DE69627042T2

DE69627042T2 - Isocumarinderivate und deren verwendung in medikamenten

Info

Publication number: DE69627042T2
Application number: DE69627042T
Authority: DE
Inventors: Naoki Agata; Shin-Ichi Hirano; Hiroshi Iguchi; Masaaki Ishizuka; Hiroyuki Kumagai; Toshiyuki Mase; Naoki Matsumoto; Tomio Takeuchi; Hiroshi Tone; Takeo Yoshioka
Original assignee: Microbial Chemistry Research Foundation; Mercian Corp
Current assignee: Microbial Chemistry Research Foundation; Mercian Corp
Priority date: 1994-12-19
Filing date: 1996-06-17
Publication date: 2003-11-20
Anticipated expiration: 2016-06-18
Also published as: JP3150709B2; CA2259621C; JPH08176138A; EP0930310A1; DE69627042D1; ATE235482T1; EP0930310A4; WO1997048693A1; EP0930310B1; CA2259621A1; US6020363A; ES2190469T3; AU6017296A

Description

Technisches Gebiet

Die vorliegende Erfindung betrifft Isocoumarin-Derivate und ihre Verwendung in Medikamenten. Sie betrifft insbesondere die Verwendung von Isocoumarin-Derivaten zur Prävention oder Behandlung von Erkrankungen, die mit einer Anomalie bei der immunologischen Regulationsfunktion oder Vaskularisierung verbunden sind.

Stand der Technik

Ein Isocoumarin-Derivat, insbesondere 3-Hydroxymethyl-6- methoxy-8-hydroxy-1H-2-benzopyran-1-on, dargestellt durch die Formel
wurde zuerst als Verbindung gefunden, die durch Streptoverticillium eurocidicum produziert wird, und hat unter dem Namen des Antibiotikums MI43-37F11 wegen ihrer wachstuminhibierenden Aktivität gegen verschiedene tierische Zellen und humane Krebszellen (japanische Offenlegungsschrift Nr. 2177/'91) Aufmerksamkeit auf sich gezogen. Anschließend wurden Untersuchungen über das Verfahren zur chemischen Synthese des vorstehenden Antibiotikums MI43-37F11 (nachfolgend abgekürzt als MI43) durchgeführt. Das Resultat war, dass Isocoumarin-Derivate, die eine Austrittsgruppe enthaltende Methylgruppe (z. B. Halogenmethyl) oder Benzyloxymethyl in der 3-Positon eines Isocoumarin-Gerüsts haben, als Zwischenprodukte bereitgestellt wurden (japanische Offenlegungsschrift Nr. 112884/'92) und dass Isocoumarin-Derivate, die in der genannten 3-Postion eine Gruppe der Formel:
worin R&sub3; und R&sub4; jeweils unabhängig eine substituierte oder unsubstituierte Alkylgruppe, eine Alkoxygruppe, eine Alkanoyloxygruppe, eine mono- oder di-substituierte Aminogruppe, eine Phenylthiogruppe oder N&sub3; sind, haben, als Verbindungen mit pharmakologischer Aktivität ähnlich der von MI43 bereitgestellt wurden (japanische Offenlegungsschrift Nr. 97841/'93).
Andererseits wurde die Verwendung von MI43 als immunologischer Regulator vorgeschlagen, da seine orale Verabreichung adjuvante Arthritis bei Ratten und Collagen-induzierte Arthritis bei Mäusen deutlich inhibieren kann (japanische Offenlegungsschrift Nr. 183966/'94). Obgleich MI43 als immunologischer Regulator beachtlich wirksam ist, besteht weiterhin Bedarf für die Bereitstellung einer wirksameren Verbindung oder eines wirksameren Medikaments.
Im Fall von Arzneimitteln, die herkömmlicherweise zur Behandlung von Autoimmunkrankheiten eingesetzt werden, z. B. Steroidhormone, Goldpräparate, D-Penicillamin, Levamisol und Salazosulfapyridin, trifft man bei ihrer Verwendung auf strenge Beschränkungen, da sie manchmal ernste Nebenwirkungen wie z. B. Nebennierendysfunktion, Infektion, Nierenkrankheiten, hematopoetische Störungen und gastrointestinale Störungen hervorrufen.
Unter dem oben beschriebenen Hintergrund besteht eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung in der Bereitstellung pharmazeutischer Präparate, die keine erkennbaren Nebenwirkungen aufweisen und die eine ausgezeichnete Wirksamkeit (insbesondere Bioverfügbarkeit) in Säugern, einschließlich Menschen, aufweisen.

