DE4293865B4

DE4293865B4 - Verbesserte Cytozentrifugiereinrichtung, Apparatur und Verfahren

Info

Publication number: DE4293865B4
Application number: DE4293865A
Authority: DE
Inventors: Barry D. North Logan Stokes; Carmelo G. Logan Quirante
Original assignee: Wescor Inc
Current assignee: Wescor Inc
Priority date: 1991-11-05
Filing date: 1992-11-04
Publication date: 2007-09-20
Anticipated expiration: 2012-11-05
Also published as: US5376267A; US5466371A; WO1993008895A1; GB9408970D0; GB2276104A; US5252228A; GB2276104B; DE4293865T1; JP3060239B2; US5380435A; JPH07500914A

Abstract

Verfahren zum Betreiben einer Cytozentrifuge (14) mit wenigstens einem Einsatz (10) zum Abscheiden und Festhaften unter Zentrifugalkraft in Radialrichtung von Zellen aus einer zellentragenden Flüssigkeit auf einem Mikroskopobjektträger (13), wobei der wenigstens eine Einsatz (10) einen Durchlass (26) und einen Filterkörper (12, 27), der zwischen dem Mikroskopobjektträger (13) und dem Auslassende des Durchlasses (26) angeordnet ist, umfasst, bei dem dem Filterkörper (12, 27) zunächst eine Filterkörpervorbenetzungsflüssigkeit zugeführt wird, um den Filterkörper (12, 27) vor dem Zuführen der zellentragenden Flüssigkeit zu benetzen, derart, dass eine flüssige Barriere zwischen der zellentragenden Flüssigkeit und dem Filterkörper (12, 27) geschaffen wird.

Description

Die Erfindung liegt auf dem allgemeinen Gebiet der medizinischen Laborausrüstung und befasst sich mit Cytozentrifugen, d.h. Apparaturen zur zentrifugalen Abscheidung von Zellen aus einer flüssigen Suspension derselben auf Mikroskopobjektträger. So betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Betreiben einer Cytozentrifuge, einen Einsatz für eine Cytozentrifuge sowie einen Cytozentrifugenrotor für die Verwendung in einer Cytozentrifuge.

Apparaturen der betreffenden Art sind bisher entwickelt worden und werden häufig verwendet. Die bekannteste Cytozentrifuge ist möglicherweise die „Cytospin", hergestellt von oder unter Leitung der Firma Shandon Southern Products Limited, Rancorn, England, wie dargestellt von Gordon, US-Patent Nr. US 4,391,710 vom 5. Juli 1983 und von Griffin, Nr. US 4,678, 579 vom 7. Juli 1987. Dort wird, wie in anderen Apparaturen der in Frage kommenden Art, wie z.B. in der DE 91 05 115 U1 offenbart, eine flüssige Suspension von Zellen, die auf einem Mikroskopobjektträger abzuscheiden sind, in eine Probenkammer einer Cytozentrifugiervorrichtung bzw. eines Einsatzes eingebracht, die bzw. der normalerweise zum Einbau in eine Zentrifuge ausgelegt ist, in welcher mehrere derartiger Einsätze aufnehmbar sind, die jeweils mit einer Probenkammer, einer Filterkörperhaltung und einer Objektträgerhalterung ausgestattet sind, so dass mehrere Mikroskopobjektträger gleichzeitig präparierbar sind, wobei die flüssige Zellensuspension unter der Zentrifugalkraft von der Probenkammer zur Objektträgerfläche durch eine Öffnung in einem Filterkörper hindurch geleitet wird, welcher gegen die Aufnahmefläche des Objektträgers festgeklemmt ist, um sowohl soweit wie möglich eine Abdichtung gegen seitliches Austreten und den dadurch entstehenden Verlust an der zellentragenden Flüssigkeit mit ihren Zellen vorzusehen, als auch die flüssige Komponente einer derartigen zellentragenden Flüssigkeit bei der Abscheidung der Zellen auf den Objektträger zu absorbieren.

Alan J. Gordon, der Erfinder zum vorstehend erwähnten US-Patent Nr. US 4,391,710 , verbesserte bereits bestehende Maschinen für die Firma Shandon in verschiedener Hinsicht, hauptsächlich durch den Einbau von Klemmeinrichtungen für Objektträger und Filterscheiben als Teil einer Probenkammereinheit, welche einheitlich (zusammen mit den Klemmeinrichtungen) aus einem Zentrifugierrotor der Cytozentrifuge entfernbar ist.

In einigen Fällen ist vor dem Zentrifugieren auf eine Vorbenetzung des flüssigkeitsabsorbierenden Filterkörpers zurückgegriffen worden, um seine anziehende Wirkung auf die zum Mikroskopobjektträger vorbeilaufende, zellentragende flüssige Probe mit der dadurch entstehenden Ableitung in den Filterkörper unter Verlust von Zellen, bevor diese am Objektträger festhalten können, auf ein Minimum zu reduzieren.

In zusätzlicher Weise ist in der Vergangenheit bei zentrifugierenden chemischen Analysatoren und Cytozentrifugen die Verwendung einer Probenkammer versucht worden, deren Tiefe normalerweise, ausgenommen unter der Zentrifugierwirkung, ein Ausströmen von Flüssigkeit eindämmt; siehe insbesondere den Artikel von N. G. Anderson mit dem Titel "The Development of Fast Analyzers", Z. Anal. Chem. 257-271 (1972) bzw. Wells, US-Patent Nr. US 4,428,323 vom 31. Januar 1984.

Vor der Entwicklung von Cytozentrifugen, welche sich einer Zentrifugalkraft bedienen, um eine Probe einer zellentragenden Flüssigkeit zu einem Mikroskopobjektträger hin und auf diesen zu treiben, wurde das Auftragen von Zellen auf Mikroskopobjektträgern durch Sedimentationstechniken unter Nutzung der Schwerkraft zum Aufströmen von Proben einer zellentragenden Flüssigkeit auf die Objektträger durchgeführt; siehe den Artikel in Acta Cytologica 8, 234-241 (1964) von G. Th. A. M. Bots und Mitarbeitern.

