orangen Farbstoffen wird durch eine angemessene Zunahme im Anteil verändert, so dass das erhaltene Verhältnis mit dem früheren Verhältnis nicht optisch überlappt. Auf diese Weise wird eine große Zahl von unterschiedlichen Klassen fluoreszierender Mikrokügelchen hergestellt.
Verschiedene Methoden können verwendet werden, um den relativen Methylierungs-Grad an einem oder mehreren CpG-Bereichen auf einem Nukleinsäure-Molekül nachzuweisen und quantitativ zu bestimmen. Die Nachweissysteme, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, können einen Detektor im festen Zustand, eine Fotomultiplier-Röhre, einen fotografischen Film, oder das Auge umfassen, von denen jedes in Verbindung mit einem zusätzlichen Instrument verwendet werden kann, wie zum Beispiel einem Spektrometer, einem Luminometer-Mikroskop, einem Plattenlesegerät, einem Fluoreszenz-Scanner, einem Durchfluss-Cytometer, oder einer beliebigen Kombination derselben, um das Nachweissystem zu vervollständigen.
In einer Ausführungsform werden die Mikrokügelchen unter Verwendung eines Durchfluss-Cytometers, zum Beispiel eines Fluo reszenz-aktivierten Zellsortier-Gerätes identifiziert, wobei die unterschiedlichen Klassen von Kügelchen in einer Mischung auf der Grundlage der fluorochromen Identität, der Größe und/oder der Gestalt einer jeden Klasse von Kügelchen physikalisch voneinander getrennt werden können, und das Vorliegen des Ziel-Polynukleotids kann qualitativ oder quantitativ auf der Grundlage des Vorliegens einer nachweisbaren Markierung für jeden sortierten Pool bestimmt werden, der Kügelchen von einer bestimmten Klasse enthält. Jedes Durchfluss-Cytometer, das in der Lage ist, sowohl die Teilchen als auch die Markierung nachzuweisen, die in dem mit der Fangsonde hybridisierten Polynukleotid enthalten ist, kann verwendet werden. Die Durchfluss-Cytometer mit vielen verschiedenen Anregungslasern und Detektoren sind bevorzugt. In einer Ausführungsform kann das Durchfluss-Cytometer Luminex 100 verwendet werden. Wie im Stand der Technik gut bekannt ist, wird die exakte Einstellung, die für eine optimale Detektion notwendig ist, von den Faktoren abhängen, wie zum Beispiel dem verwendeten Durchfluss-Cytometer, der verwendeten Markierung des Polynukleotids und der verwendeten Teilchen. Die Optimierung der Einstellungen und Bedingungen für die Verwendung eines Durchfluss-Cytometers zur Durchführung der hier offenbarten Verfahren kann durch einen erfahrenen Techniker ohne großen experimentellen Aufwand bewerkstelligt werden. Allgemeine Anleitungen für die Verwendung von Durchfluss-Cytometern können in Textbüchern gefunden werden, wie zum Beispiel Shapiro, Practical Flow Cytometry, 3. Ed., Wiley-Liss, 1995 und Jaroszeski et al., Flow Cytometry Protocols, Humana Press, 1998. Ein Beispiel für die Verwendung von fluoreszierenden Mikrokügelchen und für die Durchfluss-Cytometrie kann gefunden werden in: Smith et al., Clin. Chem., 44: 2054–2056, 1998. Die Verwendung der Durchfluss-Cytometrie ist besonders nützlich in der Situation, bei der mehr als eine Klasse von Teilchen und eine Mehrzahl von Fangsonden dazu verwendet werden, um gleichzeitig das Vorliegen von vielen verschiedenen Ziel-Polynukleotiden (Multiplex-Analyse) zu bestimmen.
In einer Ausführungsform umfasst der Nachweis und die quantitative Bestimmung der relativen Methylierungs-Grade an einem oder mehreren CpG-Bereichen auf den Nukleinsäure-Molekülen die Verwendung von Mikrokügelchen, die mit Farbstoffen konjugiert sind, wie zum Beispiel fluoreszierenden Farbstoffen. Für einen definierten CpG-Bereich auf einem Nukleinsäure-Molekül enthalten die MSPE-Produkte zum Beispiel die Nukleinsäuren sowohl von methyliertem als auch von nicht-methyliertem Ursprung. Daher ist beim Nachweis des relativen Methylierungs-Grades von einem CpG-Bereich ein bestimmtes fluoreszierendes Kennzeichen mit einem Mikrokügelchen konjugiert, das mit einer bestimmten Fangsonde verknüpft ist, wobei die Fangsonde komplementär zu einer bestimmten Adaptersequenz ist, und die Adaptersequenz dem methylierten Zustand eines besonderen CpG-Bereichs auf dem Nukleinsäure-Molekül entspricht, während ein anderes gegebenes fluoreszierendes Kennzeichen mit einem anderen Mikrokügelchen konjugiert ist, das mit einer bestimmten anderen Fangsonde verknüpft ist, wobei diese Fangsonde komplementär zu einer anderen bestimmten Adaptersequenz ist, und die Adaptersequenz dem nicht-methylierten Zustand desselben CpG-Bereichs auf demselben Nukleinsäure-Molekül entspricht. Der Nachweis des relativen Methylierungs-Grades umfasst zunächst die Identifkation des fluoreszierenden Kennzeichens auf den Mikrokügelchen, anschließend die Bestimmung und quantitative Bestimmung der Intensität der Fluoreszenz-Signale auf dem markierten MSPE-Verlängerungsprodukt. Der relative Methylierungs-Grad an diesem CpG-Bereich wird durch Vergleich der Fluoreszenz-Signale des methylierten MSPE-Verlängerungsprodukts mit den Fluoreszenz-Signalen des nicht-methylierten MSPE-Verlängerungsprodukts berechnet. Wie vorstehend beschrieben, ist das MSPE-Verlängerungsprodukt entweder mit einer primären Markierung oder einer sekundären Markierung markiert.
