DE69802102T2

DE69802102T2 - Formulierung von stabilisierter kationischen transfektionsmittel/nukleinsäuren partikeln

Info

Publication number: DE69802102T2
Application number: DE69802102T
Authority: DE
Inventors: Joel Crouzet; Bruno Pitard
Original assignee: Aventis Pharma SA
Current assignee: Aventis Pharma SA
Priority date: 1997-02-10
Filing date: 1998-02-06
Publication date: 2002-03-14
Anticipated expiration: 2018-02-07
Also published as: FR2759298A1; SK282685B6; ZA981034B; CA2278665A1; HUP0001720A1; HUP0001720A3; WO1998034648A1; BR9807563A; PT1007097E; NO993825L; AU6298798A; ATE206932T1; ES2166146T3; EP1007097B1; DK1007097T3; CZ282199A3; GR3036919T3; AU737720B2; EP1007097A1; JP2001511171A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Assoziationen kationische(s) Transfektionsmittel/DNA, deren Teilchen mit Hilfe eines nichtionischen grenzflächenaktiven Mittels größenstabilisiert sind, sowie ihre Verwendung in der Gentherapie.
Zahlreiche genetische Erkrankungen sind mit einem Expressionsdefekt und/oder einer anormalen Expression, d. h. einer mangelhaften oder exzessiven Expression, einer oder mehrerer Nukleinsäuren verbunden. Die Gentherapie setzt sich hauptsächlich zum Ziel, diesen Typ von genetischen Anomalien durch den Ausgleich der cellulären Expression in vivo oder in vitro der clonierten Gene zu korrigieren.
Heute werden mehrere Verfahren zur intracellulären Abgabe dieses Typs von genetischer Information vorgeschlagen. Eine darunter insbesondere beruht auf der Verwendung von chemischen oder biochemischen Vektoren. Die synthetischen Vektoren besitzen zwei Hauptfunktionen, die Komplexierung der zu transfizierenden DNA und die Förderung deren cellulärer Fixierung sowie deren Passage durch die Plasmamembran und gegebenenfalls durch die zwei Kernmembranen. Unter den entwickelten synthetischen Vektoren sind die kationischen Polymere vom Typ Polylysin und DEAE-Dextran oder auch die Lipofektantien besonders vorteilhaft.
Ein bedeutender Fortschritt wurde in dieser Art der Transfektion mit der Entwicklung einer Technologie erzielt, die auf der Verwendung von kationischen Transfektionsmitteln vom Typ Lipofektantien oder genauer von kationischen Lipiden beruht. So wurde nachgewiesen, dass ein positiv geladenes kationisches Lipid N-[1-(2,3-Dioleyloxy)propyl]- N,N,N-trimethylammoniumchlorid (DOTMA) in Form von Liposomen oder kleinen Vesikeln spontan mit der DNA wechselwirkt, die negativ geladen ist, wobei Lipid-DNA-Komplexe gebildet werden, die mit den Zellmembranen fusionieren können und so die intracelluläre Abgabe von DNA erlaubt.
Seit DOTMA wurden andere kationische Lipide nach diesem Strukturmodell entwickelt: lipophile Gruppe, assoziiert mit einer Aminogruppe über einen sogenannten "Spacer"arm. Unter diesen können insbesondere diejenigen genannt werden, die als lipophile Gruppen zwei Fettsäuren oder ein Cholesterinderivat umfassen und weiterhin gegebenenfalls als Aminogruppe eine quaternäre Ammoniumgruppe umfassen. DOTAP, DOBT oder ChOTB können insbesondere als repräsentative Verbindungen für diese Kategorie von kationischen Lipiden genannt werden. Andere Verbindungen, wie DOSC und ChOSC, sind durch die Anwesenheit einer Cholingruppe anstelle einer quanternären Ammoniumgruppierung gekennzeichnet.
Eine andere Kategorie von Lipofektantien, die Lipopolyamine, wurde ebenfalls beschrieben. Allgemein handelt es sich um ein amphiphiles Molekül, das mindestens eine hydrophile Polyaminregion, assoziiert über eine sogenannte Spacerregion an eine lipophile Region, umfasst. Die Polyaminregion der Lipopolyamine, die kationisch geladen ist, kann sich reversibel mit negativ geladener Nukleinsäure assoziieren. Diese Wechselwirkung bindet die Nukleinsäure stark. Die lipophile Region macht diese ionische Wechselwirkung gegenüber dem externen Milieu unempfindlich, indem das gebildete Nukleolipidteilchen mit einer Lipidhülle überzogen wird. In diesem Typ von Verbindungen kann die kationische Gruppierung durch den Rest L-5-Carboxyspermin wiedergegeben werden, der vier Ammoniumgruppierungen, zwei primäre und zwei sekundäre, enthält. Die Verbindungen DOGS und DPPES sind insbesondere ein Teil davon. Diese Lipopolyamine sind ganz besonder wirksam zur Transfektion von primären endokrinen Zellen. Als Beispiel für diese zuletzt genannte Familie von Verbindungen kann man ganz besonders die Lipopolyamine nennen, die insbesondere in den Patentanmeldungen WO 96/17823 und WO 97/18185 beschrieben sind.
Jedenfalls beruht die Wirksamkeit dieser synthetischen Vektoren darin, insbesondere eine Verbesserung hinsichtlich der Komplexierung der Nukleinsäure und genauer hinsichtlich der Stabilität der Teilchen dieser Nukleolipidkomplexe herbeizuführen. In der Tat, mit den klassischen Formulierungen Nukleinsäuren/kationisches Transfektionsmittel wird häufig und rasch ein Phänomen der Aggregation der komplexen Teilchen unterstützt. Derartige Aggregate besitzen offensichtlich eine Größe, die schwierig mit einer therapeutischen Transfektion kompatibel ist. Eine der bis heute vorgeschlagenen Lösungen, um diesen Typ von Präzipitationsphänomen zu vermeiden, besteht darin, in die Formulierung ein kationisches Transfektionsmittel, wie beispielsweise das Lipofektant, in einer exzessiven Menge, d. h. in einem Verhältnis Ladung Lipofektant/Nukleinsäuren in der Größenordnung von 10 oder mehr einzubringen. Außer der Tatsache, dass eine derartige Lösung nicht immer wirksam ist, ist sie hinsichtlich der Unschädlichkeit überhaupt nicht zufriedenstellend. Die kationischen Transfektionsmittel, wie die Lipofektantien und die kationischen Polymere, sind als solche Verbindungen, die in großen Mengen das Risiko eingehen, eine relative Toxizität für die Zellen, in die sie eingeschleust werden, zu besitzen.
Es wäre nun besonders bedeutsam, in therapeutischer Hinsicht Formulierungen von kationischen Transfektionsmitteln/Nukleinsäuren zu besitzen, die verminderte und trotzdem zeitlich stabilisierte Verhältnisse an Ladung in Form von nichtaggregierten Teilchen besitzen. Oder, wie vorstehend ausgeführt wurde, Zonen an Konzentrationen von Nukleinsäuren/Lipofektantien entsprechend derartigen Ladungsverhältnissen sind im Allgemeinen mit einem physikalisch instabilen Zustand assoziiert. Man unterstützt rasch ein Phänomen der Aggregation der Nukleolipidteilchen. Was noch mehr ist, man weiß auch, dass die Anwesenheit eines Salzes vom Typ NaCl, das klassischerweise in den Formulierungen von kationischen Transfektionsmitteln/Nukleinsäuren eingesetzt wird, bei bestimmten Konzentrationen die Fällung der Nukleolipidteilchen induzieren kann. So ist der Konzentrationsbereich an Transfektionsmittel, für den man die Fällung beobachtet, umso größer umso höher die Salzkonzentration ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft genau die Bewertung dieser Konzentrationszonen an kationischen Transfektionsmitteln/Nukleinsäuren, die hinsichtlich ihrer Unschädlichkeit für ihre verminderten Mengen an Vektor und auch hinsichtlich ihrer Interferenz mit anderen Proteinen angesichts ihrer verminderten Ladung von Bedeutung sind. In der Tat, wenn diese Komplexe relativ wenig geladen sind, ist das Risiko, dass sie mit Serumproteinen in vivo wechselwirken, signifikant vermindert. Dies ist natürlich für den Transfer von Nukleinsäuren in vivo besonders vorteilhaft (Remy, J. S., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1995; 92, 1744-1748). Zahlreiche Artikel berichten über diesen Typ von Wechselwirkungen zwischen Serumproteinen und Liposomen (Senior, J. H. et al., Biochim. Biophys. Acta 1991, 1070, 173-179; Hernandes-Caselles, T et al., Molecular and cellular Biochemistry 1993, 120, 119-126; Oku, N. et al., Biochim. Biophys. Acta 1996, 1280, 149-154). Arbeiten wurden auch über die Aktivierung des Komplementsystems durch Komplexe auf der Grundlage von DNA, die für die Gentherapie verwendet werden, publiziert. Der Grad der Komplementaktivierung hängt vom Verhältnis Kation/DNA (oder vom Ladungsverhältnis) ab. Dieses zuletztgenannte Phänomen trifft insbesondere auf Polykationen, wie Polylysine, Lipospermine (beispielsweise DOGS) zu. Die Aktivierung des Komplements ist, bezogen auf die Ladung, für quaternäre Ammoniumionen, wie DOTAP, DC-Chol oder DOTMA weniger empfindlich (Plank, C. et al., Human Gene Therapy 1996, 7, 1437-1466).
Folglich ist es besonders wichtig, in therapeutischer Hinsicht über Formulierungen aus Komplexen aus kationischen Transfektionsmitteln/Nukleinsäuren in erhöhten Konzentrationen an Nukleinsäuren und/oder mit verminderten, sogar fast neutralen Ladungsverhältnissen, zu besitzen, die außerdem in einer fluiden Form vom kolloidalen Typ stabilisiert sind, d. h. nicht aggregiert sind, zwei spezielle Eigenschaften, die natürlicherweise unvereinbar erscheinen.