Offenbarung der Erfindung

Zur Lösung der oben genannten Aufgabe haben die Erfinder Untersuchungen über die pharmakologischen Wirkungen und die Bioverfügbarkeit verschiedener Isocoumarin-Derivate durchgeführt. Als Resultat haben sie gefunden, dass Isocoumarin- Derivate, die eine Carboxylgruppe in der 3-Position, entweder direkt oder über eine Methylen- oder Methin-Gruppe, anstelle der Hydroxymethylgruppe, die in der 3-Position von MI43 gebunden ist, gebunden haben, einen immunologischen Regulationseffekt haben, der gleich dem oder größer als der Von z. B. MI43 ist, und auch eine geringe Toxizität und eine äußerst hervorragende biologische Verfügbarkeit haben. Darüber hinaus wurde auch festgestellt, dass die Verbindungen mit solchen Eigenschaften, wenn sie oral Säugern verabreicht werden, überraschenderweise eine hohe in vivo-Stabilität aufweisen. Ferner wurde festgestellt, dass die genannten Verbindungen die Vaskularisierung in Säugern deutlich hemmen können. Die vorstehend genannten Isocoumarin-Derivate, die eine Carboxylgruppe in der 3-Positon über eine Methylen- oder Methin- Gruppe gebunden haben, sind Verbindungen, die in der Literatur des Standes der Technik noch nicht beschrieben wurden.
Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung ein pharmazeutisches Präparat bereit, das ein pharmazeutisch annehmbares Zusatzmittel und eine pharmakologisch wirksame Menge einer Verbindung der Formel (I)
worin R ein Wasserstoffatom oder eine C&sub1;&submin;&sub6;-Alkylgruppe ist und n eine ganze Zahl von 0 oder 1 ist, oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes davon umfasst; ein solches pharmazeutisches Präparat ist insbesondere zur Prävention oder Behandlung von Krankheiten, die mit einer Anomalie bei der immunologischen Regulationsfunktion oder der Vaskularisierung verbunden sind, nützlich.
In einer anderen Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung einer Verbindung der obigen Formel (I) oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes davon bei der Herstellung eines pharmazeutischen Präparats zur Prävention oder Behandlung von Krankheiten, die mit einer Anomalie bei der immunologischen Regulationsfunktion oder Vaskularisierung verbunden sind, bereit.
Darüber hinaus liefert die vorliegende Erfindung eine Verbindung der Formel (I-a)
worin R ein Wasserstoffatom oder eine C&sub1;&submin;&sub6;-Alkylgruppe ist, oder ein Salz davon als neue Verbindung unter den Verbindungen der obigen Formel (I).
Darüber hinaus liefert die vorliegende Erfindung eine Verbindung der Formel (II)
worin R ein Wasserstoffatom oder eine C&sub1;&submin;&sub6;-Alkylgruppe ist und A ein Wasserstoffatom oder eine Schutzgruppe ist, wobei diese Verbindung vorteilhafterweise als Zwischenprodukt für die Synthese der vorstehend genannten Verbindung der Formel (I-a) verwendet wird.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 ist ein Diagramm, das die Änderungen der Konzentrationen an Verbindung 3 gemäß der vorliegenden Erfindung und Metaboliten davon im Blutplasma im Verlauf der Zeit zeigt, wenn diese Verbindung Mäusen oral verabreicht wird, und
Fig. 2 ist ein Diagramm, das Änderungen der Konzentrationen an MI43 (als Vergleichsverbindung) und Metaboliten davon im Blutplasma zeigt, wenn diese Verbindung Mäusen oral verabreicht wird.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Die Verbindungen der Formel (I) gemäß der vorliegenden Erfindung werden insbesondere dadurch charakterisiert, dass in der 3-Position eines Isocoumarin-Gerüsts eine Carboxylgruppe direkt oder indirekt über nur ein Kohlenstoffatom, das eine Methylengruppe bildet (in der R ein Wasserstoffatom ist) oder eine Methingruppe bildet (in der R eine C&sub1;&submin;&sub6;-Alkylgruppe ist) gebunden ist. Wenn R eine C&sub1;&submin;&sub6;-Alkylgruppe ist, umfassen spezifische Beispiele für die Alkylgruppe Methyl, Ethyl, n- oder Isopropyl, n-, iso-, sec- oder t-Butyl, n-Pentyl, Isoamyl und n-Hexyl. Wenn R eine Alkylgruppe ist, wie sie oben beschrieben wurde, zeigen die Verbindungen der Formel (I) leicht eine Verbesserung der Bioverfügbarkeit (z. B. in vivo-Stabilität) und haben daher eine höhere Einsetzbarkeit bei der oralen Verabreichung.
Die spezifischen Verbindungen, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, sind in der folgenden Tabelle angegeben. Bei der Benennung der erfindungsgemäßen Verbindungen können sie durch ihre entsprechenden Verbindungsnummern bezeichnet werden. TABELLE Spezifische Beispiele der Verbindungen
Die oben beschriebenen Verbindungen der Formel (I) können in Form von Salzen eingesetzt werden, die durch die Reaktion der Carboxylgruppe mit einer basischen Verbindung gebildet werden. Es können beliebige Salze verwendet werden, solange sie keinen nachteiligen Einfluss auf den Zweck der vorliegenden Erfindung haben. Allerdings ist es bevorzugt, Salze zu verwenden, die mit basischen Verbindungen gebildet werden, welche zur Bildung pharmazeutisch annehmbarer Salze von gängigen Carboxyl-enthaltenden Arzneimitteln verwendet werden. Spezifische Beispiele für solche Salze umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Salze, die mit Alkalimetallen wie z. B. Lithium, Natrium und Kalium; Erdalkalimetallen wie Calcium und Magnesium, und organischen Basen wie Methylamin, Ethylamin, Dimethylamin, Trimethylamin, Triethylamin, Pyridin, Piperazin und Piperidin gebildet werden.
Unter den erfindungsgemäßen Verbindungen ist Verbindung 1 eine bekannte Verbindung, die als Metabolit, der aus Aspergillus ochraceus stammt, isoliert wurde [Yamazaki et al., Chem. Pharm. Bull., 20(10), 2276-2278 (1972)]. Allerdings kann diese Verbindung z. B. auch nach dem folgenden Reaktionsschema hergestellt werden. Reaktionsschema I
Darüber hinaus können die neuen Verbindungen der Formel (II) z. B. nach dem folgenden Reaktionsschema II hergestellt werden. Reaktionsschema II
Genauer ausgedrückt, in dem obigen Reaktionsschema I kann die Ausgangsverbindung 1 z. B. nach dem Verfahren produziert werden, das in J. Org. Chem., Band 54, 4218-4220, 1989 beschrieben ist. Dann kann jede der im obigen Reaktionsschema I dargestellten Reaktionsstufen nach einem per se bekannten Verfahren durchgeführt werden. Diese Verfahren sind in der japanischen Offenlegungsschrift Nr. 163263/93 beschrieben, auf diese sollte bei Bedarf Bezug genommen werden. Die Inhalte dieses Patents werden hier durch Referenz aufgenommen.
Als nächstes wird im Reaktionsschema II ein 3-Halogenmethylisocoumarin-Derivat, z. B. der Formel 4 oder 5, mit einem Alkalimetallcyanid (z. B. KCN oder NaCN) in einem polaren Lösungsmittel wie Dimethylsulfoxid, Dimethylformamid oder Tetrahydrofuran umgesetzt, um die entsprechende Nitrilverbindung der Formel 8 zu bilden. Dann wird die resultierende Nitrilverbindung mit einem Silylierungsmittel (z. B. tert- Butyldimethylchlorsilan oder tert-Butyldimethylsilyltriflat) in einem organischen Lösungsmittel wie Dimethylformamid, Methylenchlorid oder Toluol, in Gegenwart einer organischen Base (z. B. Imidazol oder Dimethylpyridin) umgesetzt, so dass die Hydroxylgruppe in 8-Position geschützt wird. Danach wird diese Nitrilverbindung mit einem Alkylhalogenid in einem Reaktionslösungsmittel, z. B. ein Methylenchlorid-Wasser-System, in Gegenwart eines Phasentransferkatalysators und eines Alkalimetallhydroxids (z. B. Natriumhydroxid oder Kaliumhydroxid) umgesetzt, so dass eine Nitrilverbindung der Formel 9 gebildet wird. Bei Bedarf kann die Hydroxyl-Schutzgruppe in der 8- Position des Isocoumarin-Gerüsts eliminiert werden. Die vorhergehenden Reaktionen können üblicherweise bei einer Temperatur im Bereich von 0ºC bis zur Rückflusstemperatur des verwendeten Lösungsmittels durchgeführt werden.
Die Verbindungen der Formeln 8 und 9, die so erhalten werden, wie auch die Verbindungen, die durch Entfernung der Hydroxylschutzgruppe daraus erhalten werden, wurden in der Literatur des Standes der Technik noch nicht beschrieben und sind z. B. als Zwischenprodukte für die Synthese der Verbindungen der Formel (II) gemäß der vorliegenden Erfindung nützlich. Anstelle der vorstehend genannten Silylgruppe können in entsprechender Weise andere Gruppen, z. B. Trimethylsilyl, Acetyl, Propionyl, Benzoyl, Methoxymethyl, Methoxyethoxymethyl und Benzyloxymethyl als Hydroxylschutzgruppen verwendet werden. Die vorliegende Erfindung stellt auch Verbindungen der Formeln 8 und 9 bereit, die diese Schutzgruppen haben.
Die Bildung einer Verbindung der Formel (II) aus einer Verbindung der Formel 8 oder 9 kann z. B. durch Behandlung der Verbindung der Formel 8 oder 9 bei 50 bis 150ºC für 1 bis 20 Stunden mit einer organischen Säure wie z. B. p-Toluolsulfonsäure oder Methansulfonsäure oder einer anorganischen Säure wie Salzsäure, Schwefelsäure oder Phosphorsäure durchgeführt werden. Als Resultat dieser Reaktion macht die vorstehend genannte Verbindung nicht nur die Entfernung der Hydroxylschutzgruppe durch, sondern auch die Hydrolyse der Cyanogruppe und demnach ihre Umwandlung in eine Carboxylgruppe.
Ein Salz des so erhaltenen Carbonsäurederivats kann durch die per se bekannte Salzbildungsreaktion mit der entsprechenden basischen Verbindung gebildet werden.
Die oben beschriebenen Verbindungen der vorliegenden Erfindung und pharmazeutisch annehmbare Salze davon zeigen eine Inhibitorwirkung, z. B. auf Collagen-induzierte Arthritis, wie es später vollständiger beschrieben werden wird. Dementsprechend werden sie als nützlich zur Prävention und Behandlung von Erkrankungen angesehen, die in erster Linie mit einer Anomalie bei der immunologischen Regulationsfunktion verbunden sind und die Autoimmunerkrankungen wie z. B. chronischen Rheumatismus, systemischen Lupus erythematodes, systemisches Sklerom, Pemateriitis nodosa, Colitis ulcerosa und Jugenddiabetes; bösartigen Tumoren, schweren Infektionserkrankungen und dergleichen einschließen.