In alternativer Weise können die relativen Methylierungs-Grade an vielen verschiedenen CpG-Bereichen auf einem Nukleinsäure-Molekül oder auch auf verschiedenen Nukleinsäure-Molekülen gleichzeitig durch Verwendung der konjugierten Mikrokügelchen und durch nachfolgende Anwendung ähnlicher Nachweisschritte bestimmt werden. Zum Beispiel sind unterscheidbare Adaptersequenzen jeweils entweder mit dem methylierten oder mit dem nicht-methylierten Zustand eines Nukleinsäure-Moleküls verknüpft, das einen CpG-Bereich enthält. Darüber hinaus werden unterscheidbare Adaptersequenzen jeweils so gestaltet, dass sie jeweils einem definierten CpG-Bereich entsprechen. Schließlich wird ein unterscheidbares Mikrokügelchen mit einem Farbstoff konjugiert, der für jede unterscheidbare Adaptersequenz spezifisch ist. In ähnlicher Weise umfasst der Nachweisschritt zunächst die Identifikation eines unterscheidbaren fluoreszierenden Kennzeichens auf einem Mikrokügelchen, und anschließend die Bestimmung und quantitative Bestimmung der Intensität der Fluoreszenz-Signale auf dem markierten MSPE-Verlängerungsprodukt. Wie vorstehend beschrieben ist das MSPE-Verlängerungsprodukt entweder mit der primären Markierung oder mit der sekundären Markierung markiert.
In einer anderen Ausführungsform kann der Nachweis und die quantitative Bestimmung der relativen Methylierungs-Grade an vielen verschiedenen CpG-Bereichen auf den Nukleinsäure-Molekülen ebenso nach Art eines hohen Durchsatzes durchgeführt werden, zum Beispiel auf Mikroarrays. Eine auf Mikroarrays beruhende Analyse der relativen Methylierungs-Grade ermöglicht die Bearbeitung von Hunderttausenden von CpG-Bereichen gleichzeitig, im Vergleich mit einer oder wenigen CpG-Bereichen zu einem bestimmten Zeitpunkt. Ein DNA-Mikroarray ist aus einem geordneten Satz von DNA-Molekülen von bekannten Sequenzen zusammengesetzt, die üblicherweise in rechtwinkliger Anordnung auf einem kleinen Raum angeordnet sind, wie zum Beispiel auf 1 cm² in einem Standardformat eines mikroskopischen Objektträgers. Zum Beispiel würde ein Array von 200 × 200 Abschnitten 40.000 Felder enthalten, wobei jedes Feld einer Sonde mit einer bekannten Sequenz entspricht. Ein solches Mikroarray kann potenziell dazu verwendet werden, um gleichzeitig die Expression von 40.000 Nukleinsäuren in einem gegebenen Zelltyp unter verschiedenen Bedingungen zu verfolgen. Die Sonden besitzen üblicherweise die Form der cDNA, ESTs oder von Oligonukleotiden. Am meisten bevorzugt sind ESTs und Oligonukleotide im Bereich einer Länge von 30 bis 200 Basen, da sie ein ideales Substrat für die Hybridisierung bieten. Es gibt zwei Vorgehensweisen um solche Mikroarrays zu erstellen, ebenso bekannt als Chips, von denen eine die kovalente Verknüpfung von im Voraus synthetisierten Sonden beinhaltet, und die andere den Aufbau oder das Synthetisieren von Sonden unmittelbar auf dem Chip beinhaltet. Die Probe oder das Testmaterial besteht üblicherweise aus Nukleinsäuren, die durch PCR amplifiziert wurden. Die PCR dient zweierlei Zwecken, nämlich der Vervielfältigung des Ausgangsmaterials, sowie der Ermöglichung, fluoreszierende Anhänge einzuführen. Für eine eingehende Diskussion der Mikroarray-Technologie siehe zum Beispiel Graves, Trends Biotechnol. 17: 127–134, 1999.
Die Methylierung kann ebenso mittels Mikroarrays von hoher Dichte nachgewiesen werden. Mikroarrays von hoher Dichte werden durch Abscheiden einer äußerst geringen Menge von DNA-Lösungen an einem genauen Ort auf einem Array unter Verwendung von sehr genauen Maschinen erstellt, von denen eine Zahl kommerziell erhältlich ist. Eine alternative Vorgehensweise, die von Packard Instruments als führender Firma beschritten wurde, ermöglicht die Abscheidung von DNA in nahezu der gleichen Weise, in der ein Tintenstrahldrucker Spots auf einem Papier abscheidet. DNA-Mikroarrays von hoher Dichte sind im Handel erhältlich von einer Reihe von Bezugsquellen, wie zum Beispiel Affymetrix, Incyte, Mergen, Genemed Molecular Biochemicals, Sequenom, Genomic Solutions, Clontech, Research Genetics, Operon und Stratagene. Derzeit beinhaltet die Markierung für die Analyse mit DNA-Mikroarrays die Fluoreszenz, welche das gleichzeitige Ablesen von vielen verschiedenen unabhängigen Signalen ermöglicht. Dies erlaubt die gleichzeitige Hybridisierung desselben Chips mit zwei Proben, die mit unterschiedlichen fluoreszierenden Farbstoffen markiert sind. Die Berechnung des Verhältnisses der Fluoreszenz an jedem Spot erlaubt die Bestimmung der relativen Veränderung in der Expression eines jeden Gens, oder des relativen Methylierungs-Grades in diesen Genen unter zwei verschiedenen Bedingungen. Zum Beispiel hilft ein Vergleich zwischen einem normalen Gewebe und einem entsprechenden Tumorgewebe unter Verwendung dieser Vorgehensweise bei der Identifikation der Gene, deren Expression erheblich verändert ist. Somit bietet das Verfahren ein besonders aussagekräftiges Instrument, wenn das Profil der Gen-Expression derselben Zelle unter zwei oder mehreren Bedingungen verglichen werden soll. Scanner mit hoher Auflösung und der Fähigkeit, die Fluoreszenz bei verschiedenen Wellenlängen zu beobachten, sind im Handel erhältlich.
Da große Zahlen von Klassen von Adapter-Sequenzen gleichzeitig verwendet werden können, die jeweils spezifisch für einen einzelnen Ziel-CpG-Bereich sind, ist es möglich, die relativen Methylierungs-Grade von Hunderten oder von Tausenden von CpG-Bereichen in einem Experiment qualitativ oder quantitativ nachzuweisen. Zum Beispiel werden unterschiedliche Fangsonden, die komplementär zu unterschiedlichen Adapter-Sequenzen sind, auf einem festen Träger immobilisiert, so dass sie Arrays mit unterschiedlichen Adapter-Sequenzen bilden, die an unterschiedlichen Positionen auf den Arrays angeordnet sind. Für Nachweiszwecke werden Mischungen von MSPE-Verlängerungsprodukten, die von unterschiedlichen CpG-Bereichen stammen, auf die Arrays aufgetragen, wobei jeweils ein bestimmter CpG-Bereich an eine bestimmte Fangsonde an einer bestimmten Stelle auf den Arrays bindet. Die Signalintensität des markierten MSPE-Produktes an einer bestimmten Stelle kann mit Verfahren bestimmt werden, die im Stand der Technik gut bekannt sind, und die relativen Methylierungs-Grade an solchen CpG-Bereichen können durch Vergleich der Signalintensität an zwei Positionen berechnet werden, welche den methylierten und den nicht-methylierten Zuständen von einem bestimmten CpG-Bereich entsprechen. Wie vorstehend beschrieben ist das MSPE-Verlängerungsprodukt entweder mit einer primären Markierung oder mit einer sekundären Markierung markiert.