Überraschenderweise hat die Anmelderin nachgewiesen, dass die Verbindung eines nichtionischen oberflächenaktiven Mittels mit Teilchen von Komplexen aus kationischem Transfektionsmittel/Nukleinsäuren, die natürlicherweise instabil sind, d. h. die dazu neigen, sich rasch im Hinblick auf die Bildung von Aggregaten zu entwickeln, es erlaubt, diesem Phänomen wirksam entgegen zu wirken und somit die Teilchen der Komplexe auf eine Teilchengröße von kleiner als oder im Bereich von 160 nm zu stabilisieren.
Die vorliegende Erfindung betrifft daher zuerst eine in der Gentherapie-nützliche Zusammensetzung, umfassend Teilchen aus Komplexen aus kationischem Transfektionsmittel/Nukleinsäuren, die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie weiterhin mindestens ein nichtionisches oberflächenaktives Mittel in einer Menge umfassen, die ausreicht, um die Größe der Teilchen auf eine Dimension von kleiner als oder gleich 160 nm zu stabilisieren. Erfindungsgemäß soll unter stabilisierten Teilchen Teilchen verstanden werden, deren Größe im Verlauf der Zeit nicht dazu neigt, sich langsam zu verändern, wenn insbesondere diese Teilchen in Dispersion in einer Lösung gehalten werden. Im Gegensatz zu klassischen Formulierungen, d. h. ohne nichtionische oberflächenaktive Mittel, können die beanspruchten Zusammensetzungen zeitlich länger aufbewahrt werden, ohne dass irgendeine Veränderung, insbesondere des Typs der Aggregation, in dieser Dispersion festgestellt werden. Die Größe der so stabilisierten Teilchen bewegt sich im Allgemeinen zwischen 50 und 160 nm, bevorzugt zwischen 75 und 150 nm.
In Abwesenheit des beanspruchten nichtionischen oberflächenaktiven Mittels führen die Teilchen der in der beanspruchten Zusammensetzung vorhandenen Komplexe spontan zu teilchenförmigen Aggregaten mit einer Größe über 160 nm.
Außerdem hat die Anmelderin gezeigt, dass die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen eine lamelläre Struktur mit alternativ Lipid-Doppelschichten und interkalierenden DNA- Schichten besitzen.
Die erfindungsgemäßen nichtionischen oberflächenaktiven Mittel besitzen bevorzugt mindestens ein hydrophobes Segment und mindestens ein hydrophiles Segment. Der hydrophobe Teil kann auch eine aliphatische Kette, ein Polyoxyalkylen, ein Alkylidenpolyester, ein Polyethylenglykol mit einem dendritischen Benzylpolyetherkopf oder Cholesterin sein. Was den hydrophilen Teil betrifft, kann es sich um ein Polyoxyalkylen, einen Polyvinylalkohol, ein Polyvinylpyrrolidon oder ein Saccharid handeln.
Bevorzugt ist das im Rahmen der vorliegenden Erfindung eingesetzte oberflächenaktive Mittel ein nichtionisches Polyolderivat und insbesondere ein Derivat eines Polyoxyalkylens mit Alkylengruppen mit verschiedenen Längen und/oder Konformationen oder gleichen Längen und/oder Konformationen in Polymeren.
Bevorzugter entspricht es der folgenden allgemeinen Formel:
HO(CH&sub2;CH&sub2;O)a(CH(CH&sub3;)CH&sub2;O)b(CH&sub2;CH&sub2;O)cH, wobei a, b und c unabhängig voneinander ganze Zahlen, die zwischen 20 und 100 einschließlich varieren können, bezeichnen.
Das nichtionische Mittel ist bevorzugt in den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen in einer Konzentration zwischen 0,01% bis 10% Gew./Vol. der Zusammensetzung und noch bevorzugter zwischen 0,02% und 5% Gew./Vol. vorhanden.
Die Anwesenheit eines derartigen nichtionischen oberflächenaktiven Mittels in Assoziation mit Komplexen ist aus mehreren Gründen vorteilhaft:
Erfindunsgemäß ist bzw. sind das/die kationische Transfektionsmittel und Nukleinsäuren in den Zusammensetzungen in einem Ladungsverhältnis vorhanden, das natürlicherweise für die Entwicklung eines Aggregationsphänomens eigentümlich ist. Das impliziert, dass die positiven Ladungen, die das/die kationische(n) Transfektionsmittel trägt/tragen, nur in leichtem Überschuss, verglichen mit den negativen Ladungen, die die komplexen Nukleinsäuren tragen, vorhanden sind, sogar besser sie vollständig kompensieren. Ein derartiges Ladungsverhältnis ist in vivo besonders vorteilhaft, da es hinsichtlich der Wechselwirkung mit dem Serum oder anderen Proteinen, wie beispielsweise Albumin, weniger schädlich ist und größere Unschädlichkeit zeigt. Beispielsweise entwickelt sich das Ladungsverhältnis bevorzugt zwischen 1 und 6, und noch bevorzugter liegt es unter 4.
Außerdem ist dieses oberflächenaktive Mittel vollständig mit einer in-vivo-Verabreichung kompatibel. Im Falle der erfindungsgemäßen Formulierungen ist es in Tat nicht notwendig, dieses nichtionische oberflächenaktive Mittel vor der Injektion in die zu behandelnden Zellen zu eliminieren.
Schließlich können die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen vorteilhafterweise gelagert werden. Die Anwesenheit des nichtionischen oberflächenaktiven Mittels widersteht wirksam jedem Präzipitationsphänomen in der Zusammensetzung.
Als Beispiel für das bevorzugte oberflächenaktive Mittel gemäß der Erfindung wird insbesondere die Verbindung der allgemeinen Formel:
OC(CH&sub2;CH&sub2;O)a(CH(CH&sub3;)CH&sub2;O)b(CH&sub2;CH&sub2;O)cH,
genannt, wobei a 75 ist, b 30 ist und c 75 ist.
Andere bevorzugte nichtionische oberflächenaktive Mittel sind Polyethylenglykol mit einem dendritischen Benzylpolyetherkopf, Polyoxyethylenalkohol oder Polyoxyethylennonylphenylether.
Unter kationischem Transfektionsmittel werden erfindungsgemäß bevorzugt die kationischen Polymeren und die Lipofektantien bezeichnet.
Was insbesondere die Lipofektantien betrifft, so sollen unter dieser Bezeichnung erfindungsgemäß jede Verbindung oder Gemisch mit Lipidcharakter und positiver Ladung verstanden werden, das bereits als aktives Mittel im Hinblick auf die celluläre Transfektion von Nukleinsäuren vorgeschlagen wurde.
Allgemein handelt es sich um amphiphile Moleküle, die mindestens eine lipophile Region mit oder ohne Assoziation mit einer hydrophilen Region umfassen.
Als repräsentatives Beispiel der ersten Familie der Verbindungen können insbesondere Lipidgemische vorgeschlagen werden, die kationische Liposomen bilden können. Diese Formulierungen können auch POPC, Phosphatidylserin, Phosphatdiylcholin, Cholesterin, Lipofektamin oder Maleimidophenylbutyrylphosphatidylethanolamin in Assoziation mit einem kationischen Lipid, wie nachstehend definiert, enthalten.
Gemäß einer speziellen Ausführungsform der Erfindung besitzt das eingesetzte Lipofektantmittel eine kationische Region.
Als Beispiel für dieses Beispiel von kationischen Lipiden, die nach dem Modell der Struktur: lipophile Gruppe in Assoziation mit einer Aminogrupe über einen sogenannten "Spacer"arm konstruiert sind, können insbesondere DOTMA und ebenfalls diejenigen, die als lipophile Gruppe zwei Fettsäuren oder ein Cholesterinderivat umfassen, und weiterhin gegebenenfalls als Aminogruppe eine quaternäre Ammoniumgruppe tragen, genannt werden. DOTAP, DOBT oder ChOTB können insbesondere als Repräsentative dieser Kategorie von kationischen Lipiden genannt werden. Andere Verbindungen, wie DOSC und ChOSC, sind durch die Anwesenheit einer Cholingruppierung anstelle der quaternären Ammoniumgruppierung gekennzeichnet.
Vorteilhafterweise können die erfindungsgemäßen Lipofektantien auch aus Lipopolyaminen ausgewählt sein, deren Polyaminregion der allgemeinen Formel:
H&sub2; N-(-(CH)m-NH-)n-H
entspricht, worin m eine ganze Zahl von größer oder gleich 2 ist, n eine ganze Zahl von größer oder gleich 1 ist, m zwischen den verschiedenen Kohlenstoffgruppen, die zwischen den zwei Aminen eingeschlossen sind, varieren kann, wobei diese Polyaminregion covalent mit einer lipophilen Region vom Typ gesättigte oder nichtgesättigte Kohlenwasserstoffkette, Cholesterin, natürliches oder synthetisches Lipid mit der Fähigkeit, lamelläre oder hexagonale Phasen zu bilden, assoziiert sein kann. Diese Polyaminregion wird bevorzugter durch Spermin oder eines seiner Analoga, das die Eigenschaften zur Bindung an Nukleinsäure beibehalten hat, wiedergegeben.
Die Patentanmeldung EP 394 111 beschreibt Lipopolyamine dieser Familie, die erfindungsgemäß eingesetzt werden können. Als repräsentatives Beispiel für diese Lipopolyamine können ganz besonders Dioctadecylamidoglycylspermin (DOGS) und Palmitoylphosphatidylethanolamin-5-carboxyspermylamid (DPPES) genannt werden.
Die in der Patentanmeldung WO 96/17823 beschriebenen Lipopolyamine können auch vorteilhafterweise erfindungsgemäß verwendet werden. Sie werden durch die allgemeine Formel
wiedergegeben, worin R
bedeutet, worin
X und X' unabhängig voneinander ein Sauerstoffatom, eine Methylengruppe -(CH&sub2;)q-, wobei q 0, 1, 2 oder 3 ist, oder eine Aminogruppierung -NH- oder -NR'-, wobei R' eine C&sub1;-C&sub4;- Alkylgruppe bezeichnet, bezeichnen, Y und Y' unabhängig voneinander eine Methylengruppierung, eine Carbonylgruppierung oder eine Gruppierung C=S bezeichnen, R&sub3;, R&sub4; und R&sub5; unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom oder einen C&sub1;- C&sub4;-Alkylrest, der substituiert sein kann oder nicht, bedeuten, wobei p zwischen 0 und 5 variieren kann, R&sub6; ein Cholesterinderivat oder eine Dialkyl- aminogruppierung - NR&sub1;R&sub2; bezeichnet, wobei R&sub1; und R&sub2; unabhängig voneinander einen linearen oder verzweigten C&sub1;&sub2;-C&sub2;&sub2;-Alkylrest, der gesättigt sein kann oder nicht, bezeichnen.