Heutige Cytozentrifugen sind bedeutend leistungsfähiger als die Sedimentationstechniken. Dies wird durch die Anwendung hoher Zentrifugiergeschwindigkeiten erzielt, wobei die Sedimentationsgeschwindigkeit von Zellen, die in der zellentragenden Flüssigkeit suspendiert sind, auf den Objektträger erheblich größer ist, als die hydraulischen Kräfte, die seitlich an der Objektträgerfläche ausgeübt werden, auf welchen die Zellen abzuscheiden sind.

In der Praxis bedienen sich die heutigen Anlagen eines Kompromisses zwischen der das Flüssigkeitsaufnahmevermögen bestimmenden Filterkörperdicke und zu einer bequem handzuhabenden Klemmkraft, die während des Zentrifugierens den Filterkörper gegen den Objektträger hält. Dies begrenzt den Bereich der Einsatzmöglichkeiten gegenwärtiger Anlagen bezüglich der Ausführbarkeit. Wenn z.B. eine sehr langsame Strömungsgeschwindigkeit der Flüssigkeit in dem Filterkörper zusammen mit einer zweckmäßigen Klemmfederkraft erwünscht wird, muss ein sehr dünner Filterkörper verwendet werden. Unter diesen Bedingungen ist die Menge der Probe eingeschränkt auf das Volumen der Flüssigkeit, welches ein derartiger Filterkörper aufnehmen kann. Wird mit einer größeren Menge der Probenflüssigkeit gearbeitet, sollte ein relativ dicker Filterkörper eingesetzt werden, um die größere Menge der flüssigen Komponente der flüssigen Probe aufzunehmen und zu halten, jedoch kann dann die Strömungsgeschwindigkeit zu schnell sein, um eine gute Zellenrückgewinnung zu gestatten.

Ein Verlust von Zellen findet auch beim Übergang vom Ruhezustand der beschickten Probenkammer zum endgültigen konstanten Zustand der Betriebsgeschwindigkeit statt. Ein derartiger Verlust ist am größten, wenn die Probenflüssigkeit vor dem Anfang des Zentrifugierens mit dem Filterkörper in Berührung kommt. Ein seitliches Ausströmen in den Filter findet ohne ein Zentrifugieren statt, insofern dieses von der Klemmkraft, den Filtereigenschaften und der geometrischen Form der Anlage gestattet wird. Ohne eine Zentrifugalkraft zum Sedimentieren der Zellen auf den Objektträger neigen die Zellen dazu, zusammen mit der Flüssigkeit in den Filter hineinzuströmen. Wenn unter diesen Bedingungen ein größerer Teil der Probe in den Filter hineinströmt, kann ein entsprechend großer Teil der Zellen verloren gehen. Es ist deshalb erkannt worden, dass ein Mittel zum Verhindern eines vorzeitigen Kontaktes der flüssigen Probe mit dem Filterkörper vorgesehen werden muss. Alan J. Gordon ( US 4,391,710 ) erzielte dies für die Firma Shandon durch das Vorsehen einer kippbaren Kammer. Dagegen wurde von John Wells ( US 4,428,323 ) eine Vertiefung für die Probenflüssigkeit als Damm gegen ein vorzeitiges Freigeben einer derartigen Probe vorgesehen, wie dies N. G. Anderson für den sogenannten „Fast Analyzer" tat. Die benötigte Kraft und somit die Lieferungsgeschwindigkeit wird von der Tiefe der Vertiefung und der Neigung des Damms bestimmt. Eine derartige Vertiefung ist beispielsweise auch aus der DE 36 39 041 A1 bekannt.

Gemäß US 4,696,743 wird die Strömungsgeschwindigkeit beim Abfließen der überschüssigen Flüssigkeit zum Filterkörper durch das selektive Einschränken der Strömungsbahnen in den Filter konstant gehalten, um zu verhindern, dass bereits an dem Objektträger abgeschiedene Zellen von dem Filter absorbiert werden. Die Einschränkung der Strömungsbahnen wird durch Ausnehmungen in dem Filterkörper erreicht.

Die EP 0 126 429 A2 schlägt zum Absaugen von Zellen aus der zellentragenden Probe eine Lösung gänzlich ohne die Verwendung eines Filterkörpers zwischen Durchlass und Objektträger vor, wobei zum Absaugen von überschüssiger Flüssigkeit ein Absaugkanal separat zu dem Durchlass 68 in der Cytozentrifugiervorrichtung bzw. dem Einsatz gebildet ist.

Mit den vorstehenden Maßnahmen wird ein Zellenverlust beim Übergang erheblich verringert, doch tritt dieser immer noch in unerwünschtem Ausmaß auf. Sogar mit dem System von John Wells wird beim Anfahren die Flüssigkeit über den Damm und in die davon wegführende Strömungsleitung hinein getrieben. Beim Anfahren stürzt sich die zellentragende Probenflüssigkeit in die leere Strömungsleitung hinein. Da die Zellen in der Probenflüssigkeit gleichmäßig suspendiert sind, verursacht der anfängliche Kontakt mit dem Filterkörper eine Absorption von zellenenthaltender Flüssigkeit.

Eine weitere Ursache von Zellenverlust besteht während der Nassfixierung, nachdem die Zellen auf dem Objektträger eingesammelt worden sind. Normalerweise werden die eingesammelten Zellen mit einer wässrigen alkoholischen Fixierlösung eingesprüht oder es wird der Objektträger in diese eingetaucht. Die restliche Flüssigkeit auf dem Objektträger wirkt auf die Fixierlösung ein, was zusammen mit den beim Auftragen der Lösung auftretenden Kräften oftmals zu einer Verschiebung von ansonsten festhaftenden Zellen auf dem Objektträger führt.

Einige Hersteller empfehlen die Zugabe einer Fixierflüssigkeit in die Probenkammer nach der Zugabe der zellenenthaltenden flüssigen Probe, so dass die Zellen während des Zentrifugierens fixiert werden. Jedoch sind keine Maßnahmen zum Trennen des Fixiermittels von der Probe vorgesehen und die Zellen werden vor dem Einsammeln auf dem Objektträger fixiert. Dies ergibt Zellen, welche sich nicht in zweckmäßiger Weise flachlegen und deshalb nicht gut am Objektivträger haften, wodurch eine schlechte morphologische Anordnung und ein Zellenverlust entstehen. Es gibt zur Zeit keine Ausrüstung, welche während des Zentrifugierens nach der Zellensedimentation eine Fixierung an Ort und Stelle vorsieht.

