DE4234130A1

DE4234130A1 - Phospholipase A¶2¶ inhibierende Phosphatidylcholinverbindungen

Info

Publication number: DE4234130A1
Application number: DE4234130A
Authority: DE
Inventors: Hansjoerg Prof Dr Eibl; Ulrich Dr Massing; Clemens Prof Dr Unger
Original assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Current assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Priority date: 1992-10-09
Filing date: 1992-10-09
Publication date: 1994-04-14
Also published as: JPH08502735A; EP0663918A1; WO1994009014A1; AU5150093A

Description

Die Erfindung betrifft Phosphatidylcholinverbindungen, die eine inhibitorische Wirkung auf die enzymatische Aktivität der Phospholipase A₂ aufweisen und ein Verfahren zu ihrer Herstellung, sowie pharmazeutische Zubereitungen, die solche Inhibitoren enthalten.

Die Phospholipase A₂ (PLA₂) ist ein Enzym, welches die sn-2-Acylbindung von Phospholipiden spaltet. Dieses Enzym ist daher an der Bildung von einer großen Anzahl von biologische Reaktionen auslösenden Stoffen beteiligt, und zwar insbesondere bei der Bildung von Arachidonsäure. Aus der Arachidonsäure werden durch enzymatische Oxidation eine Vielzahl biochemisch wirksamer Verbindungen gebildet, die unter dem Begriff Eicosanoide zusammengefaßt werden, wozu auch die Prostaglandine, Tromboxane, Prostazykline, Leukotriene und Lipoxine gehören. Diese verschiedenen Verbindungsklassen rufen eine Vielzahl von biochemisch wichtigen Reaktionen hervor. Aus diesem Grund sind Inhibitoren von PLA₂ für die Entwicklung neuer entzündungshemmender oder auch die Blutgerinnung beeinflussender Arzneimittel von großem Interesse.

Die Erfindung hat daher zum Ziel Inhibitoren für PLA₂ bereit zustellen.

Dieses Ziel wird erfindungsgemäß durch die Bereitstellung einer Gruppe von Phosphatidylcholin-Verbindungen mit der allgemeinen Formel
R¹-C(R²)H-CH₂ -OPC
erreicht, worin R¹ ein Alkylrest mit 10-22 C-Atomen bedeu tet, -PC ein Phosphatidylcholinrest ist und R² gleich -OH, -NH2,-O-C(O)R³ oder -NH-C(O)R³ bedeutet und R³ für einen Alkylrest mit 1-20 C-Atomen steht. Bei den erfindungsgemäßen Verbindungen sind R² und OPC gegeneinan der vertauschbar. Bei den erfindungsgemäßen Substanzen kann das den Rest R² tragende C-Atom sowohl in der R- als auch in der 5-Konfiguration vorliegen. Der Alkylrest R¹ kann sowohl gesättigte als auch ungesättigte Kohlenstoffbin dungen aufweisen. In einer bevorzugten Ausführungsform ist R¹ ein C₁₁- bis C₂₂ und insbesondere ein C₁₆- bis C₁₈-Alkylrest wobei ein Palmitoylrest besonders bevorzugt ist. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist R³ ein C₁-C₁₇ Alkylrest.

Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung solcher Phosphocholinverbindungen durch Umsetzen von

- IsoPropyliden-Glycerinaldehyd mit einer Triphenyl- Phosphinalkylbromid-Verbindung mittels einer Wittigreaktion,
- einer Hydrierung und Deacetonierung des so erhaltenen Produktes auf an sich bekannte Weise, anschließender
- Tritylierung des hydrierten und deacetonierten Produktes zur entsprechenden O-Tritylhydroxy-Verbindung,
- Umsetzen der O-Tritylhydroxy-Verbindung und Detritylierung zum entsprechenden Hydroxy-O-Benzyl zwischenprodukt und Weiterverarbeitung des Zwischenproduktes entweder dadurch, daß man es
- durch Phosphorylierung zur entsprechenden Phosphocholin-O-Benzylverbindung mit anschließender Debenzylidierung zum entsprechenden O-Phosphocholin- Hydroxy-Produkt umsetzt oder daß man das Zwischenprodukt durch eine
- Phtalimideinführung mit Konformationsumkehr und an schließender Detritylierung zur entsprechenden Hydroxy-N- Phtalimido-Verbindung umsetzt, die dann mittels einer Phosphorylierung auf an sich bekannte Weise in die ent sprechende Phosphochol in-N-Phtalimido-Verbindung umgesetzt wird, welche dann durch Phtalsäureabspaltung in das gewünschte O-Phosphocholin-Amino-Produkt überführt wird. In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das Phosphocholin-Amin- oder Phosphocholin-Hydroxy-Produkt mit einem den Rest R₃ ent haltenden Acelierungsmittel zum entsprechenden Lysolipid umgesetzt.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind bezüglich ihrer Enantiomeren rein. Da die PLA₂ enantioselektiv arbeitet, kann mittels dem erfindungsgemäßen Verfahren gezielt das gewünschte Enantiomer oder auch eine Mischung der Enantiomere zur PLA₂ Modulation eingesetzt werden. Es hat sich gezeigt, daß die erfindungsgemäßen Substanzen, die eine lange aliphatische Kette aufweisen (z. B. die Octanderivate) sehr gut in die Zellen eindringen können, um dort ihre Wirkung zu entfalten. Besonders geeignet sind dabei Verbindungen, die eine kurze Acylkette aufweisen. Überraschenderweise zeigen diejenigen erfindungsgemäßen Substanzen, die eine unnatürliche Konfiguration aufweisen und/oder die die freie Amino- bzw. Hydroxylfunktion im Molekül enthalten, besonders ausgeprägte inhibitorische Wirkung.