Darüber hinaus haben sie auch eine Inhibitorwirkung, z. B. auf eine Vaskularisierung, die durch Tumorzellen, die nach dem. Transplantationsverfahren subkutan im Mausrücken implantiert wurden. Folglich wird davon ausgegangen, dass sie zur Prävention und Behandlung von Krankheiten, die in erster Linie mit einer Vaskularisierung verbunden sind, wie z. B. Wachstum und Metastasenbildung von bösartigen festen Tumoren, diabetische Retinopathie, verschiedene chronische Entzündungskrankheiten, Psoriasis, Vaskularisierung, die eine Keratoplastie begleitet, und Arteriosklerose einsetzbar sind. Im Vergleich zu MI43, von dem bekannt ist, dass es eine immunologische Regulationswirkung hat, haben die erfindungsgemäßen Verbindungen darüber hinaus eine höhere in vivo-Stabilität. Speziell im Fall einer oralen Verabreichung weisen sie eine ausgezeichnete Bioverfügbarkeit, einschließlich einer beachtlich hohen in vivo-Stabilität, auf. Darüber hinaus können sie wirksam und sicher ohne Verursachung einer nachweisbaren Toxizität eingesetzt werden.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können allein eingesetzt werden, z. B. um pharmazeutische Präparate zur Prävention oder Behandlung von Erkrankungen, die mit Anomalien bei der immunologischen Regulationsfunktion oder Vaskularisierung verbunden sind, herzustellen. Allerdings können sie vorzugsweise in Kombination mit pharmazeutisch annehmbaren Additiven (bzw. Zusatzstoffen) verwendet werden. Solche Additive umfassen Verdünnungsmittel und Exzipienzien, die üblicherweise auf diesem technischen Gebiet verwendet werden, z. B. Füllstoffe, Streckmittel, Bindemittel, Feuchthaltemittel, Zerfallsmittel, Zerfallsinhibitoren, oberflächenaktive Mittel und Gleitmittel. Was solche pharmazeutischen Präparate angeht, können entsprechend dem therapeutischen Zweck verschiedene Dosierungsformen ausgewählt werden. Typische Beispiele hierfür umfassen Tablette, Pillen, Pulver, Lösungen, Suspensionssirupe, Emulsionen, Granulate, Kapseln, Suppositorien und Injektionen (Lösungen, Suspensionen, usw.). Der besonders bevorzugte Verabreichungsweg, der es ermöglicht, dass die erfindungsgemäßen Verbindungen ihre Wirkungen zeigen, ist anerkannterweise eine orale Verabreichung. Unter, den oben beschriebenen Dosierungsformen sind daher Dosierungsformen für eine orale Verabreichung bevorzugt.
Bei der Formung der Verbindungen zu Tabletten kann eine große Vielzahl bekannter Träger verwendet werden. Diese umfassen z. B. Exzipienzien wie Lactose, Saccharose, Natriumchlorid, Glucose, Harnstoff, Stärke, Calciumcarbonat, Kaolin, kristalline Cellulose und Siliciumdioxid; Bindemittel wie Wasser, Ethanol, Propanol, einfachen Sirup, Glucoselösung, Stärkelösung, Gelatinelösung, Carboxymethylcellulose, Shellac, Methylcellulose, Kaliumphosphat und Polyvinylpyrrolidon; Zerfallsmittel wie getrocknete Stärke, Natriumalginat, Agarpulver, Laminaranpulver, Natriumhydrogencarbonat, Calciumcarbonat, Polyoxyethylensorbitanfettsäureester, Natriumlaurylsulfat, Stearinsäuremonoglycerid, Stärke und Lactose; Zerfallsinhibitoren wie Saccharose, Kakaobutter und hydriertes Öl; Absorptionsbeschleuniger wie quaternärer Ammoniumbasen und Natriumlaurylsulfat; Feuchthaltemittel wie Glycerin und Stärke; Adsorbenzien wie Stärke, Lactose, Kaolin, Bentonit und kolloidales Siliciumdioxid, und Gleitmittel wie z. B. gereinigter Talg, Stearinsäuresalze, Borsäurepulver und Polyethylenglycol.
Auf Wunsch können solche Tabletten in üblicherweise unter Bildung zuckerbeschichteter Tabletten, gelatinebeschichteter Tabletten, filmbeschichteter Tabletten, zweischichtiger Tabletten und mehrschichtiger Tabletten überzogen werden. Bei der Formung der Verbindungen zu Pillen kann eine große Vielzahl von Trägern, die auf diesem Gebiet bekannt sind, eingesetzt werden. Diese umfassen z. B. Exzipienzien wie Glucose, Lactose, Stärke, Kakaobutter, gehärtete Pflanzenöle, Kaolin und Talg; Bindemittel wie pulverförmiges Akaziengummi, pulverförmiges Tragacanth, Gelatine und Ethanol; und Zerfallsmittel wie Laminaran und Agar.
Bei der Formung der Verbindungen zu Suppositorien kann eine Vielzahl von Trägern, die auf diesem Gebiet bekannt sind, eingesetzt werden. Diese umfassen z. B. Polyethylenglycol, Kakaobutter, höhere Alkohole, Ester von höheren Alkoholen, Gelatine und halbsynthetische Glyceride.
Wenn die Verbindungen in injizierbare Lösungen und Suspensionen übergeführt werden, ist es bevorzugt, dass solche Lösungen und Suspensionen steril und gegenüber Blut isotonisch sind. Bei der Herstellung solcher Lösungen und Suspensionen können beliebige Verdünnungsmittel, die gängigerweise auf diesem Gebiet eingesetzt werden, verwendet werden. Diese umfassen z. B. Wasser, Ethanol, Propylenglycol, ethoxylierten Isostearylalkohol, Polyoxyisostearylalkohol und Polyoxyethylensorbitanfettsäureester. In diesem Fall können die Präparate Natriumchlorid, Glucose oder Glycerin in einer Menge enthalten, die zur Bildung einer isotonischen Lösung ausreicht. Darüber hinaus können gängige Solubilisierungsmittel, Puffer, Linderungsmittel und dergleichen hier ebenfalls verwendet werden. Darüber hinaus können auf Wunsch die Präparate zur oralen Verabreichung zusätzlich Färbemittel, Konservierungsmittel, Parfüms, Aromastoffe, Süßungsmittel und dergleichen sowie andere Arzneimittel enthalten.
Bezüglich des Gehalts der vorstehend genannten Verbindungen der vorliegenden Erfindung in pharmazeutischen Präparaten gemäß der Erfindung gibt es keine besondere Beschränkung, ihr Gehalt kann in weitem Rahmen variieren. Im Fall fester Präparate, z. B. Tabletten, Granulaten und Kapseln, kann der Gehalt der erfindungsgemäßen Verbindungen üblicherweise im Bereich von 1 bis 70 Gew.-%, vorzugsweise 5 bis 50 Gew.-%, bezogen auf die gesamte Zusammensetzung, liegen. Im Fall flüssiger Präparate, z. B. Lösungen, Injektionen und Suspensionen, kann er im Bereich von 0,1 bis 10 Gew.-% liegen.
Bezüglich des Verfahrens zur Verabreichung der erfindungsgemäßen Verbindungen gibt es keine besondere Beschränkung; sie können geeigneterweise entsprechend der Form des Präparats, dem Alter, Geschlecht und anderen Bedingungen des Patienten, dem Erkrankungsgrad und dergleichen verabreicht werden. Im Fall von Tabletten, Pillen, Lösungen, Suspensionsirupen, Emulsionen, Granulaten und Kapseln werden sie z. B. oral verabreicht. Obgleich eine orale Verabreichung bevorzugt ist, wie es oben beschrieben wurde, können sie entweder allein oder im Gemisch mit einer normalen Glucose- oder Aminosäurelösung zur Infusion intravenös als Injektionen verabreicht werden. Bei Bedarf können sie auch intramuskulär, intrakutan, subkutan oder intraperitoneal einzeln verabreicht werden. Im Fall von Suppositorien werden sie intrarektal verabreicht.
Die Dosierung der erfindungsgemäßen Verbindungen kann entsprechend dem Verabreichungsverfahren, dem Alter, Geschlecht und anderen Bedingungen des Patienten, dem Grad der Erkrankung und dergleichen erhöht oder verringert werden. Um im Körper des Tiers, dem sie verabreicht werden, eine pharmakologisch wirksame Menge zu erreichen, werden sie allerdings geeigneterweise z. B. in einer täglichen Dosis von 0,3 bis 300 mg/kg Körpergewicht bei der oralen Verabreichung und 0,03 bis 30 mg/kg Körpergewicht bei parentaraler Verabreichung verabreicht.
Von den erfindungsgemäßen Verbindungen wurden jede der Verbindungen 1, 2 und 3 oral oder intraperitoneal an 8 DBA/1J Mäuse in einer Dosis von 100 mg/kg Körpergewicht verabreicht. Kein Tier starb und kein Tier zeigte Anzeichen einer Toxizität. Dies scheint anzuzeigen, dass die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Verbindungen keine oder sehr geringe, wenn überhaupt, akute Toxizität haben. Darüber hinaus wurde Verbindung 1 in einer Dosis von 100 mg/kg Körpergewicht oder Verbindung 3 in einer Dosis von 30 mg/kg Körpergewicht 8 Mäusen des oben genannten Stamms oral über 40 Tage verabreicht. Kein Tier starb und kein Tier zeigte Anzeichen einer Toxizität. Somit haben die erfindungsgemäßen Verbindungen geringe subkutane Toxizität. Da davon ausgegangen wird, dass andere Verbindungen gemäß der Erfindung ähnliche Eigenschaften haben, können de erfindungsgemäßen Verbindungen sehr sicher eingesetzt werden.
Wie es später noch spezifischer beschrieben werden wird, weisen die Verbindungen gemäß der vorliegenden Erfindung in Tests, die Modelltiere für chronischen Rheumatismus und Modelltiere für Vaskularisierung verwenden, eine deutliche Wirkung auf. Andererseits zeigen sie keine inhibitorische (oder unterdrückende) Wirkung auf andere Enzyme, die durch Entzündung induziert werden, z. B. Cyclooxygenase (oder Prostaglandinendoperoxidsynthase) und Lipoxygenase, oder auf Carragenanödem, das als Modell für akute Entzündung dient. Dementsprechend werden die pharmazeutischen Präparate der vorliegenden Erfindung durch eine hochselektive Wirkung und einen hochselektiven Effekt gekennzeichnet. Außerdem zeigen die erfindungsgemäßen Verbindungen im Blut über 8 Stunden eine hohe Konzentration, wenn sie oral Mäusen verabreicht werden, was später noch spezifischer beschrieben wird; daher haben sie speziell zur Verwendung als orale Arzneimittel ausgezeichnete Eigenschaften.
Die vorliegende Erfindung wird anhand der vorliegenden Beispiele spezifischer erläutert. Allerdings sollen diese Beispiele den Umfang der vorliegenden Erfindung nicht beschränken.