Es ist die allgemeine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zum Betreiben einer Cytozentrifuge, eine Cytozentrifugiervorrichtung bzw. einen Einsatz für eine Cytozentrifuge sowie einen Cytozentrifugenrotor zu schaffen, durch das/die/den in einfacher Weise die Zellenverluste noch weiter minimiert werden können.

Diese Aufgabe wird jeweils durch die Merkmale der unabhängigen Ansprüche 1, 8 und 28 gelöst. Vorteilhafte Ausführungsformen ergeben sich aus den jeweiligen Unteransprüchen.

Durch die Erfindung werden Cytozentrifugierapparaturen und -verfahren weiter verbessert, um ein maximales Einfangen von Zellen auf dem Mikroskopobjektträger zu erzielen, zu dem die zellentragende Flüssigkeit von der entsprechenden Probenkammer unter dem Antrieb von Zentrifugalkraft geführt wird, während die flüssige Komponente der flüssigen Probe nach dem Abscheiden der Zellen auf dem Objektträger in einwandfreier Weise aufgenommen wird.

Dies ist durch das Vorsehen einer verbesserten Cytozentrifugiervorrichtung bzw. einem verbesserten Einsatz zur Verwendung mit einer Cytozentrifuge erzielt worden, wobei die Vorrichtung mehrere flüssigkeitsaufnehmende Kammern in Reihenanordnung aufweist, die mit und entlang eines gemeinsamen Durchlasses in Verbindung stehen, der zu einem Mikroskopobjektträgerhalter führt, der zum Teil von der Vorrichtung und zum Teil von der vom Rotor getragenen Klemmeinrichtung vorgesehen wird, und eine Einrichtung, die einen flüssigkeitsabsorbierenden Filterkörper flüssigkeitsabgedichtet gegen die gegenüberliegende Fläche eines vom Objektträgerhalter gehalterten Objektträgers aufnimmt und haltert, quer über das Austragende des Durchlasses in der Weise eingesetzt ist, dass sie innerhalb des Objektträgerhalters liegt. Es sind mindestens zwei der flüssigkeitsaufnehmenden Kammern hintereinander entlang des Durchlasses angeordnet, wobei die Einsätze selbst in üblicher Mehrfachweise im Rotor einer Cytozentrifugiermaschine angeordnet sind.

Die Kammern können von jeglicher Art sein, die zum aufeinanderfolgenden Austragen ihrer enthaltenen Flüssigkeit in den Durchlass unter Zentrifugierbedingungen angeordnet sind, solange mindestens zwei davon vorhanden sind. Vorzugsweise ist in jeder Vorrichtung die in Reihenfolge am nächsten zur Filterkörperhalterung und zum Mikroskopobjektträgerhalter befindliche Kammer oberhalb der Leitung positioniert, wobei deren Boden offen ist und in den Durchlass mündet. Eine Vorbenetzungslösung für den Filterkörper wird in die Kammer eingeführt, um den Filterkörper vor dem Hindurchführen der zellentragenden flüssigen Probe zu benetzen, und um eine flüssige Barriere zwischen der zellentragenden Probenflüssigkeit und dem Filterkörper vorzusehen. Die Probenflüssigkeit wird vorzugsweise in die zweite in der Reihenfolge liegenden Kammer eingeführt, die sich unterhalb des Durchlasses als Vertiefung zum Dämmen einer Ausströmung von Flüssigkeit in den Durchlass, ausgenommen unter der Wirkung einer Zentrifugalkraft auf die Flüssigkeit, erstreckt.

Es ist ersichtlich, dass wenn eine Vorbenetzungsflüssigkeit für den Filterkörper in die Kammer eingeführt wird, welche sich am nächsten zur Filterkörperhalterung und dem Objektträgerhalter des Einsatzes befindet, diese der Filterkörper durch ein Vorbenetzen vor seinem Kontakt mit der zellentragen den flüssigen Probe vorkonditioniert. Wenn die zellentragende flüssige Probe den Filter erreicht, wird dieser Filter die im voraus strömende Flüssigkeit, welche keine Zellen enthält, bereits absorbiert haben und er wird ein seitliches Herausströmen der nachfolgenden zellentragenden Flüssigkeit weiter einschränken.

Da die zellentragende flüssige Probe in den Durchlass ausgetragen wird und durch diesen hindurchströmt, ehe die vorbenetzende Flüssigkeit vollkommen absorbiert worden ist, bildet die restliche vorbenetzende Flüssigkeit eine Barriere, welche die zellentragende Flüssigkeit daran hindert, mit dem Filterkörper in Kontakt zu kommen, bevor der endgültige konstante Zustand der Rotorgeschwindigkeit erreicht worden ist. Bei einer derartigen endgültigen Rotorgeschwindigkeit wird eine maximale Sedimentationsgeschwindigkeit der Zellen erreicht worden sein, wodurch ein seitliches Abzweigen von Zellen in den Filterkörper auf ein Minimum reduziert wird.

Der Filterkörper kann in der Weise hergestellt sein, dass er immer noch die flüssige Komponente der flüssigen Probe zu absorbieren vermag, obwohl er um die Öffnung herum dünner als üblich ausgebildet ist, durch die die Probenflüssigkeit fließt, nachdem die Zellen daraus durch Ausscheidung auf und Zurückhaltung durch die Oberfläche des Objektträgers extrahiert worden sind. Zu diesem Zweck wird ein neuer, doppelt dicker Filterkörper verwendet, welcher am Rand der Öffnung für die Flüssigkeitsströmung relativ dünn und ansonsten relativ dick ausgebildet ist, wobei dieses entweder durch Komprimieren einer Lage aus Filterkörpermaterial einer einfachen Dicke am Rand der hindurchführenden Öffnung oder durch Herstellen des Filterkörpers aus zwei Lagen aus Filterkörpermaterial mit nur dem gewünschten dickeren Teil des endgültigen Filterkörpers in doppelter Dicke erzielt wird. In alternativer Weise kann ein üblicher Filterkörper einfacher Dicke zusammen mit einem vorgesehenen Filterkörpereinpressring als Klemmfläche der Filterkörperklemmeinrichtung verwendet werden, so dass die Strömungsgeschwindigkeit der flüssigen Komponente der zellentragenden flüssigen Probe in den Filterkörper hinein begrenzt wird. Ein derartiger Einpressring lässt sich mit Vorteil mit einem Filterkörper jeglicher Art verwenden.