In den im folgenden angeführten Reaktionsschemata A und B sind die Verfahren zur Synthese der erfindungsgemäßen Verbindungen zusammengefaßt. Syntheseweg A führt zu Lipiden, die auf 1,2 Diolen mit variabler Kettenlänge aufbauen. Syntheseweg B führt zu Lipiden, die auf den 2 Aminoalkoholen mit variabler Kettenlänge aufbauen. Die verschiedenen Kettenlängen werden durch eine Verwendung von Wittigsalzen mit verschiedenlangen Ketten erhalten.

Syntheseweg A

Hierbei bedeutet *, daß das C-Atom in der R- oder S- Konfiguration vorliegt.

Syntheseweg B

Die Syntheseschritte Ba)-Bc) entsprechen den Synthese schritten Aa)-Ac)

Mit den erfindungsgemäßen Phosphocholin-Verbindungen bzw. Lysolipiden wurde die kompetitive Inhibierung der Phospholipase A₂ (PLA₂) bestimmt. In den folgenden Tabellen 1 und 2 wurde am System von PLA₂/DPPC (Dipalmitoyl- Lecithin) und an dem System PLA₂/PAF (Plattlet Activating Factor mit 1-O-Hexadecyl-2-O-acetyl-sn-Glycero-3-Phospho cholin) für eine Reihe erfindungsgemäßer Substanzen, die sich von einer 1,1-Octadecandiol bzw. 2-Aminooctadecanol- Struktur ableiten, die inhibierende Wirkung bestimmt.

In der Tabelle 1 sind die Wirkungen einiger der erfindungsgemäßen Substanzen auf das PLk₂/DPPC-System angegeben. Die inhibitorische Wirkung ist in Prozent dargestellt. Die zugesetzte Menge an Inhibitor beträgt 1/10 der DPPC-Konzentration. Einige der erfindungsgemäßen Substanzen, die auf Grund ihrer physikalischen Eigen schaften den Lysolipiden zuzurechnen sind, wurden zusätz lich auf ihre inhibierende Wirkung auf das System PLA₂/PAF untersucht (Tabelle 2). Auch hier zeigen sich inhibierende Effekte der Substanzen. Von (2R)-1-O-Phosphocholin- 2-N-acetyl-Octadekan wurde die Verdünnungsreihe bei der Messung der Inhibitionswirkung auf das PLA₂/DPPC System bestimmt. Dabei wurde gefunden, daß das molare Verhältnis von DPPC zum Inhibitor bei 50%iger Inhibierung 50000:1 (x_I (50)=0,00002) beträgt.

Tabelle 1

Inhibitorische Wirkung 1-O- Phosphocholin-2-(-Tabelle)-octadecane auf das System DPPC/PLA₂₃

Tabelle 2

Inhibitorische Wirkung 1-O- Phosphocholin-2-(-Tabelle)-octadecane auf das System PAF/PLA₂

Die Erfindung betrifft auch pharmazeutische Zubereitungen, die die erfindungsgemäßen Substanzen enthalten.

Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläu tern.

Beispiel 1 Wittigreaktion/Kettenaufbau A oder B, a Bsp.: 2-(R/S/rac)-1.2-Isoproyliden-octadec-3-en

0.1 mol Triphenylphosphin-pentadecan-brmid werden in 400 ml THF gelöst. Man kühlt auf 0°C und spritzt 0.12 mol n- Butyllithium (2.5 M in Hexan) langsam in die Reaktionslö sung. Nachdem 10 Minuten bei 0°C gerührt wurde (KPG- Rührer), kühlte man auf -78°C ab. 0.12 mol Isopropyliden glycerinaldehyd (Lit: Hubschwerlen und Fischer) in 50 ml THF werden innerhalb von 30 Minuten zugetropft. Nach dem Zutropfen wird noch 20 Minuten bei -78°C gerührt und anschließend die Kühlung entfernt. Man läßt über Nacht rühren. Es wird gegen 350 ml Wasser extrahiert, die untere Phase wird nochmals gegen 50 ml Diisopropylether extra hiert. Die org. Phasen werden im Vakuum abgedampft und der Rückstand in 350 ml Pentan aufgenommen. Unter starkem Rühren kühlt man auf 0°C ab. Vom Rückstand wird abgesaugt und mit 150 ml Pentan nachgewaschen. Das Filtrat extrahiert man mit 120 ml konz. NaCl-Lsg., dampft die Lösungsmittel der org. Phasen im Vakuum ab, nimmt den Rückstand in 20 ml Hexan auf und trennt das apolare Nebenprodukt durch eine Säulenfiltration mit Hexan an 160 g Kieselgel ab. An schließend wird das Produkt mit Hexan/Diisopropylether eluiert. Man gewinnt das Produkt durch sorgfältiges Abde stillieren der Lösungsmittel im Vakuum.
Ausbeute: 0.076 mol = 76%
M = 324.549 g/mol (C₂₁H₄₀O₂)
Rf = 0.49 (Hexan/Diisopropylether (4 : 1))
[α]D^(R) = -4.600 (Reine Substanz)
[α]D^(S) = +4.600 (Reine Substanz)
Analyse: ber.: C = 77.71 H = 12.42
gef.: C = 77.98 H = 12.56

Beispiel 2 Hydrierung/Deacetonierung A oder B, b Bsp.: 2-(R/S/rac)-1.2-Octadecandiol