Ein weiterer Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung stellt ebenso einen Kit für den Nachweis der relativen Methylierungs-Grade an einem oder mehreren CpG-Bereichen auf einem Nukleinsäure-Molekül bereit. Der Kit kann umfassen: (1) ein Mittel, das nicht-methylierte Cytosin-Nukleotide modifiziert, (2) Primer für die Amplifikation der Nukleinsäure-Moleküle, (3) MSPE-Primer, wie in Anspruch 1 definiert, für die methylierte, CpG-enthaltende Nukleinsäure (entweder markiert oder nicht-markiert), (4) MSPE-Primer, wie in Anspruch 1 definiert, für die nicht-methylierte, CpG-enthaltende Nukleinsäure (entweder markiert oder nicht-markiert), (5) markierte und nicht-markierte dNTPs, (6) markierte und nicht-markierte ddNTPs, und (7) markierte und nicht-markierte Reverse-Primer. Der Kit kann darüber hinaus einen Puffer zur Amplifikation von Nukleinsäuren sowie Reagenzien für MSPE-Reaktionen umfassen. Vorzugsweise ist das Mittel, das nicht-methyliertes Cytosin modifiziert, eine Bisulfit-Verbindung.
Ein weiterer Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung stellt ebenso ein Verfahren zur Bestimmung einer Veranlagung für eine Krankheit oder eine Störung, und für eine Diagnose und/oder Prognose einer Krankheit oder Störung, oder für die Beobachtung einer therapeutischen Reaktion auf ein Arzneimittel oder eine Verbindung in einem Probanden bereit, welches Verfahren die Bestimmung des relativen Methylierungs-Zustands an einem oder mehreren CpG-Bereichen auf einem Nukleinsäure-Molekül und den Vergleich des relativen Methylierungs-Grades in dem Probanden mit dem relativen Methylierungs-Grad dieses Nukleinsäure-Moleküls aus einem Kontroll-Probanden (oder Standard) umfasst, der keine Veranlagung für die Krankheit oder Störung aufweist, wobei ein erheblicher Unterschied in dem relativen Methylierungs-Grad ein Hinweis auf die Veranlagung für die Störung oder Krankheit in dem Probanden darstellt. Gemäß einem bevorzugten Gesichtspunkt der Erfindung sind Ausführungsformen ausgeschlossen, welche sich auf diagnostische Verfahren beziehen, die am menschlichen oder tierischen Körper vorgenommen werden.
Beispiele
Beispiel 1
Die Promotor-Sequenz des p16-Gens wurde als ein Modellsystem verwendet. Die Sequenz ist nachfolgend aufgeführt:
Genomische DNA aus den Zell-Linien HT29 und LNCaP wurde als Positiv- und Negativ-Kontrolle für die Methylierung verwendet, da diese zuvor experimentell bestätigt wurden.
Die genomische DNA wurde anfänglich gemäß dem Verfahren von Frommer modifiziert (Frommer, M., L. E. McDonald, D. S. Millar, C. M. Collis, F. Watt, G. W. Grigg, P. L. Molloy, und C. L. Paul: „A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues in individual DNA strands", Proc. Natl. Acad. Sci USA 89: 1827–1831, 1992). Kurz gesagt wurden 1 μg genomische DNA, die jeweils aus der Zell-Linie HT29 bzw. LNCaP erhalten wurde, auf 50 μl mit destilliertem Wasser verdünnt, 5,5 μl 2 M NaOH wurden zugegeben, und die Mischung wurde bei 37°C für 10 Minuten inkubiert (um einzelsträngige DNA zu erzeugen). 30 μl frisch hergestelltes, 10 mM Hydrochinon (Sigma) wurden zu jedem Röhrchen gegeben. 520 μl von frisch hergestelltem 3 M Natriumbisulfit (Sigma S-8890), pH 5,0 wurden anschließend dazugegeben. Die Reagenzien wurden vollständig vermischt und anschließend mit Mineralöl abgedeckt und bei 50°C für 16 Stunden inkubiert (bei einer längeren Inkubationsdauer beginnt methyliertes Cytosin, sich zu Thymin umzusetzen). Nach dem Entfernen des Öls wurde 1 ml des DNA-Reinigungsharzes Wizard (Promega A7280) zu jedem Röhr chen gegeben, ehe die Mischung auf eine Miniprep-Säule in dem DNA-Wizard-Reinigungskit aufgetragen wurde. Die Säule wurde mit 2 ml 80% Isopropanol gewaschen und mit 50 μl heißem Wasser (60 bis 70°C) eluiert. 5,5 μl 3 M NaOH wurden zu jedem Röhrchen gegeben, und die Mischung wurde bei Raumtemperatur für 5 Minuten inkubiert. Anschließend wurde 1 μl Glycogen als Träger, 33 μl 10 M NH₄Ac und 3 Volumina Ethanol für die DNA-Fällung zugegeben. Das Pellet wurde nach unten zentrifugiert und mit 70% Ethanol gewaschen, getrocknet und erneut in 20 μl Wasser aufgenommen. 1 μl DNA wurde in jeder PCR-Reaktion verwendet.
Nach der Modifikation mittels Bisulfit veränderte sich die Sequenz zu (Y steht für C/T, da nicht-methyliertes Cytosin zu Uracil umgesetzt wurde, und als Thymin erkannt wurde; methyliertes Cytosin verbleibt unverändert als Cytosin):
Die PCR-Reaktion wurde unter Verwendung eines Standard-Protokolls durchgeführt. 1 μl der chemisch behandelten DNA wurde als Templat für die PCR-Amplifikation verwendet. In einer PCR-Reaktion wurde ein Verfahren einer anfänglichen Denaturierung von 95°C für 10 Minuten, gefolgt von einem Zyklus von 95°C für 30 Sekunden, 60°C für 30 Sekunden, 72°C für 30 Sekunden für insgesamt 40 Zyklen verwendet. Die PCR-Reaktionen wurden in 50 μl Volumen durchgeführt, das etwa 20 ng DNA, die mit Bisulfit umgesetzt wurde, 15 mM Tris-HCl (pH 8,0), 2,0 mM MgCl₂, 50 mM KCl, 200 μM von jedem dNTP, 0,4 μM Endkonzentration eines jeden Primers und 1 Einheit AmpliTaq Gold DNA-Polymerase enthielt. Die Primer waren: p16Hmod1F 5'-GAA GAA AGA GGA GGG GTT GG-3' (SEQ ID Nr. 5)/p16Hmod1R 5'-CTA CAA ACC CTC TAC CCA CC-3' (SEQ ID Nr. 6). Die Amplifikate wurden durch das Analysegerät „Agilent BioAnalyzer^®" quantitativ bestimmt.