Weitere bauliche Merkmale der Erfindung, die zur Bequemlichkeit bei der Verwendung der Cytozentrifuge beitragen, sind:

1. Das Versehen jedes Einsatzes mit einer Filterkörperhalterung, die einstückig mit dem Körper des Einsatzes aus einem plastischen Material geformt ist, zum Entfernen sowie Ersetzen eines gebrauchten Filterkörpers, wenn der Einsatz wiederverwendet werden soll, oder die mit einem eingeformten oder fest darin gehaltenen Filterkörper zum Wegwerfen zusammen mit dem gesamten Einsatz nach Gebrauch vorgesehen ist, wobei hierzu Einrichtungen vorgesehen sind, welche ein Entfernen des Objektträgers ohne ein Zerstreuen der darauf abgelagerten Zellen gestatten.
2. Das Vorsehen eines federbetätigten Klemmmechanismus für die Filterkörperhalterung und den Objektträgerhalter, welcher leicht mittels eines handbetätigten Hebelarmes geöffnet werden kann und welcher eher fest als entfernbar zwecks wiederholter Verwendung mit auswechselbaren Einsätzen am Rotor befestigt sein kann oder vorzugsweise ist. Eine derartige Klemmeinrichtung wird daran gehindert, mit einem Objektträger aus Glas in Berührung zu kommen und diesen möglicherweise zu zerbrechen, wenn der Einsatz nicht vorhanden ist, der normalerweise nicht am Rotor eingesetzt wird, bevor ein Objektträger aus Glas in den an der Klemmeinrichtung vorgesehenen Teil des Objektträgerhalters eingesetzt worden ist.
3. Das Vorsehen einer automatischen Ausrichtung des Filterkörpers relativ zum Durchlass, durch den die zellentragende Probenflüssigkeit und eine andere Flüssigkeit oder Flüssigkeiten hindurchgeleitet werden.

Der mit mehreren Kammern versehene erfindungsgemäße Einsatz sieht nicht nur ein Vorbenetzen des Filterkörpers vor, bevor die zellentragende Probenflüssigkeit den Filterkörper und den Mikroskopobjektträger erreicht, sondern ermöglicht auch in vorteilhaften Weise ein Fixieren der Zellen auf dem Objektträger als Teil eines kontinuierlichen Zentrifugiervorganges. Somit kann eine Fixierflüssigkeit in die eine der mehreren Kammern eingeführt werden, welche auf die Probenkammer folgt, so dass aus dieser nach dem Strömen der flüssigen Probe ein nachfolgendes Ausströmen stattfindet.

Vom Gesichtspunkt eines Verfahrens aus betrachtet, sieht die Erfindung eine Verfahrensweise zum Betreiben der Cytozentrifuge vor, welche die Schritte umfasst, bei denen eine zellentragende flüssige Probe in eine der in einer Mehrzahl vorgesehenen Kammern eingeführt und eine den Filterkörper benetzende Flüssigkeit in die erste in Richtung zum Filterkörper und Objektträgerhalter hin in der Reihe liegende Kammer eingeführt wird, wobei zusätzlich in vorteilhaften Weiterbildung eine Kammer eingeführt werden kann, welche in der Reihe nach der Aufnahmekammer für die flüssige Probe folgt, wonach die Cytozentrifuge betätigt wird.

