DE60030726T2

DE60030726T2 - Methode zur Herstellung von Mikropartikeln enthaltend biologisches Material

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Publication number: DE60030726T2
Application number: DE60030726T
Authority: DE
Inventors: Arnold Hilgers
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1999-07-08
Filing date: 2000-07-07
Publication date: 2007-09-13
Anticipated expiration: 2020-07-08
Also published as: DE60030726D1; AU5983300A; EP1074248A1; CA2375549C; ATE339186T1; EP1200067A1; CA2375549A1; JP4988114B2; JP2003504320A; WO2001003667A1; EP1200067B1; AU770296B2; US7008643B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Mikropartikeln aus einem flüssigen einphasigen System, das biologisches Material und mindestens zwei Verbindungen, die in wässriger Lösung nicht mischbar sind, einschließt, wobei die Bildung der Mikropartikel durch Verdunstung aus dem Einphasensystem erreicht wird, die zur Phasentrennung in eine disperse Phase und einen kontinuierliche Phase führt. Das Verfahren ist in den Ansprüchen weiter definiert.
Die Einbringung von biologischem Material in Zellen, insbesondere die Einbringung von DNA, stellt zahlreiche viel versprechende Möglichkeiten zur Behandlung von Krankheiten in Aussicht, die sowohl genetischen als auch infektiösen Ursprungs sind. Ihre Grundlage ist die Einführung von biologisch aktiven Substanzen, wie Peptiden, Proteinen oder Nukleinsäuren, in somatische Zellen eines Organismus, um den Zellmetabolismus zu beeinflussen oder defekte Gene abzuschalten, ein defektes Gen gegen ein intaktes Gen auszutauschen oder diese Zellen in die Lage zu versetzen, ein Protein zu bilden, das eine prophylaktische oder therapeutische Wirkung hat.
Beispiele für genetisch verursachte Krankheiten, für die eine Gentherapie einen Erfolg versprechenden Ansatz bietet, sind zahlreich. Andere mögliche Anwendungsgebiete sind die Immunregulierung, bei der eine Immunität durch die Verabreichung von funktionalen Nukleinsäure-Codes für ein sekretiertes Proteinantigen oder ein nicht-sekretiertes Proteinantigen durch Immunisierung erreicht wird. Andere Beispiele für genetische Defekte, bei denen eine Nukleinsäure, die das defekte Gen kodiert, verabreicht werden kann, z.B. in einer Form, die auf die speziellen Bedürfnisse zugeschnitten ist, schließen Muskeldystrophie (Dystrophin-Gen), zystische Fibrose (CFTR-Gen), Hypercholesterolämie (LDL-Rezeptorgen) ein. Gentherapeutische Behandlungsverfahren sind auch von potentiellem Nutzen, wenn Hormone, Wachstumsfaktoren oder Proteine mit immunmodulierender Aktivität im Körper synthetisiert werden sollen.
Die Gentherapie ist auch viel versprechend im Hinblick auf die Behandlung von Krebs durch Verabreichung so genannter „Krebsimpfungen". Um die Immunogenität von Tumorzellen zu erhöhen, werden sie so verändert, dass sie entweder antigenischer werden, oder dass sie bestimmte Cytokine produzieren, um eine Immunantwort auszulösen. Dies wird durch Transfizieren der Zellen mit DNA erreicht, die ein Cytokin, z.B. IL-2, IL-4, IFN-gamma, TNF-alpha und andere, kodiert. Bisher wird die Genübertragung in autologe Tumorzellen über retrovirale Vektoren als Therapeutika durchgeführt, um die Expression bestimmter Gene (wie deregulierter Onkogene oder viraler Gene) in vivo zu blockieren. Es wurde bereits gezeigt, dass kurze Antisense-Oligonukleotide in Zellen importiert werden können und dort ihre inhibierende Wirkung entfalten, selbst wenn ihre intrazelluläre Konzentration niedrig ist, was auf ihre beschränkte Aufnahme durch die Zellmembran infolge der stark negativen Ladung der Nukleinsäuren bewirkt wird.
Angesichts der erheblichen Vorteile, die eine Einbringung bieten könnte, besteht eindeutig ein Bedarf an sicheren und wirksamen Einbringungssystemen für biologisches Material, in erster Linie Nukleinsäuren.
Man kennt verschiedene Verfahren für die in vitro-Genübertragung in Säugerzellen, z.B. Einführung von DNA mittels Liposomen, Elektroporation, Mikroinjektion, Zellfusion, DEAE-Dextran- oder Kalziumphosphat-Fällungsverfahren. Kationische Lipide werden mit Erfolg verwendet, um DNA zu übertragen. Die kationische Komponente solcher Lipide kann DNA in Lösung verdichten. Es wurde gezeigt, dass dieses Verfahren zu stark aggregierten DNA-Komplexen führt, die, wenn sie für die Transfizierung der DNA in vitro verwendet werden, zu einem erhöhten Wirkungsgrad von Genübertragung und -expression (im Vergleich zu nackten DNA) führen. Obwohl die Bildung dieser Komplexe die Genübertragung in vitro fördern kann, führt die in vivo-Injizierung dieser Komplexe nicht zu einer anhaltenden und wirksamen Genübertragung.
Derzeit stellen Viren die gebräuchlichsten Vektoren für die in vitro- und in vivo-Geneinbringung dar. Diese Vektoren wurden entwickelt, um die Übertragung von Genen mittels der wirksamen Eintrittsmechanismen ihrer Elternviren zu erreichen. Diese Strategie wurde bei der Konstruktion von rekombinanten retroviralen und adenoviralen Vektoren verfolgt, um eine hoch effiziente Genübertragung in vivo und in vitro zu erreichen. Trotz ihrer Effizienz unterliegen diese Vektoren Beschränkungen im Hinblick auf die Größe und Konstruktion der übertragenen DNA, und es besteht die Gefahr, dass virale Hüllproteine Immunreaktionen im Empfänger auslösen können. Ferner stellen diese Wirkstoffe Sicherheitsrisiken im Hinblick auf die Mitübertragung möglicher funktionsfähiger viraler Genelemente des Ursprungsvirus dar. So ist beispielsweise die Verwendung von Retroviren problematisch, weil sie, zumindest zu einem kleinen Prozentsatz, die Gefahr von Nebenwirkungen, wie einer Infektion mit dem Virus (durch Rekombination mit endogenen Viren und möglicher anschließender Mutation in die pathogene Form) oder die Bildung von Krebs, beinhaltet. Darüber hinaus ist die stabile Transformation der somatischen Zellen des Patienten, wie sie mittels Retroviren erreicht wird, manchmal nicht erwünscht, da dies die Umkehrung der Behandlung, z.B. falls es zu Nebenwirkungen kommt, nur erschweren kann.
