DE10392538B4

DE10392538B4 - Verfahren zur Analyse von methylierten Nukleinsäuren

Info

Publication number: DE10392538B4
Application number: DE10392538T
Authority: DE
Inventors: Kurt Berlin
Original assignee: Epigenomics AG
Current assignee: Epigenomics AG
Priority date: 2002-04-09
Filing date: 2003-04-09
Publication date: 2010-02-18
Anticipated expiration: 2023-04-10
Also published as: WO2003085132A3; AU2003223041A1; US20060099581A1; WO2003085132A2; DE10392538T5

Abstract

Verfahren zur Analyse der Methylierung in einer CpG-Position oder mehreren CpG-Positionen, die in einer Nukleinsäure-Probe analysiert werden sollen, umfassend:
a. Umsetzung unmethylierter Cytosin-Basen in der Nukleinsäure-Probe durch Behandlung mit einem Agens in Uracil oder eine andere Base, die sich im Hinblick auf ihr Basenpaarungsverhalten von Cytosin unterscheidet;
b. Amplifizierung einer Nukleinsäure oder mehrerer Nukleinsäuren der behandelten Probe simultan in einer Amplifikationsreaktion, worin wenigstens zwei Oligonukleotid-Primerpaare für jede zu analysierende CpG-Position bereitgestellt werden, wobei ein Primerpaar bevorzugt in dem Fall hybridisiert, bei dem das CpG der behandelten Nukleinsäure in der Original-Probe vor der Umsetzung methyliert war, und worin weiterhin das andere Primerpaar bevorzugt in dem Fall hybridisiert, bei dem das CpG der behandelten Nukleinsäure in der Original-Probe vor der Umsetzung unmethyliert war und wobei sich die von jedem der Primerpaare gebildeten Amplifikate durch einen detektierbaren Fluoreszenzmarker unterscheiden;
c. Echtzeit-Detektion der in der Polymerasereaktion gebildeten Amplifikate in quantifizierbarer Art;...

Description

Hintergrund
Die vorliegende Erfindung betrifft die Analyse von methylierten Nukleinsäuren und insbesondere die Analyse des Methylierungsstatus einer Nukleinsäure-Probe innerhalb eines komplexen Methylierungsmusters.
Es ist bekannt, dass sich pathogene Zustände durch ein modifiziertes Methylierungsmuster einzelner Gene oder des Genoms zeigen. 5-Methylcytosin ist die am häufigsten kovalent modifizierte Base in der DNA eukaryotischer Zellen und sie spielt eine Rolle bei der Regulierung der Transkription, beim Imprinting und bei der Tumorgenese. Es hat sich gezeigt, dass abweichende Methylierungsmuster mit einer großen Auswahl von Krankheitszuständen in Zusammenhang stehen. Die Identifizierung von 5-Methylcytosin-Stellen in einer spezifischen Probe ist deshalb von erheblichem Interesse, nicht nur für die Forschung sondern insbesondere für die molekulare Diagnose verschiedener Krankheiten. Die Befähigung einen Gewebetyp, entweder erkrankt oder gesund, basierend auf seinen Methylierungsmustern zu charakterisieren, macht es erforderlich, dass Techniken zur Analyse von Komplexen von CpG-Positionen entwickelt werden.
Obwohl ein gesundes Gewebe häufig von einem Krebsgewebe mittels Co-Methylierungsanalyse unterschieden werden kann, wäre darüber hinaus ein ausgereifteres Verfahren der Tumor-Methylierungsanalyse wertvoll. Beispielsweise bestehen Tumorgewebe-Proben häufig sowohl aus Tumor- wie auch aus angrenzendem Gewebe. Dort, wo es erforderlich ist, dass die Klassifizierung des Tumorgewebetyps durchgeführt wird, muss die Analyse des Methylierungszustands multipler CpG-Stellen, sowohl für methylierte als auch für unmethylierte Varianten jeder CpG-Position durchgeführt werden. Allerdings wäre die Analyse unter Anwendung konventioneller MSP-Techniken zeitaufwending und nicht praktikabel. Eine andere Anwendung für die Analyse des Methylierungszustands multipler CpG-Stellen ist die Überwachung von Krankheitsprogression. Wenn ein Krankheitszustand mittels des abweichenden Methylierungszustands von CpG-reichen Inseln identifiziert wird, dann muss die Analyse auf CpG-Positionen innerhalb einer Gewebe- oder Zellprobe ausgerichtet werden, welche sowohl methylierte als auch unmethylierte Kopien der gleichen CpG-Position enthalten kann. Auch die Untersuchung einer solchen Probe unter Verwendungen von Techniken wie Bisulfit-Sequenzierung und MSP-Analyse ist wiederum zeitaufwendig und nicht praktikabel.
Die kovalente Bindung einer Methylgruppe an die C5-Position der Nukleotid-Base Cytosin tritt insbesondere häufig in CpG-Dinukleotiden von regulatorischen Genregionen auf. Die Häufigkeit des Auftretens eines jeden speziellen Dinukleotids in einer vorgegebenen DNA-Sequenz ist 1/16 oder ~6%. Beim Menschen ist jedoch die gemessene durchschnittliche Häufigkeit des CpG-Dinukleotids sehr gering – ungefähr 1/70. Trotzdem existieren zusammenhängende Genomregionen mit einer Länge von 300 bp bis 3000 bp, in welchen das Auftreten von CpG-Dinukleotiden wesentlich größer ist als normal. Diese CpG-reichen Regionen werden im Stand der Technik als CpG-”Inseln” bezeichnet und machen ungefähr 1% des Genoms aus. Solche CpG-Inseln sind erstmalig in der 5'-Region von Genen beobachtet worden und mehr als 60% der menschlichen Promotoren liegen in solchen CpG-Inseln oder überlappen mit diesen.
Das am häufigsten angewendete Verfahren zur Untersuchung von DNA oder anderen Nukleinsäure-Proben auf die Anwesenheit von 5-Methylcytosin basiert auf der spezifischen Reaktion von Bisulfit mit Cytosin. Die Bisulfit-Reaktion überführt selektiv Cytosin – aber nicht 5-Methylcytosin – in Uracil, welches in seinem Basenpaarungsverhalten mit Thymin korrespondiert. Nach der DNA-Behandlung mittels der Bisulfit-Reaktion kann 5-Methylcytosin mittels molekularbiologischer Standardverfahren als einziges verbliebenes Cytosin – beispielsweise durch Amplifikation und Hybridisierung oder Sequenzierung – nachgewiesen werden, wohingegen 5-Methylcytosin in einer unbehandelten DNA-Probe nicht von Cytosin mittels seines Hybridisierungsverhaltens unterschieden werden kann.
Eine behandelte DNA-Probe kann unter Verwendung von Verfahren, die auf der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) basieren, einschließlich PCR in Kombination mit Bisulfit-Behandlung der DNA, um unmethylierte Cytosine in Uracil zu überführen, analysiert werden. Allerdings macht die reduzierte Sequenzkomplexität von Bisulfit-behandelter DNA die Nukleinsäure-Analyse unter Verwendung von molekularbiologischen Standardtechniken wie PCR und Hybridisierungsanalyse schwieriger. Typische Probleme bei der PCR schließen erhöhte Kreuzhybridisierungslevel, Mispriming, falsch-positive Ergebnisse für die Methylierung und Schwierigkeiten bei der Identifizierung hypermethylierter Allele in kleinen Proben ein.
Um die Nachteile bei der Verwendung von PCR und Bisulfit-Behandlung zur Detektion methylierter Nukleinsäuren zu überwinden, beschrieben Herman et al. ( US-Pat. Nr. 5786146 ) die Verwendung von methylierungsempfindlichen Primern und ein Verfahren zur Detektion eines methylierten CpG in einer Nukleinsäure – methylierungsspezifische PCR (”MSP”). Herman et al. beschreiben die Verwendung von Oligonukleotid-Primerpaaren, die spezifisch für methylierte, im Gegensatz zu unmethylierten Allelen in Nukleinsäuren sind, zur Amplifikation von DNA-Proben, wobei die Anwesenheit oder Abwesenheit eines Amplifikats dadurch anzeigt, dass der Methylierungsstatus einer Gruppe von CpG-Positionen innerhalb einer CpG-Insel der Probe – das heißt ob irgendeine CpG-Position innerhalb einer Gruppe von Positionen, die durch die Forward- und Reverse-Primer abgedeckt wird, methyliert ist.
Das Verfahren wird von Herman et al. als nur zur Detektion einer unmethylierten im Gegensatz zu einer methylierten Position innerhalb CpG-reicher Regionen geeignet beschrieben. Das Verfahren ist weniger zugänglich für die Analyse komplexer Methylierungsmuster oder die Quantifizierung des Methylierungsgrads an einer spezifischen CpG-Position in einer Probe. Gemäß der Beschreibung erlaubt das Verfahren nur eine semi-quantitative Bewertung des Methylierungsgrads und ist deshalb nicht für eine detaillierte Analyse von hypermethylierter DNA innerhalb von Promotor-Regionen geeignet. Die Verwendung von MSP hat sich als insbesondere zur Detektion hypermethylierter regulatorischen Genregionen geeignet erwiesen. Jedoch ist das Verfahren, wie von Herman et al. beschrieben, nur zur Detektion von hypermethylierten im Vergleich zu nicht-methylierten Positionen innerhalb von CpG-reichen Regionen geeignet. Dieses Verfahren ist weniger zugänglich für die Analyse komplexer Methylierungsmuster oder die Quantifizierung des Methylierungsgrads an einer spezifischen CpG-Position in einer Probe.