Eine Ausführungsweise der Erfindung in der Praxis ist in den beiliegenden Zeichnungen erläutert. Es zeigen:
1 eine Draufsicht auf einen erfindungsgemäßen Cytozentrifugenrotor mit mehreren Einsätzen darin;
2 einen teilweisen Senkrechtquerschnitt entlang der Linie 2-2 der 1, der in etwas größerem Maßstab gezeichnet ist und den Cytozentrifugenrotor der 1 darstellt, der gebrauchsfertig in einer Cytozentrifuge eingebaut ist;
3 einen vergrößerten rechten Teil der 2, der nur den Einsatz und die am Cytozentrifugenrotor befestigte Klemmeinrichtung zeigt;
4 eine Ansicht, die derjenigen der 3 entspricht, jedoch einer Ausführungsform mit einer dritten Kammer, die der zweiten Kammer der 2 ähnlich und in Reihe mit den beiden Kammern der 2 angeordnet ist;
5 eine detaillierte Perspektivansicht im Maßstab der 3 und 4, gesehen in Richtung zur Vorderseite und darstellend einen Filterkörper, der in eine Filterkörperhalterung eingesetzt ist, die als Teil des Einsatzes der 3 und 4 vorgesehen und zum Aufnehmen eines austauschbaren Filterkörpers üblicher Art ausgebildet und als einen solchen halternd dargestellt ist;
6 einen Senkrechtquerschnitt entlang der Linie 6-6 der 5, der in größerem Maßstab gezeichnet ist;
7 eine Ansicht, entsprechend derjenigen der 5; die jedoch einen Behälter für einen insgesamt wegwerfbaren Filterkörper und einen Filterkörper zeigt, wobei der Filterkörper gemäß einer Ausführungsform der Erfindung am Rand der mittleren Öffnung einen dünnen Teil aufweist und ansonsten dick ausgebildet ist;
8 einen Senkrechtquerschnitt entlang der Linie 8-8 der 7, der in dem größeren Maßstab der 6 gezeichnet ist.
In der in den 1 bis 4 sowie auch 5 und 6 dargestellten Ausführungsform sind erfindungsgemäße Einsätze 10 an einem Cytozentrifugenrotor 11 aufgenommen und Seite an Seite befestigt. Jeder der Einsätze 10 ist mit mehreren Kammern ausgebildet, d.h., dass mehrere, in diesem Falle zwei, flüssigkeitsaufnehmende Kammern nacheinander in Reihe angeordnet sind, um nacheinander in einen gemeinsamen Durchlass auszutragen, welcher zu einer Halterung für einen Filterkörper 12, 5 u. 6, o. 27, 7 u. 8, und zu einem Halter für einen Mikroskopobjektträger 13 in getrennten Klemmeinrichtungen, die am Rotor 11 befestigt sind, führt.
Der Rotor 11 ist entfernbar und wiedereinsetzbar an einer Cytozentrifuge 14, 2, drehbar gelagert, die in diesem Fall mit einer Nabe 15 versehen ist, die mit einer Feststellschraube 16 an der Antriebswelle 17a eines Elektromotors 17 befestigt ist, der mittels eines Bügels 18 an einem Ständer 19 eines Gehäuses 20 befestigt ist. Die Nabe 15 wird von einem mit einer Ausnehmung versehenen Anschlussstück 11a aufgenommen, welches zur Unterseite des Rotors 11 hin offen und mit einer Reihe von Umfangsnuten 11b zum Aufnehmen einer entsprechenden Reihe von Rippen 15a, die aus der Nabe 15 hervorragen, versehen ist. Ein Knopfgriff 21 ragt von einer Abdeckung 22 des Rotors 11 nach oben, um ein bequemes Entfernen und Wiedereinsetzen eines derartigen Rotors in die Cytozentrifuge 14 zu ermöglichen. Zwischen der Abdeckung 22 und dem Rotor 11 sind 0-Ringe 22a und 22b eingesetzt, um eine Abdichtung gegen ein Freigeben von biologisch gefährlichen Materialien vorzusehen.
Der Körper jedes der Einsätze 10, siehe 3, ist vorzugsweise einstückig aus einem geeigneten, starren plastischen Material wie Polypropylen hoher Dichte 35 geformt, um eine Kammer 23 zu bilden, die an ihrer Oberseite zur Aufnahme einer Probe einer zellentragenden Flüssigkeit offen ist, aus der so viele der Zellen wie möglich auf die gegenüberliegende vordere Fläche des Mikroskopobjektträgers 13 abgeschieden und auf dieser festgehalten werden sollen.
Der Mikroskopobjektträger 13 ist in entfernbarer Weise in einen Objektträgerhalter 24 eingesetzt, welcher vorzugsweise als Teil der vorstehend erwähnten Klemmeinrichtung vorgesehen ist und direkt hinter einer Filterkörperhalterung liegt, die hier als ein rechteckiger Behälter 25 dargestellt ist, in den der Filterkörper 12 in entfernbarer Weise durch dessen obere Öffnung 25a einsetzbar ist, 5 und 6.
Die Probenkammer 23 weist bezüglich eines Durchlasses 26, mit dem sie über eine seitliche Auslassöffnung 25a in einer Wand der Kammer mit der Filterkörperhalterung 25 verbunden ist, eine Vertiefung auf, welche als Damm gegen ein Ausströmen der in der Kammer enthaltenen Probenflüssigkeit, ausgenommen unter dem Einfluss von Zentrifugalkraft, dient. Die Austraggeschwindigkeit der Flüssigkeit aus der Kammer 23 wird vom Grad der Steigung der vorderen Wand 23b der Kammer bestimmt. Es ist zu beachten, dass eine Dämmanordnung für eine Kammer, die eine Flüssigkeit enthält, die nur unter der Wirkung von Zentrifugalkraft freizugeben ist, in dem vorstehend erwähnten US-Patent Nr. 4,428,328 vom 31. Januar 1984 von Wells dargestellt ist, während das Neigen der dämmenden Wand 22b vom Inneren der Vertiefung nach außen, um die Austraggeschwindigkeit von Flüssigkeit zu steuern, im vorstehend erwähnten Stand der Technik von N. G. Anderson "Fast Analyzer" dargestellt ist.
Der Durchlass 26 führt von der Auslassöffnung 23a der Kammer 23 zur mittleren Fläche der Filterkörperhalterung 25. Der Filterkörper, siehe 12, kann aus seiner Halterung 25 entfernbar und in diese wieder einsetzbar sein, wie in 1 bis 6, oder es kann der Filterkörper in eine Filterkörperhalterung alternativer Ausführung eingeformt oder fest eingesetzt sein, wie bei dem in 7 und 8 gezeigten Filterkörper 27 doppelter Dicke. In beiden Fällen ist der Filterkörper 12, 27 mit vorzugsweise einer mittleren Öffnung, 12a und 27a, versehen, durch die die Flüssigkeit aus der Probenkammer hindurchfließen muss, um die gegenüberliegende Fläche des Objektträgers zu erreichen.