Zu 0.1 mol 1.2-Isopropyliden-octadec-3-en in 800 ml THF wird 18 g Pd/C (10%ig) in 18 ml Wasser zugegeben. Bevor man das Reaktionsgefäß an eine Hydrierapparatur anschließt, leitet man 20 Minuten einen Stickstoffstrom durch die Reaktionsmischung. Nach Beendigung der Wasserstoffaufnahme (12-24 Stunden) wird über einen Membran- oder Glasfaser filter der Katalysator abgesaugt. Zum Filtrat werden 120 ml 2 N HCl gegeben und eine Stunde bei 60°C gerührt. Nach dem Abkühlen wird mit 900 ml Kaliumcarbonatlsg. (40 g/l) extrahiert. Die wäßrige Phase wird wiederum mit 300 ml THF extrahiert, die org. Phasen vereinigt und die Lösungsmittel im Vakuum abdestilliert. Durch Zugabe von Toluol wurde das enthaltene Wasser azeotrop abdestilliert. Lösungsmitteln und Wasserspuren wurden durch Trocknung im Vakuum besei tigt.
Ausbeute: 0.097 = 97%
M = 286.50 g/mol (C₁₈H₃₈O₂)
R_f = 0.19 (Chloroform/Methanol 20 : 1)
R_f (Zwischenprodukt) = 0.50 (Hexan/Diisopropylether 4 : 1)
R_f (Edukt) = 0.56 (Hexan/Diisopropylether 4 : 1)
Analyse: ber.: C = 73.21 H = 9.98 N = 4.10
gef.: C = 73.10 H = 10.25 N = 4.25

Beispiel 3 Tritylierung A oder B, c Bsp.: 2-(R/S/rac)-1-O-Trityl-2-hydroxy-octadecan

Zu 0.1 mol 1.2-Octadecandiol in 260 ml Toluol wird 0.15 mol Triethylamin gegeben. Es wird auf Siedetemperatur erhitzt und 0.115 mol Tritylchlorid in 125 ml Toluol werden in 10 Minuten eingetropft. Man läßt eine Stunde unter Rückfluß kochen. Vom Lösungsmittel wird im Vakuum abdestilliert. Den Rückstand gibt man in 550 ml konz. NaCl- Lsg./Kaliumcarbonatlsg (40 g/l) (1 : 1) und extrahiert mit 550 ml Diisopropylether. Die org. Phase wird gegen 210 ml konz. NaCl-LSg./Kaliumcarbonatsg (40 g/l) (10 : 1) extra hiert. Über, mit Kaliumcarbonat basisch eingestellten, Kieselgel (80 g) wird die org. Phase säulenfiltriert. Man eluiert vollständig mit weiteren 350 ml Diisopropylether (+ 0.5 ml Triethylamin) und dampft die Eluate im Vakuum ab. Aus 550 ml Pentan wird zwei Tage bei -20°C kristallisiert. Das Produkt kristallisiert in feinen Nadeln. Die Trocknung erfolgt über KOH im Vakuum.
Ausbeute: 0.09 mol = 90%
M = 528.821 g/mol (C₃₇H₅₂O₂)
R_f = 0.70 (Diethylether/Pentan 1 : 1)
R_f (Edukt) = 0.09 (Diethylether/Pentan 1 : 1)

Beispiel 4 Benzylierrung/Detritylierung A, d Bsp.: 2-(R/S/rac)-1-Hydroxy-2-O-benzyl-octadecan

In 450 ml THF werden 0.1 mol 1-O-Trityl-2-hydroxy-octadecan und 0.12 mol Kalium-tert-butylat gelöst. Man erwärmt auf 50°C und tropft 0.12 mol Benzylchlorid in 150 ml THF zu. Nach zwei Stunden wird 0.045 mol Kalium-tert-butylat zugesetzt und 0.045 mol Benzylchlorid in 60 ml zugetropft. Nach weiteren zwei Stunden werden 450 ml NaCl-Lsg. (100 g/l) zugegeben. Nach der Phasentrennung destilliert man das Lösungsmittel der org. Phase im Vakuum ab, nimmt den Rückstand in 1.6 l Dioxan/Methanol (1 : 1) auf und versetzt vorsichtig mit 15 ml konz. Schwefelsäure. Man rührt 1.5 Stunden bei 50°C, gibt dann zur Reaktionslösung 1.2 l Kaliumcarbonatlösung (40 g/l) sowie 150 ml konz. NaCl-Lsg. Es wird mit 1.5 l Diisopropylether extrahiert. Die wäßrige Phase wird nochmals mit 450 ml Diisopropylether extrahiert, die vereinigten org. Phasen, im Vakuum abgedampft und der Rückstand in 70 ml Hexan aufgenommen. An 700 g Kieselgel wird erst mit 1.5 l Hexan, dann mit Hexan/Diisopropylether (20 : 1) säulenfiltriert, bis der Tritylether eluiert ist. Anschließend wird das Produkt mit Diethylether/Pentan 1 : 1 eluiert.
Ausbeute: 0.083 mol = 83%
M = 376.622 g/mol (C₂₅H₄₄O₂)
R_f = 0.35 (Diethylether/Pentan (1 : 1))
R_f (Zwischenprodukt) = 0.80 (Diethylether/Pentan (1 : 1))
R_f(Edukt) = 0.70 (Diethylether/Pentan (1 : 1))
Analyse: ber.: c = 79.73 H = 11.78 0 = 8.49
gef.: c = 79.81 H = 11.82 0 = 8.2

Beispiel 5 Phosphorylierung A, e Bsp.: 2-(R/S/rac) 1-O-Phosphocholin-2-O-benzyl-octadecan