Kürzlich wurden synthetische Vektoren als Alternative zu Viren vorgeschlagen und es wurden alternative Strategien für die Genübertragung entwickelt.
Ein Beispiel dafür ist die Übertragung von Genen in die Zelle auf dem äußerst wirksamen Weg der rezeptorvermittelten Endocytose (Lit. 1, 2). Dieser Ansatz verwendet bifunktionale molekulare Konjugate, die eine DNA-Bindungsdomäne und eine Domäne mit Spezifität für einen Zelloberflächenrezeptor aufweisen. Eine DNA-Bindungsgruppe ist in der Regel Poly-L-lysin (PLL). Komplexe mit DNA werden durch elektrostatische Wechselwirkungen zwischen den positiv geladenen Lysinresten und den negativ geladenen Phosphaten in der DNA-Hauptkette gebildet. Die Wirksamkeit der Genexpression, die durch rezeptorvermittelte Endocytose erreicht wird, wird durch eine Vielzahl von Faktoren beeinflusst, einschließlich des Durchmessers der Komplexe und der Art des verwendeten Liganden.
Es besteht die einhellige Meinung, dass das DNA-Einbringungssystem für eine erfolgreiche in vivo-Anwendung klein genug sein muss, um einen Zugang zu Zielzellen zu erhalten. Dies beinhaltet häufig die Extravasation durch Endothele, und die hyperpermeablen Endothele im Zusammenhang mit Tumoren weisen eine Größenbeschränkung von etwa 70 nm auf (Lit. 3). Darüber hinaus wirken die meisten Formen von getriggerter Membranpenetrierung über die endosomale Membran anschließend an eine Endocytose, und eine pinocytische Internalisierung ist üblicherweise auf Materialien von unter 100 nm Durchmesser beschränkt. Es wurde gezeigt, dass die Nukleinsäureverdichtung und nicht die Oberflächenladung für ein wirksames Nuclear Trafficking kritisch ist (Lit. 4).
Angesichts der erheblichen Größe von Biomolekülen, insbesondere von DNA-Expressionsvektoren in freier Lösung, ist es von Vorteil, wenn die DNA komprimiert wird. Bekanntlich kann DNA durch die einfache Zugabe von Polykationen, wie Polylysin (PLL), zu Polyelektrolytkomplexen verdichtet werden. Bekanntlich sind die Konjugate, die PLL mit höherem Molekulargewicht (MG) aufweisen, im Durchschnitt eindeutig größer und weisen eine höhere Polydispersität auf als diejenigen, die PLL mit niedrigerem Molekulargewicht aufweisen. Beispielsweise zeigen Konjugate auf Basis des größten PLL (224500 Da) eine breite Polydispersität der Größe, mit Durchmessern von bis zu 300 nm, während Konjugate auf der Basis des kleinsten PLL (3970 Da) eine geringe Größe und eine relativ gleichmäßige Verteilung (Durchmesser im Bereich von 20–30 nm) zeigen (Lit. 5).
Polykationen üben bekanntlich eine Reihe von unspezifischen toxischen Wirkungen aus, und die Konzentration der elektrostatischen Ladungen, die sich aus einer Polyelektrolytkondensation ergibt, könnte Partikel mit extrem höher Ladungsdichte und möglicherweise noch höherer Toxizität ergeben. Die Konjugate, die anhand von PLL mit höherem Molekulargewicht gebildet werden, zeigen eine beträchtlich höhere Cytoxizität als diejenigen, die mit den Polykationen mit dem niedrigsten Molekulargewicht gebildet werden (Lit. 5).
Die Funktion von PLL in DNA-PLL-Komplexen besteht darin, DNA zu einer kompakten Struktur zu kondensieren. Eines der wirksamsten DNA-Kondensierungsmittel ist Spermin, ein Tetramin. Ein Peptidanaloges von Spermin wurde synthetisiert, um die Annahme zu überprüfen, dass kurze synthetische Peptide tatsächlich ebenso gut oder besser als PLL wirken können. Das Peptid K8 (Lit. 6) ist ein überlegener Ersatz für das PLL mit hohem Molekulargewicht. Die potentielle Toxizität wurde mit der von PLL verglichen. K8 ist für HepG2-Zellen mindestens 1000-mal weniger toxisch als PLL. Ähnliche Ergebnisse wurden in anderen Zelllinien gefunden.
Frühere Untersuchungen mit DNA-PLL-Komplexen haben gezeigt, dass ein endosomaler Lysiswirkstoff für eine hoch wirksame Genübertragung nötig ist. Ein replikationsdefektes Adenovirus wird häufig verwendet, um Expressionsniveaus zu erreichen, die einem rekombinanten Adenovirus vergleichbar sind, welches das gleiche exogene Gen aufweist. Bekanntlich begrenzt die Wirts-Immunantwort auf Adenovirus dessen Verwendung auf eine einzige Verabreichung. Um Adenovirus als endosomalen lytischen Wirkstoff zu ersetzen, werden Fusionspeptide von Virusprotein verwendet. JTS-1, ein neues amphipatisches Peptid, wurde geschaffen (Lit. 6). Es wurden hohe Genexpressionsniveaus in einer Vielzahl von Zelllinien erreicht, was darauf hinweist, dass DNA-K8/JTS-1-Komplexe für die Geneinbringung in vitro von großem Nutzen sind.
Die Daten zeigen, dass es möglich ist, einfache DNA-Peptid-Komplexe zu konstruieren, die eine hoch wirksame Geneinbringung in Kulturzellen ermöglichen. Diese Komplexe enthalten nur drei Bestandteile: DNA, kondensierendes Peptid und lytisches Peptid, die alle molekular definiert sind und sich leicht von selbst zu einem aktiven DNA-Einbringungssystem gruppieren. Künftige Entwicklungen dieser Komplexe versprechen eine Ersetzung von viralen Vektoren, aber ihre in vivo-Anwendung ist noch unbekannt.
Kürzlich (Lit. 7) wurde gezeigt, dass das kationische Polymer Polyethylenimin (PEI) eine wirksame Genübertragung in eine Reihe von Zellen ohne die Zugabe irgendwelcher Zellbindungsliganden oder endosomolytischer Einheiten vermittelt. Diese Verbindung verbindet im Gegensatz zu PLL eine DNA-Bindungs- und -Kondensierungswirkung mit einer hohen pH-Pufferleistung. Jedes dritte Atom der PEI-Hauptkette ist ein protonierbares Amin-Stickstoffatom, was das Polymer zu einem wirksamen „Protonenschwamm" macht. Man nimmt an, dass die endosomale und lysosomale Pufferung die DNA vor einem Abbau schützt und eine Freisetzung aus den sauren Vesikeln fördert. Diese Eigenschaften machen PEI zu einem sehr attraktiven DNA-Bindungskern für anspruchsvollere Vektoren, die Zellbindungsdomänen und andere Zelleintrittsfunktionen aufweisen. Es wurde gezeigt, dass die Ligand/PEI-Konjugate eine wirksame Transfektion von kultivierten Tumorzellen auf Rezeptor/Ligand-abhängige Weise vermitteln können. Diese Erkenntnisse zeigen, dass ligandenkonjugiertes PEI ein viel versprechender Vektor für die rezeptorspezifische Genabgabe sein könnte (Lit. 8).
