DE3887793T2

DE3887793T2 - 5-Amino- oder substituierte Amino-1,2,3-Triazole, verwendbar als Antiproliferativa.

Info

Publication number: DE3887793T2
Application number: DE3887793T
Authority: DE
Inventors: Lawrence Argenbright; Barbara A Azzolina; Nancy Behrens; Donald Hupe
Original assignee: Merck and Co Inc
Current assignee: Merck and Co Inc
Priority date: 1987-08-20
Filing date: 1988-08-11
Publication date: 1994-07-28
Anticipated expiration: 2008-08-12
Also published as: EP0304221A3; DE3887793D1; HK107596A; US4847257A; IE882551L; PT88275A; EP0304221A2; ZA886125B; EP0304221B1; AU612172B2; DK465488D0; KR890003385A; IL87421A0; ATE101513T1; CA1325977C; IL87421A; DK175915B1; NZ225770A; CY1954A; IE61719B1

Description

5-Amino- oder substituierte Amino-1,2,3-triazole sind als Antikokzidosemittel bekannt. Als solche wurden die Verbindungen und ihre Herstellungsverfahren in der U.S. Patentschrift 4 590 201, ausgegeben am 20. Mai 1986 an Richard J. Bachis, John C. Chabala und Micheal H. Fisher, beschrieben.
Durch Testen an anerkannten in vivo-Modellen waren wir in der Lage zu zeigen, daß diese Amino-1,2,3-triazol-Analoga bei der Behandlung bestimmter Krebsarten, die den Transport einzelner Zellen von einem metastasierenden Tumor zu anderen Geweben umfassen, wirksam sein könnten.
Demgemäß ist es Aufgabe dieser Erfindung, eine neue Anwendung solcher Verbindungen zur Behandlung bestimmter Krebsarten bereitzustellen.

B. AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die Erfindung betrifft die Verwendung einer Verbindung der folgenden Strukturformel:
worin:
steht,
worin p eine Zahl von 0 bis 2 bedeutet, m eine Zahl von 0 bis 4 bedeutet und n eine Zahl von 0 bis 5 bedeutet, X für O, S, SO, SO&sub2;, CO, CHCN, CH&sub2; oder C=NR&sub6; steht, worin R&sub6; Wasserstoff, Niedrigalkyl, Hydroxy, Niedrigalkoxy, Amino, Niedrigalkylamino, Diniedrigalkylamino oder Cyano bedeutet;
R&sub4; und R&sub5; unabhängig für Halogen, Cyano, Trifluormethyl, Niedrigalkanoyl, Nitro, Niedrigalkyl, Niedrigalkoxy, Carboxy, Carbalkoxy, Trifluormethoxy, Acetamido, Niedrigalkylthio, Niedrigalkylsulfonyl, Trichlorvinyl, Trifluormethylthio, Trifluormethylsulfinyl oder Trifluormethylsulfonyl stehen;
R&sub2; Amino, Mono- oder Diniedrigalkylamino, Acetamido, Acetimido, Ureido, Formamido, Formimido oder Guanidino bedeutet; und
R&sub3; für Carbamoyl, Cyano, Carbozoyl, Amidino oder N-Hydroxycarbamoyl steht; zur Herstellung eines Medikaments, das zur Behandlung, Kontrolle und Überwachung einer Krebsart geeignet ist, die den Transport einzelner Zellen aus einem metastasierenden Tumor zu anderen Geweben umfaßt.
Die bevorzugten Verbindungen für die neue Anwendung besitzen die Formel (I), worin:
p für 1 steht, X O, S, CO oder CH&sub2; bedeutet;
R&sub4; für Fluor, Chlor, Brom, Methyl, Trifluormethyl, Cyano, Carbomethoxy, Trifluormethoxy, Trifluormethylthio oder Trichlorvinyl steht;
R&sub5; Halogen, Methyl, Trifluormethyl, Cyano, Carbalkoxy oder Trichlorvinyl darstellt;
R&sub2; Amino bedeutet R&sub3; für Carbamoyl (-CONH&sub2;) steht; und m und n unabhängig 0,1 oder 2 bedeuten.
Die am meisten bevorzugten Verbindungen für die neuen Anwendungen besitzen die Formel
worin X für CH&sub2;, S, O oder (CO)- steht;
R&sub4; Cl, CF&sub3;, Br oder CH&sub3; bedeutet;
R&sub4;, H oder Cl darstellt; und R&sub5; für Cl, Br oder NO&sub2; steht.

C. Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen

Die erfindungsgemäß zu verwendenden Verbindungen können durch die in der U.S.-Patentschrift 4 590 201 beschriebenen Verfahren hergestellt werden.
Die Verbindungen können auch durch die verbesserten Verfahren, die in dem folgenden Schema I aufgeführt und in Beispiel 1 ausführlich beschrieben sind, hergestellt werden. Schema 1