Wirkung und Effekte

Inhibitoreffekt auf Collagen-induzierte Arthritis (Nr. 1)

Der präventive Effekt auf den Beginn von Collagen-induzierter Arthritis wurde unter Verwendung von DBA/1J-Mäusen in Gruppen aus 5 bis 8 untersucht. Spezifischerweise wurde Collagen Typ II mit einem gleichen Volumen an Freund's komplettem Adjuvans vermischt und emulgiert, um eine 1 mg/ml-Emulsion herzustellen. Mäuse wurden sensibilisiert, indem 0,1 ml dieser Emulsion intrakutan in den Schwanzansatz verabreicht wurden. Nach 21 Tagen wurden die Mäuse außerdem immunisiert, indem Collagen Typ II in der gleichen Weise wie vorher emulgiert wurde und 0,1 ml der Emulsion intraperitoneal verabreicht wurden, um Arthritis zu induzieren.
Ab dem Tag der ersten Sensibilisierung mit Collagen Typ II wurde Verbindung 1 einmal am Tag über 43 Tage in einer Dosis von 10 oder 30 mg/kg Körpergewicht oral verabreicht. Ihr Inhibitoreffekt auf Collagen-induzierter Arthritis wurde beurteilt, indem die Sohlendicken der Hinterbeine mit digitalen Noniusgreifzirkeln gemessen wurden. Die erhaltenen Resultate sind in Tabelle 1 angegeben. Tabelle 1 Inhibitoreffekt auf Collagen-induzierte Arthritis (Nr. 1)
Mittelwert ± Standardabweichung
unterscheidet sich deutlich von der Kontrollgruppe:
* p < 0,05, ** p < 0,01

Inhibitoreffekt auf Collagen-induzierte Arthritis (Nr. 2)

Tiere mit Arthritis, die in der gleichen Weise wie oben beschrieben induziert worden war, wurden in Gruppen von 7 bis 8 verwendet. Verbindung 3 wurde einmal am Tag für 21 Tage nach der zusätzlichen Immunisierung mit einer Dosis von 1, 3 oder 10 mg/kg Körpergewicht oral verabreicht. Zu Vergleichszwecken wurde MI43 in ähnlicher Weise einer anderen Gruppe in einer Dosis von 30 mg/kg Körpergewicht verabreicht. Entsprechend dem Grad der Rötung, Schwellung und Steife bei jedem der Vorderbeine und Hinterbeine der Versuchstiere wurde ihr Inhibitoreffekt auf Collagen-induzierte Arthritis auf der folgenden Basis durch eine Bewertungsskala von 0 bis 4 (mit einem maximalen Wert von 16) beurteilt.