Als repräsentative Beispiele für diese Lipopolyamine können insbesondere 2,5-Bis(3-aminopropylamino)pentyl(diocta- decylcarbamoylmethoxy)acetat und 1,3-Bis(3-aminopropylamino)-2-propyl(dioctadecylcarbamoylmethoxy)acetat genannt werden.
Schließlich wurden jüngst neue Lipopolyamine, die auch im Rahmen der vorliegenden Erfindung wertvoll sind, in der Patentanmeldung WO 97/18185 beschrieben. Es handelt sich um Verbindungen der allgemeinen Formel wie folgt:
Darin bezeichnen R&sub1;, R&sub2; und R&sub3; unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom oder eine Gruppe -(CH&sub2;)q-NRR', wobei q zwischen 1, 2, 3, 4, 5 und 6 unabhängig zwischen den verschiedenen Gruppierungen R&sub1;, R&sub2; und R&sub3; variieren kann und R und R' unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom oder eine Gruppierung -(CH&sub2;)q'-NH&sub2; bezeichnen, wobei q' zwischen 1, 2, 3, 4, 5 und 6 unabhängig zwischen den verschiedenen Gruppierungen R und R' variieren kann, m, n und p unabhängig voneinander eine ganze Zahl, die zwischen 0 und 6 variieren kann, bezeichnen, wobei, wenn n einen Wert über 1 hat, m verschiedene Werte annehmen kann und R&sub3; verschiedene Bedeutungen der allgemeinen Formel besitzen kann und R&sub4; eine Gruppierung der allgemeinen Formel bezeichnet:
worin R&sub6; und R&sub7; unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom oder einen gesättigten oder nichtgestättigten aliphatischen C&sub1;&sub0;-C&sub2;&sub2;-Rest bezeichnen, wobei mindestens eine der zwei Gruppierungen verschieden von Wasserstoff ist, u eine ganze Zahl, ausgewählt zwischen 0 und 10 ist, wobei, wenn u eine ganze Zahl über 1 ist, R&sub5;, X, X und r verschiedene Bedeutungen in den verschiedenen Motiven [X-(CHR&sub5;)r-Y] haben können, X ein Sauerstoffatom, ein Schwefelatom oder eine monoalkylierte oder nichtmonoalkylierte Amingruppierung bezeichnet, Y eine Carbonylgruppe oder eine Methylengruppe bezeichnet, R&sub5; ein Wasserstoffatom oder eine Seitenkette einer natürlichen Aminosäure, die gegebenenfalls substituiert ist, bezeichnet und r eine ganze Zahl, die zwischen 1 und 10 variieren kann, bezeichnet, wobei, wenn r den Wert 1 hat, R&sub5; eine Seitenkette einer natürlichen Aminosäure, die substituiert sein kann oder nicht, bezeichnet und wenn r einen Wert über 1 hat, R&sub5; ein Wasserstoffatom bezeichnet.
Als repräsentative Beispiele für diese Lipopolyamine können insbesondere die folgenden erwähnt werden:
{H&sub2;N(CH&sub2;)&sub3;}&sub2;N(CH&sub2;)&sub4;N{(CH&sub2;)&sub3;NH&sub2;}(CH&sub2;)&sub3;NHCH&sub2;COGlyN[(CH&sub2;)&sub1;&sub7;CH&sub3;]&sub2;.
H&sub2;N(CH&sub2;)&sub3;NH(CH&sub2;)&sub4;NH(CH&sub2;)&sub3;NHCH&sub2;COGlyN[(CH&sub2;)&sub1;&sub7;CH&sub3;]&sub2;
H&sub2;N(CH&sub2;)&sub3;NH(CH&sub2;)&sub4;NH(CH&sub2;)&sub3;NHCH&sub2;COArgN[(CH&sub2;)&sub1;&sub7;CH&sub3;]&sub2;.
Besonders vorteilhafterweise kann man erfindungsgemäß Lipofectamin, Dicotadecylamidoglycylspermin (DOGS), Palmitoylphosphatidylethanolamin-5-carboxyspermylamid, (DPPES), 2,5-Bis(3-aminopropyl)pentyl-(dioctadecylcarbamoylmethoxy)acetat, 1,3-Bis(3-aminopropyl)-2-propyl- (dioctadecylcarbamoylmethoxy)acetat, {H&sub2;N(CH&sub2;)&sub3;}&sub2;N(CH&sub2;)&sub4;N{(CH&sub2;)&sub3;NH&sub2;}(CH&sub2;)&sub3;NHCH&sub2;COGlyN[(CH&sub2;)&sub1;&sub7;CH&sub3;]&sub2; H&sub2;N(CH&sub2;)&sub3;NH(CH&sub2;)&sub4;NH(CH&sub2;)&sub3;NHCH&sub2;COGlyN[(CH&sub2;)&sub1;&sub7;CH&sub3;]&sub2;, und/oder H&sub2;N(CH&sub2;)&sub3;NH(CH&sub2;)&sub4;NH(CH&sub2;)&sub3;NHCH&sub2;COArgN[(CH&sub2;)&sub1;&sub7;CH&sub3;]&sub2; verwenden.
Es kann sich auch um kationische Lipide, in die ein oder mehrere Guanidinium- und/oder Amidiniumgruppierungen eingearbeitet sind, handeln, insbesondere diejenigen, die von J. M. LEHN et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, 93, 9682-9686) beschrieben sind.
Erfindungsgemäß ist das kationische Polymere, das als kationisches Transfektionsmittel eingesetzt werden kann, bevorzugt eine Verbindung der allgemeinen Formel (I) wie folgt:
worin R ein Wasserstoffatom oder eine Gruppierung der Formel:
sein kann, worin n eine ganze Zahl zwischen 2 und 10 ist und p und q ganze Zahlen sind, mit der Maßgabe, dass die Summe p + q so ist, dass das mittlere Molekulargewicht des Polymeren zwischen 100 und 10&sup7; Da liegt.
Es versteht sich, dass in der vorstehenden Formel (I) der Wert von n zwischen den verschiedenen Motiven p variieren kann. So umfasst die Formel (I) gleichzeitig Homopolymere und Heteropolymere.
Bevorzugter ist in der Formel (I) n zwischen 2 und 5. Inbesondere besitzen die Polymere von Polyethylenimin (PEI) und von Polypropylenimin (PPI) völlig vorteilhafte Eigenschaften. Die bevorzugten Polymeren zur Durchführung der Erfindung sind diejenigen, deren Molekulargewicht zwischen 10³ und 5·10&sup6; liegt. Als Beispiel können Polyethylenimin mit einem mittleren Molekulargewicht von 50.000 Da (PEI50K), Polyethylenimin mit einem mittleren Molekulargewicht von 22.000 Da (PEI22K) oder Polyethylenimin mit einem mittlere Molekulargewicht von 800.000 Da (PEI800K) genannt werden.
Die PEI50K, PEI22K und PEI800K sind im Handel erhältlich. Was die anderen Polymere, die durch ein allgemeinen Formel (I) wiedergegeben sind, betrifft, können sie gemäß dem in der Patentanmeldung FR 95/08735 beschriebenen Verfahren hergestellt werden.
In den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen kann die mit dem kationischen Transfektionsmittel komplexierte Nukleinsäure ebensogut eine Desoxyribonukleinsäure wie eine Ribonukleinsäure sein. Es kann sich um Sequenzen natürlichen oder künstlichen Ursprungs, insbesondere um genomische DNA, cDNA, mRNA, tRNA, rNA, Hybridsequenzen oder synthetische oder semisynthetische Sequenzen von modifizierten oder nichtmodifizierten Oligonukleotiden handeln. Diese Nukleinsäuren können menschlichen, tierischen, pflanzlichen, bakteriellen, viralen etc. Ursprungs sein. Sie können durch jede Technik, die einem Fachmann bekannt ist, und insbesondere durch Absuchen von Banken, durch chemische Synthese oder auch durch gemischte Verfahren einschließlich chemischer oder enzymatischer Modifikationen der durch Absuchen der Banken erhaltenen Sequenzen erhalten werden. Sie können chemisch modifiziert werden.
Was insbesondere die Desoxyribonukleinsäuren betrifft, können sie einzeln oder doppelsträngig sein, ebenso wie kurze Oligonukleotide oder längere Oligonukleotide sein. Diese Desoxyribonukleinsäuren können therapeutische Gene, Regulatorsequenzen für die Transkription oder die Replikation, modifizierte oder nichtmodifizierte Antisensesequenzen, Bindungsregionen für andere celluläre Bestandteile etc. enthalten.
Erfindungsgemäß wird unter therapeutischem Gen insbesondere jedes Gen verstanden, das ein Proteinprodukt mit einem therapeutischen Effekt codiert. Das so codierte Proteinprodukt kann ein Protein, ein Peptid etc. sein. Dieses Proteinprodukt kann gegenüber der Zielzelle homolog sein (d. h. ein Produkt, das normalerweise in der Zielzelle exprimiert wird, wenn diese keine Pathologie zeigt). In diesem Fall erlaubt die Expression eines Proteins beispielsweise die Linderung einer unzureichenden Expression in die Zelle oder die Expression eines inaktiven oder schwach aktiven Proteins aufgrund einer Modifikation oder auch die Überexpression des Proteins. Das therapeutische Gen kann auch eine Mutante eines cellulären Proteins mit einer erhöhten Stabilität, einer modifizierten Aktivität etc. codieren. Das Proteinprodukt kann auch gegenüber der Zielzelle heterolog sein. In diesem Fall kann ein exprimiertes Protein beispielsweise eine in der Zelle fehlende Aktivität ergänzen oder herbeiführen, die dieser gestattet, einen Krankheitszustand zu bekämpfen oder eine Immunantwort zu stimulieren.
Unter den therapeutischen Produkten in Rahmen der vorliegenden Erfindung können insbesondere Enzyme, Blutderivate, Hormone, Lymphokine: Interleukine, Interferone, TNF etc. (FR 92/03120), Wachstumsfaktoren, Neurotransmitter oder ihre Vorläufer oder Syntheseenzyme, trophische Faktoren: BDNF, CNTF; NGF; IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5, HARP/Pleiotrophin etc., Dystrophin oder Minidystrophin (FR 91/11947), das CFTR-Protein, assoziiert mit Mucoviszidose, Tumorsuppressorgene: p53, Rb, Rap1A, DCC, k-rev, etc. (FR 93/04745), Gene, die an der Gerinnung beteiligter Faktoren codieren: Faktoren VII, VIII, IX, Gene, die an der Reparation der DNA beteiligt sind, Suizidgene (Thymidinkinase, Cytosindesaminase), Gene für Hämoglobin oder andere Proteintransporter, Gene entsprechend Proteinen, die am Lipidmetabolismus vom Typ Apolipoprotein, ausgewählt aus den Apolipoproteinen A-I, A-II, A-IV, B, C-I, C-III, C-III, D, E, F, G, H, J und apo(a) beteilgt sind, Stoffwechselenzyme, wie beispielsweise Lipoproteinlipase, hepatische Lipase, Lecithincholesterinacyltransferase, 7-alpha-Cholesterinhydroxylase, Phosphatidsäure, Phosphatase oder auch Transferproteine für Lipide, wie das Transferprotein von Cholesterinestern und das Transferprotein von Phospholipiden, ein Bindungsprotein für HDL oder auch ein Rezeptor, ausgewählt beispielsweise aus LDL-Rezeptoren, Chylomicronenrestrezeptoren und Scavenger-Rezeptoren etc., genannt werden.