D. NUTZEN DER ERFINDUNG

Die Erfindung betrifft die Verwendung einer Verbindung der Formel (I) zur Behandlung von Leukämie oder verwandten Krebsarten.
Zur Behandlung dieser Zustände und Krankheiten kann eine Verbindung der Formel (I) oral, topisch, parenteral, über ein Inhalationsspray oder rektal in Einheitsdosierungsformulierungen verabreicht werden, die herkömmliche nichttoxische pharmazeutisch verträgliche Trägerstoffe, Hilfsmittel und Vehikel enthalten. Die Bezeichnung parenteral umfaßt, wie hier verwendet, subkutane Injektionen, intravenöse, intramuskuläre, intrasternale Injektions- oder Infusionstechniken. Abgesehen von der Behandlung warmblütiger Tiere, wie von Pferden, Rindvieh, Schaf, Hunden, Katzen etc., sind die erfindungsgemäßen Verbindungen zur Behandlung von Menschen wirksam.
Die pharmazeutischen Präparate, die den aktiven Bestandteil enthalten, können in einer zur oralen Anwendung geeigneten Form vorliegen, beispielsweise als Tabletten, Bonbons, Pastillen, wäßrige oder ölige Suspensionen, dispergierbare Pulver oder Granulate, Emulsionen, harte oder weiche Kapseln oder Sirupe oder Elixiere. Die zur oralen Anwendung beabsichtigten Präparate können gemäß irgendeinem in der Technik bekannten Verfahren zur Herstellung pharmazeutischer Präparate hergestellt werden.
Solche Präparate können ein oder mehrere Mittel, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Süßstoffen, Aromastoffen, Farbstoffen und Konservierungsstoffen, enthalten, um eine pharmazeutisch geschmackvolle und wohlschmeckende Präparation zu liefern. Tabletten, die den aktiven Bestandteil in einem Gemisch mit nichttoxischen pharmazeutisch verträglichen Hilfsstoffen enthalten, können ebenfalls durch bekannte Verfahren hergestellt werden. Die verwendeten Hilfsstoffe können beispielsweise (1) inerte Verdünnungsmittel, wie Calciumcarbonat, Lactose, Calciumphosphat oder Natriumphosphat; (2) Granulierungs- und Zerfallsmittel, wie Maisstarke, Alginsäure; (3) Bindemittel, wie Stärke, Gelatine oder Akaziengummi und (4) Gleitmittel, wie Magnesiumstearat, Stearinsäure oder Talk, sein. Die Tabletten können unbeschichtet sein, oder sie können durch bekannte Verfahren beschichtet werden, um Zerfall und Absorption im Gastrointestinaltrakt zu verzögern und so eine über einen längeren Zeitraum ausgedehnte Wirkung erzeugen. Beispielsweise kann ein Zeitverzögerungsmaterial, wie Glycerylmonostearat oder Glyceryldistearat, eingesetzt werden. Sie können auch durch Verfahren, wie in den U.S. Patentschriften 4 256 108, 4 160 452 und 4 265 874 beschrieben, beschichtet werden, um osmotische therapeutische Tabletten zur kontrollierten Freisetzung zu bilden.
In einigen Fällen können die Formulierungen zur oralen Anwendung in Form harter Gelatinekapseln vorliegen, worin der aktive Bestandteil mit einem inerten festen Verdünnungsmittel, beispielsweise Calciumcarbonat, Calciumphosphat oder Kaolin vermischt ist. Sie können auch in Form weicher Gelatinekapseln vorliegen, worin der aktive Bestandteil mit Wasser oder einem öligen Medium, beispielsweise Erdnußöl, flüssigem Paraffin- oder Olivenöl, vermischt wird.
Wäßrige Suspensionen enthalten normalerweise die aktiven Materialien in einem Gemisch mit Hilfsstoffen, die zur Herstellung wäßriger Suspensionen geeignet sind. Solche Hilfsstoffe können sein:
(1) Suspensionsmittel, wie Natriumcarboxymethylcellulose, Methylcellulose, Hydroxypropylmethylcellulose, Natriumalginat, Polyvinylpyrrolidon, Tragacanth- und Akaziengummi;
(2) Dispersions- oder Benetzungsmittel, die sein können
(a) ein natürlich vorkommendes Phosphatid, wie Lecithin,
(b) ein Kondensationsprodukt eines Alkylenoxids mit Fettsäure, beispielsweise Polyoxyethylenstearat,
(c) ein Kondensationsprodukt von Ethylenoxid mit einem langkettigen aliphatischen Alkohol, beispielsweise Heptadecaethylenoxycetanol,
(d) ein Kondensationsprodukt von Ethylenoxid mit einem Teilester, der sich von einer Fettsäure und einem Hexit, wie Polyethylensorbitmonooleat, ableitet oder
(e) ein Kondensationsprodukt von Ethylenoxid mit einem Teilester, der sich von Fettsäure und einem Hexitanhydrid, beispielsweise Polyoxyethylensorbitanmonooleat ableitet.
Die wäßrigen Suspensionen können auch ein oder mehrere Konservierungsstoffe, beispielsweise Ethyl- oder n-Propyl-p-hydroxybenzoat, ein oder mehrere Farbstoffe, ein oder mehrere Aromastoffe, ein oder mehrere Süßstoffe, wie Saccharose oder Saccharin, enthalten.