Skala

0: Es wird kein Symptom beobachtet.
1: Nur eines der kleinen Gelenke, z. B. die der Zehen des Beins, zeigt Rötung und Schwellung.
2: Zwei oder mehr kleine Gelenke oder ein relativ großes Gelenk, z. B. das Handgelenk oder Sprunggelenk, zeigen Rötung oder Schwellung.
3: Die Hand oder der Fuß zeigt insgesamt Rötung und Schwellung.
4: Die Gesamtschwellung der Hand oder des Fußes erreicht seine Spitze und wird darüber hinaus von einer Gelenkssteife begleitet.
Die so erhaltenen Resultate sind in Tabelle 2 unten zusammengefasst. Tabelle 2 Inhibitoreffekt auf Collagen-induzierte Arthritis (Nr. 2)
Mittelwert ± Standardfehler
Deutlich verschieden von der Kontrollgruppe:
** p < 0,01
Aus den obigen Tabellen ist zu ersehen, dass die erfindungsgemäßen Verbindungen eine Collagen-induzierte Arthritis deutlich hemmten. Darüber hinaus reduzierte die Verabreichung der erfindungsgemäßen Verbindung im Fall einer oralen Verabreichung die Arthritis-Punktebewertung selbst bei einem Dosislevel von 30 mg/kg Körpergewicht deutlich, ungeachtet der Tatsache, dass die Verabreichung der Vergleichsverbindung (MI43) in einer Dosis von 30 mg/kg Körpergewicht keine signifikante Reduzierung bei der Arthritis-Punktebewertung verursachte.

Inhibitoreffekt auf eine Vaskularisierung unter Anwenden des subkutanen Transplantationsverfahrens am Mausrücken

Der Inhibitoreffekt der Verbindungen 1 und 3 gemäß der vorliegenden Erfindung auf die Neogenese von Tumorgefäßen, induziert durch den transplantierten Maustumor S180, wurde unter Verwendung des subkutanen Transplantationsverfahrens am Mausrücken untersucht. Genauer ausgedrückt, 1 · 10&sup7; S180-Zellen wurden in eine Kammer, gebildet durch Befestigen eines Milliporfilters mit einer Porengröße von 0,45 um an jeder Seite eines Milliporrings, injiziert. Nachdem das Injektionsloch verschlossen worden war, wurde diese Kammer in einen Luftsack transplantiert, welcher unter der Haut des Rückens einer männlichen ICR-Maus (9 bis 10 Wochen alt) gebildet worden war. Beginnend am Tag der Transplantation wurde oral eine Testverbindung oder eine Lösungsmittelkontrolle, die 0,5% Carboxymethylcelluloselösung enthielt, 5 Tage lang verabreicht. Nachdem die Haut am fünften Tag nach Transplantation abgetrennt wurde, wurde ein O-Ring mit einem Innendurchmesser von 10 mm, der dieselbe Form wie der Milliporring hatte, auf den Teil der Haut gelegt, der mit der Kammer in Kontakt war, unter einem Stereoskopmikroskop betrachtet und fotografiert.
Bei den so aufgenommenen Fotografien wurde der Vaskularisierungsgrad entsprechend der Anzahl 3 mm oder längerer gewundener Blutgefäße, die für Tumorgefäße charakteristisch sind, mit 0, 1, 2 oder 3 bewertet, wobei die Punktbewertung auf der folgenden Basis erfolgte.

Punktbewertung

0: Es wurde kein Tumorgefäß beobachtet.
1: Es wurde ein Tumorgefäß beobachtet.
2: Es wurden zwei Tumorgefäße beobachtet.
3: Es wurden drei oder mehr Tumorgefäße beobachtet.
Die mit Verbindung 1 erhaltenen Resultate sind in der folgenden Tabelle 3 angegeben. Tabelle 3 Inhibitoreffekt von Verbindung 1 auf die Vaskularisierung unter Verwendung des subkutanen Transplantationsverfahrens am Mausrücken
A: Gruppe, der Phosphatpuffer injiziert wurde (normale Gruppe).
B: Gruppe mit S180-Tumorzell-Injektion + Lösungsmittelverabreichung (Kontrollgruppe).
C: Gruppe mit S180-Tumorzell-Injektion + Verabreichung von Verbindung 1 (100 mg/kg Körpergewicht).
Die mit Verbindung 3 erhaltenen Resultate sind in der folgenden Tabelle 4 angegeben. Tabelle 4 Inhibitoreffekt von Verbindung 3 auf eine Vaskularisierung unter Anwendung des subkutanen Transplantationsverfahrens beim Mausrücken
A: Gruppe mit Phosphatpuffer-Injektion (normale Gruppe).
B: Gruppe mit S180-Tumorzellen-Injektion + Lösungsmittelverabreichung (Kontrollgruppe).
C: Gruppe mit S180-Tumorzelleninjektion + Verabreichung von Verbindung 3 (0,3 mg/kg).
D: Gruppe mit S180-Tumorzelleninjektion + Verabreichung von Verbindung 3 (1,0 mg/kg).
E: Gruppe mit S180-Tumorzelleninjektion + Verabreichung von Verbindung 3 (3 mg/kg).
F: Gruppe mit S180-Tumorzelleninjektion + Verabreichung von Verbindung 3 (10 mg/kg).
G: Gruppe mit S180-Tumorzelleninjektion + Verabreichung von MT 43 (100 mg/kg) (zum Vergleich).
* p < 0,05; ** p < 0,01 (Studenten's t-Test).
Aus den obigen Tabellen 3 und 4 ist zu ersehen, dass die orale Verabreichung von Verbindung 1 in einer Dosis von 100 mg/kg Körpergewicht und von Verbindung 3 in einer Dosis von 1 bis 10 mg/kg Körpergewicht eine Vaskularisierung, induziert durch die Tumorzellen S180 unter Anwendung des subkutanen Transplantationsverfahrens am Mausrücken, deutlich hemmte.