Die relativen Größen der Zellensedimentationsgeschwindigkeit und der seitlichen Flüssigkeitsströmung bestimmen, ob eine bedeutende Anzahl der Zellen in der aus der Probenkammer kommenden Probenflüssigkeit dem Objektträger verloren geht, indem sie in seitlicher Richtung in den Filterkörper eintreten, ehe sie mit der gegenüberliegenden Fläche des Mikroskopobjektträgers in Berührung kommen oder sogar nachdem sie mit dieser in Berührung kommen, jedoch nicht an dieser festhaften. Um den Verlust an Zellen in den Filterkörper hinein auf ein Minimum zu reduzieren, sollte die Sedimentationsgeschwindigkeit der Zellen auf den Objektträger die Fortpflanzungsgeschwindigkeit der flüssigen Komponente in seitlicher Richtung in den Filterkörper hinein übertreffen.
Um dies zu erzielen, wird es vorgezogen, dass der Filterkörper zwecks Extrahierung der Flüssigkeit am Rande der durchgehenden Öffnung relativ dünn und zwecks Erhaltung der Flüssigkeit weiter außen relativ dick ausgebildet ist. Jedoch können übliche Einfachlagen-Filterkörper verwendet werden und es kann in beiden Fällen eine scharfkantige kreisringförmige Stufe 26a entweder als Klemmfläche des Klemmvorsprungs 26b oder auf dieser am Austragende des Durchlasses 26 vorgesehen sein, siehe 4, oder es kann die Klemmfläche oder der Vorsprung 26b flach bleiben, wie in 3.
Die Klemmeinrichtung 28 ist zur Befestigung am Rotor 11 vorgesehen und vorzugsweise, wie in 1 bis 4 gezeigt, ausgebildet. Wie dargestellt, weist sie ein Paar Klemmarme 29 auf, die an einer Welle 30 befestigt sind, die drehbar in und zwischen nach oben ragenden Elementen 31a einer Grundplatte 31 eingesetzt ist, die am Rotor 11 z.B. mit Schrauben 31c, 3 und 4, fest befestigt ist, die vorzugsweise mit Dichtungen wie 0-Ringen (nicht dargestellt) versehen sind, die zwischen dem Rotor und den Schraubenköpfen eingesetzt sind, um biologisch gefährliche Materialien innerhalb des geschlossenen Rotors einzuschließen. Die Arme 29 werden normalerweise in einer Klemmstellung gegen eine Filterkörperklemmplatte 26c gehalten, die sich in Querrichtung von dem Durchlass 26 aus erstreckt. Ein paar Schraubenfedern 32, s. insbes. 1, von denen jeweils eine an einem der einander gegenüberliegenden Endteile der Welle 30 vorgesehen ist, weisen jeweilige Enden 32a auf, die gegen die Klemmarme 29 anliegen und diese zur Klemmplatte 26c hin und gegen diese andrücken. Zum Freigeben des Klemmdruckes ist die Welle 30 mit einem an einem ihrer Enden fest befestigten Griff 33 zum Handhaben durch den Benutzer versehen, wenn die Vorrichtung 20 aus dem Rotor 11 entfernt werden soll. In Fällen, in denen der Filterkörper in seinem Haltebehälter 25 befestigt ist, z.B. durch Formen des Behälters um diesen herum, wie in 7 oder 8, oder in den Haltebehälter 25 eingeführt ist und von diesem in nicht entfernbarer Weise festgehalten wird, wird der gesamte Einsatz 10 aus seiner Grundplattenhalterung 31 im Rotor 11 entfernt und nach dem Abscheiden der Zellen auf den Objektträger beseitigt. Die Klemmeinrichtung 28 verbleibt zwecks weiterer Benutzung am Rotor 11 befestigt.
Ausnehmungen 25b sind jeweils an Filterkörperhalteelementen 25c vorgesehen, die sich entlang des oberen und unteren Teils des Filterkörperhaltebehälters 25 erstrecken, um ein Abschaben von Zellen zu verhindern, die beim Zentrifugieren auf einem Objektträger 13 abgelagert worden sind, wenn der Einsatz 10 nach dem Zentrifugieren aus dem Rotor 11 entfernt wird.
Zwei Stifte 26d sind an dem Durchlaß 26 vor den Klemmarmen 29 vorgesehen und erstrecken sich in Querrichtung von diesem hinweg zum Zurückziehen des Einsatzes 10 aus einer Festklemmstellung, wenn der Hebel 33 am Ende eines Zentrifugiervorgangs niedergedrückt wird.
Die zweite Kammer 34 ist oberhalb des Durchlasses 26 positioniert und an ihrem Boden offen und mündet in den Durchlass ein, wie bei 34a. Sie befindet sich näher an der Filterkörperhalterung als die Probenkammer 23. Die offenen oberen Seiten der beiden Kammern 23 und 34 werden normalerweise mit einer langgestreckten einführbaren Kappe 35 fest verschlossen, nachdem sie mit ihren jeweiligen Flüssigkeiten gefüllt worden sind.
Eine Filterkörper-Benetzungsflüssigkeit, z.B. eine Salzlösung, wird in die Kammer 34 eingeführt, deren Größe zum Aufnehmen von nur wenigen Tropfen der Benetzungsflüssigkeit, typischerweise zweihundert Mikroliter, bemessen ist, so dass die Oberflächenspannung eine Hin- und Herbewegung der Benetzungsflüssigkeit im Durchlass 26 verhindert, ausgenommen wenn eine Zentrifugalkraft einwirkt, wobei dann die Flüssigkeit vor der flüssigen Probe aus der Kammer 23 zur Öffnung 12a oder 27a hin und in diese hineinfließt.
Es ist zu beachten, dass anders als in Fällen, in denen eine Vorbenetzungsflüssigkeit auf Filterkörper von Cytozentrifugen nach dem Stand der Technik aufgetragen worden ist, hier ein Auftragen der Vorbenetzungsflüssigkeit als Teil eines kontinuierlichen Durchlaufs der Zentrifuge zum Vorbenetzen des Filters sowie auch zum Bilden einer Barriere zwischen der zellentragenden Probenflüssigkeit und dem Filterkörper stattfindet.
Wenn eine dritte Kammer 36, 4, ähnlich der Kammer 23 in Reihe mit den Kammern 23 und 34 vorgesehen ist, wird die vordere Kammer 34 für die Vorbenetzungslösung verwendet, während die Kammer 23 für die Probenflüssigkeit und die letzte Kammer 36 für eine Fixierlösung wie 50%igem wäßrigen Alkohol zum Fixieren der Zellen auf den Objektträger verwendet wird.
Der Filterkörper 27 der 7 und 8 wird in zweckmäßiger Weise hergestellt durch Komprimieren des Randbereiches einer Lage aus Filterkörpermaterial, die dicker als üblich ist, zur Bildung eines relativ dünnen und dichten Teils 27b rings um die mittlere Öffnung 27a herum, und eines relativ dicken und porösen Teils 27c als restlichem Filterkörper, er kann jedoch auch durch Aufeinanderlegen von zwei Filterkörpern hergestellt werden.