Im Besonderen wurde bei gegenwärtigen Verfahren der CpG-Methylierungsanalyse, einschließlich Bisulfit-Behandlung, gefolgt von Nukleinsäureamplifikation unter Verwendung methylierungsspezifischer PCR (MSP) und methylierungsspezifischer Primer, nicht die Verwendung multipler Primerspezies, zur Quantifizierung des Methylierungsgrads in einer Probe, gezeigt. Wie in Laird et al. ( US-Pat. Nr. 6331393 B1 ) offenbart, ist das Verfahren von Herman et al. eine qualitative und keine quantitative Technik. Die Verwendung zweier getrennter, unterschiedlicher PCR-Reaktionen bei der MSP (methyliert und unmethyliert) ergibt Schwierigkeiten bei der Durchführung eines kinetischen Vergleichs zwischen den Reaktionen. Weiterhin kann die Verwendung von gepaarten Primern bei der MSP, welche häufig eine DNA-Sequenz abdecken, die mehr als ein CpG-Dinukleotid enthält, nur eine von multiplen möglichen Sequenzvarianten darstellen. Aus diesem Grund wird das Verfahren von Herman et al. als nicht-quantitativ beschrieben, da es auf dem Auftreten oder Nicht-Auftreten eines PCR-Produkts in der vollständig methylierten, im Gegensatz zur unmethylierten Reaktion, basiert.
Deshalb wird offensichtlich, dass MSP keine vielseitige Technik für die Analyse komplexer Methylierungsmuster ist. Zur Untersuchung des Methylierungsstatus einer Sequenz, die sowohl methylierte als auch unmethylierte Cytosin-Positionen enthalten kann, muss eine große Anzahl von Primern, welche jede mögliche Kombination von methylierten und nicht-methylierten CpG-Positionen abdecken, designed und getestet werden. Das ist wirtschaftlich nicht praktikabel, zeitaufwendig, teuer und arbeitsintensiv. Diese Problem würden auch dort noch offensichtlicher werden, wo das Verfahren im Rahmen großer Durchsatzmengen eingesetzt wird, wo die Aufrechterhaltung der Datenqualität schwer zu steuern sein kann und falsches Annealing von Primern auch zu einer nicht korrekten Interpretation der Daten führen kann. Ein weiterer Nachteil des Verfahrens, wie es von Herman et al. beschrieben wurde, ist, dass obwohl das Verfahren die Detektion methylierter Sequenzen in einer Probe ermöglicht, es nicht die Quantifizierung oder absolute Messung der in einer Probe vorliegenden Menge an methylierten Sequenzen gestattet.
Deshalb ist ein verbessertes Verfahren zur Bewertung des CpG-Methylierungsstatus erforderlich um, neben anderen Gründen, ein verlässliches, quantitatives Mittel bereitzustellen, das die Analyse des Methylierungsgrads an einer spezifischen CpG-Position gestattet und die simultane Analyse des Methylierungsstatus aller CpG-Dinukleotide in einer Probe erlaubt, wodurch die Untersuchung der komplexen epigenomischen Signifikanz multipler CpG-Stellen in Bezug auf phenotypische Variation vorangetrieben werden kann.
Eads CA et al., Nucleic Acids Research 2000, 28(8) E32 beschreibt einen Hochdurchsatzverfahren zur Messung der DNA-Methylierung namens ”MethylLight. Herman JG et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 1996, 93 (18), 9821–6 beschreibt eine methylierungsspezifische PCR als Verfahren zur Bestimmung des Methylierungsstatus von CpG Inseln. Herman JG et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 1998, 95 (12), 6870–5 beschreibt die Inzidenz und funktionale Konsequenzen der Hypermethylierung des hNLHl Promoters beim kolorektalen Karzinom.
Zusammenfassung der Erfindung
Das erfindungsgemäße Verfahren stellt ein Mittel zur Analyse komplexer Methylierungsmuster in biologischen Proben durch die Verwendung multipler Paare methylierungsspezifischer Primer bereit. Nachdem unmethylierte Cytosin-Basen in einer Nukleinsäure-Probe durch die Bereitstellung eines Umsetzungs-Agens, das methylierte Cytosine nicht verändert, in Uracil-Basen überführt wurden, werden ausgewählte Segmente der umgesetzten Nukleinsäure-Probe simultan in einer Polymerasereaktion, bei der mindestens zwei Oligonukleotid-Primerpaare eingesetzt werden, derart amplifiziert, dass die gebildeten Amplifikate unterscheidbar in Echtzeit detektierbar und quantifizierbar sind. Ein Primerpaar bindet bevorzugt an eine behandelte Nukleinsäuren, die in der Sequenz, an die der Primer hybridisiert, ursprünglich methyliert war. Ein anderes Primerpaar bindet bevorzugt an behandelte Nukleinsäure, die in der Sequenz, an die der Primer hybridisiert, ursprünglich unmethyliert war. Ein drittes Oligonukleotid-Primerpaar kann verwendet werden, um eine Sequenz zu amplifizieren, die als Referenz-Sequenz fungiert. Der Methylierungsgrad in mindestens einem der ausgewählten Segmente der Nukleinsäure-Probe wird basierend auf den relativen Unterschieden in den Amplifikaten bestimmt, die durch jedes der Oligonukleotid-Primerpaare gebildet wurden.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist ein Diagramm, das ein Verfahren der MSP-Amplifikationgemäß dem Stand der Technik zeigt.
2 ist ein Flussdiagramm eines bevorzugten Ausführungsbeispiels der Erfindung.
Beschreibung veranschaulichender Ausführungsbeispiele
Eine erfindungsgemäße Ausführungsform stellt ein Verfahren zur Analyse von Methylierungsmustern in Nukleinsäuren, einschließlich der Analyse von CpG-reichen Inseln, bereit. Multiple Spezies von Primeroligonukleotiden werden verwendet um eine Nukleinsäure-Probe zu amplifizieren. Die relativen Mengen der Amplifikate werden detektiert, wodurch eine detaillierte, spezifischere und quantifizierbare Analyse des Methylierungsstatus einer Nukleinsäure-Probe innerhalb eines komplexen Methylierungsmusters ermöglicht wird. Erfindungsgemäß bedeutet ein komplexes Methylierungsmuster den Methylierungsgrad an einer CpG-Position oder mehreren CpG-Positionen, wobei der Methylierungsgrad mittels der relativen Menge von methylierten zu nicht-methylierten Nukleinsäuren in der Probe bestimmt wird.
1 zeigt ein Verfahren der MSP-Amplifikation gemäß dem Stand der Technik – eine typische MSP Polymerasegestützte Amplifikation einer CpG-reichen Sequenz unter Verwendung methylierungsspezifischer Primer an vier repräsentativen Bisulfit-behandelten DNA-Strängen (A–D) (”MSP Amplifikation”). In dem in Herman et al. ( US-Pat. Nr. 5786146 ) offenbarten Verfahren, sind die Primer komplementär zur Bisulfit-umgesetzten Target-Sequenz, die ein CG-Dinukleotid einschließt, d. h., dass die Primer an Positionen hybridisieren, die in der Original-Nukleinsäure-Probe methyliert waren. Amplifikat-Nukleinsäuren werden dann detektiert, wodurch die Anwesenheit einer methylierten Nukleinsäure in der Probe angezeigt wird. Alternativ können die Primer ein 'TG'- oder 'CA'-Dinukleotid an Stelle des 'CG'-Dinukleotids umfassen, wodurch eine unmethylierte Version der Target-Nukleinsäure amplifiziert und deren Detektion ermöglicht wird. In einer weiteren Veranschaulichung des Standes der Technik kann die Verwendung von zwei Primerspezies in einer Reaktion kombiniert werden, welche zur Analyse heterogener Proben geeignet ist.
In 1 können die methylierungsspezifischen Forward-Primer 1a, 1b, 1c und 1d beziehungsweise die Reverse-Primer 1a', 1b', 1c' und 1d' an den Bisulfitehandelten DNA-Strängen A-D, an den Bisulfit-behandelten DNA-Strang 3a anlagern, wenn die korrespondierenden genomischen Subjekt-CpG-Sequenzen methyliert waren. Die Bisulfit-behandelten DNA-Stränge können amplifiziert werden, wenn sich sowohl die Forward- als auch die Reverse-Primer anlagern, wie es bei Strang A gezeigt ist. Dunkle kreisförmige Markierungen (2) an den DNA-Strängen 3a, 3c, und 3d repräsentieren methylierte, mit Bisulfit umgesetzte CpG-Positionen, wohingegen weiße kreisförmige Positionen (4) unmethylierte mit Bisulfit umgesetzte Positionen repräsentieren.