Konzentrationen an oral verabreichten Testverbindungen in Blutplasma

Verbindung 3 und MI43 wurden jeweils fastenden männlichen ICR-Mäusen (Gewicht 18 bis 21 g) in einer Dosis von 25 mg/kg oral verabreicht. Blutproben wurden 5 Minuten, 30 Minuten, 4 Stunden, 8 Stunden und 24 Stunden nach Verabreichung entnommen (3 Mäuse pro Untersuchungspunkt für Verbindung 3 und 5 Mäuse pro Untersuchungspunkt für MI43). Diese Blutproben wurden unter Erhalt von Blutplasmaproben zentrifugiert. Jede der Blutplasmaproben wurde der folgenden Vorbehandlung unterzogen und dann durch Hochleistungsflüssigkeistschromatographie (HPLC) analysiert. Zu 0,2 ml der Blutplasmaprobe wurden 1,8 ml einer gesättigten wässrigen Ammoniumsulfatlösung und 1,0 ml Methanol gegeben und damit vermischt. Dieses Gemisch wurde mit 3,5 ml Ethylacetat geschüttelt. Nachdem dieses Gemisch zentrifugiert worden war, wurde die Ethylacetatschicht abgetrennt. Darüber hinaus wurde die wässrige Schicht mit 3,5 ml Ethylacetat geschüttelt und anschließend zentrifugiert. Die so erhaltene Ethylacetatschicht wurde mit der vorher abgetrennten Ethylacetatschicht vereinigt und das Gemisch wurde unter reduziertem Druck zum Trocknen eingeengt. Der resultierende Rückstand wurde in 0,2 ml einer 50%igen wässrigen Acetonitrillösung wieder gelöst und als Probe für HPLC verwendet.
Die Analysebedingungen für HPLC (unter Verwendung des CCTD- Systems, hergestellt von Toso Co., Ltd.) waren wie folgt: Eine YMC-A-312-Säule (ODS 6 · 150 mm; hergestellt von YMC Co., Ltd.) wurde als Säule verwendet. Als mobile Phase wurde ein 60 : 40-Gemisch aus Acetonitril und 0,1%iger wässriger TFA für Verbindung 3 und ein 40 : 60-Gemisch aus Acetonitril und 0,1%iger TFA für MI43 verwendet. Die Restverbindung wurde mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 1,0 ml/min eluiert und durch W-Licht bei 244 nm detektiert.
Die Konzentrationen an Verbindung 3 und MI43 im Blutplasma sind in den Tabellen 5 und 6 angegeben und ihre Veränderungen mit der Zeit sind in den Fig. 1 und 2 dargestellt. Unveränderte Verbindung 3 erreichte 30 Minuten nach Verabreichung einen Spitzenwert und nahm dann ab. Ihre Konzentration im Blutplasma blieb selbst nach 8 Stunden hoch, fiel aber nach 24 Stunden auf einen sehr niedrigen Wert. Dagegen zeigte unverändertes MI43 nach 5 Minuten die höchste Konzentration und nahm dann apprupt ab. Außerdem wurden 5 Metaboliten von MI43 nachgewiesen. Tabelle 5 Konzentration an Verbindung 3 im Blutplasma Tabelle 6 Konzentration an MI43 (zum Vergleich) im Blutplasma
Metabolit A: Eine Verbindung so umgewandelt, dass sie in der 3-Position ein -COOH hat.
Metabolit B: Eine Verbindung, die Schwefelsäure an die Hydroxylgruppe in der 8-Position gebunden hat.
Metabolit C: Eine Verbindung, die Glucuronsäure an die Hydroxylgruppe in der 8-Position gebunden hat.
Metabolit D: Eine Verbindung, die so verändert ist, dass sie ein -OH in der 6-Position hat.
-: Unter der Nachweisgrenze.

Wirkung auf Carragheen-Ödem

Die Wirkung auf Carragheen-Ödem wurde unter Verwendung von ICR-Mäusen in Gruppen von 6 bis 7 untersucht. Genauer ausgedrückt, die Verbindung 3 wurde in eine Dosis von 3 oder 30 mg/kg Körpergewicht oral verabreicht. Als positives Kontrollarzneimittel wurde Indomethacin entsprechend in einer Dosis von 20 mg/kg Körpergewicht verabreicht. Nach 30 Minuten wurden 25 ul einer 1%igen Carragheen-Lösung subkutan in die Sohle des rechten Hinterbeins injiziert. Zwei Stunden nach Verabreichung von Carragheen wurde die Dicke der Sohle mit einem digitalen Nonius-Greifzirkel gemessen und das Ausmaß des Ödems (%) wurde auf der Basis der gemessenen Dicke vor Verabreichung berechnet. Die so erhaltenen Resultate sind in Tabelle 7 angegeben. Tabelle 7 Effekt auf Carragheen-Ödem
Mittelwert ± Standardfehler
Signifikant unterschiedlich zur Kontrollgruppe:
** p < 0,01
Aus der obigen Tabelle ist zu ersehen, dass die Verbindung 3 bei Verabreichung in Dosen von 33 mg/kg keinen Inhibitoreffekt auf ein Carragheen-Ödem hatte. Dagegen zeigte Indomethacin, ein antiinflammatorisches Mittel, bei einer Dosis von 20 mg/kg einen deutlichen Inhibitoreffekt.