Eine Mischung nach Art einer Reihe (Tabelle 1) der beiden Amplifikate mit wechselndem Verhältnis wurde als Templat in einer zweifachen MSPE-Reaktion unter Einbau von biotinyliertem dGTP verwendet. Die Reaktion begann mit einer anfänglichen Denaturierung von 95°C für 10 Minuten, gefolgt von einem Zyklus von 95°C für 30 Sekunden, 60°C für 30 Sekunden, 72°C für 30 Sekunden für insgesamt 30 Zyklen. Die Reaktion umfasste 25 μl und enthielt: 2,5 μl der vorgemischten Amplifikate in wechselnden Verhältnissen (aufgeführt in Tabelle 1), 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 1,5 mM MgCl₂, 50 mM KCl, 8 μM von jedem nicht-markierten dNTP, 4 μM biotinyliertes dGTP, 100 nM Endkonzentration der jeweiligen MSPE-Primer und 25 nM der jeweiligen Reverse-Primer und 0,5 Einheiten AmpliTaq Gold DNA-Polymerase. Die Primer waren:
15183 CE-Methyl_136U22: 5'-GAF GCT JTJ ACC TFA JAG CJT TCG TTT CGG TTG ATT GGT TGG TTA C-3' (SEQ ID Nr. 7), wobei die ersten 24 Nukleotide die „Zipcode-Sequenz" darstellen.
15184 Methyl_252L23: 5'-GCT ACA AAC CCT CTA CCC ACC TA-3' (SEQ ID Nr. 8)
15185 CE-unMethyl_134U24: 5'-JCG JCA TFA GCF TCT JGA GFA CGT TTT TGG TTG ATT GGT TGG TTA T-3' (SEQ ID Nr. 9), wobei die ersten 22 Nukleotide die „Zipcode-Sequenz" darstellen.
15186 unMethyl_252L24: 5'-CAC TAC AAA CCC TCT ACC CAC CTA-3' (SEQ ID Nr. 10)

(J = iso G, F = iso C, zwei AEGIS^TM Basen (iso C und iso G), einzigartige, nicht-standardmäßige Basenpaare, entwickelt von EraGen Biosciences, lizensiert durch die Bayer Corporation. Sowohl der Ausdruck „J" als auch der Ausdruck „F" werden in Übereinstimmung mit dem WIPO-Standard als „n" auf der Sequenzliste aufgeführt. Die Verwendung der Symbole „J" und „F" wurde auch auf die SEQ ID Nr. 10 und 11 angewendet.) Tabelle 1. Menge des DNA-Templats im MSPE-Assay

Proben-Nr.	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11
Methylierte Ziel-DNA (ng)	5,60	5,04	4,48	3,92	3,36	2,80	2,24	1,68	1,12	0,56	0,00
Nicht-methylierte Ziel-DNA (ng)	0,00	0,84	1,68	2,52	3,36	4,20	5,04	5,88	6,72	7,56	8,40
Erwartete Methylierung (%)	100,00	85,71	72,73	60,87	50,00	40,00	30,77	22,22	14,29	6,90	0,00

Nach der Reaktion wurden die MSPE-Produkte in einen Pool von Kügelchen überführt, der Luminex^®-Kügelchen enthielt, welche mit Amin-derivatisierten Oligonukleotiden konjugiert waren: 15189 CP32-3a: 5'-CGA AFG CTF TJA GGT FAF AGC JTC Sp-LCA-3' (SEQ ID Nr. 11) bzw. 15190 CP33-3a: 5'-GTJ CTC FAG AJG CTJ ATG FCG Sp-LCA-3' (SEQ ID Nr. 12). Die Konjugation wurde unter Verwendung eines Standard-Protokolls durchgeführt, und die Kügelchen wurden erneut in 5.000 μl in 1 × TE Puffer (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,5) suspendiert. Eine vierfache Hybridisierung wurde zur gleichen Zeit durchgeführt. Kurz gesagt wurden 4 μl des MSPE-Produkts in 50 μl der Hybridisierungs-Reaktion überführt, die 0,5 × Hybridisierungs-Puffer und Luminex^®-Kügelchen 8 und 9 enthielt (bei 2.000 Stück von jedem der Kügelchen). Der Puffer wurde aus 13,0 g/l HEPES (Natriumsalz), 12,0 g/l HEPES (freie Säure), 10 g/l Lithiumlaurylsulfat, 21,2 g/l LiCl, 10,0 g/l Rinderserumalbumin, 1,5 g/l Casein, 10,0 g/l BRIJ-35, 2,0 g/l MgCl₂, 0,00136 g/l ZnCl₂, 0,50 g/l Natriumazid, 0,50 g/l Proclin-300, pH 7,5 hergestellt. Die Reaktionsmischung wurde bei 96°C für 2 Minuten und bei 40°C für 30 Minuten inkubiert. Die Kügelchen wurden einmal jeweils mit 100 und 200 μl Waschpuffer (0,4 × SSC, 1,0 g/l SDS, 0,50 g/l Natriumazid, 0,50 g/l Proclin-300, pH 7,7) gewaschen. 50 μl Streptavidin-Phycoerythrin (SA-PE, 1 mg/ml), die 1:500 verdünnt wurden, wurden zu jeder Reaktion gegeben, leicht gemischt und bei Raumtemperatur für 15 Minuten (unter Vermeidung von Licht) inkubiert, und erneut mit 100 μl Waschpuffer gewaschen. Die Kügelchen wurden erneut in 80 μl TTL-Puffer (50 mM Tris, 0,1% Tween-20, 400 mM LiCl, pH 8,0) suspendiert, und die Messung wurde auf dem Instrument Luminex^® 100^TM durchgeführt. Tabelle 2. Abgelesene Werte: durchschnittliche Fluoreszenz-Einheiten (mean fluorescence units; MFU) von dem Gerat Luminex^® 100^TM

	Rohwerte (Durchschnitt – Hintergrund)		Normalisierte Werte (Durchschnitt – Kontrolle ohne Templat) (Avrg-NTC)		Standard-Abweichung (durchschnittliche Fluoreszenz-Einheiten)
Proben-Nr.	M	U	M	U	M	U
1	1568,45	18,03	1567,42	0,00	48,41	0,00
2	1283	401,48	1281,97	383,45	34,54	14,08