Im oberen Beispiel repräsentiert Strang A den Fall, bei dem alle genomischen Subjekt-CpG-Positionen co-methyliert waren und sowohl Forward- als auch Reverse-Primer sind dadurch in der Lage, sich an der korrespondierenden behandelten Nukleinsäure anzulagern und diese zu amplifizieren. Bei Strang B war keine der genomischen Subjekt-CpG-Positionen methyliert und deshalb lagert sich keiner der Primer an die korrespondierende behandelte Nukleinsäure-Sequenz an und die Sequenz wird nicht amplifiziert. Bei Strang C sind die drei genomischen Subjekt-CpG-Positionen, die durch die Forward- und Reverse-Primer abgedeckt werden, nicht co-methyliert (nur eine der Positionen ist methyliert) und deshalb lagern sich die Primer im Anschuss an die Bisulfit-Behandlung der DNA nicht an. Bei Strang D waren die die durch den Reverse-Primer abgedeckten Positionen methylierte CpG-Sequenzen in der genomischen Subjekt-DNA und der Reverse-Primer lagert sich deshalb an die korrespondierende Bisulfit-behandelte Sequenz an. Es gibt jedoch keine exponentielle Amplifikation der korrespondierenden Bisulfit-behandelten DNA-Sequenz weil die mit dem Forward-Primer abgedeckten genomischen Subjekt-CpG-Positionen nicht methyliert waren und der Forward-Primer sich nicht anlagert. Wie in Laird et al. im US-Pat. Nr. 6331393 B1 offenbart, ist das Verfahren von Herman et al. nicht quantitativ, weil die in Herman et al. verwendeten gepaarten Primer nur eine von multiplen möglichen Sequenzvarianten repräsentieren können und es auf dem Vorhandensein eines PCR-Produkts in der vollständig methylierten gegenüber der vollständig unmethylierten Reaktion basiert.
Im Stand der Technik wird deshalb offensichtlich, dass MSP weder eine ausreichend vielseitige noch eine praktikable Technik für die Analyse komplexer Methylierungsmuster ist. Zur Untersuchung des Methylierungsstatus einer Sequenz mittels MSP, welche sowohl methylierte als auch nicht-methylierte Cytosin-Positionen enthalten kann, muss eine große Anzahl von Primern, welche jede mögliche Kombination von methylierten und nicht-methylierten CpG-Positionen abdecken, designed und getestet werden. Das ist wirtschaftlich nicht praktikabel, zeitaufwendig, arbeitsintensiv und teuer und wirtschaftlich nicht realisierbar. Diese Probleme würden dort noch offensichtlicher werden, wo das Verfahren im Rahmen großer Durchsatzmengen eingesetzt wird, wo die Aufrechterhaltung der Datenqualität schwer zu steuern sein kann und falsches Annealing von Primern zu einer nicht korrekten Interpretation der Daten führen kann. Ein weiterer Nachteil des Verfahrens, wie es von Herman et al. beschrieben wurde, ist, dass obwohl das Verfahren die Detektion methylierter Sequenzen in einer Probe ermöglicht, es nicht die Quantifizierung oder absolute Messung der in einer Probe vorliegenden Menge an methylierten Sequenzen gestattet.
Im Gegensatz zum Stand der Technik stellt die gegenwärtige Erfindung ein Verfahren zur Analyse von Methylierungsmustern in Nukleinsäuren, einschließlich der Analyse CpG-reicher Inseln bereit. In einem ersten Ausführungsbeispiel stellt das Verfahren ein Mittel zur Analyse des Methylierungsgrads einer einzelnen CpG-Position bereit. Dieses wäre dort anwendbar, wo eine Probe heterogenen Ursprungs ist – zum Beispiel dort, wo multiple Proben einer Kategorie gepoolt werden, wobei das beschriebene Verfahren ein Mittel zur Bestimmung des durchschnittlichen Auftretens von Methylierung in dem Probensatz bereitstellen würde. Ein zweites Ausführungsbeispiel des Verfahrens stellt ein Mittel zur Analyse multipler CpG-Positionen in einer Probe bereit, so dass die relativen Mengen an Methylierung an jeder Position mittels Kalibrierung mit einer Referenz-Sequenz abgeleitet wird.
In dem ersten Ausführungsbeispiel werden in einer genomischen DNA-Probe Cytosin-Basen, die in der 5-Position unmethyliert sind, durch die Behandlung mit einem Agens, z. B. Bisulfit, in Uracil oder eine andere Base überführt, die sich in Bezug auf ihr Basenpaarungsverhalten von Cytosin unterscheidet. Eine Nukleinsäure oder mehrere Nukleinsäuren der behandelten Probe werden simultan in einer Amplifikationsreaktion mittels zweier oder mehrerer Primeroligonukleotid-Paare für jede zu analysierende CpG-Position amplifiziert. Ein Primerpaar hybridisiert bevorzugt, wenn die CpG-Position vor der Bisulfit-Behandlung methyliert war, und ein anderes Primerpaar hybridisiert bevorzugt, wenn die CpG-Position vor der Bisulfit-Behandlung unmethyiert war. Die durch jedes Primerpaar gebildeten Amplifikate unterscheiden sich durch einen detektierbaren Fluoreszenzmarker und werden in Echtzeit detektiert und gemessen, wodurch die Bestimmung des Methylierungsgrads an jeder analysierten CpG-Position mittels des Vergleichs der Mengen der entsprechenden Amplifikate ermöglicht wird.
Die folgende Beschreibung betrifft ein Ausführungsbeispiel der Erfindung, das mittels des Flussdiagramms in 2 veranschaulicht wird, ist jedoch nicht auf dieses begrenzt. Erfindungsgemäß wird eine Probe einer Nukleinsäure, zum Beispiel DNA, zuerst aus Gewebe oder zellulären Quellen extrahiert (110), welche beispielsweise Gewebeproben, Zell-Linien, histologische Schnitte, Körperflüssigkeiten oder in Paraffin eingebettetes Gewebe einschließen können. Der Begriff ”Nukleinsäure” bezieht sich auf Desoxyribonukleotide oder Ribonukleotide und deren Polymere, entweder in einzel- oder doppelsträngiger Form. Der Begriff umfasst Nukleinsäuren, welche bekannte Nukleotid-Analoga oder modifizierte Rückgrat-Reste oder Bindungen, ob synthetisch, natürlich vorkommend oder nicht-natürlich vorkommend, enthalten, welche die gleichen Bindungseigenschaften besitzen wie die Referenz-Nukleinsäuren und welche in zu den Refernz-Nukleotiden analoger Weise metabolisiert werden. Beispiele solcher Analoga schließen ein, ohne Begrenzung, Phosphorthioate, Phosphoramidate, Methylphosphonate, chirale-Methylphosphonate, 2-O-Methylribonukleotide, Peptid-Nukleinsäuren (PNAs).
Zum Zweck der Veranschaulichung wird in der Darstellung des erfindungsgemäßen Ausführungsbeispiels in 2 auf DNA Bezug genommen. Die Extraktion kann mit Mitteln geschehen, die einem Durchschnittsfachmann gängig sind, einschließlich beispielsweise der Verwendung von detergenten Lysaten, Ultraschall und Verwirbeln mit Glasperlen.
Die Extraktion von DNA zur weiteren Analyse kann in einem winzigen Volumen, üblicherweise in einer Ölschicht, stattfinden, welche den Kontakt mit der Umwelt verhindert und Verluste an DNA gering hält, um auch mit kleinen Ausgangsmengen ein reproduzierbares Ergebnis bereitzustellen.
In Schritt (115), hier als ”Vorbehandlung” bezeichnet, wird die genomische DNA-Probe derart mit einem Umsetzungs-Agens behandelt, dass Cytosin-Basen, die an der 5'-Position unmethyliert sind, in Uracil, Thymidin oder eine andere Base überführt werden, die sich im Hinblick auf ihr Basenpaarungsverhalten von Cytosin unterscheidet. Beispiele von Umsetzungs-Agenzien sind Sulfit- und Disulfit-Lösungen. Ein bevorzugtes Agens ist Natriumbisulfit (NaHSO₃), welches mit der 5,6-Doppelbindung von Cytosin reagiert, was mit einer wesentlich langsameren Geschwindigkeit verläuft als die Reaktion mit methylierter Cyto sin-Base. Cytosin reagiert mit dem Bisulfit-Ion, wodurch ein sulfoniertes Cytosin als Reaktionszwischenprodukt entsteht, welches zur Deaminierung neigt, was zu einem sulfonierten Uracil führt. Die Sulfonatgruppe kann unter alkalischen Bedingungen entfernt werden, wodurch es zur Bildung von Uracil kommt.
Weil Uracil durch Polymerase als Thymin erkannt wird, enthält das aus der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) resultierende Produkt Cytosin nur an der Position, an der 5-Methylcytosin in der ursprünglichen Templat-DNA auftritt. Die Umsetzung einer genomischen Sequenz mittels Bisulfit-Behandlung resultiert gewöhnlich in der Erzeugung einer Cytosin-armen Nukleinsäure.
In dem am stärksten bevorzugten Ausführungsbeispiel des Verfahrens wird die Bisulfit-Behandlung gemäß der Agarose-Matrix durchgeführt, wie von A. Olek, J. Oswald und J. Walter, ”A modified and improved method for bisulphite based cytosine methylation analysis.” Nucleic Acids Res., 15. Dez. 1996, 24(24): 5064–6, beschrieben. In diesem Verfahren werden Zellen oder isolierte chromosomale DNA vor der Bisulfit-Behandlung in eine Agarose-Gelmatrix eingeschlossen. Durch den Einschluss der zu analysierenden Nukleinsäuren in eine feste Matrix ist der Verlust an DNA begrenzt und die Empfindlichkeit des Verfahrens wird dadurch erhöht. Weiterhin ist beobachtet worden, dass das Agarose-Bead-Verfahren der Bisulfit-Behandlung eine höhere Umsetzungsgeschwindigkeit hat als andere Verfahren.