Die therapeutische Nukleinsäure kann auch ein Gen oder eine Antisensesequenz sein, deren Expression in der Zielzelle die Kontrolle der Expression der Gene oder der Transkription der cellulären mRNAs erlaubt. Derartige Sequenzen können beispielsweise in die Zielzelle in RNA, die zur cellulären mRNAs komplementär ist, transkribiert werden und so ihre Übersetzung in ein Protein gemäß der in dem Patent EP 140 308 beschriebenen Technik blockieren. Die therapeutischen Gene umfassen auch Sequenzen, die Ribozyme codieren, die selektiv Ziel-RNAs zerstören können (EP 321 201).
Wie vorstehend angegeben, kann die Nukleinsäure auch ein oder mehrere Gene umfassen, die ein antigenes Peptid codieren, das beim Menschen oder beim Tier eine Immunantwort erzeugen kann. In dieser besonderen Ausführungsform erlaubt die Erfindung nun die Erzeugung entweder von Impfstoffen oder von immuntherapeutischen Behandlungen, die beim Menschen oder beim Tier angewendet werden, insbesondere gegen Mikroorganismen, Viren oder Krebs. Es kann sich insbesondere um spezifische Antigenpeptide des Epstein- Barr-Virus, des HIV-Virus, des Hepatitis-B-Virus (EP 185 573), des Pseudo-Rabies-Virus, des Syncitien bildenden Virus, andere Viren oder auch tumorspezifische Antigen (EP 259 212) handeln.
Bevorzugt umfasst die Nukleinsäure auch Sequenzen, die die Expression des therapeutischen Gens und/oder des Gens, das das antigene Peptid in der gewünschten Zelle oder dem Organ codiert, erlauben. Es kann sich um Sequenzen handeln, die natürlicherweise für die Expression des in Betracht gezogenen Gens verantwortlich sind, wenn diese Sequenzen in der infizierten Zellen funktionieren können. Es kann sich auch um Sequenzen unterschiedlichen Ursprungs (die für die Expression anderer Proteine oder auch synthetische Protein verantwortlich sind) handeln. Insbesondere kann es sich um Promotorsequenzen von eukaryontischen oder viralen Genen handeln. Beispielsweise kann es sich um Promotorsequenzen handeln, die aus dem Genom der Zelle hervorgegangen sind, die man infizieren möchte. Ebenso kann es sich um Promotorsequenzen handeln, die aus dem Genom eines Virus hervorgegangen sind. In dieser Hinsicht können beispielsweise die Promotoren der Gene E1A, MLP, CMV, RSV etc. genannt werden. Außerdem können diese Expressionssequenzen durch Hinzufügen von Aktivierungssequenzen, Regulationssequenzen etc. modifiziert sein. Es kann sich auch um einen induzierbaren oder reprimierbaren Promotor handeln.
Außerdem kann die Nukleinsäure auch insbesondere stromaufwärts des therapeutischen Gens eine Signalsequenz, die das synthetisierte therapeutische Produkt in die Sekretionswege der Zielzelle dirigiert, umfassen. Diese Signalsequenz kann die natürliche Signalsequenz des therapeutischen Produkts sein, aber es kann sich auch um jede andere funktionelle Signalsequenz oder um eine künstliche Signalsequenz handeln. Die Nukleinsäure kann auch eine Signalsequenz umfassen, die das synthetisierte therapeutische Produkt in ein spezielles Kompartiment der Zelle leitet.
Gemäß einer anderen Ausführungsform können die beanspruchten Zusammensetzungen weiterhin ein Adjuvans vom Typ Dioleoylphosphatidylethanolamin (DOPE), Oleoylpalmitoylphosphatidylethanolamin (POPE), Distearoyl-, -palmitoyl, Myristoylphosphatidylethanolamine sowie ihre 1- bis 3-fach Nmethylierten Derivate, die Phosphatidylglycerine, die Diacylglycerine, die Glykosyldiacylglycerine, die Cerebroside (insbesondere die Galactocerebroside), die Sphingolipide (insbesondere die Sphingomyeline) oder auch die Asialoganglioside (insbesondere die asialoGM1 und -GM2) umfassen.
Sehr jüngst hat die Anmelderin gezeigt, dass es auch besonders vorteilhaft ist, als Adjuvans in den transfizierenden Zusammensetzungen eine Verbindung zu verwenden, die direkt oder nicht direkt auf der Ebene der Kondensation der Nukleinsäuren wechselwirkt. Diese Verbindung besteht ganz oder teilweise aus Peptidmotiven (KTPKKAKKP) und/oder (ATPAKKAA), wobei die Anzahl der Motive zwischen 2 und 10 variieren kann. Ein derartiges Mittel kann auch einerseits von einem Teil eines Histons, einem Nucleoin, einem Protamin und/oder einem der Derivate davon (WO 96/25508) abgeleitet sein. Eine derartige Verbindung kann sehr vorteilhafterweise in die beanspruchte Zusammensetzung eingearbeitet werden.
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können auch ein oder mehrere Elemente zum Absuchen umfassen, die die Steuerung der Nukleinsäurekomplexe in Richtung Rezeptoren oder Liganden auf die Oberfläche der Zellen erlauben. Als Beispiel kann die erfindungsgemäße Zusammensetzung ein oder mehrere Antikörper, die gegen Moleküle der cellulären Oberfläche gerichtet sind oder auch ein oder mehrere Liganden von Membranrezeptoren, wie Insulin, Transferrin, Folsäure oder jeden anderen Wachstumsfaktor, Cytokine oder Vitamine, umfassen. Vorteilhafterweise kann die Zusammensetzung Lectine, die modifiziert sein können oder nicht, umfassen, um spezielle Polysaccharide auf der Zelloberfläche oder auf der benachbarten extracellulären Matrix zu suchen. Proteine mit dem Motiv RGD, Peptide, die ein Tandem der Motive RGD enthalten, die cyclisch sein können oder nicht, sowie die Peptide Polylysin können ebenfalls verwendet werden. Jüngst wurden auch natürliche oder synthetische Ligandenpeptide, die insbesondere wegen ihrer Selektivität gegenüber spezifischen Zellen interessant sind, und wirksam die Internalisierung auf der Ebene dieser Zellen förder können, beschrieben. (Bary et al., Nature Medicine, 2, 1996, 299-305). Diese Mittel zum Absuchen sind im Allgemeinen mit dem in Betracht gezogenen kationischen Transfektionsmittel assoziiert.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung der beanspruchten Zusammensetzungen. Genauer betrifft sie ein Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung, umfassend Teilchen aus Komplexen Transfektionsmittel(n)/Nukleinsäuren, die größenstabilisiert sind und dadurch gekennzeichnet sind, dass das Transfektionsmittel und die Nukleinsäure in Gegenwart einer ausreichenden Menge eines nichtionischen oberflächenaktiven Mittels in Kontakt gebracht werden, um die Teilchen der so gebildeten Nukleinsäurekomplexe auf eine Größe unter etwa 160 nm zu stabilisieren.
Genauer wird eine der Verbindungen, d. h. die Nukleinsäure oder das Lipofektant, vorher mit einem nichtionischen oberflächenaktiven Mittel vermischt, bevor es in Gegenwart des zweiten Bestandteils gebracht wird. So wird die Ausprägung jedes Aggregationsphänomens verhindert, das sich spontan in Abwesenheit des nichtionischen oberflächenaktiven Mittels manifestiert.
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können im Hinblick auf Verabreichungen auf topischem, kutanem, oralem, rektalem, vaginalem, parenteralem, intranasalem, intravenösem, intramuskulärem, subkutanem, intraokulärem, transdermalem etc. Weg formuliert werden. Bevorzugt enthalten die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen einen pharmazeutisch verträglichen Träger für eine injizierbare Formulierung, insbesondere für eine direkte Injektion in das gewünschte Organ oder für eine Verabreichung auf topischem Weg (über die Haut und/oder Schleimhaut). Es kann sich insbesondere um sterile, isotone Lösungen oder um trockene, insbesondere lyophilisierte Zusammensetzungen handeln, die durch Zugabe, je nach Fall, von sterilisiertem Wasser oder physiologischem Serum die Rekonstitution von injizierbaren Lösungen erlauben. Die verwendeten Mengen an Nukleinsäure für eine Injektion sowie die Anzahl der Verabreichungen können als Funktion der verschiedenen Parameter, insbesondere als Funktion des verwendeten Verabreichungswegs, der betroffenen Pathologie, des zu exprimierenden Gens oder auch der Dauer der gewünschten Behandlung angepasst werden. Was insbesondere den Verabreichungsweg betrifft, kann es sich entweder um eine direkte Injektion in Gewebe oder den Kreislauf oder um eine Behandlung der Zellen in Kultur, gefolgt von ihrer in-vivo- Reimplantation durch Injektion oder Transplantation handeln.
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen sind therapeutisch besonders vorteilhaft. Man kann von jetzt an erfindungsgemäß in Betracht ziehen, wirksam Komplexe aus Nukleinsäuren mit einer geeigneten Größe und vermindertem Ladungsverhältnis zu verabreichen, was in vivo besonders nützlich ist. Die Wechselwirkungen Serum/Nukleinsäure-Komplexe, die allgemein beobachtet werden, sind mit den beanspruchten Zusammensetzungen signifikant abgeschwächt.
Die vorliegende Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele und Figuren ausführlicher beschrieben, die als erläuternd und nicht als beschränkend gelten.