3	956,16	730,25	955,13	712,22	43,65	31,98
4	718,98	931,7	717,95	913,67	29,54	28,21
5	538,23	1153,28	537,2	1135,25	30,57	108,13
6	414,3	1271,95	413,27	1253,92	16,85	22,75
7	287,25	1392,17	286,22	1374,14	9,30	41,80
8	180,86	1585,12	179,83	1567,09	10,17	84,13
9	100,73	1563,43	99,7	1545,4	2,68	17,96
10	46,05	1601,39	45,02	1583,36	1,11	26,46
11	1,03	1573,37	0,00	1555,34	0,00	74,75

MFU: durchschnittliche Fluoreszenz-Einheiten (mean fluorescence unit); M: methyliert; U: nicht-methyliert; NTC: Kontrolle ohne Templat (non template control)

Die Ergebnisse zeigten ausgezeichnete Werte sowohl für methylierte als auch für nicht-methylierte Signale (1) mit einer begrenzten Menge an Templat (im Nanogramm-Bereich, siehe Tabelle 2). Der Hintergrund des methylierten und des nicht-methylierten Signals war minimal (1,03 bzw. 18,03 MFU). Das Signal-Rauschverhältnis war mehr als 22 (401,48/18,03, siehe Tabelle 2). Sowohl die methylierten als auch die nicht-methylierten Signale wurden klar unterschieden, mit einer minimalen Schwankung (< 9,53%) zwischen den Vierfach-Reaktionen. Die Signalintensität von beiden lag in einem vergleichbaren Bereich und passte sich eng an eine Binomial-Kurve an (R² > 0,995) (1).
Beispiel 2
Die Promotor-Sequenz des p16-Gens wurde als ein Modellsystem verwendet. Die Sequenz ist nachfolgend aufgeführt:
Genomische DNA aus den Zell-Linien HT29 und LNCaP wurde als Positiv- und Negativ-Kontrolle für die Methylierung verwendet, da sie zuvor experimentell bestätigt wurden.
Die genomische DNA wurde anfänglich gemäß dem Verfahren von Frommer modifiziert (Frommer, M., L. E. McDonald, D. S. Millar, C. M. Collis, F. Watt, G. W. Grigg, P. L. Molloy, und C. L. Paul: „A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues in individual DNA strands", Proc. Natl. Acad. Sci USA 89: 1827–1831, 1992). Kurz gesagt wurden 1 μg genomische DNA, die jeweils aus der Zelllinie HT29 bzw. LNCaP erhalten wurde, auf 50 μl mit destilliertem Wasser verdünnt, 5,5 μl 2 M NaOH wurden zugegeben, und die Mischung wurde bei 37°C für 10 Minuten inkubiert (um einzelsträngige DNA zu erzeugen). 30 μl von frisch hergestelltem, 10 mM Hydrochinon (Sigma) wurden zu jedem Röhrchen gegeben. 520 μl frisch hergestelltes, 3 M Natriumbisulfit (Sigma S-8890), pH 5,0, wurden anschließend dazugegeben. Die Reagen zien wurden vollständig vermischt und anschließend mit Mineralöl abgedeckt und bei 50°C für 16 Stunden inkubiert (bei einer längeren Inkubationsdauer beginnt methyliertes Cytosin, sich zu Thymin umzusetzen). Nach dem Entfernen des Öls wurde 1 ml des DNA-Reinigungsharzes Wizard (Promega A7280) zu jedem Röhrchen gegeben, ehe die Mischung auf eine Miniprep-Säule in dem DNA-Wizard-Reinigungskit aufgetragen wurde. Die Säule wurde mit 2 ml 80% Isopropanol gewaschen, und mit 50 μl heißem Wasser (60 bis 70°C) eluiert. 5,5 μl 3 M NaOH wurden zu jedem Röhrchen gegeben, und die Mischung wurde bei Raumtemperatur für 5 Minuten inkubiert. Anschließend wurde 1 μl Glycogen als Träger, 33 μl 10 M NH₄Ac und 3 Volumina Ethanol für die DNA-Fällung zugegeben. Das Pellet wurde nach unten zentrifugiert und mit 70% Ethanol gewaschen, getrocknet und erneut in 20 μl Wasser aufgenommen. 1 μl DNA wurde in jeder PCR-Reaktion verwendet.
Nach der Modifikation mittels Bisulfit veränderte sich die Sequenz zu (Y steht für C/T, da nicht-methyliertes Cytosin zu Uracil umgesetzt wurde, und als Thymin erkannt wurde; methyliertes Cytosin verbleibt unversehrt als Cytosin):
Die PCR-Reaktion wurde unter Verwendung eines Standard-Protokolls durchgeführt. 1 μl der chemisch behandelten DNA wurde als Templat für die PCR-Amplifikation verwendet. In einer PCR-Reaktion wurde ein Verfahren einer anfänglichen Denaturierung von 95°C für 10 Minuten, gefolgt von einem Zyklus von 95°C für 30 Sekunden, 60°C für 30 Sekunden, 72°C für 30 Sekunden für insgesamt 40 Zyklen verwendet. Die PCR-Reaktionen wurden in 50 μl Volumen durchgeführt, das etwa 20 ng DNA, die mit Bisulfit umgesetzt wurde, 15 mM Tris-HCl (pH 8,0), 2,0 mM MgCl₂, 50 mM KCl, 200 μM von jedem dNTP, 0,4 μM Endkonzentration eines jeden Primers und 1 Einheit AmpliTaq Gold DNA-Polymerase enthielt. Die Primer waren: p16Hmod1F 5'-GAA GAA AGA GGA GGG GTT GG-3' (SEQ ID Nr. 5)/p16Hmod1R 5'-CTA CAA ACC CTC TAC CCA CC-3' (SEQ ID Nr. 6). Die Amplifikate wurden durch das Analysegerät Agilent BioAnalyzer^® quantitativ bestimmt.