Die verschiedenen Reaktionsschritte der Bisulfit-Reaktion sind Gleichgewichtsreaktionen, bei welchen die Gleichgewichte der zwei wichtigen Reaktionsschritte, die Sulfonierung des Cytosins und die anschließende Deaminierung, sich bei unterschiedlichen Temperaturen auf der richtigen (sulfoniert und deaminiert) Seite befinden. Deshalb ist es vorteilhaft, die Bisulfit-Reaktion unter zyklischen Bedingungen mit wechselnden Temperaturen durchzuführen. Ein bevorzugtes Ausführungsbeispiel des Verfahrens umfasst eine Änderung von ungefähr 4°C (10 min) auf 50°C (20 min). Alle anderen Temperaturen und Reaktionszeiten bei bestimmten Temperaturen sollten jedoch in dem erfindungsgemäßen Verfahren eingeschlossen sein. Zum Beispiel ist es unter bestimmten Bedingungen vorteilhaft gewesen, wenn wesentlich kürzere Reaktionszeiten eingestellt wurden. Es ist auch zweckmäßig einen Schritt einzufügen, bei welchem die zu untersuchende DNA zwischen einem Deaminierungsschritt (bei hoher Temperatur, > 50°C.) und einem nachfolgenden wiederholten Sulfonierungsschritt bei sehr hohen Temperaturen wieder denaturiert wird. Für DNA mit hohem Molekulargewicht sind die Denaturierungstemperaturen üblicherweise > 90°C, sie können aber auch niedriger sein. Bei einigen Variationen des Verfahrens sind die zu untersuchenden DNA-Fragmente sehr kurz. In anderen Fällen kann die Komplementarität zwischen Strängen zurückgehen. In einem zyklischen Protokoll kann die Denaturierungstemperatur im ersten Zyklus höher als 90°C sein, jedoch kann sie bei späteren Zyklen auf niedrigere Werte reguliert werden.
Die DNA-Extraktion kann, wie in Olek et al. beschrieben, in einem winzigen Volumen, zum Beispiel 1 μl, aber auch mit kleineren oder größeren Volumina, unter einer Ölschicht durchgeführt werden. Nachdem die DNA-Probe denaturiert wurde, wird dann die erforderliche Bisulfit-Konzentration durch die Addition eines größeren Volumens einer Bisulfit-Lösung (zum Beispiel 4 μl) hinzugefügt, was etwas mehr ist als zur ordnungsgemäßen Behandlung erforderlich ist, so dass die erforderliche Endkonzentration und der pH sich automatisch unter dem Öl einstellen. Anschließend wird die Bisulfit-Behandlung nach einem der oben beschriebenen Verfahren durchgeführt.
Gemäß einem erfindungsgemäßen Ausführungsbeispiel wird die vorbehandelte Nukleinsäure dann als Basis für eine CpG-Stellen-Analyse verwendet, die auf einer Ampli fikationsreaktion, wie einer Polymerase, basiert. ”Amplifikationsreaktion” bezieht sich auf jede chemische, ein schließlich enzymatische, Reaktion, die zu erhöhten Kopien einer Templat-Nukleinsäure-Sequenz führt, wie zum Beispiel PCR, ist jedoch nicht darauf begrenzt. In diesem Zusammenhang können thermostabile Polymerasen jeglichen Ursprungs verwendet werden. Der verwendete Polymerase-Typ ist nicht wesentlich und er kann auch in Abhängigkeit der vorliegenden Puffer-Bedingungen variiert werden. Diese Lösung enthält eine solche Polymerase und alle Nukleotide und die erforderlichen Oligonukleotid-Primer. Nach der Zugabe dieser Lösung kann daher eine Amplifikation direkt im gleichen Reaktionsbehälter stattfinden.
Die Amplifikation kann unter Verwendung von zwei oder mehr Oligonukleotid-Primerpaaren durchgeführt werden, wobei zwei Primerpaare bei der Analyse einer jeden CpG-Position benutzt werden. In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel des Verfahrens werden zwei Primerpaare (125, 130) bei der Amplifikation jeder Target-Sequenz verwendet, wobei die Target-Sequenz mindestens eine zu analysierende CpG-Position umfasst. Ein Primerpaar lagert sich spezifisch an die Target-Sequenz an, die vor der Bisulfit-Behandlung unmethyliert war und das andere Primerpaar lagert sich, in dem Fall, dass die Sequenz vor der Bisulfit-Behandlung methyliert war, an dieselbe Target-Sequenz an.
Gemäß einem erfindungsgemäßen Ausführungsbeispiel besteht jedes Paar Amplifikationsprimer aus einem ersten (Forward) und einem zweiten (Reverse) Primer, wie es in vielen Amplifikationsverfahren, wie bei der Polymerase-Kettenreaktion (PCR), Standard ist. Es ist erforderlich, dass jedes der Primerpaare aus wenigstens einem methylierungsspezifischen Primeroligonukleotid besteht. Methylierungsspezifischer Primer bezieht sich auf ein Primeroligonukleotid für die Verwendung bei der Amplifikation einer methylierungsdiskriminierenden Bisulfit-behandelten Nukleinsäure (oder gleichartig umgesetzter Nukleinsäure), wobei der Primer wenigstens ein CpG- oder CpA-Dinukleotid in seiner Sequenz enthält. Wie beispielsweise im US-Patent Nr. 5786146 von Herman et al. beschrieben, bestehen MSP-Primer aus einem Oligonukleotid, das spezifisch für das Annealing an eine Nukleotidsequenz ist, die wenigstens ein Bisulfit-behandeltes CpG-Dinukleotid enthält. Gemäß diesem Ausführungsbeispiel des Verfahrens umfasst deshalb das Primerpaar, das bevorzugt an die Target-Nukleinsäure hybridisiert, die vor der Bisulfit-Behandlung methyliert war, ein CpG-Dinukleotid an der zu untersuchenden CpG-Position, und das Primerpaar, das bevorzugt an die Target-Nukleinsäure hybridisiert, die vor der Bisulfit-Behandlung unmethyliert war, umfasst ein TpG- oder CpA-Dinukleotid an der CpG-Position. Methylierungsspezifische Primer enthalten allgemein relativ wenige Cytosine, da Cytosine durch die Bisulfit-Reaktion umgesetzt werden. Wenn die Primer jedoch spezifisch für methylierte Cytosin-Dinukleotide sind, werden die Cytosin-Positionen in den Primer-Oligonukleotiden konserviert. Deshalb enthält die Sequenz der Primer wenigstens ein CpG-, TpG-, oder CpA-Dinukleotid. MSP-Primer enthalten üblicherweise relativ wenige Cytosine, da Cytosine durch die Bisulfit-Reaktion umgesetzt werden. Wenn die Primer jedoch spezifisch für methylierte Cytosin-Dinukleotide sind, werden Cytosin-Positionen in den Primer-Oligonukleotiden konserviert.
Das Design methylierungsspezifischer Primer kann unter Verwendung von Software, wie ”Primo MSP 3.4.”, durchgeführt werden. Es ist bevorzugt, dass das Design von methylierungsspezifischen Primern gemäß der folgenden Richtlinien durchgeführt wird:

• Primer sollten wenigstens eine CpG-Stelle in ihrer Sequenz besitzen und die CpG-Stelle sollte sich bevorzugt am äußersten 3'-Ende ihrer Sequenz befinden, um methylierte DNA von unmethylierter DNA zu unterscheiden.
• Primer sollten eine minimale Anzahl von Nicht-CpG-Cytosinen in ihrer Sequenz besitzen, um nur Bisulfit- umgesetzte DNA zu amplifizieren. Primer mit mehr Nicht-CpG-Cytosinen sind bevorzugt, da die Bisulfit-Umsetzung in manchen Fällen unvollständig sein kann.
• Der Primer-Satz für methylierte DNA und der Satz für unmethylierte DNA sollte die gleichen CpG-Stellen in seiner Sequenz haben. Wenn zum Beispiel ein Forward-Primer für methylierte DNA diese Sequenz hat: ATTAGTTTCGTTTAAGGTTCGA, muss der Forward-Primer für unmethylierte DNA auch die beiden CpG-Stellen wie der methylierte Forward-Primer haben. Sie können sich jedoch in ihrer Länge und ihrer Startposition unterscheiden.
• Beide Primersätze sollten eine ähnliche Annealing-Temperatur haben. In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel sind alle Primer verlängert, insbesondere mittels einer Polymerasereaktion. Wenn eine Polymerase verwendet wird ist die resultierende doppelsträngige Nukleinsäure denaturiert, bevorzugt mittels Wärmebehandlung. Es werden aufeinander folgende Zyklen von Primer-Annealing, Extension und Denaturierung entsprechend der Polymerase-Kettenreaktion durchgeführt, wie im Stand der Technik bekannt ist.

In den obigen Ausführungsbeispielen werden die von jedem der Primerpaare gebildeten Amplifikate gemessen und die Menge der durch jeden Primer gebildeten Amplifikate wird bestimmt.
Die Amplifikationsreaktion (120) erzeugt Amplifikate von allen Primer-Spezies, die von jenen unterscheidbar sind, die jeweils von den anderen Primerpaaren gebildet werden. Deshalb ist es erforderlich, dass aufgrund ihrer Länge, Sequenz oder mittels eines detektierbaren Markers (155) unterscheidbar ist. sich die von jedem der Primer paare gebildeten Amplifikate durch einen detektierbaren Fluoreszenzmarker unterscheiden.
Wenn die Amplifikate aufgrund ihrer Länge getrennt werden, kann das durch jegliches chromatographische Mittel, das im Stand der Technik bekannt ist (150), zum Beispiel Gel-Elektrophorese, durchgeführt werden. Die getrennten Fragmente können dann zum Beispiel durch Anfärben mittels Ethidiumbromid oder mittels Hybridisierung mit markierten Sonden (Southern Blot) sichtbar gemacht werden und die Menge einer Amplifikat-Spezies relativ zu einer anderen kann mittels der Größe der entsprechenden Banden bestimmt werden. Bei der Bestimmung des Methylierungsgrads einer jeden analysierten CpG-Position, kann dann die Menge einer Amplifikat-Spezies im Verhältnis zu einer anderen mittels der Größe der entsprechenden Banden bestimmt werden.