Zu 0.115 mol Phosphoroxychlorid wird unter Kühlung auf < 10°C 0.1 mol 1-Hydroxy-2-O-benzyl-octadecan (A, d) zusam men mit 0.175 mol Triethylamin in 140 ml THF zugetropft. Man entfernt die Kühlung und läßt 10 Minuten rühren (KPG- Rührer). 0.133 mol N-Methyl-ethanolaniin zusammen mit 0.175 mol Triethylamin in 75 ml THF werden so zugetropft, daß die Reaktionstemperatur 40°C nicht übersteigt. Man saugt nach 15 Minuten vom Hydrochlorid ab und gießt das Filtrat unter Rühren zu 23 ml 6 N HCl. Nach 5 Minuten neutralisiert man mit konz. Ammoniaklösung. Das Lösungsmittel wird im Vakuum vorsichtig abgedampft, bis nur noch Wasser übergeht. Die Vorlage nimmt man mit 270 ml Chloroform und 340 ml Methanol auf und extrahiert gegen 230 ml Wasser. Das Lösungsmittel der unteren Phase wird, bis auf Reste an Wasser, vorsichtig im Vakuum abgedampft. Der Rückstand der Vorlage wird in 280 ml Dichlormethan/2-Propanol (1 : 3) aufgenommen und mit 0.24 mol Dimethylsulfat versetzt. Man erwärmt auf 40°C und tropft rasch 0.25 mdl Kaliumcarbonat in 100 ml Wasser zu. Nach 30 Minuten intensiven Rührens läßt man abkühlen und trennt die Phasen. Das Lösungsmittel der oberen Phase wird im Vakuum abgedampft, der Rückstand in 500 ml Methanol und 450 ml Chloroform aufgenommen und gegen 450 ml Wasser extrahiert. Das Lösungsmittel der unteren Phase wird unter Zusatz von Toluol im Vakuum abdestilliert. Der Rückstand wird in 55 ml Dichlormethan gelöst. Durch Zugabe von 600 ml Aceton wird das Rohprodukt über Nacht ausgefällt. Dies, noch mit kleinen Mengen an Salzen, verunreinigte Produkt wird in der Folgereaktion eingesetzt.
M = 541.750 g/mol (C₃₀H₅₆O₅NP)
R_f = 0.17 (Chloroform/Methanol/Ammoniaklsg. 6% (60 : 40 : 6))

Beispiel 6 Debenzylierung A, f Bsp.: 2-(R/S/rac)-1-O-Phosphocholin-2-hydroxy-octadecan

Das noch mit anorganischen Salzen verunreinigte Rohprodukt der Phosphorylierung (A, e) (0.1 mol) werden in 450 ml Methanol/THF (1 : 1) aufgenommen. 10 g Pd/C (5%ig) in 40 ml Wasser werden unter Rühren zugegeben. Nach Zugabe von 40 ml 1 N HCl leitet man 20 Minuten einen Stickstoffstrom durch die Reaktionslösung. Man schließt das Reaktionsgefäß an eine Hydrierapparatur an, die Hydrogenolyse erfolgt unter intensivem Rühren. Nach Beendigung der Wasserstoffaufnahme (ca. 4 Stunden) wird vom Katalysator abgesaugt (Membran- oder Glasfaserfilter) und das Filtrat mit Ammoniaklösung neutralisiert. Man dampft die Lösungsmittel im Vakuum ab, nimmt den Rückstand mit 550 ml Methanol und 450 ml Chloro form auf und extrahiert zweimal mit je 450 ml 10%iger Kochsalzlösung. Die Lösungsmittel der unteren Phase werden unter Zusatz von Toluol im Vakuum abdestilliert. Der Rückstand wird unter Aufkochen in 160 ml Chloroform fein suspendiert. 1.6 l Aceton werden zugegeben und über 48 Stunden bei 4°C gefällt. Man erhält das reine Produkt durch Absaugen und Trocknung im Vakuum.
Ausbeute: 0.099 mol = 99% (aus A, d = 90%)
M = 451.626 g/mol (C₂₃H₅₀O₅NP)
R_f = 0.12 (Chloroform/Methanol/Ammoniaklsg. 6% (60 : 40 : 6)
Analyse: ber.: c = 61.17 H = 11.16 N = 3.10 P = 6.86
gef. : C = 61.15 H = 11.27 N = 3.15 P = 6.8

Beispiel 7 Acylierung A, g Bsp.: 2- (R/S/rac)-1-O-Phosphocholin-2-O-acy-octadecan

10 mmol des entsprechend konfigurierten 1-O-Phosphocholin- 2-hydroxy-octadecan (A, f) und 21 mmol DMAP sowie 20 mmol des entsprechenden Säurechlorids bzw. des Acetanhydrids werden in 90 ml alkoholfreiem Chloroform im geschlossenen Kolben bei 30°C 16 Stunden im Ultraschallbad beschallt. 1 ml Methanol wird zugegeben, nach 10 Minuten wird das Lösungsmittel im Vakuum abdestilliert. In X₁ ml Chloroform wird aufgenommen und mit 560 ml bei X₂°C gefällt. Das Rohprodukt wird abgesaugt und mit 160 ml Chloroform und 180 ml Methanol aufgenommen. Man extrahiert gegen 135 ml Wasser, die obere Phase wird anschließend mit 200 ml Chloroform/Methanol (2 : 1) extrahiert. Beim Produkt 1-O- Phosphocholin-2-O-acetyl-octadecan wird anstelle von 135 ml Wasser 10%ige Kochsalzlösung verwendet. Die Lösungsmittel der vereinigten unteren Phasen werden unter Zusatz von Toluol in Vakuum abdestilliert. Der Rückstand wird chromatographisch an 450 g Kieselgel gereinigt. Dabei eluiert man zuerst die rel. apolaren Verunreinigungen mit Chloroform/Methanol/Ammoniak (60 : 40 : 2) um anschließend das Produkt mit Chloroform/Methanol/Ammoniak (60 : 40 : 7) aus der Säule zu eluieren. Das Produkt 1-O- Phosphocholin-2-O-acetyl-octadecan wird mit Chloroform-Me thanol-Ammoniak (55 : 45 : 9) eluiert. Die Produkte werden durch Zusatz von Toluol azeotrop getrocknet und im Vakuum anschließend von Wasser und Lösungsmittelresten befreit. Die Ausbeute beträgt X₃ (mmol, %).