Eine ölige Suspension kann durch Suspendieren des aktiven Bestandteils in einem Pflanzenöl, beispielsweise Erdnußöl, Olivenöl, Sesamöl oder Kokosnußöl, oder in einem Mineralöl, wie flüssigem Paraffin, formuliert werden. Die öligen Suspensionen können ein Verdickungsmittel, beispielsweise Bienenwachs, Hartparaffin oder Cetylakohol, enthalten. Süßstoffe und Aromastoffe können zugegeben werden, um eine wohlschmeckende orale Präparation zu liefern. Diese Präparate können durch Zugabe eines Antioxidans, wie Ascorbinsäure, konserviert werden.
Zur Herstellung einer wäßrigen Suspension sind dispergierbare Pulver und Granulate geeignet. Sie stellen den aktiven Bestandteil in einem Gemisch mit einem Dispersions- oder Benetzungsmittel, einem Suspensionsmittel und einem oder mehreren Konservierungsstoffen bereit. Beispiele für geeignete Dispersions- oder Benetzungsmittel und Suspensionsmittel sind die bereits oben erwähnten. Weitere Hilfsstoffe, beispielsweise Süßstoffe, Aromastoffe und Farbstoffe, die oben beschrieben sind, können ebenfalls vorhanden sein.
Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Präparate können auch in Form von Öl-in- Wasser-Emulsionen vorliegen. Die ölige Phase kann ein Pflanzenöl, wie Olivenöl oder Erdnußöl, oder ein Mineralöl, wie flüssiges Paraffin, oder ein Gemisch davon sein. Geeignete Emulgatoren können sein (1) natürlich vorkommende Gummen, wie Akazien- und Tragacanth-Gummi, (2) natürlich vorkommende Phosphatide, wie Sojabohnen-Phosphatid und Lecithin, (3) Ester oder Teilester, die sich von Fettsäuren und Hexitanhydriden ableiten, beispielsweise Sorbitanmonooleat, (4) Kondensationsprodukte der genannten Teilester mit Ethylenoxid, beispielsweise Polyoxyethylensorbitanmonooleat. Die Emulsionen können auch Süß- und Aromastoffe enthalten.
Sirupe und Elixiere können mit Süßstoffen, beispielsweise Glycerin, Propylenglycol, Sorbit oder Saccharose, formuliert sein. Solche Formulierungen können auch ein Linderungsmittel, einen Konservierungsstoff und Aroma- und Farbstoffe enthalten.
Die pharmazeutischen Präparate können in Form einer sterilen injizierbaren wäßrigen oder öligen Suspension vorliegen. Diese Suspension kann gemäß bekannten Verfahren formuliert werden, wobei diejenigen geeigneten Dispersions- oder Benetzungsmittel und Suspensionsmittel verwendet werden, die oben erwähnt worden sind. Die sterile injizierbare Präparation kann auch eine sterile injizierbare Lösung oder Suspension in einem nichttoxischen, parenteral verträglichen Verdünnungsmittel oder Lösungsmittel sein, beispielsweise eine Lösung in 1,3-Butandiol. Unter den verträglichen Vehikeln und Lösungsmitteln, die verwendet werden können, sind Wasser, Ringer's Lösung und eine isotonische Natriumchloridlösung. Ferner werden üblicherweise gebundene Öle als Lösungsmittel oder Suspensionsmedium eingesetzt. Zu diesem Zweck kann irgendein mildes gebundenes Öl, einschließlich synthetischer Mono- oder Diglyceride, verwendet werden. Ferner finden Fettsäuren, wie Oleinsäure, zur Herstellung injizierbarer Präparationen Anwendung.
Eine Verbindung (I) kann auch in Form von Zäpfchen zur rektalen Verabreichung des Arzneimittels verabreicht werden. Diese Präparate können durch Vermischen des Arzneimittels mit einem geeigneten, nicht reizenden Hilfsstoff hergestellt werden, der bei normalen Temperaturen fest, jedoch bei Rektaltemperatur flüssig ist, und darum im Rectum unter Freisetzung des Arzneimittels schmilzt. Solche Materialien sind Kakaobutter und Polyethylenglycole.
Zur topischen Anwendung werden Cremes, Salben, Gele, Lösungen oder Suspensionen etc., die die aktiven Verbindungen enthalten, eingesetzt.
Dosierungskonzentrationen in der Größenordnung von etwa 0,5 mg bis etwa 100 mg pro Kilogramm Körpergewicht pro Tag (etwa 25 mg bis etwa 5 g pro Patient pro Tag) sind zur Behandlung der oben angegebenen Zustände geeignet.
Die Menge des aktiven Bestandteils, die mit den Trägermaterialien kombiniert werden kann, um eine Einheitsdosierungsform herzustellen, variiert je nach behandeltem Wirt und insbesondere der bestimmten Verabreichungsart. Beispielsweise kann eine Formulierung, die zur oralen Verabreichung bei Menschen beabsichtigt ist, 5 mg bis 5 g des aktiven Mittels enthalten, das mit einer geeigneten und zweckmäßigen Menge an Trägermaterial kompoundiert ist, das von etwa 5 bis etwa 95% des gesamten Präparats variieren kann. Einheitsdosierungsformen enthalten im allgemeinen etwa 25 mg bis etwa 500 mg des aktiven Bestandteils.
Selbstverständlich jedoch hängt die spezifische Dosierungskonzentration für jeden bestimmten Patienten von einer Reihe von Faktoren ab, einschließlich der Aktivität der speziellen eingesetzten Verbindung, des Alters, Körpergewichts, der allgemeinen Gesundheit, des Geschlechts, der Diät, Verabreichungszeit, des Verabreichungsweges, der Ausscheidungsgeschwindigkeit, Arzneimittelkombination und Schwere der bestimmten Krankheit, die der Therapie unterzogen wird.