Eine Mischung nach Art einer Reihe (Tabelle 1) der beiden Amplifikate mit wechselndem Verhältnis wurde als Templat in einer zweifachen MSPE-Reaktion unter Einbau von biotinyliertem dGTP verwendet. Die Reaktion begann mit einer anfänglichen Denaturierung von 95°C für 10 Minuten, gefolgt von einem Zyklus von 95°C für 30 Sekunden, 60°C für 30 Sekunden, 72°C für 30 Sekunden für insgesamt 30 Zyklen. Die Reaktion umfasste 25 μl und enthielt: 2,5 μl der vorgemischten Amplifikate in wechselnden Verhältnissen (aufgeführt in Tabelle 1), 10 mM Tris HCl (pH 8,3), 1,5 mM MgCl₂, 50 mM KCl, 8 μM von jedem nicht-markierten dNTP, 4 μM biotinyliertes dGTP, 100 nM Endkonzentration der jeweiligen MSPE-Primer und 25 nM der jeweiligen Reverse-Primer und 0,5 Einheiten AmpliTaq Gold DNA-Polymerase. Die Primer waren:
15183 CE-Methyl_136U22: 5'-GAF GCT JTJ ACC TFA JAG CJT TCG TTT CGG TTG ATT GGT TGG TTA C-3' (SEQ ID Nr. 7), wobei die ersten 24 Nukleotide die „Zipcode-Sequenz" darstellen.
15184 Methyl_252L23: 5'-GCT ACA AAC CCT CTA CCC ACC TA-3' (SEQ ID Nr. 8)
15185 CE-unMethyl_134U24: 5'-JCG JCA TFA GCF TCT JGA GFA CGT TTT TGG TTG ATT GGT TGG TTA T-3' (SEQ ID Nr. 9), wobei die ersten 22 Nukleotide die „Zipcode-Sequenz" darstellen.
15186 unNethyl_252L24: 5'-CAC TAC AAA CCC TCT ACC CAC CTA-3' (SEQ ID Nr. 10)

Nach der Reaktion wurden die MSPE-Produkte in einen Pool von Kügelchen überführt, der Luminex^®-Kügelchen enthielt, welche mit Amin-derivatisierten Oligonukleotiden konjugiert waren: 15189 CP32-3a: 5'-CGA AFG CTF TJA GGT FAF AGC JTC Sp-LCA-3' (SEQ ID Nr. 11) bzw. 15190 CP33-3a: 5'-GTJ CTC FAG AJG CTJ ATG FCG Sp-LCA-3' (SEQ ID Nr. 12). Die Konjugation wurde unter Verwendung eines Standard-Protokolls durchgeführt, und die Kügelchen wurden erneut in 5.000 μl in 1 × TE Puffer (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,5) suspendiert. Eine vierfache Hybridisierung wurde zur gleichen Zeit durchgeführt. Kurz gesagt wurden 4 μl des MSPE-Produkts in 50 μl der Hybridisierungs-Reaktion überführt, die 0,5 × Hybridisierungs-Puffer und Luminex^®-Kügelchen 8 und 9 enthielt (bei 2.000 Stück von jedem der Kügelchen). Der Puffer wurde aus 13,0 g/l HEPES (Natriumsalz), 12,0 g/l HEPES (freie Säure), 10 g/l Lithiumlaurylsulfat, 21,2 g/l LiCl, 10,0 g/l Rinderserumalbumin, 1,5 g/l Casein, 10,0 g/l BRIJ-35, 2,0 g/l MgCl₂, 0,00136 g/l ZnCl₂, 0,50 g/l Natriumazid, 0,50 g/l Proclin-300, pH 7,5 hergestellt. Die Reaktionsmischung wurde bei 96°C für 2 Minuten und bei 40°C für 30 Minuten inkubiert. Die Kügelchen wurden einmal jeweils mit 100 und 200 μl Waschpuffer (0,4 × SSC, 1,0 g/l SDS, 0,50 g/l Natriumazid, 0,50 g/l Proclin-300, pH 7,7) gewaschen. 50 μl Streptavidin-Phycoerythrin (SA-PE, 1 mg/ml), die 1:500 verdünnt wurden, wurden zu jeder Reaktion gegeben, leicht gemischt, und die Mischung wurde bei Raumtemperatur für 15 Minuten (unter Vermeidung von Licht) inkubiert und erneut mit 100 μl Waschpuffer gewaschen. Die Kügelchen wurden erneut in 80 μl TTL-Puffer (50 mM Tris, 0,1% Tween-20, 400 mM LiCl, pH 8,0) suspendiert, und die Messung wurde auf dem Instrument Luminex^® 100^TM durchgeführt. Tabelle 3. Vergleich des erwarteten mit dem beobachteten Prozentsatz der Methylierung

Proben-Nr.	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11
Erwartetes Verhältnis (%) M/(M + U)	100,00	85,71	72,73	60,87	50,00	40,00	30,77	22,22	14,29	6,90	0,00
Beobachtetes Verhältnis (%) M/(M + U)	98,86	76,17	56,70	43,56	31,82	24,57	17,10	10,24	6,05	2,80	0,07

M: methyliert; U: nicht-methyliert

Das erwartete Verhältnis im Vergleich mit dem eingesetzten Templat-Verhältnis passt sich gut einer Binomial-Kurve an (R² = 0,9994), was die hohe quantitative Kapazität des Assays zeigt (2). Das Verhältnis wurde unmittelbar aus den Werten des Geräts Luminex^® 100^TM unter Verwendung der Standardkurve berechnet. Das Vorhersagepotenzial liegt nahe bei 100%, unabhängig von der Zusammensetzung der Ziel-DNA (von 0–100% Methylierung) (3).
Eine schematische Beschreibung der Erfindung ist in 4 gezeigt.
Weitere Ausführungsformen
Weitere Ausführungsformen werden für den Fachmann ersichtlich sein. Es sollte so verstanden werden, dass die vorstehende genaue Beschreibung nur aus Gründen der Klarheit erfolgt ist und lediglich der Beispiele wegen erfolgt ist.