Es wurden PEI/DNA-Komplexe mit unterschiedlichen Verhältnissen von PEI-Stickstoff zu DNA-Phosphat (N/P-Verhältnis) hergestellt und in einer Reihe von in vivo-Modellen getestet. Frühere Versuche, die mit dem verzweigten 25 kDa-PEI durchgeführt wurden, zeigen, dass dieses Polymer toxisch ist und innerhalb weniger Minuten zum Tod führt, auch wenn es in niedrigen N/P-Verhältnissen verwendet wird. Bessere Ergebnisse können mit linearen Polymeren erhalten werden, die ein mittleres Molekulargewicht von 22 kDA aufweisen (Exgene 500). Wenn ein Reportergen (pCMV-Luc) mit Exgene 500 in Verhältnissen von 3 zu 5 (N/P) komplexiert wird, ist 24 h später in der Lunge, dem Herzen, der Milz, der Leber, den Nieren und dem Gehirn eine transgene Expression zu finden (Lit. 9). Jedoch können toxische und immunogene Eigenschaften bei Verwendung von PEI möglicherweise nicht überwunden werden.
Die Elektroporation, ein weiteres nicht-virales Einbringungssystem, wird verwendet, um biologisches Material durch Anlegen eines elektrischen Felds in Zielzellen einzubringen, wie im US-Patent Nr. 4,849,355 und im US-Patent Nr. 5,232,856 beschrieben. Um biologisches Material in Zellen einzubringen, werden elektrische Impulse an Zielzellen angelegt, z.B. in einer Zellsuspension. Das biologische Material in der Suspension kann durch kleine Poren, die durch die Anlegung der elektrischen Impulse in der Zellmembran ausgebildet werden, in die Zelle diffundieren.
Liposomale Verfahren werden mit Elektroporationsverfahren kombiniert, um die biologischen Materialien in Liposomen zu verkapseln und die Liposome durch Elektrofusion mit Zielzellen zu fusionieren, um eine Einbringung mit höherem Wirkungsgrad zu erreichen. Die Liposome sind jedoch nur schwach geladen und fusionieren nicht gut mit der Zielzelle in dem elektrischen Feld.
Im US-Patent Nr. 5,789,213 wird ein Elektroporationssystem beschrieben, das die Verwendung eines zweiphasigen Polymersystems betrifft, welches biologische Materialien mit den Zielzellen konzentriert, so dass die Materialien durch Konzentrierung sowohl der Zielzellen als auch des einzubringenden biologischen Materials in einer der beiden Phasen während und nach der Verabreichung eines elektrischen Impulses in Zielzellen eingeführt werden können.
Ein zweiphasiges Polymerverfahren ist in der Lage, Zellen, Proteine und Mineralien zu separieren oder zu partitionieren (beschrieben im US-Patent Nr. 4,181,589; und in Partitioning in Aqueous Two-Phase Systems, 1985, Hsg. H. Walter, D. Brooks und D. Fisher, Publ. Academic Press, worin Polymerkonzentrationen % Gew./Gew. sind, wenn nichts anderes angegeben ist). Die Partition von Partikeln in unterschiedliche Polymerphasen hängt von der Grenzflächenenergie der Partikel und der Polymerlösungen ab. Durch Variieren der Grenzflächenenergie, die von den Polymer- und Salzkonzentrationen bestimmt wird, können ausgewählte Partikel (Zellen, Makromoleküle) in eine bestimmte Phase getrieben werden, wodurch der Zweck der Separierung oder Partitionierung unter Verwendung von Polymerkombinationen erreicht wird.
Gemäß dem US-Patent Nr. 5,789,213 wird eine Zusammensetzung verwendet, die die Funktion hat, sowohl Zielzellen als auch biologische Materialien in einer einzigen Phase zu konzentrieren, sowie die Funktion, das Volumen dieser Phase durch osmotische Steuerung so zu verringern, dass Zellen und biologische Materialien während der Elektroporation in dieser einzigen Phase in konzentrierter Form eingekapselt werden. Dann werden die biologischen Materialien während der Elektroporation in die Zielzellen getrieben, und die anschließende kolloidal-osmotische Quellung von Zellen nach der Elektroporation wird begrenzt, was zu einem höheren Beladungswirkungsgrad führt. Beispielsweise wird ein zweiphasiges Polymersystem, für das Polyethylenglycol (PEG; Molekülgröße (MG) 8000 (in Dalton)) und eine von drei Formulierungen von Dextran (dx; MG 9000 und 71000 und 249000) verwendet werden, beschrieben.
Neben anderen Nachteilen erfordert die Elektroporation jedoch Spezialausrüstung und ist auf die Verwendung in vitro beschränkt.
Die Einbringung von bioaktiven Molekülen wie Nukleinsäure kann durch die Immobilisierung des bioaktiven Moleküls an Polymerpartikeln erheblich verbessert werden, was die Übertragung des Moleküls in die Zielbereiche erleichtert, wie oben beschrieben. Jedoch müssen Polymere vorzugsweise nicht-toxisch sein, keine toxischen Monomere enthalten und zu nicht-toxischen Komponenten abgebaut werden, mit Blut kompatibel sein, chemisch mit den abzugebenden Substanzen verträglich sein. Um Mikropartikel aus synthetischen und natürlichen Polymeren herzustellen, wurden eine Reihe von unterschiedlichen Verfahren entwickelt.
Die europäische Patentanmeldung Nr. 0213303 offenbart ein Verfahren zur Erzeugung kleiner, sphärischer Polymerpartikel aus Systemen, die zwei flüssige Phasen enthalten, wobei eine Phase eine oder mehrere gelöste Substanzen aufweist und in Form von kleinen Tröpfchen in der andere Phase dispergiert wird, um eine Emulsion zu bilden, wonach bewirkt wird, dass die Tröpfchen erstarren.