E. BIOLOGISCHER BEWEIS ZUR STÜTZE DER NÜTZLICHKEIT DER ERFINDUNGSGEMÄßEN VERBINDUNGEN

Es wurde gefunden, daß die Verbindungen der Formel (I) antiproliferative Aktivitäten aufweisen. Es wurde bewiesen, daß bestimmte Hemmstoffe der Nucleotid-Biosynthese Psoriasis, Tumorbildung und weitere proliferative Störungen heilen können. Beispielsweise kontrolliert Mycophenolsäure, ein spezifischer Hemmstoff der Guaninnucleotid-Produktion, Psoriasis dadurch, daß es bei oraler Verabreichung zu einer Remission, jedoch mit unverträglichen Nebenwirkungen, kommt. Weitere spezifische Hemmstoffe der Purinnucleotid- oder Pyrimidinnucleotid-Biosynthese einschließlich Methotrexat, Fluoruracil, Thioguanin und N-Phosphonacetyl-L-aspartat haben sich zur Behandlung der Krankheit als wirksam erwiesen, obwohl jedes aufgrund der Toxizität unverträgliche Nebenwirkungen besitzt. Es ist jedoch klar, daß diese Arzneimittel, die die Proliferationsgeschwindigkeit von Zellen durch Hemmung der Nucleotid-Biosynthese regulieren, auch eine Wirksamkeit gegen Psoriasis und weitere proliferative Störungen zeigen sollten.
Es wurden in vitro-Experimente durchgeführt, die die Wirksamkeit von Amino-1,2,3- triazolen, beispielsweise von 5-Amino-1-(4-(4-chlorbenzoyl)-3,5-dichlorbenzyl)-1,2,3- triazol-4-carboxamid (Verbindung A), bei 1 ug/ml zur Hemmung der Nucleotid- Biosynthese bei einer Reihe von Säugerzellen in einer Einschichtenkultur zeigten. Der Einbau von Hypoxanthin, Adenin und Formiat in die Nucleotid-Pools wurde unterbrochen, was nahelegte, daß die Biosynthese von Phosphoribosylpyrophosphat, PRPP, gehemmt wurde. Die PRPP-Synthetaseaktivität sank durch das Arzneimittel bei den Experimenten auf Zellbasis dramatisch ab, obwohl in vitro-Studien zeigten, daß keine direkte Hemmung des Enzyms eintrat. Dieses neue Mittel zur Hemmung der Nucleotid- Biosynthese legte nahe, daß die Verbindung bei denselben Konzentrationen antiproliferativ sein würde. Dies wurde bei einer Reihe von Zelltypen einschließlich der normalen menschlichen epidermalen Keratinozyten, die für Psoriasis relevant sind, gezeigt. Verbindung A erwies sich von einer großen Anzahl von Analoga gegen Psoriasis hinsichtlich der Wirksamkeit der Hemmung der Proliferation in vitro des Fehlens von Toxizität oder Gentoxizität und einer metabolischen Stabilität in vitro als am wertvollsten, obwohl bei dem Antiproliferationstest einige Analoga mit einer größeren Aktivität vorhanden waren.
Es wurde gezeigt, daß Verbindung A die Produktion von LTB&sub4;, 5-HETE und HHT in Ratten-PNS's, sowie die Produktion von LTC&sub4; und PGE&sub2; und die Freisetzung des lysosomalen Enzyms in Makrophagen bei denselben Konzentrationen von 1 ug/ml, die gegen die Proliferation und Nucleotid-Produktion wirksam waren, hemmte. Wie im Falle der Nucleotid-Hemmung wurde kein Nachweis für eine direkte Hemmung der relevanten Enzyme, wie 5-Lipoxygenase oder LTA&sub4;-Hydrolase, erhalten, und die Arzneimittelwirkung schien auf ein regulatorisches System einzuwirken.
Die in vivo-Aktivitäten, die für Verbindung A gezeigt worden waren, schließen bei einem Lebensverlängerungstest mit 60 mg/kg/Tag und mit höheren Dosen eine Aktivität gegen P388-Leukämie bei nackten Mäusen ein. Die topische Aktivität gegen die Keratinozyten-Proliferation wurde anhand einer Bewertung der Proliferationsgeschwindigkeit gezeigt. Eine 2%ige Formulierung in Gel Nr. 1 (Mischung aus Isopropylmyristat:Crodamol:Ethanol 1 : 1 : 2), die topisch aufgetragen wird, hemmt die UV-induzierte Hyperproliferation auf Schweinehaut, die in ihrem Aufbau der menschlischen entspricht, vollständig. Die topischen antiproliferativen Aktivitäten zusammen mit den antiproliferativen in vitro-Aktivitäten gegen menschliche Keratinozyten und Fibroblasten liefern die biologischen Daten zur Stütze der beanspruchten Nützlichkeit:

(1) IN VITRO-TESTS

a. HEMMUNG DES NUCLEOTID-METABOLISMUS IN SÄUGERZELLEN

Verbindung A und die Analoga sind in der Lage, die Nucleotid-Biosynthese in einer Reihe von Säugerzelltypen zu hemmen. Wie in Tabelle 1 gezeigt, wird der Einbau von 3H-Hypoxanthin in Maden Darby-Rindernierenzellen (MDBK) im wesentlichen durch Inkubation der Zellen mit 1 ,0 ug/ml von Verbindung A in Minimal Essential Eagles Medium wesentlich verringert. Tabelle 1 ³H-Hypoxanthin-Aufnahme Probe Konz. (ug/ml) Zeit (min) Hemmung Kontrolle Verbindung A a DPM = Zerfall pro Minute
Konfluente Zellen wurden in Minimal Essential Eagles Medium 2,5 Stunden lang, anschließend mit phosphatgepufferter Salzlösung + Ca + Mg 30 Minuten lang und dann mit oder ohne 1 ug/ml von Verbindung A 15 Minuten lang inkubiert. Medium, das 100 uM 8&supmin;³H-Hypoxanthin mit oder ohne Arzneimittel enthielt, wurden für die angegebene Zeit mit den Zellen inkubiert, wonach sie durch Eintauchen in eiskalten Puffer gestoppt wurden. Die DPM-Messungen wurden anhand von Aliquoten der neutralisierten Perchlorsäure-Überstände durchgeführt.
Die mit den aus Tabelle 1 vergleichbaren Hemmdaten wurden durch Messung der Fähigkeit des Arzneimittels zur Hemmung des Einbaus von entweder Formiat oder Adenin in lösliche Nucleotid-Pools gemessen.

