DE4341005A1 - Verfahren und Vorrichtung zum selektiven Konzentrieren der Leukozyten aus einer Probe eines Blutpräparates - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zum selektiven Konzentrieren der Leukozyten aus einer Probe eines Blutproduktes zum Zwecke der quantitativen Erfassung der Restleu­ kozyten.

Die Erfindung kann in der Transfusionsmedizin sowie bei der Beur­ teilung der Effizienz von Leukozytenfiltern eingesetzt werden.

Bei der Anwendung von konservierten Blutprodukten ist es wün­ schenswert und in einigen Fällen erforderlich, die weißen Zellen so weit wie möglich zu entfernen, um die verschiedenen Transfu­ sionsreaktionen, unter anderem die Alloimmunisierung der Patien­ ten auszuschließen. Zu diesem Zweck sind verschiedene Methoden entwickelt worden, wobei die Filtration der Blutpräparate durch leukozyten- und thrombozytenbindende Adsorber sich immer mehr in der Praxis als effektive, ökonomisch vorteilhafte und handhabbare Technik durchsetzt.

Die auf dem Markt vorherrschenden Blutfilter erlauben eine Leuko­ zytenreduktion von WBC bis auf 0,002·10⁹ Zellen/l. Diese Zahl der Leukozyten, die mit gewöhnlichen Meßmethoden nicht mehr er­ faßt werden kann, ist wichtig festzustellen, um die Immunogenität und Antigenität des gefilterten Blutes und/oder die Qualität des Filters abzuschätzen.

Die speziellen Techniken, die dafür eingesetzt werden können (z. B. Durchflußzytometrie mit Anwendung von monoklonalen Antikör­ pern oder fluoreszenzmarkierten DNS-färbenden Substanzien, Anwen­ dung von radioaktiven in den Zellkern eindringenden Markern, Aus­ zählung der Zellzahl von Leukozyten in großvolumigen Zählkammern usw.) sind mit einem sehr hohen apparativen oder zeitlichem Auf­ wand verbunden.

Ein grundsätzliches Problem bei der Leukozytenzahlung ist die unentbehrliche (etwa 10-fache) Verdünnung jeder Probe durch die Zugabe von einer Lösung (z. B. Essigsäure o.ä), die die roten Blutzellen auflösen soll, da die Erythrozyten sich im normalen Lichtmikroskop nicht von Leukozyten unterscheiden. Bei der Aus­ wertung von Blutproben mit sehr niedrigem Leukozytengehalt bedeu­ tet die zusätzliche Verdünnung eine besondere Schwierigkeit.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein alternatives Ver­ fahren und eine Vorrichtung zur Zählung von Restleukozyten in Blutpräparaten mit sehr geringem Leukozytengehalt zu entwickeln, die zusätzlich eine Dokumentation der zu erfassenden Leukozyten als hämatologisches Präparat erlauben und routinemäßig mit gerin­ gem apparativen Aufwand effizient eingesetzt werden können.

Die Aufgabe wird durch die eingangs beschriebene selektive Sorp­ tion der Leukozyten an einer Vorrichtung, die ein Sorbens ent­ hält, das oder dessen sorptionsfähige Komponente solubilisierbar ist, und nachfolgendes Suspendieren der Leukozyten durch Solubi­ lisierung des Sorbens oder seiner sorptionsfähigen Komponente gelöst.

Das selektive Sorbens ist in der Lage, die Leukozyten nahezu quantitativ zu binden und läßt die bei der Zählung störenden Ery­ throzyten frei passieren. Dadurch wird die Störung der Leukozy­ tenzählung durch die Erythrozyten ohne die übliche Verdünnung der Probe durch die erythrozytenlösenden Flüssigkeiten aufgehoben und gleichzeitig eine Konzentrierung der Leukozyten im Packungsvolu­ men des Sorbens erreicht.

Die am Sorbens gebundenen Leukozyten können noch nicht in einer optimalen Weise gezählt werden. Daher enthält die Vorrichtung erfindungsgemäß ein Sorbens, das bzw. dessen sorptionsfähige Kom­ ponente solubilisierbar sein muß. Die Solubilisierung der sorp­ tionsfähigen Komponente kann je nach ihrer Art enzymatisch oder nicht enzymatisch erfolgen.

Als sorptionsfähige Komponente sind besonders enzymatisch hydro­ lisierbare Biopolymere wie Pektinstoffe und Proteine geeignet. Von einem vesikulären Trägermaterial, dessen Oberfläche aus Zel­ lulose und Pektinstoffen besteht, ist bereits bekannt, daß es die selektive Bindung von Leukozyten mit hoher Effizienz bewirkt (Mavrina u. a., 1992). Überraschend zeigte sich, daß die Beschich­ tung der genannten Träger mit Kollagen die Bindungskapazität noch erhöht. Sowohl Pektinstoffe als auch Kollagen lassen sich mit Hilfe preiswerter kommerzieller Enzyme solubilisieren, ohne daß die weißen Blutzellen unter den Hydrolysebedingungen ihre Inte­ grität und Nachweisbarkeit verlieren.