Beispiel 8 Phtalimideinführung mit Konfigurationsumkehr/Detritylierung B,d Bsp.: 2-(R/S/rac)-1-Hydroxy-2-N-Phtalimido-octadecan

Zu 0.1 mol 1-O-Trityl-2-hydroxy-octadecan in 600 ml THF werden 0.12 mol Phthalimid und 0.145 mol Triphenylphosphin gegeben. Unter Rühren und Kühlung auf 0°C wird langsam 0.146 mol Diethylazodicarboxylat in 120 ml THF zugetropft. Nach zwei Stunden wird zur Reaktionsmischung 1.2 l Kaliumcarbonatlsg. (40 g/l) und 120 ml konz. NaCl.-Lsg. gegeben und mit 1.2 l Diisopropylether extrahiert. Man extrahiert die obere Phase mit 230 ml konz. NaCl.-Lsg. und destilliert das Lösungsmittel im Vakuum ab. Der Rückstand wird in 50 ml Diisopropylether gelöst und auf eine Säule (650 g Kieselgel, Hexan/Diisopropylether 2 : 1 + 1% Triethylamin) gegeben. Man eluiert zuerst die apolaren Verunreinigungen mit Hexan/Diisopropylether (2 : 1), dann das Zwischenprodukt mit Diisopropylether. Die produkthaltigen Phasen werden im Vakuum eingedampft, der Rückstand mit 600 ml Methanol und 600 ml Dioxan aufgenommen und vorsichtig mit 12 ml konz. Schwefelsäure versetzt. Man rührt 1.5 Stunden bei 60°C. Nach Abkühlung wird 1.2 l Kaliumcarbonatlsg. (40 g/l) und gegen 1.2 l Diisopropylether extrahiert. Man trennt die Phasen, zieht das Lösungsmittel der oberen Phase ab und unterwirft den Rückstand einer Säulenfiltration an 700 g Kieselgel. Zuerst wird der Tritylether mit Hexan/Diisopropylether, alsdann das Produkt mit Diethylether eluiert. Das Produkt wird im Vakuum getrocknet.
Ausbeute: 0.077 mol = 77%
M = 415.618 g/mol (C₂₆H₄₁O₃N)
R_f = 0.29 (Essigester/Hexan 1 : 2)
R_f (Zwischenprodukt) = 0.67 (Essigester/Hexan 1 : 2)
R_f (Edukt) = 0.69 (Essigester/Hexan 1 : 2)
Analyse: ber.: C = 73.21 H = 9.98 N = 4.10
gef.: C = 73.10 H = 10.25 N = 4.25

Beispiel 8 Phosphorylierung B, e Bsp.: 2-(R/S/rac)-1-O-Phosphocholin-2-N-phthalimido-octadecan

Zu 0.115 mol Phosphoroxychlorid wird unter Kühlung auf < 10°C 0.1 mol 1-Hydroxy-2-N-Phthalimido-octadecan zusammen mit 0.175 mol Triethylamin in 140 ml THF zugetropft. Man entfernt die Kühlung und läßt 10 Minuten rühren (KPG- Rührer). 0.133 mol N-Methyl-ethanolamin zusammen mit 0.175 mol Triethylamin in 75 ml THF werden so zugetropft, daß die Reaktionstemperatur 40°C nicht übersteigt. Man saugt nach 15 Minuten vom Hydrochlorid ab und gießt das Filtrat unter Rühren zu 23 ml 6 N HCl. Nach 5 Minuten neutralisiert man mit konz. Ammoniaklösung. Das Lösungsmittel wird im Vakuum vorsichtig abgedampft, bis nur noch Wasser übergeht. Die Vorlage nimmt man mit 380 ml Chloroform und 460 ml Methanol auf und extrahiert gegen 310 ml Wasser. Das Lösungsmittel der unteren Phase wird, bis auf Reste an Wasser, vorsichtig im Vakuum abgedampft.

Der Rückstand der Vorlage wird in 280 ml Dichlormethan/2-Propanoi (1 : 3) aufgenommen und mit 0.24 mol Dimethylsulfat versetzt. Man erwärmt auf 40°C und tropft rasch 0.25 mol Kaliumcarbonat in 100 ml Wasser zu. Nach 30 Minuten intensiven Rührens läßt man abkühlen und trennt die Phasen. Das Lösungsmittel der oberen Phase wird im Vakuum abgedampft, der Rückstand in 450 ml Methanol und 380 ml Chloroform aufgenommen und gegen 380 ml Wasser extrahiert. Das Lösungsmittel der unteren Phase wird unter Zusatz von Toluol im Vakuum abdestilliert, das resultierende Rohpro dukt in der nächsten Reaktion eingesetzt. M = 580.714 g/mol (C₃₁H₅₃O₆N₂P)
R_f = 0.17 (Chloroform/Methanol/Ammoniaklsg. 6%ig (60 : 40 : 6))

Beispiel 9 Phthalsäureabspaltung B, f Bsp.: 2-(R/S/rac)-1-O-Phosphocholin-2-amino-octadecan