Im US-Patent Nr. 5,849,884 werden makromolekulare Mikropartikel und ein Verfahren zu ihrer Herstellung und Verwendung beschrieben. Dieses Verfahren beruht auf dem Kollaps von Makromolekülen mit einer tertiären oder quartären Struktur, die die Basisstrukturelemente bilden. Mikropartikel werden durch Mischen von Makromolekülen in Lösung oder einer flüssigen Phase mit einem Polymer oder einer Polymermischung in Lösung oder einer flüssigen Phase in Anwesenheit einer Energiequellen über einen Zeitraum, der für die Bildung der Partikel ausreicht, erzeugt. Die Lösung ist vorzugsweise eine wässrige Lösung. Entweder wird die Makromoleküllösung dem Polymer zugegeben oder die Polymerlösung wird der Makromoleküllösung zugegeben, um eine Entfernung von Wasser aus den Makromolekülen oder deren Dehydratisierung zu bewirken. Dieses Verfahren beruht auf dem Kollaps der Makromoleküle mit einer tertiären oder quartären Struktur, die die Grundstrukturelement bilden. Mikropartikel werden durch Mischen von Makromolekülen in Lösung oder einer flüssigen Phase mit einem Polymer oder einer Polymermischung in Lösung oder einer flüssigen Phase in Anwesenheit einer Energiequelle über eine Zeit, die ausreicht, um Partikel zu bilden, erzeugt. Die Lösung ist vorzugsweise eine wässrige Lösung. Entweder wird die Makromoleküllösung dem Polymer zugegeben, oder die Polymerlösung wird der Makromoleküllösung zugegeben, um eine Entfernung von Wasser aus den Makromolekülen oder eine Dehydratisierung der Makromoleküle zu bewirken. Dieses Verfahren wird vom Fachmann als „Volumenabscheidung" bezeichnet.
Die Makromolekültypen, die die Mikropartikel bilden, schließen Proteine, Peptide, Carbohydrate, Konjugate, Nukleinsäuren, Viren oder deren Mischungen ein. Da Makromoleküle die wichtigsten strukturbildenden Elemente in den Mikropartikeln bilden, müssen geeignete Makromoleküle eine tertiäre oder quartäre Struktur haben oder haben können. Bei dem bevorzugten Polymer handelt es sich um Polyvinylpyrrolidon (PVP), Polyethylenglykol (PEG), Dextran (Dx), Polyoxyethylen/Polyoxypropylen-Copolymer (PPC), Polyvinylalkohol (PVA) oder deren Mischungen.
Jeder Mikropartikel besteht aus mindestens 40% Gew. Makromolekülen und höchstens oder genau 30% Gew. Polymermolekülen, welche den Mikropartikel durchsetzen oder mit ihm verflochten und allgemein homogen verteilt sind.
Um den Mikropartikel bildenden Kollaps der Makromoleküle in der Makromoleküllösung zu induzieren, wird die Makromolekül/Polymer-Lösung in Anwesenheit einer Energiequelle über einen vorgegebenen Zeitraum inkubiert. Die bevorzugte Energiequelle ist Wärme. Jedoch schließen mögliche Energiequellen Wärme, Bestrahlung und Ionisierung ein, allein oder in Kombination mit Beschallung, Verwirbelung, Vermischung oder Bewegung. Vorzugsweise wird die Makromolekül/Polymer-Lösungsmischung in einem Wasserbad bei einer Temperatur von mindestens 37°C und höchstens 90°C zwischen etwa 5 Minuten und 2 Stunden inkubiert. Am stärksten bevorzugt wird die Mischung 5–30 Minuten lang bei einer Temperatur zwischen 50 und 90°C inkubiert.
Für dieses Verfahren muss die Makromolekül/Polymer-Lösung entweder vor, nach oder während der Vermischung des Polymers mit dem Makromolekül auf einen bestimmten pH-Bereich eingestellt werden, und zwar auf einen pH nahe dem isoelektrischen Punkt (pI) des Makromoleküls, vorzugsweise innerhalb von 3 bis 4 pH-Einheiten am pI des Makromoleküls, am stärksten bevorzugt innerhalb von 1,5 bis 2 pH-Einheiten am pI des Makromoleküls.
Für die Herstellung von Mikromolekülen, die aus Nukleinsäuren bestehen, muss zuerst die Nukleinsäure entweder mit einem Protein wie Rinderserumalbumin gemischt werden, oder, weil Nukleinsäuren Anionen sind, müssen Kationen zugegeben werden, wie Poly-L-lysin (PLL), das sehr bei der Bildung von Mikropartikeln hilft.
Im Hinblick auf diese Zusammensetzung ist es von Nachteil, dass das Verfahren auf einen bestimmten pH-Bereich der Makromolekül/Polymer-Lösung beschränkt ist. Zusätzlich verlangt es Spezialausrüstung, um die Lösung mit Energie, beispielsweise Wärme, in Kombination mit Bewegung, Verwirbelung oder Vermischung zu inkubieren.
Ferner ist es auf Makromoleküle beschränkt, die eine tertiäre oder quartäre Struktur aufweisen oder aufweisen können.
Vor allem aber löst dieses Verfahren nicht die Schwierigkeiten im Zusammenhang mit der Übertragung von Genen in Zellen eines Organismus. Insbesondere sind die Probleme im Zusammenhang mit dem Eindringen von biologischen Materialien, insbesondere Nukleinsäure, in Zellen und ihre Kerne nicht gelöst.
Daher ist es Aufgabe der Erfindung, ein wirksames in vitro- und in vivo-Einbringungssystem für biologisches Material, insbesondere für Polynukleotide, zu schaffen.
Die Erfindung beruht auf der Erkenntnis, dass unter bestimmten Bedingungen eine wässrige Polymerlösung sich spontan in ein zweiphasiges Polymersystem trennt. Während dieses Vorgangs können H-Bindungen zwischen ungeladenen Polymermolekülen gebildet werden. Die H-Bindungsbildung kann auch stattfinden, wenn ein Makromolekül geladen ist. Gleichzeitig kommt es zu einer spontanen Erhöhung der Konzentration von biologischem Material und Polymer in einer der Phasen, was anschließend zur Bildung von Mikropartikeln mit hoher Transfektionsleistung führt, die verwendet werden können, um Gene in eine Zahl von Organen in vivo einzuführen.
Die Mikropartikel, die anhand des erfindungsgemäßen Verfahrens gebildet werden, können aus mindestens 75% Polymermolekülen und höchstens 25% biologischem Material zusammengesetzt sein. Die Polymermoleküle können das wichtigste strukturbildende Element darstellen.
Diese Mikropartikel dringen in alle Arten von Zellen und Kernen ein, was durch Fluoreszenzmikroskopie nachgewiesen werden kann.
Ein besseres Verständnis der Merkmale der vorliegenden Erfindung wird anhand der folgenden Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen und Beispiele (siehe auch 1) gewonnen.