Effekt auf Cyclooxygenase und Lipoxygenase

Der Inhibitoreffekt von Verbindung 3 auf Cyclooxygenase (oder Prostaglandinendoperoxidsynthase)-Aktivität wurde nach dem Verfahren von Evans et al. (Biochemical Parmacology, 36: 2035-2037, 1987) untersucht. Spezifischer ausgedrückt, ein Enzympräparat, das aus Schafsamenvesikeln stammte, wurde 1,5 Minuten in Gegenpart von 500 uM Arachidonsäure und 300 uM Verbindung 3 bei 27ºC inkubiert. Nachdem die Reaktion durch Zusatz von Trichloressigsäure zu dem Reaktionsgemisch gestoppt worden war, wurde seine Extinktion bei 532 nm gemessen.
Darüber hinaus wurde sein Inhibitoreffekt auf 5-Lipoxygenase nach dem Verfahren von Egan et al. (Journal of Biological Chemistry, 260: 11554-11559, 1985) untersucht. Spezifischer ausgedrückt, es wurde ein Enzympräparat verwendet, das von den basophilen Leukämiezellen (RBL-1) von Ratten stammte. Dieses Enzympräparat wurde zusammen mit 30 uM Verbindung 3 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, worauf der Zusatz von Linolensäure folgte. Danach wurde dieses Gemisch bei Raumtemperatur 8 Minuten inkubiert. Nachdem die Reaktion durch Zusatz einer Natriumhydroxidlösung gestoppt worden war, wurde seine Extinktion bei 234 nM gemessen.
Die so erhaltenen Resultate sind in der folgenden Tabelle 8 angegeben. Tabelle 8 Effekt auf Cyclooxygenase- und Lipoxygenase-Aktivität
n = 2
Aus der obigen Tabelle ist zu ersehen, dass Verbindung 3, die in einer Konzentration von 30 uM oder 300 uM verwendet wurde, keinen Inhibitoreffekt auf Cyclooxygenase oder Lipoxygenase hatte. Herstellungsbeispiele Beispiel 1: Herstellung von 8-Hydroxy-6-methoxy-1-oxo-1H-2- benzopyran-3-carbonsäure (Verbindung 1)
3,60 g (16,20 mmol) MI43 wurden in 100 ml Aceton gelöst und es wurden 14 ml Jones-Reagens unter Eiskühlung zugesetzt. Das resultierende Gemisch wurde 10 Minuten bei 0ºC gerührt. Nach Zusatz von 500 ml Wasser wurde das Reaktionsgemisch mit 1000 ml- und 500 ml-Portionen Ethylacetat extrahiert. Die organische Schicht wurde dreimal mit 200 ml-Portionen einer 20%igen wässrigen Natriumchloridlösung gewaschen. Die wässrige Schicht wurde erneut mit 20 ml Ethylacetat extrahiert und der resultierende Extrakt wurde zweimal mit 100 ml-Portionen einer 20%igen wässrigen Natriumchloridlösung gewaschen. Nach Kombination der ersten und zweiten Extrakte wurde das Gemisch viermal mit 300 ml-Portionen einer 5%igen wässrigen Natriumhydrogencarbonatlösung rückextrahiert. Nach Zusatz von. Wasser zur Herstellung eines Gesamtvolumens von 1400 ml wurde der Extrakt mit konzentrierter Salzsäure auf pH 3,0 eingestellt. Das resultierende weiße Präzipitat wurde durch Filtration gesammelt, im Vakuum getrocknet und in heißem Aceton gelöst. Diese Lösung wurde zur Entfernung von unlöslichem Material filtriert und das Filtrat wurde konzentriert. Der resultierende Feststoff wurde in 40 ml einer 10%igen wässrigen Methanollösung suspendiert, für 10 Minuten unter Rückfluss erhitzt und dann mit Eis abgekühlt. Die so gebildeten weißen Kristalle wurden abfiltriert und unter reduziertem Druck getrocknet, wodurch 2,36 g Verbindung 1 in 62%iger Ausbeute erhalten wurden.
¹H-NMR-Spekttum (400 MHz, DMSO-d&sub6;): Die Hauptabsorptionspeaks waren wie folgt:
δTMS (ppm): 3,88 (3H, s), 6,70 (1H, d, J = 2,0 Hz), 6,95 (1H, d, J = 2,0 Hz), 7,59 (1H, s), 10,98 (1H, s). Beispiel 2: Herstellung von 3-Chlormethyl-8-hydroxy-6- methoxy-1-oxo-1H-2-benzopyran
5,00 g (22,50 mmol) MI43 und 10,0 g (38,25 mmol) Triphenylphosphin wurden in 50 ml Tetrahydrofuran gelöst. 30 ml (244 mmol) Tetracchlorkohlenstoff wurden zugesetzt und das resultierende Gemisch wurde für 30 Minuten unter Rückfluss erhitzt. Nachdem das Reaktionsgemisch unter reduziertem Druck konzentriert worden war, wurden 18,46 g des resultierenden Rückstands in 47 ml Ethanol gelöst und dann unter Erhalt von 4,72 g der Titelverbindung in 87%iger Ausbeute umkristallisiert.
¹H-NMR-Spektrum (400 MHz, CDCl&sub3;): Die Hauptabsorptionspeaks sind wie folgt:
δTMS (ppm): 3,88 (3H, s), 4,33 (2H, s), 6,40 (1H, d, J = 2,4 Hz), 6,51 (1H, s) 6,53 (1H, d, J = 2,4 Hz), 11,00 (1H, s). Beispiel 3: Herstellung von 3-Cyanomethyl-8-hydroxy-6- methoxy-1-oxo-1H-2-benzopyran
5,00 g (20,78 mmol) des in Beispiel 2 erhaltenen 3- chlormethyl-8-hydroxy-6-methoxy-1-oxo-1H-2-benzopyrans wurden in 70 ml Dimethylsulfoxid gelöst. 4,29 g (83,11 mmol) Natriumcyanid wurden zugesetzt und das resultierende Gemisch wurde für 30 Minuten bei 15ºC unter Stickstoffatmosphäre gerührt. Nach Zusatz von 300 ml Wasser wurde das Reaktionsgemisch mit 600 ml und 3 · 250 ml-Portionen Ethylacetat extrahiert. Die organische Schicht wurde dreimal mit 200 ml-Portionen einer 20%igen wässrigen Natriumchloridlösung gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und unter reduziertem Druck auf etwa 300 ml konzentriert. Nach Zusatz von 3 g Aktivkohle wurde diese Lösung 10 Minuten unter Rückfluss erhitzt. Die Aktivkohle wurde mittels Filtration durch Celite entfernt und das Filtrat und die Waschflüssigkeiten wurden auf etwa 100 ml konzentriert. Die ausgefallenen Kristalle wurden durch Erhitzen unter Rückfluss gelöst und dann mit Eis abgekühlt. Die ausgefallenen Kristalle wurden abfiltriert, wodurch 4,08 g der Titelverbindung in einer Ausbeute von 84% erhalten wurden.
¹H-NMR-Spektrum (400 MHz, DMSO-d&sub6;): Die Hauptabsorptionspeaks sind wie folgt:
δTMS (ppm): 3,65 (2H, d, J = 1,1 Hz), 3,89 (3H, s), 6,42 (1H, d, J = 2,4 Hz), 6,54 (1H, d, J = 2,4 Hz), 6,58 (1H, s), 10,82 (1H, s). Beispiel 4: Herstellung von (8-Hydroxy-6-methoxy-1-oxo-1H-2- benzopyran-3-yl)essigsäure (Verbindung 2)
1,50 g (6,49 mmol) des in Beispiel 3 erhaltenen 3-Cyano-8- hydroxy-6-methoxy-1-oxo-1H-2-benzopyran wurden in 8 ml Essigsäure und 8 ml konzentrierter Salzsäure suspendiert, die resultierende Suspension wurde 5,5 Stunden lang bei 70ºC gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde konzentriert und mit 150 ml Ethylacetat extrahiert. Die organische Schicht wurde dreimal mit 50 ml-Portionen einer 20%igen wässrigen Natriumchloridlösung gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, unter reduziertem Druck konzentriert und im Vakuum unter Erhalt eines schwarzen Pulvers getrocknet. Es wurden 20 ml Ethanol und 0,3 g Aktivkohle zugesetzt und das resultierende Gemisch wurde 30 Minutenlang unter Rückfluss erhitzt. Nachdem die Aktivkohle entfernt worden war, wurden die weißen Kristalle, die sich nach Abkühlen gebildet hatten, abfiltriert und unter reduziertem Druck getrocknet, wobei 1,30 g der Titelverbindung (Verbindung 2) in 80%iger Ausbeute erhalten wurden.
IR-Absorptionsspektrum (KBr): Die charakteristischen Absorptionspeaks sind wie folgt (Einheit: cm&supmin;¹).
νmax: 1238, 1574, 1626, 1651, 1690, 1723.
¹H-NMR-Spektrum (400 MHz, DMSO-d&sub6;): Die Hauptabsorptionspeaks sind wie folgt:
δTMS (ppm): 3,62 (2H, s), 3,86 (3H, s), 6,56 (1H, d, J = 2,4 Hz), 6,63 (1H, d, J = 2,4 Hz), 6,66 (1H, s), 10,90 (1H, s). Beispiel 5: Herstellung von 8-tert-Butyldimethylsilyloxy-3- cyanomethyl-6-methoxy-1-oxo-1H-2-benzopyran
2,70 g (11,68 mmol) des in Beispiel 3 erhaltenen 3- Cyanomethyl-8-hydroxy-6-methoxy-1-oxo-1H-2-benzopyran wurden in 25 ml Dimethylformamid suspendiert. Nach und nach unter Eiskühlung wurden 1,59 g (23,4 mmol) Imidazol und 2,82 g (18,7 mmol) tert-Butyldimethylsilylchlorid zugesetzt und das resultierende Gemisch wurde 2 Stunden gerührt. Nach Beendigung der Reaktion wurde das Reaktionsgemisch mit Toluol vermischt, einmal mit 50 ml einer 10%igen wässrigen Natriumchloridlösung gewaschen und zweimal mit 50 ml-Portionen einer wässrigen Natriumchloridlösung gewaschen. Die Toluolschicht wurde über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, unter reduziertem Druck konzentriert und im Vakuum getrocknet. Der resultierende Rückstand wurde auf 20 ml Ethanol umkristallisiert, wodurch 3,77 g der Titelverbindung in 93%iger Ausbeute erhalten wurden.
¹H-NMR-Spektrum (400 MHz, CDCl&sub3;): Die Hauptabsorptionspeaks sind wie folgt:
δTMS (ppm): 0,28 (6H, s), 1,05 (9H, s), 3,59 (2H, d, J = 1,6 Hz), 3,87 (3H, s), 6,45 (3H, m). Beispiel 6: Herstellung von 8-tert-Butyldimethylsilyloxy-3- (1-cyanoethyl)-6-methoxy-1-oxo-1H-2-benzopyran
2,50 g (7,24 mmol) des in Beispiel 5 erhaltenen 8-tert- Butyldimethylsilyloxy-3-cyanomethyl-6-methoxy-1-oxo-1H-2- benzopyran wurden in 80 ml Methylenchlorid gelöst. 100 ml einer wässrigen 1 M Natriumhydroxidlösung wurden zugegeben und das resultierende Gemisch wurde auf 0ºC gekühlt. Während dieses Gemisch kräftig gerührt wurde, wurden 584 mg (1,81 mmol) Tetrabutylammoniumfluorid und danach 10 ml Methylenchlorid, die 0,92 ml (14,47 mmol) Methyloidid enthielten, zugesetzt, worauf sich ein Rühren bei 0ºC über 1 Stunde anschloss. Darüber hinaus wurden 10 ml Methylenchlorid, enthaltend 0,92 ml (14,47 mmol) Methyliodid zugesetzt, worauf 30 Minuten gerührt wurde. Nach Beendigung der Reaktion wurde die Methylenchloridschicht abgetrennt, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und unter reduziertem Druck konzentriert. Der resultierende Rückstand wurde durch Silicagelsäulenchromatographie [unter Verwendung von 130 g Wako Gel C-200 und Hexan/Ethylacetat (5 : 1)] gereinigt. Auf diese Weise wurden 1,01 g der Titelverbindung in 39%iger Ausbeute erhalten.
¹H-NMR-Spektrum (400 MHz, CDCl&sub3;): Die Hauptabsorptionspeaks sind wie folgt:
δTMS (ppm): 0,28 (6H, s), 1,05 (9H, s), 1,68 (3H, d, J = 7,2 Hz), 3,73 (1H, q, J = 7,2 Hz), 3,87 (3H, s), 6,45 (1H, d, J = 2,0 Hz), 6,46 (1H, d, J = 2,0 Hz), 6,48 (1H, s). Beispiel 7: Herstellung von 2-(8-Hydroxy-6-methoxy-1-oxo-1H- 2-benzopyran-3-yl)propionsäure (Verbindung 3)
1,63 g (4,72 mmol) des in Beispiel 6 erhaltenen 8-tert- Butyldimethylsilyloxy-3-(1-cyanoethyl)-6-methoxy-1-oxo-1H-2- benzopyran wurden in 5 ml Essigsäure und 5 ml konzentrierter Salzsäure gelöst; die resultierende Lösung wurde 12 Stunden bei 70ºC gerührt. Nachdem das Reaktionsgemisch abgekühlt worden war, wurden 10 ml Wasser zugesetzt, so dass Kristalle ausfielen. Diese Kristalle wurden durch Filtration gesammelt, mit Wasser gewaschen und unter reduziertem Druck getrocknet, um 1,21 g Rohkristalle der Titelverbindung zu erhalten. Nach Zusatz von 8 ml Ethanol wurde das resultierende Gemisch unter Rückfluss erhitzt und dann abgekühlt. Die so gebildeten schwachgelben Kristalle wurden abfiltriert und unter reduziertem Druck getrocknet, wodurch 1,04 g der Titelverbindung (Verbindung 3) in 80%iger Ausbeute erhalten wurden.
¹H-NMR-Spektrum (400 MHz, DMSO-d&sub6;): Die Hauptabsorptionspeaks sind wie folgt:
δTMS (ppm): 1,40 (3H, d, J = 7,2 Hz), 3,70 (1H, q, J = 7,2 Hz), 3,86 (3H, s), 6,56 (1H, d, J = 1,6 Hz), 6,67 (1H, d, J = 1,6 Hz), 6,68 (1H, s), 10,90 (1H, s).