b. HEMMUNG DER PROLIFERATION VON SÄUGERZELLEN IN KULTUR

Die Hemmung der PRPP-Biosynthese durch Verbindung A und die Analoga stützten die beanspruchte Verwendung der Verbindungen als antiproliferative Mittel, da diese Hemmung die gesamte de novo-Biosynthese und Wiederverwertungsbiosynthese von Purin- und Pyrimidin-Nucleotiden hemmen sollte. Wie in den Tabellen 2 bis 4 gezeigt, zeigen Konzentrationen von ungefähr 1,0 ug/ml eine wesentliche Hemmung des Wachstums von normalen menschlichen epidermalen Keratinozyten (NHEK), Maden Darby-Rindernierenzellen oder normalen menschlichen Fibroblasten. Die Daten aus den NHEK's sind besonders wichtig, da sie die Überproliferation dieser Zellen darstellen, die bei Psoriasis auftritt. Tabelle 2 Hemmung des Wachstums von NHEK's durch Verbindung A Konz. (ug/ml) Zeit (Tag) ABS-Hintergrund (650 nm) % Hemmung 0 (Kontrolle) Tabelle 3 Hemmung des Fibroblastenwachstums durch Verbindung A Konz. (ug/ml) Zeit (Tage) Anz. v. Zellen - bereitgestellte Zellen % Hemmung 0 (Kontrolle) Tabelle 4 Hemmung des Wachstums von MDBK-Zellen durch Verbindung A Konz. (ug/ml) Zeit (Tage) Anz. Zellen·10&sup6; - Anz. Zellen, bereitgestellt % Hemmung 0 (Kontrolle)
Eine Anzahl von Verbindungen besitzen eine mit Verbindung A vergleichbare Aktivität (Tabelle 5). In diesen Exprimenten wurde die keratinozytentransformierte Maus-Zellinie PAPp26 in Dulbecco's modifiziertem Eagle-Medium mit 10% fetalem Kalbserum bei 37ºC, 5% CO&sub2; gezüchtet. In jeder Vertiefung einer Platte mit 96 Vertiefungen wurden 2000 Zellen in 200 ul einer jeden Arzneimittelverdünnung in doppelter Ausführung bereitgestellt. Eine Platte wurde gestoppt und jeweils an dem Zeitpunkt fixiert, mit Giemsa angefärbt und dann in einer Titertek-Plattenlesevorrichtung bei 650 nm gelesen. Die Absorptionen wurden mit bekannten Zellenzahlen auf Kontrollplatten geeicht. Die NHEK's wurden von Clonetics Corporation im Sekundärstadium erhalten. Die antiproliferativen Tests wurden wie mit Maus-Keratinozyten durchgeführt. Medium (KGM) ohne Serum wurde ebenfalls von Clonetics geliefert. Normale menschliche Fibroblasten und MDKB-Zellen wurden unter denselben Bedingungen gezüchtet, außer daß die MDBK-Zellen bei 41ºC gezüchtet wurden. Tabelle 5 Aktivitäten der Analoga von Verbindung A bei Proliferationstests vs PAPp26 Maus-Keratinozyten und normalen menschlichen epidermalen Keratinozyten Verbindung

(2) IN VIVO-EXPERIMENTE

a. TOPISCHE ANTIPROLIFERATIVE AKTIVITÄT IN SCHWEINEHAUT

Verbindung A hemmt den Einbau von markiertem Thymidin in gesunde Schweinehaut und hemmt ferner die Keratinozyten-Proliferation, wie gemessen durch eine Metaphasen-Hemmung mit Colchicin. Die unten beschriebenen Experimente zeigen, daß das Arzneimittel als Antiproliferativum topisch aktiv ist und daß die Wirkungen vom Vehikel abhängen.
In einem Experiment wurde ein Schwein von 20 kg ruhiggestellt. Mehrere Flächen ausgeschnittener Haut wurden einer UV-Strahlung ausgesetzt, die ausreichte, um innerhalb einiger Tage der Exposition eine gemäßigte hyperproliferative Reaktion hervorzurufen. An den Tagen 0, 1, 2 und 3 wurden mehrere bestrahlte Stellen in doppelter Ausführung mit Verbindung A in mehreren Vehikeln oder Lösungsmitteln topisch behandelt. Die topischen Präparationen enthielten 2% Arzneimittel in Gel Nr. 1, Mischung aus Isopropylmyristat: Crodamol: Ethanol 1 : 1 : 2 oder DMSO. Die hyperproliferative Reaktion der Haut auf UV wurde am 4. Tag bewertet, indem ³H-Thymidin intradermal injiziert und eine Stunde später die Stellen durch Stanzbiopsie entnommen und die Proben autoradiographisch bearbeitet wurden. Derartige Autoradiographien zeigen die Anzahl von epidermalen Zellen in der S-Phase, die DNA synthetisieren. Dies ist ein allgemeines, von Dermatologen angewendetes Mittel, um die Hemmung der Proliferation in vivo zu testen. Eine Einmalinjektion von Methotrexat 4 Stunden vor einer Injektion von ³H-Thymidin wurde als positive Kontrolle zur Hemmung der DNA-Synthese angewendet. Ein Markierungsindex L. I., der dem Prozentsatz der Gesamtzahl der gezählten epidermalen Basalzellen (Keratinozyten) entspricht, zeigte einen Markierungseinbau. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 gezeigt. 4 Tage nach der UV-Exposition nahm L. I. der Schweinehaut von 7,6% auf 20,8% zu (normale menschliche Haut ca. 2%, psoriatische Läsionen ca. 25%, zum Vergleich). Die tägliche Anwendung von Verbindung A verringerte die UV-induzierte Hyperprofilferation in Gel Nr. 1 dramatisch, war in Crodamol weniger wirksam und zeigte gemäß diesem Protokoll keine Wirkung mit DMSO als Vehikel. Die Hemmung der Proliferation durch Verbindung A in Gel Nr. 1 war mit derjenigen für injiziertes Methotrexat vergleichbar. Tabelle 6 Wirkung von Verbindung A auf eine UV-induzierte Hyperproliferation in Schweinehaut in vivo Behandlung gesamte Basalzellen, gezählt markierte Zellen LI % % Hemmung normal, UV-exponiert Verbindung A,Crodamol Methotrexat