Die anschließende Messung des Auftretens jeder Amplifikat-Spezies wird in der Lösung mittels der Inkorporation einer detektierbaren Markierung (155) durchgeführt. Ausgeführt wird dies durch Fluoreszenz-Markierung jeder Primer-Spezies. Üblicherweise werden auf diesem Gebiet fluoreszent markierte Nukleinsäuren verwendet und eine breite Auswahl von Fluoreszenzmolekülen ist für die Verwendung in dem erfindungsgemäßen Verfahren geeignet. Die Bindung des Fluoreszenzmarkers an die Primer ist im Stand der Technik bekannt. Die einfache Bindung von Cy3- und Cy5-Farbstoffen an das 5'-OH der Primer ist insbesondere für Fluoreszenzmarkierungen geeignet. Cy3- und Cy5-Farbstoffe sind, wie viele geeignete Fluoreszenz-Moleküle, kommerziell erhältlich. Die Detektion (145) der Fluoreszenz der hybridisierten Sonden kann beispielsweise mittels eines konfokalen Mikroskops erfolgen. Alternativ kann die Amplifikat-Synthese in Echtzeit mittels Fluoreszenzpolarisation beobachtet werden, wie zum Beispiel in den deutschen Patenten DE 101 04 938 und DE 100 65 814 , K. Berlin und J. Distler beschrieben.
Eine große Auswahl von Fluorophoren ist für die Verwendung in Fluoreszenzpolarisationstechniken geeignet. Die Auswahl geeigneter Fluorophore ist im Stand der Technik bekannt. Bevorzugte Fluorophore schließen ein, sind aber nicht begrenzt auf, 5'-Carboxyfluorescein (FAN), 6-Carboxy-X-Rhodamin (ROX), N,N,N',N',-Tetramethyl-6-carboxy-X-rhodamin (TMR), BODIPY-Texasrot (BTR), CY5, CY3, FITC, DAPI, HEX und TET. Die Länge der Linker, die verwendet werden um die Fluorophore an die Basen der Nukleinsäuren zu binden, sollte minimal gehalten werden während maximale Steifheit erreicht wird. Kurze und/oder steife Linker minimieren die Bewegung des Fluorophors relativ zum Oligonukleotid, wodurch die Empfindlichkeit des Assays erhöht wird. Die Empfindlichkeit der Detektion der Fluoreszenzpolaristaion kann weiterhin erhöht werden, indem die Rotationsbeweglichkeit der Bisulfit-behandelten DNA oder des Primers durch Erhöhung ihrer Masse verringert wird.
In einem weiteren bevorzugten Ausführungsbeispiel kann der Detektionsschritt (145) für synthetisierte Amplifikate gleichzeitig mit der Amplifikationsreaktion (120) durchgeführt werden. Zum Beispiel kann die PCR-Amplifikation derart durchgeführt werden, dass alle Amplifikate eine detektierbare Markierung tragen. Es kann eine Auswahl von Markierungen, die im Stand der Technik Standard sind, verwendet werden, einschließlich, aber nicht begrenzt auf, Fluoreszenmarkern, insbesondere Fluoreszenzpolarisationsmarkern. In diesem Ausführungsbeispiel des Verfahrens werden die Amplifikate mittels Oligonukleotid-Sonden detektiert, welche gleichzeitig mit der Amplifikation der Nukleinsäure-Probe an die Bisulfit-behandelte DNA hybridisieren.
Ein insbesondere bevorzugtes Ausführungsbeispiel dieses Verfahrens ist die Verwendung von fluoreszenz-basierter quantitativer Real-Time-PCR (Held et al., Genome Res. 6: 986–994, 1996, siehe auch United States Pat. Nr. 6331393 B1 , Laird et al.). Es gibt zwei bevorzugte Ausführungsbeispiele der Durchführung dieses Verfahrens. Ein Ausführungsbeispiel, bekannt als das TaqMan^TM-Assay, verwendet eine doppelt-markierte fluoreszente Oligonukleotid-Sonde. Die TaqMan^TM-PCR-Reaktion nutzt die Verwendung eines nicht verlängerbaren abfragenden (”nonextendible interrogating”) Oligonukleotids, TaqMan^TM-Sonde genannt, welche derart designed ist, dass sie an eine Target-Sequenz hybridisiert, die sich zwischen den Forward- und Reverse-Amplifikationsprimern befindet. Die TaqMan Sonde umfasst weiterhin einen fluoreszenten ”Reporter-Teil” und einen ”Quencher-Teil”, der kovalent gebunden an einen Linker-Teil (z. B. Phosphoramidite) ist, welcher an die Nukleotide des TaqMan^TM-Oligonukleotids gebunden ist. Hybridisierte Sonden werden ausgetauscht und mittels der Polymerase der Amplifikationsreaktion abgebaut, wodurch es zu einem Anstieg der Fluoreszenz kommt. Zur Analyse der Methylierung in Nukleinsäuren im Anschluss an die Bisulfit-Behandlung ist es weiterhin bevorzugt, dass die Sonde methylierungsspezifisch ist, wie in Laird et al. beschrieben wurde (hiermit in ihrer Gesamtheit als Referenz einbezogen), auch bekannt als MethyLight^TM-Assay. Die zweite bevorzugte Ausführungsform dieser Technologie ist die Doppelsonden-Technologie (Lightcycler^TM). Jede Sonde trägt einen Fluoreszenz-Donor- oder Fluoreszenz-Empfänger-Rest, wobei die Hybridisierung zweier benachbarter Sonden durch einen Anstieg fluoreszierender Amplifikationsprimer angezeigt wird. Diese Technik kann auch derart angepasst werden, dass sie zur Methylierungsanalyse von CpG-Dinukleotiden in den Amplifikaten geeignet ist.
Der Methylierungsgrad wird an jeder CpG-Position aus dem Verhältnis zwischen der Menge an Amplifikat, die von methylierten und nicht-methylierten Primern an jeder analysierten CpG-Position gebildet wird, abgeleitet (170).
In dem zweiten bevorzugten Ausführungsbeispiel, dargestellt in 3, werden mindestens drei Primer-Oligonukleotid-Paare bei der Amplifikation verwendet. Ex traktion (310), Bisulfit-Behandlung (315) und Amplifikation (320) werden wie in der ersten Ausführungsform durchgeführt, die unter Bezugnahme auf 2 beschrieben wurde. Ein Primerpaar (330) amplifiziert eine Referenz-Sequenz und wenigstens zwei Primerpaare sind spezifisch für eine Target-CpG-Position oder -Positionen (325). Von den Primerpaaren gebildete Amplifikate werden detektiert und gemessen (345), wie es für das in 2 dargestellte Ausführungsbeispiel beschrieben wurde (145). Es wird quantitative Echtzeit-Analyse (322) zur Detektion und Messung von Amplifikaten (345) eingesetzt. In Schritt (370) wird der Methylierungsgrad der zu analysierenden Sequenz aus dem Verhältnis zwischen der Menge an Amplifikat, das von jedem methylierungsspezifischen Primer gebildet wird und der Menge an Amplifikat abgeleitet, das vom Referenz-Primer gebildet wird.
In einem dritten bevorzugten Ausführungsbeispiel stellt die Erfindung ein Verfahren zur Analyse des Methylierungsstatus eines CpG-Dinukleotids oder mehrerer CpG-Dinukleotide in einer Nukleinsäure-Probe bereit. Die zu analysierende Nukleinsäure wird derart mit einem Umsetzungs-Agens behandelt, dass Cytosin-Basen, die an der 5-Position unmethyliert sind, in Uracil oder eine andere Base umgesetzt werden, die sich im Hinblick auf ihr Basenpaarungsverhalten von Cytosin unterscheidet. Methylierungsspezifische Primerpaare werden zur Amplifikation von einer Target-Nukleinsäure oder mehrerer Target-Nukleinsäuren der behandelten Nukleinsäure und einer Referenz-Probe oder mehrerer Referenz-Proben verwendet. Die simultane Amplifikation wird mittels einer Polymerase-Enzymreaktion mit Hilfe von einem methylierungsspezifischen Primeroligonukleotid-Paar oder zwei methylierungsspezifischen Primeroligonukleotid-Paaren pro CpG-Position durchgeführt, so dass sich die durch jede Primerpaar-Spezies gebildeten Amplifikate unterscheiden in einer detektierbaren Fluoreszenz-Markierung. Die durch die Primerpaare in jeder Probe gebildeten Amplifikate werden in Echtzeit detektiert und die Menge der durch jedes Primerpaar in jeder Probe gebildeten Amplifikate werden gemessen. In dem Verfahren wird der Umfang der Methylierung in der behandelten Sequenz an jeder analysierten CpG-Position durch die Bestimmung der Menge an Amplifikat, das in der behandelten Probe gebildet wurde, im Vergleich zur Menge an Amplifikat, das in der beziehungsweise den Referenzprobe(n) für jedes Primerpaar gebildet wurde, abgeleitet.