Das noch mit Salzen verunreinigte Rohprodukt der Phosphorylierung, (B, e), (0.1 mol) wird in 310 ml 2-Pro panol/Wasser/Toluol (6 : 1 : 1 : 5) gelöst. Nach Zugabe von 0.2 mol Natriumborhydrid bei 0°C läßt man über Nacht bei RT rühren. 0.05 mol Natriumborhydrid wird zugegeben, eine weitere Stunde intensiv gerührt. Durch vorsichtige Destil lation im Vakuum wird das Lösungsmittel entfernt. Nach Umfüllen des Rückstandes mit insges. 380 ml Wasser in ein 4 l Becherglas wird unter ständigem Rühren und unter Eisküh lung insges. 380 ml konz. HCl sehr langsam und vorsichtig (schäumt !) zugegeben. Man rührt die Suspension 10 Stunden bei 80°C (Innentemperatur). Nach Abkühlung wird erst mit fester NaOH, anschließend mit 6 N NaOH auf pH 9.0 einge stellt. Es wird mit 2.4 l Methanol/Chloroform (1 : 1) extra hiert. Die obere Phase wird noch dreimal mit je 550 ml Chloroform extrahiert. Dabei befinden sich in der unteren Phase feste Bestandteile, was normal ist. Die unteren Phasen werden vereinigt und im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wird unter Erwärmung in 125 ml konz. HCl fein suspendiert, dann mit 550 ml Aceton versetzt und eine Stunde auf 0°C gekühlt. Nach Absaugen den feinen NS ver setzt man das Filtrat mit weiteren 5 l Aceton und beläßt 24 Stunden bei -20°C. Es wird abgesaugt, der Rückstand in 370 ml 12%ige Ammoniaklösung extrahiert. Mit je 250 ml Chlo roform/Methanol (8 : 1) wird die obere Phase zweimal extra hiert. Das Produkt erhält man durch das Eindampfen der vereinigten unteren Phasen und Trocknung im Vakuum.
Ausbeute: 0.08 mol = 80% (aus B, d = 70%)
M = 450.641 g/mol (C₂₃H₅₁ON₂P)
R_f = 0.05 (Chloroform/Methanol/Ammoniaklsg. 6% (60 : 40 : 6))
Analyse: ber.: C = 61.30 H = 11.55 N = 6.21
gef.: C = 60.55 H = 11.17 N = 5.76.

Beispiel 10 Acylierung B, g Bsp.: 2-(R/S/rac)-1-O-Phosphocholin-2-N-acyl-octadecan

10 mmol des entsprechend konfigurierten Eduktes (B. f) und 21 mmol DMAP sowie 20 mmol des entsprechenden Säurechlorids bzw. des Acetanhydrids werden in 90 ml alkoholfreiem Chloroform im geschlossenen Kolben bei 30°C 10 Stunden im Ultraschallbad beschallt. 1 ml Methanol wird zugegeben, nach 10 Minuten wird das Lösungsmittel im Vakuum abdestil liert. In X₁ ml Chloroform wird aufgenommen und mit 560 ml bei X₂°C gefällt. Das Rohprodukt wird abgesaugt und mit 160 ml Chloroform und 180 ml Methanol aufgenommen. Man extra hiert gegen 135 ml Wasser, die obere Phase wird anschlie ßend-mit 200 ml Chloroform/Methanol (2 : 1) extrahiert. Beim Produkt 1-O-Phosphocholin-2-N-acetyl octadecan wird die obere Phase zusätzlich dreimal gegen je 110 ml Chloroform/Methanol (8 : 1) extrahiert. Die Lösungs mittel der vereinigten unteren Phasen werden unter Zusatz von Toluol in Vakuum abdestilliert. Der Rückstand wird chromatographisch an 450 g Kieselgel gereinigt. Dabei eluiert man zuerst die rel. apolaren Verunreinigungen mit Chloroform/Methanol/Ammoniak (60 : 40 : 2) um anschließend das Produkt mit Chloroform/Methanol/ Ammoniak (60 : 40 : 7) aus der Säule zu eluieren. Das Produkt 1-O-Phosphocholin-2-N-acetyl-octadecan wird mit Chloroform/ Methanol/Ammoniak (50 : 50 : 9) eluiert. Die Produkte werden durch Zusatz von Toluol azeotrop getrocknet, im Hochvakuum werden sie anschließend von Wasser und Lösungsmittelresten befreit. Die Ausbeute beträgt X₃ (mmol, %).

Beispiel 11 Bestimmung der Enantiomerenreinheit der erfindungsgemäßen Substanzen

Hierzu wurden die "Mosher"-ester (Ester der (R)-(+)-α-Methoxy-α-trifluormethylphenylesäure) von A oder B, c sowie von A, d und von B, d synthetisiert. Die Ester wurden ¹⁹F-NMR-spektroskopisch daraufhin überprüft, ob sich durch Veresterung mit dem chiralen Alkohol nur ein diastereomerer Ester gebildet hat, wie es von einem enantiomeren reinen Alkohol erwartet wird. Zum Vergleich wurden die ¹⁹F-NMR-Spektren der "Mosher"-ester der racemischen Alkohole herangezogen. Die hier überprüften Alkohole werden im Verlauf der Synthese in die erfindungsgemäßen Substanzen überführt, ohne das am chiralen Zentrum noch eine Manipulation durchgeführt wird. Die optische Reinheit der hier untersuchten Alkohole ist also voll auf die erfindungsgemäßen Substanzen zu übertra gen.