Beispiel 8: Herstellung von Kapseln

20 mg Verbindung 1, die in der in Beispiel 1 beschriebenen Weise hergestellt worden war, 180 mg Lactose und 1 mg Magnesiumstearat werden gründlich miteinander vermischt (die angegebenen Mengen sind für eine Kapsel). Harte Gelatinekapseln Nr. 3 werden jeweils mit etwa 200 mg der resultierenden Mischung gefüllt.

Beispiel 9: Herstellung von Tabletten

10 mg Verbindung 2, die wie in Beispiel 4 beschrieben hergestellt worden war, 120 mg Lactose und 57 mg Maisstärke werden gut vermischt (die angegebenen Mengen gelten für eine Tablette). Dieses Gemisch wird durch Vermischen mit einer 10%igen Stärkepastelösung granuliert und das resultierende Granulat wird gut mit 60 mg Maisstärke und 3 mg Magnesiumstearat vermischt (die angegebenen Mengen gelten für eine Tablette). Das resultierende Gemisch wird zu Tabletten mit einem Durchmesser von 8 mm und einer Höhe von etwa 250 mg verformt.

Beispiel 10: Herstellung eines Suspensionssirup

100 mg Verbindung 3, die wie in Beispiel 7 beschrieben hergestellt worden war, 100 mg Carboxymethylcellulosenatrium, 10 mg Methylparahydroxybenzoat, 14 mg Ethylparahydroxybenoat, 40 ml Sirup und 10 ml gereinigtes Wasser wurden unter Bildung einer Suspension gut vermischt (die angegebenen Mengen gelten für eine Flasche). Die Suspension wird in eine Dosierflasche gegossen.

Industrielle Verwertbarkeit

Erfindungsgemäß werden Verbindungen oder pharmazeutische Präparate bereitgestellt, die einen ausgezeichneten immunologischen Regulationseffekt und einen ausgezeichneten Inhibitoreffekt auf die Vaskularisierung haben. Dementsprechend ist die vorliegende Erfindung in der pharmazeutischen Industrie von Bedeutung.

Claims

1. Pharmazeutisches Präparat, das ein pharmazeutisch annehmbares Zusatzmittel und eine pharmakologisch wirksame Menge einer Verbindung der Formel (I)

worin R ein Wasserstoffatom oder eine C&sub1;&submin;&sub6;-Alkylgruppe ist und n eine ganze Zahl von 0 oder 1 ist, oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes davon umfasst.

2. Pharmazeutisches Präparat nach Anspruch 1, das zur Prävention oder Behandlung von Krankheiten, die mit einer Anomalie bei der immunologischen Regulationsfunktion oder Vaskularisierung verbunden ist.

3. Pharmazeutisches Präparat nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei n die ganze Zahl 1 ist.

4. Pharmazeutisches Präparat nach Anspruch 2 oder Anspruch 3, wobei die Krankheiten Autoimmunkrankheiten sind.

5. Pharmazeutisches Präparat nach einem der Ansprüche 1 bis 4, das eine Dosierungsform zur oralen Verabreichung hat.

6. Verwendung einer Verbindung der Formel (I)

worin R ein Wasserstoffatom oder eine C&sub1;&submin;&sub6;-Alkylgruppe ist und n eine ganze Zahl von 0 oder 1 ist, oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes davon bei der Herstellung eines pharmazeutischen Präparats zur Prävention oder Behandlung von Krankheiten, die mit einer Anomalie bei der immunologischen Regulationsfunktion oder Vaskularisierung verbunden ist.

7. Verwendung nach Anspruch 6, wobei n die ganze Zahl 1 ist.

8. Verwendung nach Anspruch 6 oder Anspruch 7, wobei die Krankheiten Autoimmunkrankheiten sind.

9. Verwendung nach einem der Ansprüche 6 bis 8, wobei das pharmazeutische Präparat eine Dosierungsform zur oralen Verabreichung hat.

10. Verbindung der Formel (I-a)

worin R ein Wasserstoffatom oder eine C&sub1;&submin;&sub6;-Alkylgruppe ist, oder ein Salz davon.

11. Verbindung der Formel (II)

worin R ein Wasserstoffatom oder eine C&sub1;&submin;&sub6;-Alkylgruppe ist und A ein Wasserstoffatom oder eine Schutzgruppe ist.