Ein zweiphasiges Polymerverfahren ist in der Lage, Zellen, Proteine und Mineralien zu separieren oder zu partitionieren (im US-Patent Nr. 4,181,589 beschrieben). Die Partition von Partikeln in unterschiedliche Polymerphasen hängt wie erläutert von der Grenzflächenenergie der Partikel und der Polymerlösungen ab. Durch Variieren der Grenzflächenenergie, die durch die Polymer- und Salzkonzentrationen bestimmt wird, können ausgewählte Partikel (Zellen, Makromoleküle) in eine bestimmte Phase getrieben werden, wodurch der Zweck der Separierung oder Partitionierung unter Verwendung von Polymerkombinationen erreicht wird (Lit. 10).
Eine spontane Phasentrennung wird erreicht, wenn Wasser teilweise aus dem System aus einphasigem Polymer1(P1)/Polymer2(P2)-Makromolekül (z.B. Nukleinsäure oder Protein) und Wasser verdunstet wird, und zwei wässrige Phasen werden in Form der Wasser-in-Wasser-Mischung (W1/W2; W1-dispergierte Phase, W2-kontinuierliche Phase) gebildet. Das Verfahren wird durch Senken der Temperatur gefördert. Es kann sogar bei einer Temperatur von etwa 0°C durchgeführt werden.
Die erste Phase besteht aus Wasser und hauptsächlich P1, die zweite Phase besteht aus Wasser und hauptsächlich P2. Der Partitionskoeffizient eines Makromoleküls kann immer so eingestellt werden, dass es ausschließlich in eine der beiden Phasen bewegt wird. Wenn ein Makromolekül eine Nukleinsäure ist, ist ein einphasiges Dx/PEG/Nukleinsäure/Wasser-System bevorzugt. Mikropartikel mit hohen Transfektionseigenschaften werden gebildet, wenn Nukleinsäure in Dx-Phase konzentriert wird.
Wenn die W1-Phase gebildet wird (während des Verdunstungsverfahrens) kommt es zu einer hohen Konzentration von Carbohydraten und biologischem Material in Partikeln der diskontinuierlichen Phase und die Wasserstoffbindungsbildung zwischen Polymermolekülen wirkt hauptsächlich als stabilisierendes Phänomen für Mikropartikelstrukturen (Lit. 11).
Dextran ist das beste Polymer für die Mikropartikelbildung, da dieses Polymer biologisch abbaubar ist und seit langem als Plasmaexpander verwendet wird. Außerdem beruht eine Reihe von Formulierungen für eine gesteuerte Freisetzung und ein Arzneistofftargeting auf der Verwendung von Dextran oder dessen Derivaten oder Analogen (Lit. 11).
Neben Dextran schließen geeignete Polymere andere Polymere auf Carbohydratbasis, wie Methylcellulose, Chitin oder Stärke ein. Polyaliphatische Alkohole, wie Polyethylenoxid und dessen Derivate, z.B. Polyethylenglykol (PEG) oder PEG-Acylat- und Poly(vinyl)-Polymere und deren Derivate, wie Poly(vinyl)alkohole, können ebenfalls geeignet sein. Auch Polyaminosäuren, wie Polylysin, können verwendet werden. Ferner kann die erfindungsgemäße Zusammensetzung natürlich vorkommende Polymere, wie Zein, Pullulan oder Chitosan oder deren Derivate, als Komponenten des wässrigen Polymersystems beinhalten.
Das biologische Material, das die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung beinhaltet, kann alle Substanzen natürlichen oder synthetischen Ursprungs einschließen. Vorzugsweise zeigen diese Substanzen eine biologische Aktivität in oder an der Zielzelle. Es ist von Vorteil, dass das biologische Material nicht auf Makromoleküle mit einer tertiären oder quartären Struktur beschränkt ist.
Somit können die Mikropartikel, die anhand des erfindungsgemäßen Verfahrens gebildet werden, Peptide, Proteine, Enzyme, rekombinante Proteine, Nukleinsäuren, Hormone, Wachstumsfaktoren, Carbohydrate, Lipide und deren Derivate einschließen. Auch Viren, Viruspartikel oder Plasmide können mit den Polymeren wie oben angegeben gemischt werden, um Mikropartikel zu bilden. Kleine Moleküle, wie Hapten, können an Makromoleküle, z.B. ein Protein, konjugiert werden, bevor sie der Polymerlösung zugegeben werden. Eine organische oder anorganische pharmazeutische Verbindung oder ein Arzneimittel kann durch Bindung des Arzneimittels an ein Molekül, wie ein Protein, in das Mikropartikel aufgenommen werden. Anschließend können die Mikropartikel mit dem Makromolekül/Arzneimittel-Komplex oder -Konjugat gebildet werden.
Es sei darauf hingewiesen, dass der Ausdruck biologische Materialien auch Kombinationen der oben genannten Substanzen umfasst. Der Ausdruck umfasst auch biologisch aktives Material, ebenso wie Material biologischen Ursprungs.
Die Nukleinsäure-Mikropartikel können auch pharmazeutische Substanzen einschließen, wie Chloroquin, wodurch Nukleinsäuren aus cytoplasmischen Kammern in das Cytoplasma entkommen können, so dass es leichter von den Zellen transkribiert und translatiert werden kann.
Um eine Krebstherapie zu unterstützen, kann die Mikropartikel bildende Zusammensetzung Wachstumsregulierungsfaktoren, wie Interleukin oder Interferon, beinhalten.
Zusätzlich können die Mikropartikel mit Substanzen umhüllt sein, die den Wirkungsgrad der Translation erhöhen können, oder sie können mit Substanzen wie Tensiden, z.B. Tween, umhüllt sein, um ein zellspezifisches Targeting von Mikropartikeln zu unterstützen und zu ermöglichen.
In einer bevorzugten Ausführungsform beinhaltet die Zusammensetzung zur Verwendung in dem erfindungsgemäßen Verfahren ein Nukleinsäurebindungsmittel, wie Polylysin oder Polyethylenimin (PEI). Die Verwendung von Bindungsmitteln mit kondensierenden Aktivitäten, z.B. Tetramin, wie Spermin, kann von Vorteil sein. Das Kondensierungsmittel kann an einen oder mehrere zusätzliche(n) Vektor(en) oder Liganden gebunden werden.
Ferner kann das Kondensierungsmittel vorteilhafterweise mit einem Lysemittel, vorzugsweise lytischen Peptiden, kombiniert werden, um den Wirkungsgrad des Gentransfers zu verbessern. Als Lysemittel kann ein replikationsdefektes Adenovirus oder können Fusionspeptide von Virusproteinen verwendet werden.
Die Erfindung kann verwendet werden, um Träger für die Gentherapie zu bilden, oder für die Herstellung von „genetischen Impfungen", wenn die Zusammensetzung Nukleinsäuren wie DNA oder RNA enthält. Die mit Nukleinsäure beladenen Mikropartikel können auf ganz ähnliche Weise wie nackte DNA in Zielzellen, beispielsweise Säugerzellen, eingebracht werden. Die in vitro-Einbringung, beispielsweise in Zellen, die Teil einer Zellkultur sind, ist ebenfalls möglich.