FIGUREN

Fig. 1: Wirkung von Poloxalkol auf die Entwicklung der Größe von Komplexen RPR 120535/DANN, mit einem Ladungsverhältnis (+/-) 2,5 als Funktion der Zeit.
Fig. 2: Wirkung von Poloxalkol auf die Entwicklung der Größe von Komplexen RPR 120531/DNA, mit einem Ladungsverhältnis (+/-) 2,5 als Funktion der Zeit.
Fig. 3: Wirkung von Poloxalkol auf die Assoziationen RPR 120535/DNA.
Fig. 4: Wirkung von Poloxalkol auf die Luziferase- Aktivität (RLU/5 ul Lysat) der Komplexe RPR 120535/DNA bei einem Ladungsverhältnis von (+/-) 2,5.
Fig. 5: TEIL A: Schematische Darstellung der Struktur der Komplexe RPR 120535/DNA in Abwesenheit oder in Anwesenheit von Poloxalkol.
TEIL B: Schematische Darstellung der Struktur der Komplexe BGTC/DNA in Abwesenheit und in Anwesenheit von Poloxalkol.

MATERIALIEN

Das in den folgenden Beispielen eingesetzte oberflächenaktive Mittel ist Poloxalkol der Formel (OH(CH&sub2;CH&sub2;O)&sub7;&sub5;(CH(CH&sub3;)CH&sub2;O)&sub3;&sub0;(CH&sub2;CH&sub2;O)&sub7;&sub5;H. Es wird unter der Marke Pluronic F68® vertrieben. Die eingesetzte Stammlösung an Poloxalkol in den folgenden Beispielen enthält 10% (Gewicht/Volumen) in Wasser.
Die zur Herstellung von Proben verwendete DNA ist das Plasmid pXL2774, das in der PCT/FR 96/01414 beschrieben ist. Es wird in einer Konzentration von 0,7 mg/ml in einem Puffer Tris/EDTA (10 mM/0,1 mM) mit einem pH-Wert von 7,5 verwendet.
Die verwendeten kationischen Lipide sind die folgenden:
H&sub2;N(CH&sub2;)&sub3;NH(CH&sub2;)&sub4;NH(CH&sub2;)&sub3;NHCH&sub2;COGlyN[(CH&sub2;)&sub1;&sub7;CH&sub3;]&sub2; (RPR 120535) (Acetatsalz) und H&sub2;N(CH&sub2;)&sub3;NH(CH&sub2;)&sub4;NH(CH&sub2;)&sub3;NHCH&sub2;COArgN[(CH&sub2;)&sub1;&sub7;CH&sub3;] (RPR 120531) (Trifluoracetatsalz), die beide in der PCT/FR 96/01774 beschrieben sind. Sie werden in einer Konzentration von 5 mM in Wasser verwendet, wo sie durch 25 minütiges Erhitzen auf 50ºC solubilisiert werden, wobei die Lösungen anschließend auf Umgebungstemperatur abgekühlt werden.

VERFAHREN

Die Messung des hydrodynamischen Durchmessers wird mit einem Coulter N4Plus unter Verwendung von Plastikküvetten (vier transparente Seiten), die mit 800 ul der verschiedenen Lösungen gefüllt sind, durchgeführt, wobei die Messung bei 90ºC unimodal durchgeführt wird.
Die Fluoreszensmessungen werden an einem Perkin Eimer LS50B durchgeführt, wobei die Wellenlängen für die Anregung und die Emission 260 nm bzw. 590 nm betragen. Die Spaltbreiten für die Anregung und die Emission werden auf 5 nm eingestellt. Der Fluoreszenswert wird nach jedem Zusatz von 5 ug Etidiumbromid/ml in Endkonzentration registriert.
Die Transmissionsexperimente mit dem elektronischen Cryomikroskop (cryo-TEM) werden mit 7-ul-Proben, die aus 0,5 mg DNA/ml hergestellt wurden, durchgeführt, die auf ein Kohlekupfergitter, das mit einer dünnen Membran bedeckt ist, gegeben werden. Die Gitter werden anschließend in flüssiges Ethan so getaucht, um das flüssige Wasser in glasförmiges Wasser umzuwandeln. Dann wird dieses Gitter in einen mit flüssigem Stickstoff abgekühlten Objektträger eingespannt und in das Mikroskop (Philips CM12) zur Betrachtung eingeführt.
Die Röntgenbeugungsexperimente mit kleinen Winkeln werden mit einem Synchroton (LURE) in Orsay (Frankreich) an der Linie D43 durchgeführt. Die Proben werden zu 0,5 mg DNA/ml hergestellt und dann zentrifugiert. Die Bodensätze werden in eine Zelle eingebracht, deren zwei Fenster aus Kapton bestehen. Ein Germanium-Monochromator (111 Reflektion) erlaubt die Selektion der Wellenlänge von 0,138 nm.
Die in-vivo-Transfektionen werden durch Injektion von 200 ul in die Schwanzvene von 30 Tage alten Mäusen, einer Lösung, die 0,2 mg DNA/ml enthält, assoziiert mit einem kationischen Lipidvektor, durchgeführt. 24 Stunden nach der Injektion werden die Mäuse euthanisiert, dann werden verschiedene Organe gewonnen (Lunge, Leber, Herz, Niere, Milz). Diese Organe werden dann in einen Lysepuffer mit Hilfe eines Ultraturax zerkleinert. Die so erhaltenen Zerkleinerungsgüter werden anschließend zentrifugiert, dann werden 10 ul des Überstands entnommen, um die Luziferase- Aktivität zu bestimmen.