(3) WEITERE IN VIVO-AKTIVITÄTEN

Verbindung A zeigte in nackten Mäusen eine deutliche in vivo-Aktivität gegen P388-Leukämie. Die verwendeten Dosen betrugen 240, 120 und 60 mg/kg, die einmal am Tag 5 Tage lang i.p. verabreicht wurden. Der Lebensverlängerungstest mit typischen Kontroll-Überlebenszeiten von 15-20 Tagen ergab Werte von 134%, 124% und 127% für die drei Arzneimittelkonzentrationen. Die Größe der Überlebenszeitzunahme entspricht der Zeitspanne, während der die Tiere eine Dosis erhielten.
Das folgende Beispiel erläutert die Herstellung der erfindungsgemäßen, bei dem Behandlungsverfahren nützlichen Verbindungen, schränkt jedoch den Umfang der Erfindung nicht ein.

Beispiel

Herstellung von 5-Amino-1-(4-[4-chlorbenzoyli-3 5-dichlorbenzyl)-1,2,3-triazol-4-carboxamid

Stufe A: Herstellung von 3,5-Dichlorbenzylalkohol, 2

Zu einer gerührten Lösung von 3,5-Dichlorbenzoylchlorid (712 mg, 3,40 mmol) in THF (6 ml) bei 0ºC wird tropfenweise eine Lösung aus Natriumborhydrid (227 mg, 6,0 mmol) in N-Methylpyrrolidinon (1,5 ml) gegeben, wobei die Temperatur bei ≤ 18ºC gehalten wird. Das Reaktionsgemisch wird 2 Stunden lang bei Umgebungstemperatur gerührt und dann zwischen 0,5 N wäßriger HCl (60 ml) und EtOAc (60 ml) verteilt. Die Schichten werden getrennt, und die wäßrige Schicht wird mit EtOAc (20 ml) gewaschen. Die vereinigte organische Schicht wird mit H&sub2;O (60 ml) und Salzlösung (40 ml) gewaschen, getrocknet (Na&sub2;SO&sub4;), filtriert und konzentriert, um ein Rohprodukt als kristallinen Feststoff zu ergeben. Einmaliges Umkristallisieren aus heißem Cyclohexan (7,5 ml) ergibt 2, d. h. 3,5-Dichlorbenzylalkohol (451 mg, 2,55 mmol, 75%, Fp. 77-77,5ºC).

Stufe B: Herstellung von 3,5-Dichlorbenzyl-t-butylsilylether 3

In einen 100 ml-Rundkolben unter Stickstoff werden Alkohol 2 (4,80 g, 27,1 mmol), Imidazol (4,60 g, 67,6 mmol) und eine katalytische Menge 4-Dimethylaminopyridin (16 mg, 0,13 mmol) in DMF (9 ml) aufgelöst. t-Butyldimethylsilylchlorid (4,29 g, 28,5 mmol) wird hinzugegeben (Vorsicht - Wärmeentwicklung). Das Reaktionsgemisch wird bei Umgebungstemperatur ca. 4 Stunden lang gerührt. Im Anschluß an die Umsetzung folgt ein Gewichtsprozent-Test durch reverse phase-HPLC. Das Verschwinden von Ausgangsmaterial 2 wird durch Auflösen eines bekannten Gewichts des Reaktionsgemisches in 10 ml Elutionsmittel (die Konzentration sollte ca. 16 mg Reaktionsgemisch/10 ml Elutionsmittel betragen) aufgezeichnet und auf einer ODS-C8- Zorbax-Säule von DuPont analysiert, die isokratisch bei Umgebungstemperatur mit einer Flußgeschwindigkeit von 2 ml/min mit einer mobilen Phase von 55% H&sub2;O, 45% CH&sub3;CN und 0, 1% H&sub3;PO&sub4; eluiert wird, Aufzeichnung durch UV-Detektion bei 230 nm. Die Retentionszeit von Alkohol 2 beträgt 5,1 min. Die Reaktion wird als beendet betrachtet, wenn < 3% Alkohol 2 zurückbleiben. Nach Beendigung wird das Reaktionsgemisch zwischen Hexan (80 ml) und 1 N wäßriger HCl (100 ml) verteilt.
Die organische Schicht wird abgetrennt und mit 1 N wäßriger HCl (80 ml) und Wasser (3 · 100 ml) gewaschen, getrocknet (Na&sub2;SO&sub4;) und filtriert. 3,5-Dichlorbenzyl-tbutylsilylether, 3, kann durch Konzentrieren der Hexanlösung zu einem Öl isoliert werden. Reines 3 (Öl) wird durch präparative Kieselgel-TLC mit 2% EtOAC in Hexan als Elutionsmittel erhalten. Der Test von 3 wird anhand von isokratischer Normalphasen- HPLC bei Umgebungstemperatur auf Zorbax Sil von DuPont, eluiert mit 2 ml/min mit Hexan, aufgezeichnet durch UV-Detektion bei 230 nm, durchgeführt. Die Retentionszeit von 3 beträgt 6,4 min.