Ein Einbringungssystem gemäß der Erfindung kann auf Zielzellen verschiedener Arten von Organismen angewendet werden. Vorzugsweise wird es für Zielzellen von Säugern in vivo und in vitro verwendet, insbesondere für menschliche Zellen. Trotzdem kann es sich bei den Zielzellen auch um solche von niedrigeren Lebewesen, wie Amphibien oder Reptilien, handeln. Daneben kann dieses Verfahren verwendet werden, um biologisches Material in Protoplasten von Pflanzenzellen und in Mikroorganismen einzubringen.
Was Säugerzielzellen in vivo, insbesondere solche vom Menschen, betrifft, so können die Mikropartikel einem Patienten intravenös, intramuskulär oder subkutan oder auf andere bekannte Weise, die für den gewünschten therapeutischen Effekt geeignet ist, verabreicht werden, einschließlich in Form eines Aerosols oder Sprays für die Lungen oder durch direkte Spülung durch Körperöffnungen. Die Mikropartikel können lyophilisiert und dann vor der Anwendung in eine wässrige Suspension im Bereich von Mikrogramm/ml bis 100 mg/ml formuliert werden. Sie können einmalig verabreicht werden oder können in eine Reihe von kleineren Dosen aufgeteilt werden, die in verschiedenen Zeitabständen, verabreicht werden, je nach gewünschter Dosierung.
Definitionen:
Einbringungssystem bezeichnet allgemein einen Träger und einen Mechanismus, der den Transport von synthetischen oder natürlichen Substanzen in eine Zielzelle ermöglicht. Ein Einbringungssystem kann verschiedene Zusammensetzungen aufweisen und verschiedenen Ursprungs sein. Bekannte Beispiele sind Liposome, Polymerkonjugate und Viren. Häufig werden sie verwendet, um biologisch aktive Substanzen zu und in Zielzellen zu bringen.
Zielzelle bezeichnet Zellen, Gewebe, Organismen, Organe oder Organellen, die das Ziel der Substanzen darstellen, die von den Einbringungssystemen übertragen werden. Sie stellen entweder den lebenden Organismus selbst, Zellen, Gewebe, Organe oder Organellen innerhalb eines lebenden Organismus oder eine Zellstruktur dar oder bilden einen Teil davon. Das biologische Material kann mit Liganden verbunden sein, die das oben definierte biologische Material beinhalten.
Biologisches Material bezeichnet Substanzen natürlichen oder synthetischen Ursprungs, die vorzugsweise eine biologische Aktivität in oder an der Zielzelle zeigen. Biologisches Material schließt Peptide, Proteine, Enzyme, rekombinante Proteine, Nukleinsäure, Hormone, Wachstumsfaktoren, Carbohydrate, Lipide, Viren oder Viruspartikel, Plasmide, Antikörper oder Derivate, Kombinationen oder Polymere davon ein.
Mikropartikel bezeichnet feste oder halbfeste Partikel mit einem Durchmesser von vorzugsweise unter einem Millimeter, spezieller unter 100 Mikrometer, die aus einer Vielzahl von Materialien gebildet werden können, einschließlich von synthetischen Polymeren, Proteinen und Polysacchariden. Mikropartikel bezeichnet auch Mikrokapseln und Mikrokügelchen.
Nukleinsäure-Bindungsmittel bezeichnet natürliche oder synthetische Substanzen, die mit Nukleinsäuren oder vergleichbarem Material Komplexe bilden. Vorzugsweise beinhalten sie Polykationen, die elektrostatische Wechselwirkungen zwischen ihren positiv geladenen Resten und der negativ geladenen Hauptkette der Nukleinsäuren darstellen. Sie können eine zusätzliche Kondensierungs- und/oder Pufferungsaktivität liefern.
Tensid bezeichnet Substanzen entweder natürlichen oder synthetischen Ursprungs, die in die Mikropartikel bildende Zusammensetzung integriert sind oder die die Mikropartikel umhüllen. Vorzugsweise beinhalten sie hydrophile und lipophile Substanzen.
Die Erfindung wird näher durch die Beispiele bevorzugter Ausführungsformen beschrieben.
Beispiel 1
1.1 Fluoresceinylierte Proteine
Proteine wurden unter Verwendung von Fluoresceinisothiocyanat (FITC) fluoresceinyliert. Um jegliche Spuren von freiem Fluorescein zu beseitigen, wurden fluoresceinierte Proteine durch Ethanol gefällt, durch Zentrifugierung pelletiert und dann in PBS gelöst.
1.2 Fluoresceinylierte Polymere
FD-20S, FD-70S, FD-500S (FITC-markierte Dextrane) wurden von Sigma Chemical Company (St. Louis, MO, USA) erworben und zur Lokalisierung von intrazellulären Mikropartikeln verwendet.
1.3 Derivate von Dextranen
Verfahren zur Bindung von DNA-bindenden und biologisch aktiven Proteinen und Peptiden an Dextrane sind ausführlich beschrieben und dem Fachmann bekannt (siehe beispielsweise Roger L. Lundblad, „Techniques in Protein Modification", 1995).
1.4 Zellen
Zellen können von American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA) erworben werden. Zellen werden entsprechend den in der Literatur gegebenen Empfehlungen kultiviert. Generell werden sie in Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), das mit 10 bis 20% fetalem Kälberserum, Penicillin (100 E/ml), Streptomycin (100 μg/ml) und 2 mm L-Glutamin (GIBCO, Gaithersburg, MD, USA) ergänzt ist, gehalten.
1.5 Polymere
Dextrane, Polyethylenglycole, Polyvinylpyrrolidone und andere (Co)polymere sind im Handel von chemischen Anbietern wie „Sigma" (USA), „Serva" (Deutschland), „Fluka" (Schweiz) erhältlich.
1.6 Herstellung von Mikropartikeln
Einphasige wässrige Lösungen, die Dextran (P1, 20–500 kDa; Serva) und PEG (P2, 1,5 bis 35 kDa; Serva) oder PVP (P2, 10–360 kDa, Fluka) oder Tween-80 (P2; Serva) oder Pluronic F-68 (P2; Serva) oder Ficoll (P2; Serva) enthalten, werden hergestellt. Dann wird das FITC-markierte Dx (FD-20, 70, 500S, Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, USA) oder das FITC-markierte Protein zugegeben und der Verdunstungsprozess wird gestartet. Nach 5 bis 10 Stunden wird der Verdunstungsprozess gestoppt. Danach kann P2 entsprechend den Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, entfernt werden. Mikropartikel werden für die Lagerung gefroren und getrocknet. Der mittlere Durchmesser der Mikropartikel variiert zwischen 0,03 und 3 Mikrometer, die Partikelgröße hängt von dem P1-Phase/P2-Phase-Verhältnis der W1/W2-Emulsion, den Molekülgewichten der Polymere, ihrer Beschaffenheit, der Temperatur und den Verdunstungsraten ab.