SEQUENZLISTE

Claims

Verfahren zum Nachweis einer 5'-Methylierung der DNA an einem Cytosin-Rest eines CpG-Bereichs in einer Nukleinsäure-Sequenz, umfassend: (a) Gewinnen von DNA aus einer zu untersuchenden Probe; (b) in Kontakt bringen der DNA mit einer Bisulfit-Verbindung; (c) Amplifizieren der DNA unter Verwendung strang-spezifischer Primer; (d) Durchführen einer Primerverlängerungs-Reaktion unter Verwendung von mindestens einem Paar von Primern, die für die methylierungs-spezifische Primerverlängerung (methylation specific primer extension; MSPE) vorgesehen sind und mit dem oberen Strang der amplifizierten DNA hybridisieren, sowie von markierten dNTPs und einer DNA-Polymerase, wobei das 3'-Ende des ersten MSPE-Primers in dem Paar eine Polynukleotid-Sequenz umfasst, die für den oberen Strang der methylierten DNA spezifisch ist, wobei der Rest am 3'-Ende des Primers mit dem Cytosin-Rest des zu untersuchenden CpG-Bereichs hybridisiert, und wobei das 5'-Ende des ersten MSPE-Primers eine erste einzigartige Sequenz umfasst, die nicht mit irgendwelchen DNA-Sequenzen in der Probe hybridisiert; wobei das 3'-Ende des zweiten MSPE-Primers in dem Paar eine Polynukleotid-Sequenz umfasst, die für den oberen Strang der nicht-methylierten DNA-Sequenz spezifisch ist, wobei der Rest am 3'-Ende des Primers mit dem Thymin-Rest hybridisiert, der aus dem Cytosin des zu untersuchenden CpG-Bereichs stammt, und wobei das 5'-Ende des zweiten MSPE-Primers eine zweite einzigartige Sequenz umfasst, die nicht mit irgendwelchen DNA-Sequenzen in der Probe hybridisiert; (e) Hybridisieren der Primerverlängerungs-Produkte aus (d) mit mindestens einem Paar von Oligonukleotiden, wobei das erste Oligonukleotid in dem Paar komplementär zur ersten einzigartigen Sequenz ist, und das zweite Oligonukleotid in dem Paar komplementär zur zweiten einzigartigen Sequenz ist; und (f) Bestimmen des 5'-Methylierungs-Zustands am Cytosin-Rest des CpG-Bereichs durch Vergleich der Hybridisierungs-Intensität der methylierten DNA mit der Hybridisierungs-Intensität der nicht-methylierten DNA in der Probe; oder wobei (d) die Primerverlängerungs-Reaktion unter Verwendung von mindestens einem Paar von MSPE-Primern durchgeführt wird, die mit dem unteren Strang der amplifizierten DNA hybridisieren, sowie von markierten dNTPs und einer DNA-Polymerase, wobei das 3'-Ende des ersten MSPE-Primers in dem Paar eine Polynukleotid-Sequenz umfasst, die für den unteren Strang der methylierten DNA spezifisch ist, wobei der Rest am 3'-Ende des Primers mit dem Guanin-Rest hybridisiert, der komplementär zu dem Cytosin des CpG-Bereichs auf dem oberen Strang ist, und wobei das 5'-Ende des ersten MSPE-Primers eine erste einzigartige Sequenz umfasst, die nicht mit irgendwelchen DNA-Sequenzen in der Probe hybridisiert; wobei das 3'-Ende des zweiten MSPE-Primers in dem Paar eine Polynukleotid-Sequenz umfasst, die für den unteren Strang der nicht-methylierten DNA-Sequenz spezifisch ist, wobei der Rest am 3'-Ende des Primers mit dem Adenin-Rest hybridisiert, der von dem Cytosin des CpG-Bereichs auf dem oberen Strang stammt, und wobei das 5'-Ende des zweiten MSPE-Primers eine zweite einzigartige Sequenz umfasst, die nicht mit irgendwelchen DNA-Sequenzen in der Probe hybridisiert; oder wobei (d) die Primerverlängerungs-Reaktion unter Verwendung von mindestens einem Paar von MSPE-Primern durchgeführt wird, die für die methylierungs-spezifische Primerverlängerung vorgesehen sind und mit dem oberen Strang der amplifizierten DNA hybridisieren, sowie von dNTPs, markiertem ddCTP und einer DNA-Polymerase, wobei das 3'-Ende des ersten MSPE-Primers in dem Paar eine Polynukleotid-Sequenz umfasst, die für den oberen Strang der methylierten DNA spezifisch ist, wobei der Rest am 3'-Ende des Primers mit dem Cytosin-Rest des zu untersuchenden CpG-Bereichs hybridisiert, und wobei das 5'-Ende des ersten MSPE-Primers eine erste einzigartige Sequenz umfasst, die nicht mit irgendwelchen DNA-Sequenzen in der Probe hybridisiert; wobei das 3'-Ende des zweiten MSPE-Primers in dem Paar eine Polynukleotid-Sequenz umfasst, die für den oberen Strang der nicht-methylierten DNA-Sequenz spezifisch ist, wobei der Rest am 3'-Ende des Primers mit dem Thymin-Rest hybridisiert, der von dem Cytosin des zu untersuchenden CpG-Bereichs stammt, und wobei das 5'-Ende des zweiten MSPE-Primers eine zweite einzigartige Sequenz umfasst, die nicht mit irgendwelchen DNA-Sequenzen in der Probe hybridisiert; oder wobei (d) die Primerverlängerungs-Reaktion unter Verwendung von mindestens einem Paar von MSPE-Primern durchgeführt wird, die für die methylierungs-spezifische Primerver längerung vorgesehen sind und mit dem oberen Strang der amplifizierten DNA hybridisieren, sowie von einer Mischung von markierten dNTPs und ddNTPs, einer Mischung von unmarkierten dNTPs und ddNTPs, und einer DNA-Polymerase, wobei das 3'-Ende des ersten MSPE-Primers in dem Paar eine Polynukleotid-Sequenz umfasst, die für den oberen Strang der methylierten DNA spezifisch ist, wobei der Rest am 3'-Ende des Primers mit dem Cytosin-Rest des zu untersuchenden CpG-Bereichs hybridisiert, und wobei das 5'-Ende des ersten MSPE-Primers eine erste einzigartige Sequenz umfasst, die nicht mit irgendwelchen DNA-Sequenzen in der Probe hybridisiert; wobei das 3'-Ende des zweiten MSPE-Primers in dem Paar eine Polynukleotid-Sequenz umfasst, die für den oberen Strang der nicht-methylierten DNA-Sequenz spezifisch ist, wobei der Rest am 3'-Ende des Primers mit dem Thymin-Rest hybridisiert, der von dem Cytosin des zu untersuchenden CpG-Bereichs stammt, und