Stufe C: Herstellung von 4-(4-Chlorbenzoyl)-3,5-dichlorbenzyl-t-butlylsilylether

Das Hexan wird für die anschließende Metallierung durch THF ausgetauscht, indem wasserfreies THF (100 ml) hinzugegeben wird, unter reduziertem Druck auf ca. 50 ml reduziert und zusätzliches THF (100 ml) zugegeben und auf ca. 70 ml konzentriert wird. Zu einer Lösung des rohen Silylethers 3 (ca. 27 mmol) in THF (ca. 70 ml, KF in Lösung ≤ 60 ug/ml) unter Stickstoff, abgekühlt auf -75ºC, wird tropfenweise eine Lösung aus n-BuLi in Hexan (11,0 ml einer 2,70 M Lösung, 29,7 mmol) hinzugegeben, wobei die Temperatur bei ≤ 60ºC gehalten wird. Nach 30minütigem Rühren bei ≤ 60ºC wird das Reaktionsgemisch auf -75ºC abgekühlt, und eine Lösung aus 4-Chlorbenzoylchlorid (5,42 g, 31 mmol) in THF (5 ml) wird bei ≤ 60ºC tropfenweise hinzugegeben. Nach 3stündigem Rühren bei -70ºC bis -60 ºC wird das Reaktionsgemisch durch Zugabe von 2 N wäßriger HCl (2 ml) gestoppt. Das ungefähre Ausmaß der Umwandlung wird durch das Verschwinden von Silylether 3 unter Anwendung der oben beschriebenen Normalphasen-HPLC-Bedingungen für Gewichtsprozent getestet. Die typische beobachtete Umwandlung beträgt 85-90%.

Stufe D: Herstellung von 3,5-Dichlor-4-(4-chlorbenzoyl)-benzylalkohol, 5

Konzentrierte wäßrige HCl (25 ml) wird zu dem obigen Reaktionsgemisch gegeben, das auf Raumtemperatur aufgewärmt und 12 Stunden lang gealtert wird. Die Reaktion wird durch Silicagel-TLC, eluiert mit 10% EtOAc in Hexan (Rf 5 : 0,03), überwacht. Nach Beendigung wird das Reaktionsgemisch zwischen EtOAc (100 ml) und kaltem H&sub2; (300 ml) verteilt, und die Schichten werden getrennt. Die organische Schicht wird mit H&sub2;O (150 ml), 1 N wäßriger NaOH (2 · 150 ml, sorgfältig, zur Entfernung von 4-Chlorbenzoesäure), H&sub2;O (150 ml) und 0,1 N wäßriger HCl gewaschen. Die organische Schicht wird getrocknet (Na&sub2;SO&sub4;), filtriert und konzentriert, um den rohen kristallinen 3,5-Dichlor-4-(4-chlorbenzoyl)-benzylalkohol 5 (9,97 g) zu ergeben, Reinheit 60 Gew.- % (70% Testausbeute aus Alkohol 2), durch HPLC-Test über Zorbax ODS- C8 von DuPont, bei Umgebungstemperatur bei 2 ml/min mit 55% H&sub2;O, 45% CH&sub3;CN und 0,1% H&sub3;PO&sub4; isokratisch eluiert und durch UV-Detektion bei 230 nm kontrolliert (Retentionszeiten, Alkohol 2 : 5,1 min; Benzophenon 5 : 14,4 min; 4-Chlorbenzoesäure: 2,9 min).

Stufe E: Herstellung von 3,5-Dichlor-4-(4-chlorbenzoyl)-benzylazid, 7

Natriumazid (6,2 g, 0,09 mol) wurde zu einem gerührten Gemisch aus Chlorid 6 (22 g, 66% reines 6, 14,5 g, 0,043 mol) und Natriumiodid (1 g, 0,007 mol) in Ethanol (150 ml) gegeben. Das Gemisch wurde unter Stickstoff 3 Stunden lang am Rückfluß erhitzt und dann auf 20ºC abkühlen gelassen. Das Reaktionsgemisch wurde in Wasser gegossen und das Produkt in Ether (200 ml, 2 · 100 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden mit Wasser (3 · 100 ml) gewaschen, getrocknet (Na&sub2;SO&sub4;) und unter reduziertem Druck (< 40ºC) eingedampft. Der Rückstand (23,7 g), ein gelbbraunes Öl, wurde über Kieselgel (150 g) chromatographiert, das bis zum Beginn der Elution des reinen Azids 7 mit 9 : 1 Hexan:Methylenchlorid eluiert, dann mit 4 : 1 und 1 : 1 Hexan:Methylenchlorid eluiert wurde, um die Isolierung von reinem 7 zu beenden. Die Ausbeute von 7 betrug 11,9 g (80%), Fp. 65-68,5ºC. Es wird erwartet, daß die Verwendung von reinem Chlorid 6 reines 7 ohne Chromatographie liefert, obwohl die Kristallisation von 7 aus Hexan oder Hexan-Ether erforderlich sein kann.