Die genannten Stoffe sind nicht die einzigen, die als sorptions­ fähige und solubilisierbare Komponenten in Frage kommen. Es ist für die Erfindung auch nicht essentiell, ob die sorptionsfähige Komponente enzymatisch oder nichtenzymatisch solubilisiert werden kann. Beispielsweise ist es möglich, daß diese Komponente, ein Pektinstoff, mit Hilfe eines Lektins an den Träger gebunden ist und die Solubilisierung mit Hilfe eines Zuckers erfolgt. Jede an­ dere Affinitätsbindung zur Verankerung der sorptionsfähigen Kom­ ponente ist ebenso geeignet für die Gewährleistung der Solubili­ sierbarkeit.

Für die Erfindung ist es ausreichend, wenn ausschließlich die sorptionsfähige Komponente solubilisierbar ist. Es ist aber von Vorteil, wenn die Sorbenspartikeln vollständig auflösbar sind, wie es beispielsweise bei den oben genannten aus Pflanzenzellwän­ den bestehenden vesikulären Trägern oder Kollagenmatrices gegeben ist.

Nach der Auflösung des Sorbens oder der sorptionsfähigen Kompo­ nente der Sorbenspartikeln können die Leukozyten leicht, bei­ spielsweise durch Zentrifugation, Wirkung eines Magnetfeldes oder Flüssigkeitsströmung vom Sorbens getrennt und danach ausgezählt werden.

Ist die Vorrichtung nach Art eines Zytozentrifugenaufsatzes ge­ baut, ergibt sich die günstige Möglichkeit, die abgelösten Leuko­ zyten durch Zentrifugation auf den Objektträger zu überführen und auf diese Weise in einem zweiten Schritt noch einmal zu konzen­ trieren. Die Zellen können in üblicher Weise fixiert, gefärbt, ausgewertet und als jederzeit verfügbares Dokument (hämatolo­ gisches Präparat) gelagert werden.

Die Erfindung soll nach stehend an 2 Ausführungsbeispielen und einer Tabelle näher erläutet werden.

Beispiel 1 Adsorption von Blutzellen an pflanzlichen Zellwandpartikeln und Ablösung der adsorbierten Zellen durch verschiedene Lösungen

Für die Versuche wurde das frisch abgenommene Heparinblut der ge­ sunden Spender (2 ml) verwendet, das mit jeweiligem Sorbens (2 ml Feuchtvolumen) vermischt und nach einer 5 min Inkubation durch die Sorbensschicht mit 2 ml physiologischer Kochsalzlösung her­ auseluiert. Mit den zusätzlichen 4 ml der 0,9%-igen NaCl-Lösung oder anderer enzymhaltigen isotonen Lösung wurde versucht, die am Trägerpartikel adsorbierten Leukozyten herauszuwaschen. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle dargestellt.

Beispiel 2 Einfluß der zellulose-/pektinlösenden Enzyme auf die Nachweisbar­ keit der Leukozyten

Als Ausgangsmaterial diente eine erythrozytenarme Leukozytensu­ spension mit bestimmter Zellzahl, die für eine routinemäßige Zäh­ lung optimal war. Die Leukozytensuspension wurde mit einer isoto­ nen Enzymlösung vermischt (Endkonzentration gleich 6%) und bei 36°C etwa 1 Stunde inkubiert. In bestimmten Zeitabschnitten wur­ den Proben abgenommen und ausgezählt. Die Ausgangszahl der Zellen war bei der Auswertung der Versuche als 100% genommen.

Nach der mathematischen Auswertung der Versuchsergebnisse (Krus­ kal Wallis - Test und Regressionsanalyse) war keine negative Wir­ kung der o.g. Enzyme auf die Integrität der Leukozyten erwar­ tungsgemäß feststellbar. Die Abb. 1 zeigt keine signifikante Unterschiede in der Zellzahl bei verschiedenen Inkubationszeiten.

Claims (8)

1 . Verfahren zum selektiven Konzentrieren der Leukozyten aus ei­ ner Probe eines Blutproduktes, dadurch gekennzeichnet, daß das flüssige Blutpräparat ein selektives Sorbens für die Leukozyten durchströmt, dessen sorptionsfähige Komponente solubilisierbar ist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die sorptionsfähige Komponente des Trägers mit Hilfe von Enzymen so­ lubilisierbar ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das selektive Sorbens an seiner Oberfläche einen Pektinstoff enthält.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das selektive Sorbens an seiner Oberfläche ein Protein enthält.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das selektive Sorbens an seiner Oberfläche Kollagen enthält.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das selektive Sorbens magnetisch ist.

7. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß das selektive Sorbens auf einer Filterplatte bzw. einem Sieb gepackt ist.

8. Vorrichtung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß sie einen Zytozentrifugenaufsatz mit Anschlußmöglichkeit an einen Objektträger besitzt.