wobei das 5'-Ende des zweiten MSPE-Primers eine zweite einzigartige Sequenz umfasst, die nicht mit irgendwelchen DNA-Sequenzen in der Probe hybridisiert; oder wobei (d) die Primerverlängerungs-Reaktion unter Verwendung von mindestens einem Paar von MSPE-Primern durchgeführt wird, die mit dem unteren Strang der amplifizierten DNA hybridisieren, sowie von einer Mischung von markierten dNTPs und ddNTPs, einer Mischung von unmarkierten dNTPs und ddNTPs, und einer DNA-Polymerase, wobei das 3'-Ende des ersten MSPE-Primers in dem Paar eine Polynukleotid-Sequenz umfasst, die für den unteren Strang der methylierten DNA spezifisch ist, wobei der Rest am 3'-Ende des Primers mit dem Guanin-Rest hybridisiert, der komplementär zu dem Cytosin des CpG-Bereichs auf dem oberen Strang ist, und wobei das 5'-Ende des ersten MSPE- Primers eine erste einzigartige Sequenz umfasst, die nicht mit irgendwelchen DNA-Sequenzen in der Probe hybridisiert; wobei das 3'-Ende des zweiten MSPE-Primers in dem Paar eine Polynukleotid-Sequenz umfasst, die für den unteren Strang der nicht-methylierten DNA-Sequenz spezifisch ist, wobei der Rest am 3'-Ende des Primers mit dem Adenin-Rest hybridisiert, der von dem Cytosin des CpG-Bereichs auf dem oberen Strang stammt, und wobei das 5'-Ende des zweiten MSPE-Primers eine zweite einzigartige Sequenz umfasst, die nicht mit irgendwelchen DNA-Sequenzen in der Probe hybridisiert; oder wobei (d) die Primerverlängerungs-Reaktion unter Verwendung von mindestens einem Paar von MSPE-Primern durchgeführt wird, die mit dem oberen Strang der amplifizierten DNA hybridisieren, sowie von mindestens einem markierten Reverse-Primer, dNTPs und einer DNA-Polymerase, wobei das 5'-Ende des ersten MSPE-Primers in dem Paar eine erste einzigartige Sequenz umfasst, die nicht mit irgendwelchen DNA-Sequenzen in der Probe hybridisiert, und wobei das 3'-Ende des ersten MSPE-Primers eine Polynukleotid-Sequenz umfasst, die für den oberen Strang der methylierten DNA-Sequenz spezifisch ist, wobei der Rest am 3'-Ende des Primers mit dem Cytosin-Rest des zu untersuchenden CpG-Bereichs hybridisiert; wobei das 5'-Ende des zweiten MSPE-Primers in dem Paar eine zweite einzigartige Sequenz umfasst, die nicht mit irgendwelchen DNA-Sequenzen in der Probe hybridisiert, und wobei das 3'-Ende des zweiten MSPE-Primers in dem Paar eine Polynukleotid-Sequenz umfasst, die für den oberen Strang der nicht-methylierten DNA spezifisch ist, und wobei der Rest am 3'-Ende des Primers mit dem Thymin-Rest hybridisiert, welcher von dem Cytosin des zu untersuchenden CpG-Bereichs stammt; und (e) die Primerverlängerungs-Produkte aus (d) mit mindestens einem Paar von Oligonukleotiden hybridisiert werden, wobei das erste Oligonukleotid in dem Paar das gleiche ist wie die erste einzigartige Sequenz, und das zweite Oligonukleotid in dem Paar das gleiche ist wie die zweite einzigartige Sequenz; oder wobei (d) die Primerverlängerungs-Reaktion unter Verwendung von mindestens einem Paar von MSPE-Primern durchgeführt wird, die mit dem unteren Strang der amplifizierten DNA hybridisieren, sowie von mindestens einem markierten Reverse-Primer, dNTPs, und einer DNA-Polymerase, wobei das 5'-Ende des ersten MSPE-Primers in dem Paar eine erste einzigartige Sequenz umfasst, die nicht mit irgendwelchen DNA-Sequenzen in der Probe hybridisiert, und wobei das 3'-Ende des ersten MSPE-Primers eine Polynukleotid-Sequenz umfasst, die für den unteren Strang der methylierten DNA-Sequenz spezifisch ist, wobei der Rest am 3'-Ende des Primers mit dem Guanin-Rest hybridisiert, welcher komplementär zu dem Cytosin des CpG-Bereichs auf dem oberen Strang ist; wobei das 5'-Ende des zweiten MSPE-Primers in dem Paar eine zweite einzigartige Sequenz umfasst, die nicht mit irgendwelchen DNA-Sequenzen in der Probe hybridisiert, und wobei das 3'-Ende des zweiten MSPE-Primers in dem Paar eine Polynukleotid-Sequenz umfasst, die für den unteren Strang der nicht methylierten DNA spezifisch ist, und wobei der Rest am 3'-Ende des Primers mit dem Adenin-Rest hybridisiert, welcher von dem Cytosin des CpG-Bereichs auf dem oberen Strang stammt; und (e) die Primerverlängerungs-Produkte aus (d) mit mindestens einem Paar von Oligonukleotiden hybridisiert werden, wobei das erste Oligonukleotid in dem Paar das gleiche ist wie die erste einzigartige Sequenz, und das zweite Oligonukleotid in dem Paar das gleiche ist wie die zweite einzigartige Sequenz.
Verwendung des Verfahrens nach Anspruch 1 zum Nachweis einer Krankheit oder einer Störung in einem Probanden, wobei ein signifikanter Unterschied im Methylierungszustand eines Cytosin-Restes eines CpG-Bereichs in einer Nukleinsäure-Sequenz von dem Probanden, wie er durch das Verfahren nach Anspruch 1 bestimmt wurde, verglichen mit dem Methylierungszustand desselben CpG-Bereichs in einer Nukleinsäure-Sequenz aus einem Probanden oder einem Standard, der die Krankheit oder Störung nicht aufweist, wie er durch das Verfahren nach Anspruch 1 bestimmt wurde, auf das Vorliegen dieser Krankheit oder Störung in dem Probanden hindeutet.
Kit für den Nachweis einer Nukleinsäure, welche methyliertes CpG enthält, aus einer Probe, wobei der Kit umfasst: (1) eine Bisulfit-Verbindung; (2) Primer für die Amplifikation des Nukleinsäure-Moleküls; (3) MSPE-Primer, wie in Anspruch 1 definiert für Nukleinsäuren, die methyliertes CpG enthalten; (4) MSPE-Primer, wie in Anspruch 1 definiert für Nukleinsäuren, die nicht-methyliertes CpG enthalten; (5) markierte und unmarkierte dNTPs; (6) markierte und unmarkierte ddNTPs; und (7) markierte oder unmarkierte Reverse-Primer.