Stufe F: Herstellung von 5-Amino-1-(4-[4-chlorbenzoyll-3,5-dichlorbenzyl)-1,2,3-triazol-4-car-boxamid

Wasserfreies gemahlenes Kaliumcarbonat (119 g, 0,86 mol) wurde in DMSO (450 ml) 10 Minuten lang suspendiert. Cyanacetamid (18,2 g, 0,22 mol) wurde hinzugegeben. Die Aufschlämmung wurde 10 Minuten lang kräftig gerührt. Dann wurde das feste Azid (73,4 g, 0,22 mol) auf einmal hinzugegeben. Nach 16 Stunden wurde das Gemisch durch Absaugen filtriert und die Feststoffe mit DMSO (500 ml) gespült. Wasser (4 l) wurde im Verlauf von 30 Minuten unter externem Kühlen, um die Temperatur bei < 30ºC zu halten, zu den vereinigten Extrakten gegeben. Das orangegelbe Produkt wurde 4 Stunden lang bei 20ºC gealtert, dann filtriert und mit Wasser (2 l) gewaschen. Der Filterkuchen wurde trockengesaugt und in einen 1 l-Flanschkolben, der Ethylacetat (500 ml) enthielt, übergeführt. Das Gemisch wurde unter Rückfluß an einer Dean Stark-Trennvorrichtung erhitzt, bis sich kein Wasser mehr ansammelte. Ethylacetat (200 ml) wurde durch Destillation entfernt. Die rote Lösung wurde abgekühlt und kristallisiert. Das Produkt wurde 1 Stunde lang bei 10ºC gealtert, filtriert und mit Ethylacetat (2 · 150 ml) gewaschen, bei 50ºC in vacuo unter einem Luftstrom getrocknet, um 78,0 g gelben Feststoff (85% Ausbeute, Fp. 202-204ºC) zu ergeben. Mehrere Chargen (Gesamtgewicht 134,0 g) wurden vereinigt und bei Rückflußtemperatur in Methanol (5 l) aufgelöst. Die Lösung wurde filtriert und auf 1,8 l durch Destillation des Methanols konzentriert. Die resultierende Aufschlämmung wurde auf 10ºC abgekühlt, 1 Stunde lang gealtert, filtriert und mit Methanol gewaschen. Das Produkt wurde luftgetrocknet, dann noch in vacuo bei 40ºC getrocknet, um 122,5 g eines farblosen kristallinen Feststoffes zu ergeben (91% Ausbeute, FP. 202,0-204ºC; HPLC: 210 nm und 254 nm, Einzelpeak; DSC: 99,4 mol-% bei 2ºC/min [MW = 424,5]).

Claims

1. Verwendung einer Verbindung der Formel (I):

worin:

bedeutet

worin

p für 0 bis 2 steht;

m für 0 bis 4 steht;

n für 0 bis 5 steht;

X für O, S, SO, SO&sub2;, CO, CHCN, CH&sub2; oder C=NR6 steht, worin R&sub6; folgendes bedeutet:

(a) Wasserstoff;

(b) Niedrigalkyl;

(c) Hydroxy;

(d) Niedrigalkoxy;

(e) Amino;

(f) Niedrigalkylamino;

(g) Di-Niedrigalkylamino; oder

(h) Cyano;

R&sub4; und R&sub5; unabhängig folgendes bedeuten:

(a) Halogen;

(b) Cyano;

(c) Trifluormethyl;

(d) Niedrigalkanoyl;

(e) Nitro;

(f) Niedrigalkyl;

(g) Niedrigalkoxy;

(h) Carboxy;

(i) Carbalkoxy;

(j) Trifluormethoxy;

(k) Acetamido;

(l) Niedrigalkylthio;

(m) Niedrigalkylsulfonyl;

(n) Trichlorvinyl;

(o) Trifluormethylthio;

(p) Trifluormethylsulfinyl oder

(q) Trifluormethylsulfonyl;

R&sub2; folgendes bedeutet:

(a) Amino;

(b) Mono- oder Di-Niedrigalkylamino;

(c) Acetamido;

(d) Acetimido;

(e) Ureido;

(f) Formamido;

(g) Formimido; oder

(h) Guanidino und

R&sub3; folgendes bedeutet:

(a) Carbamoyl;

(b) Cyano;

(c) Carbazoyl;

(d) Amidino; oder

(e) N-Hydroxycarbamoyl

zur Herstellung eines Medikaments, das geeignet ist zur Behandlung, Kontrolle und Überwachung von Krebs, umfassend den Transport von einzelnen Zellen von einem metastasierenden Tumor zu anderen Geweben.

2. Verwendung nach Anspruch 1, wobei n und m unabhängig 0,1 oder 2 bedeuten; p für 1 steht; X O, S, CO oder CH&sub2; bedeutet;

R&sub4; die folgenden Bedeutungen besitzt:

(a) Fluor;

(b) Chlor;

(c) Brom;

(d) Methyl;

(e) Trifluormethyl;

(f) Cyano;

(g) Carbomethoxy;

(h) Trifluormethoxy;

(i) Trifluormethylthio;

(i) Nitro oder

(k) Trichlorvinyl;

R&sub5; die folgenden Bedeutungen besitzt:

(a) Chlor;

(b) Brom;

(c) Fluor;

(d) Methyl;

(e) Trifluormethyl;

(f) Cyano;

(g) Carbalkoxy;

(h) Trichlorvinyl oder

(j) Nitro.

3. Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Verbindung die Formel (a)

aufweist, worin X für CH&sub2;, S, O oder CO steht; R&sub4; Cl, CF&sub3;, Br oder CH&sub3; bedeutet; und

R&sub5; Cl, Br oder NO&sub2; darstellt.

4. Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Verbindung 5-Amino-1-(4-[4-chlorbenzoyl]-3,5-dichlorbenzyl)- 1,2,3-triazol-4-carboxamid ist.