Die Größe von Mikropartikeln, die sich für die intrazelluläre Verabreichung eignet, wurde mittels Photonenkorrelations-Spektroskopie (Zeta sizer 1, AZ 110, 90 Grad, Wellenlänge 633) bestimmt. Die Größe wird durch Variieren von
P1/P2 (Gew./Gew.)-Verhältnis in wässrigen einphasigen Lösungen (R1); R1 = 0,01–1,0;
Verdunstungsprozessdauer (D, Stunden); D = 5–10;
Temperatur (T, °C); T = 25, 37;
auf 200–300 nm eingestellt.
1.7. In vitro-Versuch
Humane Hepatocarcinomazellen (HepG2-Zellen; ATCC HB-8065, ATCC, Rockville, MA, USA) werden in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), das 10% wärmeinaktiviertes Serum enthält, kultiviert. Medium und fetales Rinderserum (FBS) stammen von GIBCO-BRL (Gaithersburg, MD, USA). Kulturmedien werden mit 2 mM L-Glutamin und Antibiotika (100 Einheiten/ml Penicillin und 0,1 mg/ml Streptomycin; GIBCO) ergänzt.
HepG2-Zellen werden am Tag vor der Transfektion in 24-Muldenplatten eingebracht. Zellen werden in einem Endvolumen von 0,75 ml pro Mulde Kulturmedium, die 2 mg Mikropartikel enthält, transfiziert. Die Größe der Mikropartikel ist 0,2–0,3 Mikrometer. Die Mikropartikel bestehen aus Dx (20, 70, 500 kDa) und Dx-(FD-70S, 500S; 2 μg) oder FITC-markiertem HSA (Humanserumalbumin; 2 μg). Nach einer Inkubation von 6 oder 24 h bei 37°C wird das Transfektionsmedium entfernt und die Zellen werden in BSA-haltigem PBS gewaschen und 30 Minuten lang in 5%iger Essigsäure in Methanol bei –20°C fixiert.
Die Versuche werden mehrmals mit 3T3-Fibroblasten und auch mit HeLa-Zellen durchgeführt. Innerhalb einer Reihe werden die Versuche doppelt durchgeführt. Intakte Zellen wurden als Kontrolle verwendet.
Die Fluoreszenzmikroskopie zeigt dann eine intranukleäre und intrazelluläre Verortung von Mikropartikeln in allen Arten von verwendeten Zellen.
Beispiel 2
2.1 Herstellung von Mikropartikeln zur Transfektion
Einphasige wässrige Lösungen, die Dx (P1; 20, 70, 500 kDa; Serva), PEG (P2; 6 kDa; Serva) oder PVP (P2; 40 kDa; Fluka) oder Ficoll (P2; Serva) oder Pluronic F68 oder Tween 80 sowie Polynukleotid in Form von Plasmid, das die Kodierungssequenz von beta-Galactosidase (LacZ) unter dem CMV-Promotor (Clonetech, Palo Alto, CA, USA) enthält, werden hergestellt und dann wird der Verdunstungsprozess durchgeführt (siehe Beispiel 1).
Die Größe der Partikel wird durch Variieren von R1, D und T auf 100–200 nm eingestellt. Die Einschlussniveaus werden mittels Agarosegel-Elektrophorese (1% Agarosegel, TAE-Puffer, pH 7,4, 90 V, 3 h) geschätzt. Plasmid ohne Einschließung wird durch Ethidiumbromid-Interkalation erfasst. Ein Plasmid-DNA-Einschlussniveau von 0,95 ist ohne Verwendung von DNA-Bindungsmittel wie PLL erreichbar, wenn das P1/pDNA Gew./Gew.-Verhältnis über 25 liegt. In anderen Fällen werden Polykationen, wie PLL, Peptide oder Dextrane, die mit DNA-Bindungsmitteln substituiert sind, verwendet.
2.2 In vitro-Transfektion
Zellen werden 24 h vor dem Versuch in 24-Mulden-Gewebekulturplatten eingebracht und transfiziert (siehe Bsp. 1). Nach 24 h langer Inkubation bei 37°C wird das Transfektionsmedium entfernt, die Zellen werden mit BSA-haltigem PBS gewaschen und 30 Minuten lang in 5%iger Essigsäure in Methanol bei –20°C fixiert und über Nacht bei 37°C mit einer X-gal-Lösung behandelt. Nach der Anfärbung wird eine LacZ-Expression in allen Arten von verwendeten Zellen gefunden (HeLa, 3T3, HepG2).
2.3 In vivo-Transfektion
Mäusen werden durch die Schwanzvene Mikropartikel (Dx/pCMV LacZ 2,5 mg/0,025 mg pro Tier) in 0,1 ml 150 mM NaCl-Kochsalzlösung injiziert. Die Mäuse wurden zwei Wochen nach der Injektion skarifiziert und nacheinander mit 5 mg/l Heparin in Kochsalzlösung, 4% Paraformaldehyd in PBS und einer Standard-β-Galactosidase-Indikatorlösung (1 mg/ml X-gal, Sigma) perfundiert. Nach der Perfusion wurden alle Organe präpariert und die β-Galactosidaseindikation wurde 48 Stunden lang durch Eintauchen in die X-gal-Lösung bei 30°C fortgesetzt. Nach der Anfärbung wurden die Organe für die Histochemie in Paraffin eingeschlossen. Eine Transgen (LacZ)-Expression wurde in den Lungen, dem Herzen, den Muskeln, der Leber und dem Gehirn gefunden.
Beispiel 3
3.1 Biologisches Material:
Als biologisches Material ist pCMVLacZ, das bakterielle β-Galactosidase enthält, die von einem humanen Cytomegalovirus-Promotor oder pNTβGal angetrieben wird, was ein ähnliches Konstrukt ist, das durch ein Signal für die Kernlokalisierung modifiziert ist, in der Zusammensetzung enthalten.
3.2 Herstellung von Mikropartikeln
Die Mikropartikel werden hergestellt wie ausführlich unter Beispiele 1 und 2 beschrieben.
3.3 Mikropartikelcharakterisierung
Die Größenverteilung der Mikropartikel wird mittels Elektronenmikroskopie bestimmt. Alle Partikel weisen einen Durchmesser von etwa 1 Mikrometer auf.