Beispiel 12 Synthese der "Mosher"-ester

X₁ mg (0.250 mmol) des zu veresternden Alkohols wird zusammen mit 79.6 mg (0.386 mmol) Dicyclohexylcarbadiimid (DCC) und 82.0 mg (0.350 mmol) (R)-(+)-α-Methoxy-α-trifluormethylphenylessigsäure (R- Moshersäure) sowie einem Kristall DMAP in 1.5 ml alkoholfreiem Chloroform gelöst und drei Stunden bei RT gerührt. (Prüfung des vollständigen Umsatzes durch DC- Kontrolle.) Vom Lösungsmittel wird vorsichtig im Vakuum abdestilliert. Man reinigt das Produkt Säulenchromatographisch an 25 g Kieselgel. Die "Mosher"-ester der Alkohole 1-Hydroxy-2-O-benzyl-octadecan und 1-Hydroxy-2-N-phthal-imido-octadecan werden mit Essigester/Hexan (1 : 4) eluiert, die "Mosher"-ester der Alkohole 1-O-Trityl-2-hydroxy-octadecan werden mit Diisopropylether/Hexan (1 : 7) eluiert. Ausbeute: X₂ mg (X₃ mmol) = X₄ %.

Die zu Vergleichszwecken dienenden "Mosher"-ester entspre chenden racemischen Alkohole wurden durch Mischung der "Mosher"-ester der chiralen Alkohole erzeugt.

Aus den Spektren ist ersichtlich, das die erfindungsgemäßen Verbindungen enantiomerenrein sind. Die Signalintensitäten des jeweilig unerwünschten Distereomers liegen weit unter 1 %. Das unerwünschte Diastereomerensignal kann auch von der nicht vollständigen Enantiomerenreinheit der handelsüblichen R-"Mosher"-säure herrühren. (ee < 99%.) Der Enantiomerenüberschuß der chiralen erfindungsgemäßen Substanzen beträgt folglich mehr als 99%.

Beispiel 13 Bestimmung der Substrateigenschaften gegen die Phospholipase A₂ (PLA₂)

Das Volumen eines Testansatzes betrug 2 ml. Pro Testansatz wurden in einem Reagenzglas 2 µmol Substrat (Substrat in Lösung/Suspension; 20 µmol/ml Wasser) in der entsprechendem Menge Puffer (Tris/HCl 100 mM + 10 mM CaCl₂; pH: 8.9) aufgenommen und im Ultraschallbad bei 45°C 30 Minuten suspendiert, Die Proben wurden im Wasserbad bei 25°C vorinkubiert, dann die Reaktion durch Zugabe der PLA₂-Lösung gestartet. Dabei wurde je nach Substrateigenschaften 0.01-1 U Enzym zugege ben. Die Inkubationszeiten variieren von 10-60 Minuten. Für jedes Substrat wurden Kontrollansätze ohne Enzym parallel durchgeführt. Die Enzymmenge und die Inkubationszeiten wurden so gewählt, daß maximal 10% des eingesetzten Substrates umgesetzt wurden. Mindestens drei Bestimmungen wurden für jedes Substrat durchgeführt. Die Reaktionen wurden durch Extraktion mit je 2 ml Chloroform/Methanol (3 : 1) gestoppt. Es wurde 5 Minuten zentrifugiert (500 g), die untere Phase separiert. Die obere Phase wurde daraufhin noch einmal mit 2 ml Chloroform/Methanol (3 : 1), dann mit 2 ml Chloroform extrahiert und zentrifugiert. Die vereinigten unteren Phasen wurden im Stickstoffstrom vom Lösungsmittel befreit.

Der Rückstand wurde in 200-2000 µl Chloro form/Methanol/Wassdr 30 : 60 : 8 aufgenommen. Aus diesen Lösungen wurden Aliquots von 2-20 µl entnommen und zur quantitativen Bestimmung der Produktmenge durch die HPTLC-Technik eingesetzt.

Aus den Mengen des gebildeten Produktes, den eingesetzten Enzymmengen und den Inkubationszeiten wurden die spezi fischen Aktivitäten der PLA₂ gegen die entsprechenden Substrate in µmol/min/mg = U/mg berechnet. Mit den reinen Produkten wurde in einem analogen Ansatz die Recovery bestimmt, um die jedes Ergebnis korrigiert wurde. Die Eichlösungen wurden durch Einwage der Produkte und Aufnahme in Chloroform/Methanol/Wasser 30 : 60 : 8 hergestellt. Die Konzentration der Eichlösungen betrug 100 pmol/µl.

Zur Durchführung der Messung der Inhibitorwirkung auf die PLA₂-Hydrolyse von DPPC bzw. PAF wurde die entsprechende Menge "Inhibitor" mit DPPC bzw. PAF gemeinsam beschallt und die Probe dann der PLA₂-Hydrolyse unterworfen. Man bestimmt wie beschrieben die entstandene Menge Lysolipid und be rechnet den Vergleich mit einer, nicht mit "Inhibitor" behandelten, DPPC- bzw. PAF-Probe die Inhibitionswirkung. Bei "Inhibitoren", die auch der PLA₂-Hydrolyse unterliegen, wird die Hemmung auf das DPPC/PLA₂ bzw. PAF/PLA₂-System bestimmt, indem die Verhältnisse der unabhängig voneinander gemessenen Umsatzraten mit den Verhältnissen der gemeinsam gemessenen Umsatzraten verglichen werden.