Claims

Verfahren zum Betreiben einer Cytozentrifuge (14) mit wenigstens einem Einsatz (10) zum Abscheiden und Festhaften unter Zentrifugalkraft in Radialrichtung von Zellen aus einer zellentragenden Flüssigkeit auf einem Mikroskopobjektträger (13), wobei der wenigstens eine Einsatz (10) einen Durchlass (26) und einen Filterkörper (12, 27), der zwischen dem Mikroskopobjektträger (13) und dem Auslassende des Durchlasses (26) angeordnet ist, umfasst, bei dem dem Filterkörper (12, 27) zunächst eine Filterkörpervorbenetzungsflüssigkeit zugeführt wird, um den Filterkörper (12, 27) vor dem Zuführen der zellentragenden Flüssigkeit zu benetzen, derart, dass eine flüssige Barriere zwischen der zellentragenden Flüssigkeit und dem Filterkörper (12, 27) geschaffen wird.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die zellentragende Flüssigkeit in eine Kammer (23) einer Reihe von Kammern (36, 23, 34) eingeführt wird, die sich entlang des Durchlasses (26) erstrecken und in diesen einmünden.
Verfahren nach Anspruch 2, bei dem die Filtervorbenetzungsflüssigkeit in eine Kammer (34) der Reihe von Kammern (36, 23, 34) eingeführt wird, die in der Reihe der Kammern (36, 23, 34) in Richtung zum Filterkörper (12, 27) hin an erster Stelle liegt, und die in der Reihe vor der Kammer (23) liegt, in der die zellentragende Flüssigkeit eingeführt wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem nach dem Einleiten der zellentragenden Flüssigkeit in den Durchlass (26) zusätzlich eine Zellenfixierlösung in den Durchlass (26) eingeleitet wird.
Verfahren nach Anspruch 4, bei dem die Zellenfixierlösung in eine Kammer (36) der Reihe von Kammern (36, 23, 34) eingeführt wird, die in der Reihe als nächste nach der Kammer (23) liegt, in der die zellentragende Flüssigkeit eingeführt wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem nach dem Einführen der zellentragenden Flüssigkeit in die Kammer (23) und dem Einführen der Vorbenetzungsflüssigkeit in die Kammer (34) die Cytozentrifuge (14), oder nach dem Einführen der zellentragenden Flüssigkeit in die Kammer (23) und dem Einführen der Vorbenetzungsflüssigkeit in die Kammer (34) und dem Einführen der Zellenfixierlösung in die Kammer (36) die Cytozentrifuge (14) betätigt wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem der Filterkörper (12, 27) um den Rand einer Öffnung in dem Filterkörper (12, 27) herum zusammengedrückt gehalten wird, durch die die zellentragende Flüssigkeit unter Zentrifugierbedingungen geleitet wird.
Einsatz (10) für eine Cytozentrifuge (14) zum Abscheiden unter Zentrifugalkraft von Zellen aus einer zellentragenden Flüssigkeit auf einen Mikroskopobjektträger (13), aufweisend – einen Durchlass (26), um die zellentragende Flüssigkeit unter Zentrifugalkraft in Radialrichtung zu führen, – eine erste flüssigkeitsaufnehmende Kammer (23), die am Durchlass (26) angeordnet ist und eine in den Durchlass (26) mündende Auslassöffnung (23a) aufweist, dadurch gekennzeichnet, dass wenigstens eine zweite flüssigkeitsaufnehmende Kammer (34) mit einer in den Durchlass (26) mündenden Auslassöffnung (34a) vorgesehen ist, wobei die erste Kammer (23) und die zwei Kammer (34) hintereinander entlang des Durchlasses (26) angeordnet sind, und mit entlang des gemeinsamen Durchlasses (26) in Verbindung stehen.
Einsatz (10) nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die zweite flüssigkeitsaufnehmende Kammer (34) oberhalb des Durchlasses (26) positioniert ist, wobei deren Boden offen ist und in den Durchlass (26) mündet.
Einsatz (10) nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass die zweite Kammer (34) in Reihe als die nächste zur ersten Kammer (23) angeordnet ist.
Einsatz (10) nach einem der Ansprüche 8 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die zweite Kammer (34) zur Aufnahme einer den Filterkörper (25) benetzenden Flüssigkeit vorgesehen ist und näher zum Mikroskopträger (13) angeordnet ist, als irgendeine andere.
Einsatz (10) nach einem der Ansprüche 8 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass die erste Kammer (23) zur Aufnahme der zellentragenden Flüssigkeit vorgesehen ist.
Einsatz (10) nach einem der Ansprüche 8 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass eine dritte flüssigkeitsaufnehmende Kammer (36) vorgesehen ist, die in Reihe mit der ersten Kammer (23) und der zweiten Kammer (34) angeordnet ist.
Einsatz (10) nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die dritte Kammer (36), die in der Reihe als nächste nach der Kammer (23) liegt, in der die zellentragende Flüssigkeit eingeführt ist, zur Aufnahme einer Zellenfixierlösung vorgesehen ist.
Einsatz (10) nach einem der Ansprüche 8 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass die erste Kammer (23) und/oder die zweite Kammer (34) und/oder die dritte Kammer (36) jeweils eine derartig unterhalb der Verbindung mit dem Durchlass (26) liegende Tiefe aufweisen, dass eine Vertiefung gebildet ist, die das Austragen von Flüssigkeit aus der jeweiligen Kammer (23, 34, 36) dämmt, ausgenommen unter der Wirkung von Zentrifugalkraft auf die Flüssigkeit innerhalb der jeweiligen Kammer (23, 34, 36).
Einsatz (10) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Durchlass (26) im Wesentlichen waagrecht verläuft, so dass eine aus den Kammern (23, 34, 36) in den Durchlass (26) ausgetragene Flüssigkeit, außer unter der Einwirkung von Zentrifugalkraft, von der Oberflächenspannung daran gehindert wird, entweder nach vorne oder nach hinten zu strömen.
Einsatz (10) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass ein Filterkörper (12, 27) vorgesehen ist, der zwischen einem Auslassende in Richtung der Zentrifugalkraft des Durchlasses (26) und dem Mikroskopobjektträger (13) angeordnet ist.