3.4 In vivo-Transfektion
Eine Genübertragung wird an Mäusen vorgenommen. Für die Verabreichung von Mikropartikeln werden intramuskuläre (Musculus quadriceps f.) und intravenöse (Schwanzvene) Wege verwendet. 25 oder 50 μg Plasmid-DNA werden pro Injektion in Mikropartikel geladen. Kontrolltiere werden mit der gleichen Menge nackter Plasmid-DNA transfiziert.
3.5. Skarifizierung der Tiere
Die Tiere wurden am Tag 14 nach der Verabreichung skarifiziert.
3.6 β-Gal-Expressionsanalyse
Im Falle einer intramuskulären Verabreichung werden Gewebeproben des injizierten Muskels, der Leber oder der Lunge genommen. Im Falle einer intravenösen Verabreichung werden Gewebeproben aus Leber oder Lunge genommen. Keine dieser Gewebeproben zeigt irgendwelche Anzeichen für eine Gewebedegenerierung.
3.7 Untersuchung der transgenen Expression
Nach der Skarifizierung werden Gewebeproben einem Snap Freezing in flüssigem Stickstoff unterzogen und für die weitere Prüfung auf qualitative cytochemische Markergenexpression an Cryostatsektionen oder an den ganzen Organproben weiterverarbeitet.
Der Anteil der β-Gal-positiven Zellen (Kerne) an der Gesamtzahl der Zellen (Kerne) wird als Mittelwert für die Transfektionseffizienz quantifiziert.
Nach intramuskulären Injektionen war der Anteil von positiven Zellen 0,01–0,07 in Muskelgewebe und 0,01–0,03 in Leber- und Lungengewebe.
Nach intravenösen Injektionen war der Anteil von positiven Zellen 0,01–0,05 sowohl in Leber als auch in Lunge.
Obwohl die Erfindung ausführlich beschrieben ist, sind die Beispiele zur Erläuterung angegeben.
Literaturstellen:

1. Wu, George Y. et al., „Receptor-mediated Gene Delivery and Expression in Vivo". The Journal of Biological Chemistry, Bd. 263, Nr. 29, S. 14621–14624. 15. Oktober 1988.
2. Wu, George Y. et al., „Receptor-mediated Gene Delivery in Vivo". The Journal of Biological Chemistry, Bd. 266, Nr. 22, S. 14338–14342. 5. August 1991.
3. Seymour, L. W.: "Passive tumor targeting of soluble macromolecules and drug conjugates", Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst., 1992, Bd. 9, S. 135–137;
4. Pollard, H. et al.: "Polyethylenimin but not cationic lipids promotes transgene delivery to the nucleus in mammalian cells"; The Journal of Biol. Chem., 1998, Bd. 273, N13, S. 7507–7511;
5. Wolfert, M. A., Seymour, L. W.: „Atomic force microscopic analysis of the influence of the molecular weight of PLL on the size of polyelectrolyte complexes formed with DNA"; Gene Therapy, 1996, Bd. 3, S. 269–273;
6. Gottschalk, S. et al.: "A novel DNA – peptide complex for efficient gene transfer and expression in mammalian cells"; Gene Therapy, 1996, Bd. 3, S. 448–457;
7. Boussif O. et al.: "A novel versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine"; PNAS USA, 1995, Bd. 92, S. 7297–7303;
8. Kirchels, R. et al.: "Coupling of cell-binding ligands to polyethylenimine for targeted gene delivery"; Gene Therapy, 1997, Vd. 4, S. 409–418;
9. Goula D. et al.: "Polyethylenimine-based intravenous delivery of transgenes to mouse lung"; Gene Therapy, 1998, Bd. 5, S. 1291–1295;
10. Partitioning in Aqueous Two-Phase Systems, 1985, eds., H. Walter, D. Brooks, and D. Fisher, Academic Press 11. Schröder, U.: "Crystallised carbohydrates spheres for slow release and targeting"; Methods in enzymology, 1985, Bd. 112, S. 116–128;
11. Schröder, U.: "Crystallized Carbohydrate Spheres for Slow Release and Targeting"; Methods in Enzymology, 1985, Bd. 112, S. 116–128;
12. Franssen, O., Tenekes, R. J., Hennink, W. E.: „Controlled release of a model protein from enzymatically degrading dextran microspheres", J. Controlled Release, 20. Mai 1999; 59(2), S. 219–228;

Literaturstellen für alternative Mikroverkapselungsverfahren:

1. Schröder, U.: "Crystallised Carbohydrate Spheres for Slow Release and Targeting"; 1985, Methods in Enzymology, Bd. 112, S. 116–128;
2. Stenekes, R. J., Franssen, O. et al.: „The use of aqueous PEG/dextran phase separation for the preparation of dextran microspheres", Int. J. Pharm., 10. Juni 1999; 183(1), S. 29–32;

Literaturstellen für die Nicht-Toxizität von Dextran:

1. Reza Mehvar, Megan A. Robinson, James M. Reynolds, "Molecular Weight Dependent Tissue Accumulation of Dextrans: In Vivo Studies in Rats"; Journal of Pharm. Sciences, 1994, Bd. 83, Nr. 10, S. 1495–1499;
2. Thoren, L., Develop. Biol. Stand., 1981, 48, 157–167;
3. Yamaoka, T., Tabata, Y., Ikada, Y.; Drug Delivery, 1993, Bd. 1, S. 75–82.

Claims

Verfahren zur Herstellung von Mikropartikeln aus einem flüssigen einphasigen System, enthaltend biologisches Material und auch mindestens zwei nicht mischbare Komponenten, wobei die Bildung der Mikropartikel durch Verdunstung aus dem einphasigen System erreicht wird, die zur Trennung in eine disperse und eine kontinuierliche Phase führt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Verdunstungsprozess eine Dauer zwischen 0,1 und 100 Stunden hat.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Verdunstungsprozess eine Dauer zwischen 0,1 und 50 Stunden hat.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Verdunstungsprozess bei einer Temperatur zwischen 0° und 100° durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Verdunstungsprozess bei einer Temperatur zwischen 0° und 50° durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Verdunstungsprozess bei einem Druck zwischen 0,1 bis 760 mm Hg. P. durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Verdunstungsprozess gestoppt wird, wenn die Wasserkonzentration innerhalb des Systems zwischen 5 und 80% liegt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Verdunstungsprozess gestoppt wird, wenn die Wasserkonzentration inner halb des Systems zwischen 5 und 75% liegt.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Kalziumphosphat-Ausfällungsmethode angewendet wird.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei die Kalziumphosphat-Ausfällungsmethode angewendet wird.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Kalziumphosphat-Ausfällungsmethode angewendet wird.
Mikropartikel werden hergestellt durch die Anwendung einer Methode nach einem der Ansprüche 1 bis 11.
Mikropartikel nach Anspruch 12 aus mindestens 75% polymeren Molekülen und 25% oder weniger biologischem Material.