BEISPIEL 1: Einfluss von Poloxalkol auf die Größe der Komplexe RPR 120535/DNA.

Das Plasmid (10 ug/ml) wird in eine Lösung, die 150 mM NaCl und verschiedene Konzentrationen Poloxalkol enthält, eingebracht. Das Lipofektant RPR 120535 wird anschließend hinzugefügt, um ein Ladungsverhältnis (+/-) 2,5 zu erhalten. Die Größe der Komplexe wird anschließend photonenspektrophotometrisch gemäß dem in Methoden beschriebenen Protokoll gemessen. Die Ergebnisse sind in Fig. 1 dargestellt.
Man stellt fest, dass in Abwesenheit von Poloxalkol ( ) die Größe der Teilchen sich von 274 nm bis zu einem Maximum von 1000 nm in einigen zehn Minuten entwickelt. Anschließend beobachtet man ein Präzipitat nach einigen Stunden Inkubation.
Umgekehrt beobachtet man in Gegenwart von 0,1% (+) Poloxalkol eine Verminderung der Größe der Komplexe, eine Größe, die für eine Konzentration von 0,8% ( ) und 1% ( ) Poloxalkol stabil bleibt und sich nicht über 150 nm hinaus entwickelt.
Die Inkubation des Lipofektants allein mit Poloxalkol in einer Konzentration von 1% (Gewicht/Volumen) bildet keine durch quasi elektrische Diffusion im Licht nachweisbaren Teilchen. Ebenso kann, wenn die DNA mit 1% Poloxalkol inkubiert wird, kein Teilchen nachgewiesen werden.

BEISPIEL 2: Einfluss von Poloxalkol auf die Größe der Komplexe RPR 120531/DNA.

Dazu wurde das Beispiel 1 mit dem kationischen Lipid RPR 120531 wiederholt.
Das Plasmid (10 ug/ml) wird in eine Lösung gegeben, die 150 mM NaCl in verschiedenen Poloxalkol-Konzentrationen enthält. Das RPR 120531 wird anschließend hinzugefügt, um ein Ladungsverhältnis (+/-) 2,5 zu erhalten. Die Größe der Komplexe wird spektroskopisch mittels Photonenkorrelation (Coulter N4plus) gemessen. Die Ergebnisse sind in Fig. 2 dargestellt.
Es wird festgestellt, dass in Abwesenheit von Poloxalkol die Größe der Komplexe RPR 120531/DNA sich von 234 nm bis zu 590 nm in einigen Stunden entwickelt, während sie in Gegenwart von 0,5% ( ) und 0,9% ( ) Poloxalkol stabil bleibt.

BEISPIEL 3: Kontrolle des Verpackungsgrads DNA/Lipofektant in Gegenwart und in Abwesenheit von Poloxalkol

Es wurde bestätigt, dass die Teilchen, die in Gegenwart von Poloxalkol entstanden sind, die Teilchen sind, die durch eine Assoziation von DNA mit kationischem Lipid hervorgegangen sind. Dazu wurden Insertionsexperimente mit einer Sonde, die fluoresziert, wenn sie mit DNA interkaliert, durchgeführt. Das Fluoreszensniveau ist hoch, wenn die DNA frei ist, und umgekehrt gering, wenn sie unzugänglich, da mit kationischen Lipiden kompaktiert, ist. Die Fig. 3 zeigt die erhaltenen Ergebnisse.
Man beobachtet die nach Assoziierung der DNA mit kationischem Lipid in Gegenwart und in Abwesenheit von Poloxalkol erhaltenen Fluoreszensniveaus. Zuerst wird festgestellt, dass die Fluoreszens des mit der DNA interkalierten Ethidiumbromids nicht durch die Anwesenheit oder Abwesenheit von 1% Poloxalkol modifiziert wird. Fluoreszenshöhen der Komplexe kationisches Lipid/DNA (Ladungsverhältnis (+/-) 2,5)) in Gegenwart oder in Abwesenheit von 1% Poloxalkol sind in der Tat von der gleichen Größenordnung. Dieser Wert der verbleibenden Fluoreszens zeigt an, dass die DNA für die Sonden nicht zugänglich ist. Folglich verhindert Poloxalkol nicht das normale Ablaufen der Assoziation von DNA mit dem kationischen Lipid.

BEISPIEL 4: In-vitro-Transfektion der DNA oder RPR 120535, enthaltend 1% Poloxalkol

Man wollte verifizieren, wie die Wirkung von Poloxalkol war, wenn es mit DNA allein oder mit kationischem Lipid allein vermischt wurde. Dafür wurden die zwei folgenden Proben hergestellt.
Probe 1 : 10 ug DNA/ml in einem Medium, das 300 mM NaCl und 1% (Gewicht/Volumen) Poloxalkol enthält.
Probe 2 : 60 uM RPR 120535 in einem Medium, das 300 mM NaCl und 1% Poloxalkol enthält.
Diese Proben werden durch Mischen in der Reihenfolge für Probe 1 hergestellt: Wasser, NaCl, DNA und Poloxalkol und für Probe 2: Wasser, NaCl, Poloxalkol und RPR 120535 in den in der nachstehenden Tabelle I angegeben Mengen:

TABELLE I

Die biologische Aktivität dieser zwei Proben wird an NIH- 3T3-Zellen getestet. Ein 50-ul-Volumen der verschiedenen Proben wird pro Kavität auf Platten mit 24 Kavitäten aufgebracht.
Die Transfektion wird in Abwesenheit von fötalem Kälberserum durchgeführt. Letzteres wird 2 Stunden nach der Zugabe der Komplexe zugesetzt.
Die Ergebnisse zeigen an, dass kein Gentransfer mit nichtkomplexierter DNA in Gegenwart von 1% Poloxalkol und in Abwesenheit von 10% fötalem Kälberserum beobachtet wird.
Andererseits zeigt die Bestimmung der Gesamtproteine, dass es keine offensichtliche Toxizität gibt.
BEISPIEL 5: In-vitro-Transfektion mit Lösungen aus Komplexen Lipofektant RPR 120535/DNA, die mit verschiedenen Konzentrationen an Poloxalkol stabilisiert wurden.
Man versucht, das Auftreten der Stabilisierung der Teilchen durch Poloxalkol auf die Transfektionseffizienz dieser Teilchen in Gegenwart von Poloxalkol zu erkennen. Dazu wurden Proben, die verschiedene Konzentrationen Poloxalkol enthielten, hergestellt.
Vier Proben mit einem Ladungsverhältnis (+/-) 2,5 werden in einem Medium, das 300 ml NaCl in verschiedenen Poloxalkol-Konzentrationen (0; 0,5%; 0,8% und 1%; Gewicht/Volumen) enthält, hergestellt.
Probe 1: Ladungsverhältnis (+/-) 2,5, 300 mM NaCl.
Probe 2: Ladungsverhältnis (+/-) 2,5, 300 mM NaCl und 0,5% Poloxalkol.
Probe 3: Ladungsverhältnis (+/-) 2,5, 300 mM Nacl und 0,8% Poloxalkol.
Probe 4: Ladungsverhältnis (+/-) 2,5, 300 mM NaCl und 1% Poloxalkol.
Diese Proben wurden durch Vermischen in der Reihenfolge hergstellt: Wasser, NaCl, DNA, Poloxalkol und RPR 120535 in den Mengen, die in der nachstehenden Tabelle II angegeben sind:

TABELLE 11

* Die Probe 1 gehört einer Konzentrationseinheit an kationischem Lipid an, bei der keine Stabilität der Teilchen in Lösung vorliegt, d. h. die Teilchen aggregieren sich untereinander und bilden große Aggregatpakete, die große hydrodynamische Durchmesser (größer als 1000 nm) besitzen.
* Die Probe 2 besitzt das gleiche Ladungsverhältnis kationisches Lipid/DNA wie Probe 1, aber die Mischung wird in Gegenwart von 0,5% (Gewicht/Volumen) Poloxalkol hergestellt. Jedoch reicht diese Konzentration nicht aus, um eine vollständige Stabilisierung der Teilchen zu gewährleisten (vergleiche Beispiel Nr. 1: Einfluss eines nichtionischen Polymeren auf die Größe der Komplexe RPR 120535/DNA).
* Die Proben 3 und 4 sind stabil, der hydrodynamische Durchmesser der Teilchen bleibt immer bei 150 nm.
Die biologische Aktivität der verschiedenen Formulierungen wird an NIH-3T3-Zellen getestet. Ein Volumen von 50 ul verschiedener Proben (zu 10 ug DNA/ml) wird pro Kavität zugesetzt. Die Transfektion wird in Abwesenheit von fötalem Kälberserum durchgeführt. Diese letztere wird 2 Stunden nach der Zugabe der Komplexe zugesetzt. Die so erhaltenen Ergebnisse sind in Fig. 4 gezeigt.
Es wird in Fig. 4 festgestellt, dass Poloxalkol unabhängig von seiner Konzentration nicht die in-vitro- Transfektion der NIH-3T3-Zellen ändert. Das Poloxalkol modifiziert nicht Transfektionseigenschaften in Abwesenheit von fötalem Kälberserum der Komplexe RPR 120534/DNA bei einem Ladungsverhältnis (+/-) 2,5.