Einsatz (10) nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass der Filterkörper (12, 27) eine durchgehende Öffnung (12a, 27a) für eine Flüssigkeitsströmung aufweist.
Einsatz (10) nach einem der Ansprüche 17 oder 18, dadurch gekennzeichnet, dass eine Halterung (25) für den Filterkörper (12, 27) vorgesehen ist, um den Filterkörper (12, 27) gegen den Mikroskopobjektträger (13) anzudrücken.
Einsatz (10) nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Halterung (25) für den Filterkörper (12, 27) aus einem Filterkörper-Halterungsbehälter mit Filterkörper-Halterungselementen (25c) entlang seinem unteren und oberen Teil besteht.
Einsatz (10) nach Anspruch 19 oder 20, dadurch gekennzeichnet, dass der Filterkörper (12, 27) herausnehmbar in der Halterung (25) anordenbar ist.
Einsatz (10) nach Anspruch 20 oder 21, dadurch gekennzeichnet, dass die Filterkörper-Halterungselemente (25c) entlang eines Teiles ihrer Längen, der etwas länger als die Breite des Austragendes des Durchlasses (26) ist, mit Ausnehmungen (25b) versehen sind, um ein Abwischen von Zellen von der gegenüberliegenden Fläche eines Mikroskopobjektträgers (13) zu verhindern.
Einsatz (10) nach einem der Ansprüche 17 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass der Filterkörper (12, 27) einen dünneren, die Öffnung (12a, 27a) umgebenden Randbereich und einen verbleibenden dickeren Teil als Reservoir für vom Filterkörper (12, 27) aufgenommene Flüssigkeit aufweist.
Einsatz (10) nach Anspruch 19 bis 23, dadurch gekennzeichnet, dass am Durchlass (26) und quer zu diesem verlaufend unmittelbar hinter seinem Auslassende eine Klemmplatte (26c) als Teil der Filterkörperhalterung (25) zum Einsetzen in den Filterkörperhalterungsbehälter gegen einen darin befindlichen Filterkörper (12, 27) befestigt ist.
Einsatz (10) nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, dass die Klemmplatte (26c) als ein umtaufendes Flanschteil ausgebildet ist, welches in einer entsprechend vorgeformten Einpressstelle (27b), die um die Flüssigkeitsströmungsöffnung (27a) im Filterabsorptionskörper (27) gebildet ist, anordenbar ist, um den Filterabsorptionskörper (27) an der Einpressstelle (27b) gegen den Mikroskopobjektträger (13) anzudrücken.
Einsatz (10) nach Anspruch 24 oder 25, dadurch gekennzeichnet, dass die Klemmplatte (26c) als gestufter Ring ausgebildet ist.
Einsatz (10) nach einem der Ansprüche 19 bis 26, dadurch gekennzeichnet, dass die Filterkörperhalterung (25) eine Einschnappeinrichtung zum Aufnehmen und Halten der Klemmplatte (26c) aufweist.
Cytozentrifugenrotor (11) für die Verwendung in einer Cytozentrifuge (14) mit wenigstens einem Einsatz (10) nach einem der Ansprüche 8 bis 27.
Cytozentrifugenrotor (11) nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, dass für jeden Einsatz (10) eine Klemmeinrichtung (28) vorgesehen ist, durch welche der jeweilige Einsatz (10) am Cytozentrifugenrotor (11) lösbar befestigt ist.
Cytozentrifugenrotor (11) nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, dass die Klemmeinrichtung (28) wiederum von dem Cytozentrifugenrotor (11) gegen ein Entfernen gesichert ist, wenn der ihr zugeordnete Einsatz (10) entfernt wird.
Cytozentrifugenrotor (11) nach einem der Ansprüche 28 oder 29, dadurch gekennzeichnet, dass die Klemmeinrichtung (28) eine Mikroskopobjektträger-Halterung (24) für einen Mikroskopobjektträger (13) aufweist, mit einem aufrechtstehenden Wandelement, welches sich quer zum Durchlass (26) eines aufgenommenen Einsatzes (10) erstreckt und dazu ausgelegt ist, einen Mikroskopobjektträger (13) entlang seiner vorderen Fläche aufzunehmen, die der Filterkörperhalterung (25) gegenüberliegt.
Cytozentrifugenrotor (11) nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, dass das Wandelement einen sich nach vorne erstreckenden Teil aufweist, der ein Grundelement mit aufrechtstehenden Enden aufweist, die sich im Abstand von der vorderen Fläche des Wandelementes befinden, um die Filterkörperhalterung (25) des Einsatzes (10) aufzunehmen und zu haltern.
Cytozentrifugenrotor (11) nach einem der Ansprüche 28 bis 32, dadurch gekennzeichnet, dass die Klemmeinrichtung (28) eine Welle (30) aufweist, die drehbar in und zwischen den aufrechtstehenden Enden des Grundelementes gelagert ist, ein Paar Klemmarme (29), die an der Welle (30) befestigt sind und sich nach oben erstrecken, um dazwischen den Durchlassteil des Einsatzes (10) aufzunehmen und um gegen die Filterkörperhalterung (25) des aufgenommenen Einsatzes (10) anzuliegen.
Cytozentrifugenrotor (11) nach Anspruch 33, dadurch gekennzeichnet, dass eine Federeinrichtung an der Welle (30) zum Ausüben eines Klemmdruckes auf die Arme (29) angeordnet ist.
Cytozentrifugenrotor (11) nach einem der Ansprüche 33 oder 34, dadurch gekennzeichnet, dass ein langgestreckter Griff (33) vorgesehen ist, der mit einem Ende an einem Endteil der Welle (30) als Hebel zum Drehen der Welle (30) in einer Richtung zum Zurückziehen des aufgenommenen Einsatzes (10) aus der Objektträgerhalteeinrichtung (13).
Cytozentrifugenrotor (11) nach einem der Ansprüche 33 bis 35, dadurch gekennzeichnet, dass der Einsatz (10) ein Paar Stiftelemente (26d) aufweist, die sich von gegenüberliegenden Seiten des Durchlasses (26) nach außen in den Weg der Klemmarme (29) hinein während deren Zurückziehung erstrecken, um den aufgenommenen Einsatz (10) mit seiner eingesetzten Filterkörperhalterung (25) zurückzuziehen, wenn es erwünscht ist, den aufgenommenen Einsatz (10) vom Cytozentrifugenrotor (11) zu entfernen und den Mikroskopobjektträger (13) von der Mikroskopobjektträger-Halterung (24) der Klemmeinrichtung (28) zu entfernen.