In diesem Ausführungsbeispiel kann die methylierte Version entweder eine vollständig methylierte Version der zu analysierenden Sequenz oder eine vollständig unmethylierte Version der zu analysierenden Sequenz sein. Es ist jedoch insbesondere bevorzugt, dass beide Referenz-Proben verwendet werden. Die vollständig methylierte Referenz-Probe kann durch jedes verfügbare Mittel hergestellt werden oder von einer kommerziellen Quelle bezogen werden. In einem Ausführungsbeispiel kann sie durch die Behandlung einer Nukleinsäure-Probe (aus klinischen Quellen oder von kommerziellen Anbietern) mit dem Enzym SssI Methylase und einem geeigneten Methyldonor-Co-Faktor wie S-Adenosylmethionin in einer geeigneten Pufferlösung (zum Beispiel Mss1-Puffer) bei einer geeigneten Temperatur (bevorzugt 37 Grad) über einen geeigneten Zeitraum (beispielsweise, aber nicht begrenzt auf, sechzehn Stunden) hergestellt werden. Die vollständig unmethylierte Referenz-Probe kann durch jedes verfügbare Mitte hergestellt werden oder von einer kommerziellen Quelle bezogen werden. In einem Ausführungsbeispiel kann sie mittels enzymatischer Amplifikation einer Proben-Nukleinsäure (aus klinischen Quellen oder von kommerziellen Anbietern) unter Verwendung von Standard-Mitteln, wie Polymerase-Kettenreaktion, hergestellt werden.
Die Bisulfit-Behandlung der Test- und Referenz-Proben wird wie in den vorher beschriebenen Ausführungsbeispielen durchgeführt. Die behandelte Test-Probe und die Referenz-Probe(n) wird beziehungsweise werden dann unter Verwendung von einem Primerpaar oder mehreren Primerpaaren amplifiziert. Es ist bevorzugt, dass jede CpG-Position unter Verwendung von sowohl den methylierten strangspezifischen Primerpaaren (d. h., worin der Primer ein CpG-Dinukleotid oder mehrere CpG-Dinukleotide umfasst), als auch dem unmethylierten strangspezifischen Primerpaar (d. h., worin der Primer ein TpG- oder CpA-Dinukleotid oder mehrere TpG- oder CpA-Dinukleotide umfasst) analysiert wird. Das Verfahren ist jedoch auch noch mittels der Verwendung von nur einer Primer-Spezies durchführbar.
Das Design von Primern für die Amplifikation wird wie in vorher beschriebenen Ausführungsbeispielen durchgeführt, und auch die Amplifikationsbedingungen sind dort beschrieben.
Die durch jedes Primerpaar in jeder Probe gebildeten Amplifikate werden detektiert und die Menge der Amplifikate wird mittels Detektionsverfahren, wie in vorhergehenden Ausführungsbeispielen, bestimmt. Zur Quantifizierung werden die synthetisierten Amplifikate jeder Probe dann relativ miteinander verglichen.
Der Vergleich der Amplifikate wird dann analog zum zweiten Ausführungsbeispiel, das oben beschrieben wurde, durchgeführt. Erfindungsgemäß wird die Amplifikation in Echtzeit überwacht. Es wird eine erste Kalibrierungskurve für jede Primer-Spezies gezeichnet, wobei die Menge des Amplifikats in jeder Probe (sowohl Referenz als auch behandelt) gegen die Zykluszahl aufgetragen wird. Aus dieser graphischen Darstellung wird die Kreuzungslinie bestimmt, wobei die Kreuzungslinie der Punkt auf jeder Kurve ist, bei welchem das Signal des PCR-Amplifikationszyklus in die linear-logarithmische Phase eintritt. Unter Verwendung dieser Schnittpunkte kann ein Kalibrierungsdiagramm berechnet werden, welches einen Zusammenhang zwischen der Zykluszahl, bei welcher das Amplifikations signal die Kreuzungslinie schneidet, und der Templat-Konzentration herstellt, die ursprünglich in der Probe vorgelegen hat. Somit kann, wenn der Schnittpunkt eines Amplifikationssignals (ausgedrückt als Zykluszahl) bekannt ist, die ursprüngliche Templatkonzentration direkt aus dem Kalibrierungsdiagramm abgeleitet werden. Diese Berechnungen können unter Verwendung der ”Fit Points”- und ”Second Derivative Maximum”-Verfahren durchgeführt werden. Das ”Second Derivative Maximum”-Verfahren ist bevorzugt, wenn Proben mit einer großen Kopienzahl (über 1000 Kopien/Probe) analysiert werden sollen. Wenn Proben mit einer geringeren Kopienzahl analysiert werden sollen, ist das ”Fit Points”-Verfahren bevorzugt.
Wenn ein Referenz-Primer eingesetzt wurde, werden die Amplifikate von allen anderen Primerpaaren durch den Vergleich mit dem Amplifikat, das durch den Referenz-Primer synthetisiert wurde, normalisiert, wodurch ein relativer Vergleich zwischen der in der Probe vorliegenden Menge methylierter gegenüber nicht-methylierter Target-DNA ermöglicht wird.
In einem weiteren Ausführungsbeispiel des Verfahrens, wird die Amplifikatmenge von jedem MSP-Primerpaar mit der Amplifikatmenge, die von den anderen MSP-Primern synthetisiert wurde und mit der Amplifikatmenge, die durch den Referenz-Primer synthetisiert wurde, verglichen. Amplifikate aller anderen Primerpaare werden durch den Vergleich mit dem Amplifikat, das durch den Referenz-Primer synthetisiert wurde, normalisiert. Die Amplifikatmengen, die von jedem dieser Primer sythetisiert wurden, werden dann relativ miteinander verglichen, wodurch eine relative Quantifizierung des Methylierungsgrads in einer ausgewählten Region des Genoms ermöglicht wird (370).
In einem weiteren Ausführungsbeispiel des Verfahrens wird die Amplifikatmenge von jedem MSP-Primerpaar mit der Amplifikatmenge, die von den anderen MSP-Primern synthe tisiert wurde, und mit Amplifikatmenge, die vom Referenz-Primer synthetisiert wurde, verglichen. Durch den Vergleich mit der Amplifikatmenge, die durch den Referenz-Primer gebildet wurde, ist es möglich, die Level der Methylierung an einer speziellen Position auf den Level der Nicht-Methylierung zu normalisieren. Das Verfahren gestattet es deshalb, sowohl quantitativ den Methylierungsgrad an einer spezifischen Position zu bewerten, als auch den relativen Level der Methylierung an einer spezifischen Position in einer ausgewählten Region des Genoms zu ermitteln.
Die oben beschriebenen erfindungsgemäßen Ausführungsbeispiele können auf verschiedene Anwendungen adaptiert werden. In einem Ausführungsbeispiel kann das Verfahren verwendet werden, um den Methylierungsgrad an einer spezifischen CpG-Dinukleotid-Position zu bestimmen. Dadurch wird die Analyse heterogener Nukleinsäure-Proben – d. h. Proben, die sowohl Nukleinsäuremoleküle, die an der in fraglichen Position methyliert sind wie auch Nukleinsäuremoleküle, die an der fraglichen Position unmethyliert sind, enthalten. Klinische Proben fester Tumore, wie Brusttumore, bestehen häufig aus multiplen Gewebetypen (d. h. Tumor- und umgebende Gewebe). Die Amplifikationsreaktion wird unter Verwendung von zwei Primerpaaren pro CpG-Dinukleotid-Position (wie bei einer Standard-MSP-Reaktion) durchgeführt. Ein Primerpaar ist spezifische für die methylierte Version des CG-Dinukleotids und enthält deshalb ein CG an der fraglichen Position, und das andere Primerpaar ist spezifisch für die unmethylierte Version der fraglichen CG-Position und enthält deshalb ein TG-Dinukleotid an der fraglichen Position. Amplifikation der Nukleinsäure-Probe unter Verwendung der methylierungs- und nicht-methylierungsspezifischen Primer führt zur Bildung einer gemischten Population von Amplifikaten, wobei die relativen Level der Methylierung an den fraglichen CpG-Positionen durch den Vergleich mit den Leveln der durch das Referenz-Primeroligonukleotid synthetisierten Amplifikate bestimmt werden.
In einem alternativen Ausführungsbeispiel kann das beschriebene Verfahren für die Untersuchung großer Populationen, zum Beispiel bei wissenschaftlichen Untersuchungen von gepoolten Proben eingesetzt werden. Indem Proben gepoolt und unter Verwendung des beschrieben Verfahrens untersucht werden, ist es möglich, zeitsparend und wirtschaftlich das Auftreten von Methylierung an den untersuchten CpG-Positionen in einer einzigen Reaktion zu ermitteln. Ein anderes erfindungsgemäßes Ausführungsbeispiel schließt ein Kit ein, das zur Durchführung der hierin beschriebenen Polynukleotid-Amplifikationsreaktion geeignet ist. Ein solches Kit kann (1) ein Umsetzungs-Agens, bevorzugt eine Lösung von Natriumdisultit oder Hydrogensulfit, (2) mindestens zwei Paare Oligonukleotid-Primer für die Amplifikation ders Bisulfit-behandelten Nukleinsäuren, (3) Reagenzien zur Durchführung der Polynukleotid-Amplifikationsreaktion, wobei die Reagenzien Desoxynukleotidtriphosphate und ein DNA-polymerisierendes Enzym einschließen, und (4) Anleitungen zur Durchführung der Amplifikationsreaktion und für die spezielle Detektion der Amplifikate enthalten. Optional kann das Kit weiterhin detektierbar markierte Oligonukleotid-Sondenmoleküle zur Verwendung bei der Quantifizierung von Methylierung in den Proben enthalten.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die erfindungsgemäßen Aspekte weiter.
Beispiel 1
Das folgende Beispiel beschreibt die Analyse einer CpG-reichen Insel in der 5'-Region des Gens TPEF (NM 016192). Die Hypermethylierung dieser Region ist früher mit der Tumorgenese in Tumor-Zell-Linien in Zusammenhang gebracht worden (Cancer Research 60, 4907–4912, 1. September, 2000).