BEISPIEL 6: Bestimmung der Struktur der Komplexe RPR 120535/DNA, GBTC/DNA und GBTC/DOPE/DNA, die durch Poloxalkol stabilisiert wurden.

In dieser Studie wurde die Struktur der Transfektant- Komplexe kationisches Lipid/DNA mittels Röntgenbeugung bei kleinen Winkeln und mittels Transmissionselektronenmikroskopie bestimmt.
Die Fig. 5A betrifft die Komplexe RPR 120535/DNA. Die in Abwesenheit oder in Anwesenheit von Poloxalkol erhaltene Struktur ist eine lamelläre Struktur, in der die DNA sandwichartig zwischen die Lipiddoppelschichten eingepackt ist, deren Periodizität 8 nm beträgt. Die Anwesenheit von Poloxalkol erlaubt den Erhalt den Komplexen mit kleiner Größe, während in Abwesenheit von Poloxalkol Präzipitate erhalten werden, deren Größe über 1000 nm liegt.
Die Fig. 5B betrifft Strukturen, die mit dem kationischen Lipid BGTC (beschrieben in der Patentanmeldung WO 97/31935) erhalten wurden. In diesem Fall wird auch eine lamelläre Struktur erhalten, deren Periodizität 6,5 nm in Gegenwart oder in Abwesenheit von Poloxalkol beträgt. Die Anwesenheit von Poloxalkol erlaubt auch in diesem Fall die Herstellung von Komplexen mit kleiner Größe. Die Ergebniss werden unabhängig davon erhalten, ob die Komplexe das Adjuvans DOPE enthalten oder nicht.
Man kann nun daraus folgern, dass die Zugabe eines Poloxalkols keine Assoziation der DNA mit dem kationischen Lipid erzeugt, sondern nur den kolloidalen Zustand dieses Komplexes modifiziert.

BEISPIEL 7: In-vivo-Transfektion nach systemischer Injektion von Komplexen kationisches Lipid/DNA, die durch Poloxalkol stabilisiert wurden.

1) RPR 120535/DNA/F68®

Es wurden die Transfektionseffizienzen für ein Gen nach systemischen Injektionen der gefällten Komplexe RPR 120535/DNA und dieser gleichen Komplexe, die durch Zugabe von Pluronic F68® stabilisiert wurden, verglichen. Die nachstehende Tabelle III zeigt an, dass, wenn Komplexe in Abwesenheit von F68® hergestellt werden, nur eine Expression in den Lungen gefunden wird. Im Gegensatz dazu ist, wenn die Teilchen kolloidal durch Zugabe von F68® stabilisiert sind, die Luziferase-Aktivität um einen Faktor 10 in den Lungen erhöht, und man findet eine Expression in anderen Geweben (Leber, Herz).

TABELLE III

2) BGTC/DOPE/DNA/F68®

Zu den vorstehend beschriebenen Experimenten identische wurden durchgeführt, indem ein anderes Lipid verwendet wurde: BGTC. Ähnliche Ergebnisse wurden erhalten, nämlich eine Verbesserung des Gentransfers in den Lungen und eine messbare Expression in der Leber, im Herzen und in den Nieren. Diese Ergebnisse wurden mit verschiedenen Mausrassen (Balbc, C57B16 und C57B16, defekt bezüglich Apolipoprotein E) erhalten. Es ist beachtlich, dass identische Transfektionshöhen mit normalen oder an Apolipoprotein E defizienten Mäusen C57B16 erhalten wurden, da die zuletzt genannten einen sehr hohen Lipidwert, d. h. zehnmal höher als eine normale Maus, besitzen. In der Tat, wenn man nichtvirale Lipidvektoren verwendet, hätte man erwarten können, dass die Komplexe durch die Anwesenheit dieser endogenen Lipide in großer Menge destabilisiert werden. Die Ergebnisse der in-vivo-Transfektion der Komplexe BGTC/DOPE/DNA in Abwesenheit oder in Anwesenheit von Poloxalkol sind in der nachstehenden Tabelle IV zusammengestellt:

TABELLE IV

BEISPIEL 8: Verwendung anderer nichtionischer oberflächenaktiver Mittel

Andere nichtionische oberflächenaktive Mittel wurden getestet: dendrimere Polyethylenglykol, Polyoxyethylenalkohol, Polyoxyethylennonylphenylether. Sie zeigten die gleiche Kapazität wie F68®, um Komplexe aus kationischen Lipiden/DNA zu stabilisieren. Das kationische Lipid, mit dem die Untersuchungen durchgeführt wurden, ist RPR 120535.

1) Dendrimere Polyethylenglykol

Es wurde ein Dendrimer mit einem Benzylpolyetherkopf der Generation 2 verwendet, auf den ein Polyethylenglykol (PEG) mit einem Molekulargewicht von 5000 Da gepfropft ist (bezeichnet als SAS11), und ein anderes Dendrimer des gleichen Typs, das aber 2 Benzylpolyetherköpfe, aufgepfropft auf ein PEG mit einem Molekulargewicht von 11.000 Da (bezeichnet als SAS9) enthält. Die nachstehende Tabelle IV zeigt an, dass mit diesem Dendrimeren ab 0,02% (Gewicht/Volumen) nicht mehr mikronische Präzipitate der Transfektant-Komplexe erhalten werden, aber vor allem Teilchen mit einem Durchmesser von kleiner als oder im Bereich von 100 nm erhalten werden.

2) Polyoxyethylenalkohol

Dieses Produkt, das auch als "Brij" bezeichnet wird, umfasst 100 Oxyethylen auf den hydrophilen Teil und erlaubt den Erhalt von Komplexen RPR 120535/DNA mit einem Durchmesser von kleiner 100 nm im Verlauf von 1 Stunden.

3) Polyoxyethylennonylphenylether

Dieses Produkt erlaubt auch die kolloidale Stabilisierung der Transfektant-Komplexe RPR 120535/DNA. Der Durchmesser der Teilchen liegt auch im Bereich von 100 nm.
Die nachstehende Tabelle V gibt den Durchmesser in nm der Komplexe RPR 120535/DNA mit einem Ladungsverhältnis von 2,75 (+/-) bei 0,25 mg DNA/ml in 150 mM NaCl, stabilisiert durch verschiedene nichtionische oberflächenaktive Mittel, wieder.

TABELLE V

Für die Gesamtheit der mit den verschiedenen nichtionischen oberflächenaktiven Mitteln stabilisierten Formulierungen wurde der Zustand der Kondensation der DNA mit kationischem Lipid durch Messungen der Fluoreszens bestätigt. Die Ergebnisse zeigten an, dass die Anwesenheit dieser oberflächenaktiven Mittel auf der Oberfläche der Komplexe kationisches Lipid/DNA nicht die Kondensation der DNA mit den kationischen Lipiden modifiziert (Ergebnisse nicht gezeigt).

Claims

1. Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, dass sie Teilchen aus lamellären Komplexen kationische(s) Transfektionsmittel/Nukleinsäuren umfasst und dass sie mindestens ein nichtionisches oberflächenaktives Mittel in einer Menge zwischen 0,01 und 10 Gew.-% /Volumen umfasst, so dass stabilisierte lamelläre Komplexe mit einem Durchmesser von kleiner oder gleich 160 nm erhalten werden.

2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das oberflächenaktive Mittel mindestens ein hydrophobes Segment und mindestens ein hydrophiles Segment umfasst.

3. Zusammensetzung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das hydrophobe Segment aus aliphatischen Ketten, Polyoxyalkylenen, Alkylidenpolyestern, Polyethylenglykol mit Benzylpolyetherkopf und Cholesterin ausgewählt ist.

4. Zusammensetzung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das hydrophile Segment aus Polyoxyalkylenen, Polyvinylalkoholen, Polyvinylpyrrolidonen oder Sacchariden ausgewählt ist.

5. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das oberflächenaktive Mittel ein Polyoxyalkylen der allgemeinen Formel:

HO(CH&sub2;CH&sub2;O)a(CH(CH&sub3;)CH&sub2;O)b(CH&sub2;CH&sub2;O)cH

ist, wobei a, b und c unabhängig voneinander ganze Zahlen, die zwischen 20 und 100 variieren können, bezeichnen.

6. Zusammensetzung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass sie als oberflächenaktives Mittel eine Verbindung der allgemeinen Formel OH(CH&sub2;CH&sub2;O)a(CH(CH&sub3;)CH&sub2;O)b(CH&sub2;CH&sub2;O)cH umfasst, wobei a gleich 75, b gleich 30 und c gleich 75 ist.

7. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass sie als oberflächenaktives Mittel eine Verbindung der Polyethylenglykol-Familie mit einem dendritischen Benzylpolyetherkopf umfasst.

8. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass sie als oberflächenaktives Mittel eine Verbindung der Polyoxyethylenalkohol-Familie enthält.

9. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass sie als oberflächenaktives Mittel Polyoxyethylennonylphenylether enthält.

10. Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das oberflächenaktive Mittel in einer Menge zwischen 0,02 und 5 Gew.-% /Volumen vorhanden ist.

11. Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das kationische Transfektionsmittel ein Lipofektant ist.

12. Zusammensetzung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass das Lipofektant ein amphiphiles Molekül, umfassend mindestens eine lipophile Region, die mit einer hydrophilen Region assoziiert ist oder nicht assoziiert ist, ist.

13. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um ein Lipofektant handelt, das mindestens eine Polyaminregion der allgemeinen Formel:

H&sub2; N-(-(CH)m-NH-)n-H

umfasst, worin m eine ganze Zahl von größer oder gleich 2 ist und n eine ganze Zahl von größer oder gleich 1 ist, wobei m zwischen den verschiedenen Kohlenstoffgruppen, die zwischen 2 Aminen in covalenter Assoziierung an eine lipophile Region vom Typ Kohlenwasserstoff, der gesättigt oder nicht-gesättigt sein kann, Cholesterin oder ein natürliches oder synthetisches Lipid, das lamelläre oder hexagonale Phasen bilden kann, vorhanden sind, variieren kann.

14. Zusammensetzung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Polyaminregion durch Spermin oder eines seiner Analoga, das seine Eigenschaften zur Bindung an die Nukleinsäure beibehalten hat, wiedergegeben ist.

15. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um ein Lipofektant der allgemeinen Formel:

handelt, worin R, das die lipophile Region darstellt, durch die allgemeine Formel:

wiedergegeben wird, worin X und X' unabhängig voneinander ein Sauerstoffatom, eine Methylengruppe -(CH&sub2;)q-, wobei q 0, 1, 2 oder 3 bedeutet, oder eine Aminogruppe -NH- oder - NR'-, wobei R' eine C&sub1;-C&sub4;-Alkylgruppe bedeutet, darstellen, Y und Y' unabhängig voneinander eine Methylengruppe, eine Carbonylgruppe oder eine Gruppierung C=S bedeuten, R&sub3;, R&sub4; und R&sub5; unabhängig voneinander ein Wasserstoffatem oder einen C&sub1;-C&sub4;-Alkylrest, der substituiert sein kann oder nicht, wobei p zwischen 0 und 5 variieren kann, bedeuten, R&sub6; ein Cholesterinderivat oder eine Alkylaminogruppe -NR&sub1;R&sub2; bedeutet, wobei R&sub1; und R&sub2; unabhängig voneinander einen gesättigten oder ungesättigten, linearen oder verzweigten aliphatischen C&sub1;&sub2;-C&sub2;&sub2;-Rest bezeichnen.

16. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um ein Lipofektant der allgemeinen Formel:

handelt, worin R&sub1;, R&sub2; und R&sub3; unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom oder eine Gruppierung -(CH&sub2;)q-NRR' bedeuten, wobei q zwischen 1, 2, 3, 4, 5 und 6 und unabhängig zwischen den verschiedenen Gruppierungen R&sub1;, R&sub2; und R&sub3; variieren kann, und R und R' unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom oder eine Gruppierung -(CH&sub2;)q'-NH&sub2; bedeuten, q' zwischen 1, 2, 3, 4, 5 und 6 und unabhängig zwischen den verschiedenen Gruppierungen R und R' variieren kann, m, n und p unabhängig voneinander eine ganze Zahl bezeichnen, die zwischen 0 und 6 variieren kann, wobei, wenn n einen Wert über 1 hat, m verschiedene Werte annehmen kann und R&sub3; verschiedene Bedeutungen in der vorstehenden allgemeinen Formel besitzen kann, und R&sub4; eine Gruppierung der allgemeinen Formel:

bedeutet, worin R&sub6; und R&sub7; unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom oder einen aliphatischen, gesättigten oder nicht-gesättigten C&sub1;&sub0;-C&sub2;&sub2;-Rest bedeuten, wobei mindestens eine der zwei Gruppierungen von Wasserstoff verschieden ist, u eine ganze Zahl, ausgewählt zwischen 0 und 10 ist, wobei, wenn u eine ganze Zahl über 1 bedeutet, R&sub5;, X, Y und r verschiedene Bedeutungen in den verschiedenen Motiven [X-(CHR&sub5;)r-Y] besitzen können, X ein Sauerstoff- oder Schwefelatom oder eine monoalkylierte oder nichtmonoalkylierte Amingruppe bedeutet, Y eine Carbonylgruppierung oder eine Methylengruppierung bedeutet, R&sub5; ein Wasserstoffatom oder eine Seitenkette einer natürlichen Aminosäure bedeutet, die gegebenenfalls substituiert ist, und r eine ganze Zahl, die zwischen 1 und 10 variieren kann, bedeutet, wobei, wenn r einen Wert von 1 hat, R&sub5; eine Seitenkette einer natürlichen Aminosäure, die substituiert sein kann oder nicht, bedeutet, und wenn R einen Wert über 1 hat, R&sub5; ein Wasserstoffatom bedeutet.

17. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, dass das Lipofektant ein kationisches Lipid ist, das ein oder mehrere Guanidinium- und/oder Amidiniumgruppierungen trägt.

18. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass das kationische Transfektionsmittel ein kationisches Polymeres ist.

19. Zusammensetzung nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass das kationische Polymere eine Verbindung der allgemeinen Formel (I):

ist, worin R ein Wasserstoffatom oder eine Gruppe der Formel:

sein kann, n eine ganze Zahl zwischen 2 und 10 ist und p und q ganze Zahlen sind, mit der Maßgabe, dass die Summe p + q so ist, dass das mittlere Molekulargewicht der Polymeren zwischen 100 und 10&sup7; Da liegt.

20. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 18 oder 19, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um ein Polyethylenimin mit einem mittleren Molekulargewicht von 50.000 Da (PEI50K), Polyethylenimin mit einem mittleren Molekulargewicht von 22.000 Da (PEI22K) oder Polyethylenimin mit einem mittleren Molekulargewicht von 800.000 Da (PEI800K) handelt.

21. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass das kationische Transfektionsmittel bevorzugt aus Lipofectamin, Dioctadecylamidoglycylspermin (DOGS), Palmitoylphosphatidylethanolamin-5-carboxyspermylamid (DPPES), 2,5-Bis-(3- aminopropylamino)pentyl(dioctadecylcarbamoylmethoxy)acetat oder 1,3-Bis-2-(3-aminopropylamido)propyl(dioctadecylcarbamoylmethoxy)acetat, {H&sub2;N(CH&sub2;)&sub3;}&sub2;N(CH&sub2;)&sub4;N{(CH&sub2;)&sub3;NH&sub2;}(CH&sub2;)&sub3;NHCH&sub2;COGlyN[(CH&sub2;)&sub1;&sub7;CH&sub3;]&sub2;, H&sub2;N(CH&sub2;)&sub3;NH(CH&sub2;)&sub4;NH(CH&sub2;)&sub3;NHCH&sub2;COGlyN[(CH&sub2;)&sub1;&sub7;CH&sub3;]&sub2; und H&sub2;N(CH&sub2;)&sub3;NH(CH&sub2;)&sub4;NH(CH&sub2;)&sub3;NHCH&sub2;COArgN[(CH&sub2;)&sub1;&sub7;CH&sub3;]&sub2; ausgewählt ist.

22. Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure eine Desoxyribonukleinsäure ist.

23. Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure eine Ribonukleinsäure ist.

24. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 22 oder 23, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure chemisch modifiziert ist.

25. Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure eine Antisense ist.

26. Zusammensetzung nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure ein therapeutisches Gen umfasst.

27. Zusammensetzung nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass sie weiterhin ein Adjuvans vom Typ Dioleoylphosphatidylethanolamin (DOPE), Oleoylpalmitoylphosphatidylethanolamin (PO- PE), Distearoyl, -palmitoyl, -myristoylphosphatidylethanolamin sowie ihre 1- bis 3-fach Nmethylierten Derivate, Phosphatidylglycerine, Diacylglycerine, Glykosyldiacylglycerine, Cerebroside (wie insbesondere Galactocerebroside), Sphingolipide (wie insbesondere Sphingomyeline) oder auch Asialoganglioside umfasst.

28. Zusammensetzung nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass sie in weiterer Assoziation mit dem kationischen Transfektionsmittel ein Element zum Durchmustern umfasst.

29. Zusammensetzung nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, dass das Element zum Durchmustern ausgewählt ist aus gegen Moleküle der cellulären Oberfläche gerichteten Antikörpern, Liganden von Membranrezeptoren, wie Insulin, Transferrin, Folsäure oder jeder andere Wachstumsfaktor, Cytokine oder Vitamine, modifizierten oder nichtmodifizierten Lectinen, Proteinen mit einem RGD-Motiv, Peptiden, die ein Tandem von RGD-Motiven enthalten und cyclisch oder nicht-cyclisch sind, Polylysinpeptiden sowie natürlichen oder synthetischen Peptidliganden.

30. Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung, umfassend Teilchen der Komplexe kationische(s) Transfektionsmittel/Nukleinsäuren, wie vorstehend definiert, dadurch gekennzeichnet, dass das Transfektionsmittel und die Nukleinsäure in Gegenwart einer ausreichenden Menge eines nichtionischen oberflächenaktiven Mittels in Kontakt gebracht werden, um die so gebildeten Teilchen mit einer Größe von kleiner etwa 160 nm aus Nukleinsäurekomplexen zu stabilisieren.

31. Verfahren nach Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, dass einer der Bestandteile, ausgewählt aus Nukleinsäure oder Lipofektant, zuvor mit dem nichtionischen oberflächenaktiven Mittel vermischt wird, bevor er in Gegenwart des zweiten Bestandteils gebracht wird.