Beispiel 14 Durchführung von HPTLC-Analysen

Vor dem Auftragen der Eich- und Meßlösungen auf die HPTLC- Platte ließ man die Platte in Chloroform/Methanol/Ammoniak (25%) 50 : 50 : 4 vorlaufen, um Verschmutzungen zu entfernen. Die Platte wurde 10 Minuten bei 180°C getrocknet. 2-10 µl der Eichlösungen sowie 2-20 µl der zu messenden Produktlö sungen wurden mit einem HPTLC-Auftragegerät auf die Dünn schichtplatte aufgetragen. Man entwickelte die Platte im für die Substrat/Produkt-Trennung günstigsten Laufmittel (Tab. X.1). Die entwickelten Platten trockneten 10 Minuten bei 180°C. Zum Anfärben wurde die erkaltete Platte 15 Sekunden in eine Lösung von 100 g Kupfersulfat in 906 ml Wasser und 94 ml Phosphorsäure (85%) getaucht. Man ließ die Platte ein Minute bei 110°C trocknen. Die Anfärbung erfolgte schließlich durch Erhitzen der Platte auf 180°C. Je nach Produkt dauerte dieser Vorgang 1-4 Minuten. Die so angefärbte Platte wurde in einem Densitometer vermessen. Über die mitaufgetragenen Eichsubstanzen und der daraus resultierenden Eichkurve wurden die Produktmengen der zu vermessenden Produktlösungen bestimmt. Diese konnten dann zur Berechnung der enzymatischen Umsätze herangezogen werden.

Substrat
Laufmittel (R_F-Werte: Substrat/Produkt)
DPPC
A (0.44/0.34)
PAF	B (0.18/0.10)
(C-2-Ester)	B (0.15/0.09)
(C-12-Ester)	A (0.39/0.22)
(C-16-Ester)	A (0.39/0.22)
(C-18/1-Ester)	A (0.38/0.22)
(C-18-Ester)	A (0.35/0.22)
(C-2-Amid)	B (0.12/0.07)
(C-12-Amid)	A (0.33/0.16)
(C-16-Amid)	A (0.34/0.16)
(C-18/1-Amid)	A (0.33/0.16)
(C-18-Amid)	A (0.33/0.16)

Laufmittel A: Chloroform/Methanol/Triethylamin/Wasser 60 : 70 : 68 : 16
Laufmittel B: Chloroform/Methanol/Ammoniak (25%) 50 : 50 : 4.

Claims

1. Phosphocholinverbindungen der allgemeinen Formel
R¹-C(R²)H-CH₂-OPC,
wobei R¹ ein C₁₀-C₂₂ Alkylrest bedeutet,
R² ein O-CO-R³, NH-CO-R³, OH oder NH₂ bedeutet und
R³ ein C₁-C₂₀-Alkylrest ist
und PC für einen Phosphocholinrest steht,
wobei OPC und R² auch miteinander vertauschbar sind,
sowie deren Enantiomeren.

2. Verbindungen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß R¹ ein C₁₄-C₁₈
-Alkylrest ist.

3. Verbindungen nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß R² ein Palmitoylrest ist.

4. Verbindungen nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß R¹ ein Hydroxylrest ist und das ihn tragende C-Atom die 5-Konfiguration aufweist.

5. Verbindungen nach einem der Ansprüche 1-3, dadurch ge kennzeichnet, daß R² ein Essigsäureamid oder ein Essig säureester ist und daß das diesen Rest tragende C-Atom die R-Konfiguration aufweist.

6. Verbindungen nach einem der Ansprüche 1-3 dadurch gekennzeichnet, daß R² ein Fettsäureamidrest mit 10-17 C-Atomen ist.

7. Verbindungen nach Anspruch 6 dadurch gekennzeichnet, daß das den Fettsäureamidrest aufweisende C-Atom die R-Konfiguration aufweist.

8. Verbindungen nach Anspruch 6 dadurch gekennzeichnet, daß das den Fettsäureamidrest tragende C-Atom die S-Konfiguration aufweist.

9. Verfahren zur Herstellung von Phosphocholinverbindungen nach einem der Ansprüche 1-8 durch Umsetzen von

- Isopropyliden-Glycerinaldehyd mit einer Triphenylphosphinalkylbromid-Verbindung mittels einer Wittigreaktion,
- einer Hydrierung und Deacetonierung des so erhaltenen Produktes auf an sich bekannte Weise, anschließender
- Tritylierung des hydrierten und deacetonierten Produktes zur entsprechenden O-Tritylhydroxy- Verbindung,
- Umsetzen der O-Tritylhydroxy-Verbindung und Detritylierung zum entsprechenden Hydroxy-O-Benzyl zwischenprodukt und Weiterverarbeitung des Zwischenproduktes entweder dadurch, daß man es
- durch Phosphorylierung zur entsprechenden Phosphocbolin-O-Benzylverbindung mit anschließender Debenzylidierung zum entsprechenden O-Phosphocholin-Hydroxy-Produkt umsetzt oder daß man das Zwischenprodukt durch eine
- Phtalimideinführung mit Konformationsumkehr und anschließender Detritylierung zur entsprechenden Hydroxy-N-Phtalimido-Verbindung umsetzt, die dann mittels einer Phosphorylierung auf an sich bekannte Weise in die entsprechende Phosphocholin-N-Phtalimido-Verbindung umgesetzt wird, und diese dann durch Phtalsäureabspaltung in das gewünschte O-Phosphochol in-Amino-Produkt überführt wird.

10. Verfahren nach Anspruch 9 dadurch gekennzeichnet, daß das Phosphocholin-Amino- oder Phosphocholin- Hydroxy-Produkt mit einem den Rest R₃ enthaltenden Acetylierungsmittel zum entsprechenden Lysolipid umsetzt.

11. Pharmazeutische Zubereitung enthaltend eine Phosphocholinverbindung nach einem der Ansprüche 1-8.