DNA kann unter Verwendung geeigneter kommerziell erhältlicher Kits, z. B. dem Qiagen^TM-Extrationskit, extrahiert werden. Die DNA-Probe wird dann unter Verwendung einer Bisulfit-Lösung (Hydrogensulfit, Disulfit) gemäß dem Agarose-Bead-Verfahren (Olek et al. 1996) behandelt. Die Behandlung geschieht derart, dass alle nicht methylierten Cytosine in der Probe in Thymidin überführt werden. Im Gegensatz dazu verbleiben 5-methylierte Cytosine in der Probe unmodifiziert. Der Methylierungsstatus wird mittels eines methylierungsspezifischen Assays bestimmt, das für die interessierende CpG-Insel designed wurde. Das CpG-Insel-Assay deckt sowohl CpG-Stellen in den Primern als auch der Taqman^TM-artigen Sonde ab. Verfahren:
Das für die methylierte Version der CpG-Insel spezifische Assay wird unter Einsatz der folgenden Primer und Sonden ausgeführt:
Primer: TTTTCGTCGTTTTAGGTTATCG (SEQ ID NR: 1);
Primer: TTTTTGTTGTTTTAGGTTATTGG (SEQ ID NR: 2); und
Sonde: TTCGGACGTCGTTGTTCGGTCGATGT (SEQ ID NR: 3). Das korrespondierende Assay, das spezifisch für die unmethylierte Version der CpG-Insel ist, wird unter Einsatz der folgenden Primer und Sonden ausgeführt:
Primer: TTTTTGTTGTTTTAGGTTATTGG (SEQ ID NR: 4);
Primer: CATATGCTGTGAATAAATTAC (SEQ ID NR: 5); und
Sonde: TTTGGATGTTGTTGTTTGGTTGATGT (SEQ ID NR: 6). Die Reaktion wird unter den folgenden Assay-Bedingungen durchgeführt: Reaktionslösung: (900 nM Primer; 300 nM Sonde; 3,5 mM Magnesiumchlorid; 1 Unit Taq-Polymerase; 200 μM dNTPs, 7 μl DNA, in einem Reaktionsendvolumen von 20 μl); Zyklisierungsbedingungen: (95°C 10 Minuten lang; dann 50 Zyklen von: 95°C 15 Sekunden lang; 60°C 1 Minute lang). Die Reaktion wird in Echtzeit mittels eines kommerziell erhältlichen Geräts, wie dem ”ABI PRISM 7700” Sequenz-Detektor, überwacht.
Die relativen Amplifikatmengen, die gebildet werden dann verwendet, um den relativen Level von methylierten gegenüber nicht methylierten Nukleinsäuren in der Probe zu bestimmen.
Beispiel 2
Das folgende Beispiel beschreibt die Analyse einer CpG-reichen Insel in der 5'-Region des Gens Calcitonin. Untersuchungen am Calcitonin-Gen haben offen gelegt, dass Hypermethylierung der Promotor-Region des Gens in neoplastischen Zellen verschiedener Krebstypen, insbesondere akuter Leukämie, vorliegt.
DNA kann unter Verwendung geeigneter kommerziell erhältlicher Kits, z. B. dem Qiagen^TM-Extrationskit, extrahiert werden. Die DNA-Probe wird dann unter Verwendung einer Bisulfit-Lösung (Hydrogensulfit, Disulfit) gemäß dem Agarose-Bead-Verfahren (Olek et al. 1996) behandelt. Die Behandlung geschieht derart, dass alle nicht methylierten Cytosine in der Probe in Thymidin überführt werden. Im Gegensatz dazu verbleiben 5-methylierte Cytosine in der Probe unmodifiziert. Der Methylierungsstatus wird mittels eines methylierungsspezifischen Assays bestimmt, das für die interessierende CpG-Insel und ein Referenz-Fragment designed wurde.
Das für die methylierte Version der CpG-Insel spezifische Assay wird unter Einsatz der folgenden Primer und Sonden ausgeführt:
Primer: CGGATACGATTTCGGGG (SEQ ID NR: 7);
Primer: ATACGATAAACGCAACAACGAC (SEQ ID NR: 8); und
Sonde: ATTTGGAGTTTCGTGATTCGCGTTACGGA (SEQ ID NR: 9). Das korrespondierende Assay, das spezifisch für die unmethylierte Version der CpG-Insel ist, wird unter Einsatz der folgenden Primer und Sonden ausgeführt:
Primer: TGGATATGATTTTGGGGTA (SEQ ID NR: I0);
Primer: ATATGATAAATGCAACAATGACAT (SEQ ID NR: 11); und
Sonde: .ATTTGGAGTTTTGTGATTTGTGTTATGGA (SEQ ID NR: 12).
Das korrespondierende Referenz-Assay wurde unter Einsatz der folgenden Primer und Sonden ausgeführt:
Primer: TCCATATTCCAAACCCTATACCAAA (SEQ ID NR: 13);
Primer: TGGGATTGAGGGTAAGAGGGAT (SEQ ID NR: 14). Die Reaktion wird unter den folgenden Assay-Bedingungen durchgeführt: Reaktionslösung: (900 nM Primer; 300 nM Sonde; 3,5 mM Magnesiumchlorid; 1 Unit Taq-Polymerase; 200 μM dNTPs, 7 μl DNA, in einem Reaktionsendvolumen von 20 μl); Zyklisierungsbedingungen: (95°C 10 Minuten lang; dann 50 Zyklen von: 95°C 15 Sekunden lang; 60°C 1 Minute lang). Die Reaktion wird in Echtzeit mittels eines kommerziell erhältlichen Geräts, wie dem ”ABI PRISM 7700” Sequenz-Detektor, überwacht.
Die Menge an methylierter Nukleinsäure in der Tumor-Probe wird durch Aufzeichnung einer ersten Kalibrierungskurve quantifiziert, worin die Amplifikatmenge jeder Probe gegen die Zykluszahl aufgetragen wird. Aus dieser graphischen Darstellung wird die Kreuzungslinie bestimmt, wobei die Kreuzungslinie der Punkt auf jeder Kurve ist, bei welchem das Signal des PCR-Amplifikationszyklus in die linear-logarithmische Phase eintritt. Unter Verwendung dieser Schnittpunkte kann ein Kalibrierungsdiagramm berechnet werden, welches einen Zusammenhang zwischen der Zykluszahl, bei welcher das Amplifikationssignal die Kreuzungslinie schneidet, und der Templat-Konzentration herstellt, die ursprünglich in der Probe vorgelegen hat. Somit kann, wenn der Schnittpunkt eines Amplifikationssignals (ausgedrückt als Zykluszahl) bekannt ist, die ursprüngliche Templatkonzentration direkt aus dem Kalibrierungsdiagramm abgeleitet werden. Diese Berechnungen können unter Verwendung der ”Fit Points”- und ”Second Derivative Maximum”-Verfahren durchgeführt werden. Das ”Second Derivative Maximum”-Verfahren ist bevorzugt, wenn Proben mit einer großen Kopienzahl (über 1000 Kopien/Probe) analysiert werden sollen. Wenn Proben mit einer geringeren Kopienzahl analysiert werden sollen, ist das ”Fit Points”-Verfahren bevorzugt.
Beispiel 3
Im folgenden Beispiel wird das methylierungsspezifische Assay gemäß Beispiel 2 an drei verschiedenen Proben durchgeführt.
Eine erste Probe wird aus einer Tumor-Probe erhalten und wird unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Kits, z. B. dem Qiagen^TM-Extraktionskit, extrahiert.
Eine zweite genomische DNA-Probe, kommerziell von Promega erhältlich, wird unter Verwendung des folgenden Verfahrens künstlich methyliert:
Reagenzien:
DNA

SssI Methylase (Konzentration 2 Units/μl).
SAM (S-Adenosylmethionin)
4,5 μl Mss1-Puffer (NEB Buffer B+ (10 mM Tris-HCl 300 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA, 1 mM Dithiothreitol, 500 μg/ml BSA, 50% Glycerin (pH 7,4 bei 25°C) pH 7,5;
10 mM MgCl₂; 0,1 mg/ml BSA)
dd Wasser (0,2 μm-filtriert autoklaviert, DNasen, RNasen, Proteasen, Phosphatase-frei).

Verfahren:
Die Reagenzien werden vereinigt und bei 37 Grad 16 Stunden lang inkubiert. Die Probe kann dann im Kühlschrank gelagert werden (+4°C).
Eine dritte genomische DNA-Probe, kommerziell von Promega erhältlich, wird mittels einer Polymerase-Reaktion unter Verwendung der folgenden Reagenzien amplifiziert, um sicherzustellen, dass in der Probe keine Methylierung vorhanden ist.
Alle drei Proben werden dann gemäß dem Agarose-Bead-Verfahren Bisulfit-behandelt.
Das für die methylierte Version der CpG-Insel spezifische Assay wird unter Einsatz der folgenden Primer und Sonden ausgeführt:
Primer: CGGATACGATTTCGGGG (SEQ ID NR: 7);
Primer: ATACGATAAACGCAACAACGAC (SEQ ID NR: 8); und
Sonde: ATTTGGAGTTTCGTGATTCGCGTTACGGA (SEQ ID NR: 9). Das korrespondierende, für die unmethylierte Version der CpG-Insel spezifische Assay wird unter Einsatz der folgenden Primer und Sonden ausgeführt:
Primer: TGGATATGATTTTGGGGTA (SEQ ID NR: 10);
Primer: ATATGATAAATGCAACAATGACAT (SEQ ID NR: 11); und
Sonde: ATTTGGAGTTTTGTGATTTGTGTTATGGA (SEQ ID NR: 12).
Jede der Reaktionen wird unter den folgenden Assay-Bedingungen durchgeführt: Reaktionslösung: (900 nM Primer; 300 nM Sonde; 3,5 mM Magnesiumchlorid; 1 Unit Taq-Polymerase; 200 μM dNTPs, 7 μl DNA, in einem Reaktionsendvolumen von 20 μl); Zyklisierungsbedingungen: (95°C 10 Minuten lang; dann 50 Zyklen von: 95°C 15 Sekunden lang; 60°C 1 Minute lang). Die Reaktion wird in Echtzeit mittels eines kommerziell erhältlichen Geräts, wie dem ”ABI PRISM 7700” Sequenz-Detektor, überwacht. Die Menge an methylierter Nukleinsäure in der Tumor-Probe wird durch Aufzeichnung einer ersten Kalibrierungskurve quantifiziert, wobei die Amplifikatmenge jeder Probe gegen die Zykluszahl aufgetragen wird. Aus dieser graphischen Darstellung wird die Kreuzungslinie bestimmt, wobei die Kreuzungslinie der Punkt auf jeder Kurve ist, bei welchem das Signal des PCR-Amplifikationszyklus in die linear-logarithmische Phase eintritt. Unter Verwendung dieser Schnittpunkte kann ein Kalibrierungsdiagramm berechnet werden, welches einen Zusammenhang zwischen der Zykluszahl, bei welcher das Amplifikationssignal die Kreuzungslinie schneidet, und der Templat-Konzentration herstellt, die ursprünglich in der Probe vorgelegen hat. Somit kann, wenn der Schnittpunkt eines Amplifikationssignals (ausgedrückt als Zykluszahl) bekannt ist, die ursprüngliche Templatkonzentration direkt aus dem Kalibrierungsdiagramm abgeleitet werden. Diese Berechnungen können unter Verwendung der ”Fit Points”- und ”Second Derivative Maximum”-Verfahren durchgeführt werden. Das ”Second Derivative Maximum”-Verfahren ist bevorzugt, wenn Proben mit ei ner großen Kopienzahl (über 1000 Kopien/Probe) analysiert werden sollen. Wenn Proben mit einer geringeren Kopienzahl analysiert werden sollen, ist das ”Fit Points”-Verfahren bevorzugt.
Andere Aspekte der Erfindung werden im Rückblick auf die Beschreibung bevorzugter erfindungsgemäßer Ausführungsbeispiele, in Verbindung mit den beigefügten Zeichnungen, offensichtlich werden. Die Erfindung wird jedoch durch die angefügten Ansprüche dargelegt. SEQUENCE LISTING

Claims

Verfahren zur Analyse der Methylierung in einer CpG-Position oder mehreren CpG-Positionen, die in einer Nukleinsäure-Probe analysiert werden sollen, umfassend: a. Umsetzung unmethylierter Cytosin-Basen in der Nukleinsäure-Probe durch Behandlung mit einem Agens in Uracil oder eine andere Base, die sich im Hinblick auf ihr Basenpaarungsverhalten von Cytosin unterscheidet; b. Amplifizierung einer Nukleinsäure oder mehrerer Nukleinsäuren der behandelten Probe simultan in einer Amplifikationsreaktion, worin wenigstens zwei Oligonukleotid-Primerpaare für jede zu analysierende CpG-Position bereitgestellt werden, wobei ein Primerpaar bevorzugt in dem Fall hybridisiert, bei dem das CpG der behandelten Nukleinsäure in der Original-Probe vor der Umsetzung methyliert war, und worin weiterhin das andere Primerpaar bevorzugt in dem Fall hybridisiert, bei dem das CpG der behandelten Nukleinsäure in der Original-Probe vor der Umsetzung unmethyliert war und wobei sich die von jedem der Primerpaare gebildeten Amplifikate durch einen detektierbaren Fluoreszenzmarker unterscheiden; c. Echtzeit-Detektion der in der Polymerasereaktion gebildeten Amplifikate in quantifizierbarer Art; und d. Bestimmung des Methylierungsgrads in wenigstens einer CpG-Position der Nukleinsäure-Probe.
Verfahren gemäß Anspruch 1, worin das Umsetzungs-Agens Bisulfit oder eine seiner Verbindungen ist.
Verfahren zur Analyse des Methylierungsstatus eines CpG-Dinukleotids oder mehrerer CpG-Dinukleotide in einer Nukleinsäure-Probe, umfassend: a. Umsetzung von Cytosin-Basen in der Nukleinsäure-Probe, welche in der 5-Position unmethyliert waren, mit einem Umsetzungs-Agens zu Uracil oder einer anderen Base, die sich von Uracil im Hinblick auf ihr Basenpaarungsverhalten unterscheidet; b. Amplifizieren einer Nukleinsäure oder mehrerer Nukleinsäuren simultan in einer Polymerase-Enzymreaktion mittels wenigstens zwei Primeroligonukleotid-Paaren, worin ein Primerpaar eine Referenz-Sequenz amplifiziert und die anderen Primerpaare methylierungsspezifische Primer sind, und worin sich weiterhin die durch jede Primer-Spezies der Primerpaare gebildeten Amplifikate in einem detektierbaren Fluoreszenzmarker unterscheiden; c. Detektieren der durch die Primerpaare gebildeten Amplifikate in Echtzeit; d. Messung der Menge der durch jedes Primerpaar gebildeten Amplifikate; und e. Bestimmen des Methylierungsgrads an jeder analysierten CpG-Position.
Verfahren gemäß Anspruch 3, worin das Umsetzungs-Agens Bisulfit oder eine seiner Verbindungen ist.
Verfahren gemäß Anspruch 3, worin die Detektion durch Echtzeit mittels eines Verfahren oder mehrerer Verfahren durchgeführt, ausgewählt aus der Gruppe, die Real-Time-PCR^TM-Assay, TaqMan^TM-Assay, LightCycler^TM-Assay umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 3, worin wenigstens drei Primerpaare bei der Polymerasereaktion verwendet werden, wobei eines der Primerpaare ein Referenz-Primerpaar ist, welches eine nicht-methylierte Sequenz amplifiziert, die als Referenz-Sequenz fungiert.
Verfahren gemäß Anspruch 6, worin der Referenz-Primer kein CpG-Dinukleotid und kein TpG-Dinukleotid enthält.
Verfahren gemäß Anspruch 7, worin die Primerpaare, welche nicht die Referenz-Sequenz amplifizieren, ein CpG-, TpG- und CpA-Dinukleotid oder mehrere CpG-, TpG- und CpA-Dinukleotide einschließen.
Verfahren gemäß Anspruch 6, worin das durch jedes Primerpaar synthetisierte Amplifikat mit dem Amplifikat der anderen Primer und der Amplifikatmenge des Referenz-Primers verglichen wird.
Verfahren gemäß Anspruch 6, worin die Bestimmung des Methylierungsgrads durch die Bestimmung der Menge jedes Amplifikats eines jeden Primerpaars relativ zur Amplifikatmenge, die durch den Referenz-Primer gebildet wurde, durchgeführt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 6, worin die Amplifikate derart modifiziert werden, dass sie Peptiden ähnlich werden.
Verfahren zur Analyse des Methylierungsstatus eines CpG-Dinukleotids oder mehrerer CpG-Dinukleotide in einer Nukleinsäure-Probe, umfassend: a. Umsetzung von Cytosin-Basen, die in der 5-Position unmethyliert sind, durch die Behandlung mit einem Umsetzungs-Agens zu Uracil oder einer anderen Base, die sich von Uracil im Hinblick auf ihr Basenpaarungsverhalten unterscheidet; b. Amplifizieren einer Nukleinsäure oder mehrerer Nukleinsäuren der behandelten Nukleinsäure und einer Referenz-Probe oder zwei Referenz-Proben in einer Polymerase-Enzymreaktion mittels eines methylierungsspezifischen Primer-Oligonukleotidpaars oder mehrerer methylierungsspezifischen Primer-Oligonukleotidpaare, worin sich die durch jede Primerpaar-Spezies gebildeten Amplifikate in einem detektierbaren Fluoreszenz-Marker unterscheiden; c. Detektieren der durch die Primerpaare in jeder Probe gebildeten Amplifikate in Echtzeit; d. Messung der Amplifikatmengen, die durch jedes Primerpaar in jeder der Proben gebildet wurde; und e. Bestimmung des Umfangs der Methylierung in der behandelten Sequenz durch Bestimmung der Amplifikatmenge, die in der behandelten Probe, relativ zur Amplifikatmenge, die in der Referenz-Probe oder den Referenz-Proben durch jedes Primerpaar gebildet wurde.
Verfahren gemäß Anspruch 12, worin das Umsetzungs-Agens Bisulfit oder eine seiner Verbindungen ist.
Verfahren gemäß Anspruch 12, worin die Referenz-Probe oder die Referenz-Proben eine vollständig methylier ten Version der zu analysierenden Target-Nukleinsäure und eine vollständig unmethylierte Version der zu behandelnden Target-Nukleinsäure ist beziehungsweise sind.
Verfahren gemäß Anspruch 12, worin die Detektion der Amplifikate mittels einem oder mehrerer Verfahren, durchgeführt wird, ausgewählt aus der Gruppe, die Real-Time-PCR^TM-Assay, TaqMan^TM-Assay, LightCycler^TM-Assay umfasst.