DE3855591T2 - Verfahren zur Herstellung eines biologisch-aktiven Peptides durch Expression von modifizierten Speicherproteingenen in transgenetischen Pflanzen - Google Patents
Verfahren zur Herstellung eines biologisch-aktiven Peptides durch Expression von modifizierten Speicherproteingenen in transgenetischen PflanzenInfo
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Description
- Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Produktion von nützlichen biologisch aktiven Polypeptiden durch die Modifikation geeigneter Pflanzengene.
- Die Produktion von bestimmten biologisch aktiven Polypeptiden in leicht zu reinigender Form und in nützlichen Mengen ist in den meisten Fällen immer noch mit beträchtlichen Schwierigkeiten verbunden.
- Alternative Verfahren sind die chemische Synthese oder die Produktion durch gentechnisch veränderte Mikroorganismen. Das erste Verfahren ist sehr teuer und führt oft nicht zu Polypeptiden mit der korrekten Konformation. Die zuletzt genannte Alternative ist infolge der Probleme der Instabilität des Polypeptids, der intrazellulären Ausfällung und der Reinigung des Produkts zu einer reinen Form schwierig. Zusätzlich sind einige Peptidklassen einschließlich Hormonpeptide nur nach weiteren Prozessierungsschritten, wie der korrekten Disulfidbrückenbildung, Acetylierung, Glycosylierung oder Methylierung, völlig aktiv. In der Natur werden Disulfidbrücken mit hoher Effizienz gebildet, weil sie kotranslational durch die Proteindisulfidisomerase während der Membrantranslokation der Vorläufer katalysiert werden. Die aktive Form wird dann aus dem Vorläufer durch proteolytische Spaltverfahren gebildet.
- Chemisch synthetisierte oder in prokaryontischen Systemen überproduzierte Peptide werden im allgemeinen in einer reduzierten Form erhalten, und die Disulfidbrücken müssen dann durch milde Oxidation der Cysteinreste gebildet werden. Da man oft von dem völlig denaturierten "geknäuelten" Zustand des Peptids ausgeht, ist die Disulfidbrückenbildung dann ein Zufallsprozeß, bei dem intermolekulare Brücken (die Aggregate mit höherem Molekulargewicht ergeben) und inkorrekte Disulfidbindungen (welche inaktive Peptide ergeben) zusätzlich zu dem korrekt gefalteten Peptid erzeugt werden können.
- Die Verwendung von Pflanzenzellen als Systeme für die Produktion von bestimmten Peptiden wurde ebenfalls vorgeschlagen, z.B. in der PCT/US86/01599. Es gibt keinen Nachweis in dem Patent, daß die vorgeschlagenen Verfahren, deren Prinzip darin liegt, daß man das Peptid nach bekannten Techniken (EP 83112985.3) konstitutiv zur Expression bringt, den Erhalt eines hohen Expressionsgrades ohne Störung der Pflanzenphysiologie und hoher Ausbeuten bei der Gewinnung der Peptide durch ihre Abtrennung von den Pflanzenproteinen erlauben. Dies ist insbesondere der Fall, wenn die ganze Pflanze als solche verwendet wird und im Boden gezüchtet wird.
- Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, diese Schwierigkeiten zu überwinden, ökonomisch wertvolle Verfahren und gentechnisch erzeugte lebende Substanz bereitzustellen, die in großen Mengen produziert werden kann, wobei die bestimmten Polypeptide sowohl in großen Mengen synthetisiert werden können, ohne die Physiologie der lebenden Substanz zu stören, und in einer Form produziert werden können, die einen hohen Grad physiologischer Aktivität entsprechend dem Wildtyppeptid, das die gleichen oder im wesentlichen die gleichen Aminosäuresequenzen besitzt, erlaubt und leicht aus der lebenden Substanz isoliert werden kann.
- Insbesondere liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Produktion eines interessierenden Polypeptids bereitzustellen, wobei eine genetisch modifizierte Pflanzen-DNA und lebendes Pflanzenmaterial, das die genetisch modifizierte DNA einschließt, die in den Zellen des Pflanzenmaterials replizierbar ist, produziert werden, wobei die genetisch modifizierte Pflanzen-DNA Sequenzen enthält, die die bestimmten Polypeptide codieren, deren Expression unter der Kontrolle eines gegebenen Pflanzenpromotors steht, der die Expression in mindestens einer Entwicklungsstufe der entsprechenden Pflanzen steuert. Diese Entwicklungsstufe wird so gewählt, daß die Expression in Pflanzenorganen oder in Pflanzengewebe vorkommt, die in hohen Mengen und leicht isolierbar produziert werden.
- Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Ausnutzung der Fähigkeit von Samenspeicherproteinen, in großen Mengen in Pflanzen produziert zu werden und in einer bestimmten Entwicklungsstufe der Pflanzen exprimiert zu werden, insbesondere in der Stufe der Samenbildung. Insbesondere soll erfindungsgemäß die Leichtigkeit ausgenützt werden, mit der wasserlösliche Speicherproteine aus den entsprechenden Pflanzensamen isoliert werden können.
- Die Expression fremder Gene in Pflanzen ist gut etabliert (De Blaere et al., 1987). In mehreren Fällen wurden Gene für Samenspeicherproteine in andere Pflanzen überführt. In mehreren Fällen wurde gezeigt, daß in der neuen Umgebung das übertragene Gen für ein Samenspeicherprotein gewebsspezifisch und entwicklungsreguliert exprimiert wird (Beachy et al., 1985; Okamuro et al., 1986; Sengupta-Gopalan et al., 1985; Higgins et al., 1986). Dies bedeutet, daß das übertragene Gen nur in den geeigneten Teilen des Samens und nur zur normalen Zeit exprimiert wird. Es wurde auch in mindestens einem Fall gezeigt, daß fremde Samenspeicherproteine in den Proteinkörpern der Wirtspflanze lokalisiert sind (Greenwood und Chrispeels, 1985). Es wurde weiter gezeigt, daß stabile und funktionelle Messenger-RNAs erhalten werde können, wenn eine cDNA anstelle eines vollständigen Gens, das Introns enthält, als Basis für das chimäre Gen verwendet wird (Chee et al., 1986).
- Samenspeicherproteine machen bis zu 90 % des gesamten Samenproteins in den Samen vieler Pflanzen aus. Sie werden als Quelle für die Ernährung für junge Sämlinge in der Zeitspanne unmittelbar nach der Keimung verwendet. Die sie codierenden Gene sind strikt reguliert und werden hochgewebsspezifisch und stadiumsspezifisch exprimiert (Walling et al., 1986; Higgins, 1984). So werden sie fast ausschließlich in sich entwickelnden Samen exprimiert, und unterschiedliche Klassen von Samenspeicherproteinen können in unterschiedlichen Entwicklungsstadien des Samens exprimiert werden. Sie sind allgemein auf ihre intrazelluläre Lokalisation beschränkt und werden in membrangebundenen Organellen, sog. Proteinkörpern oder Proteinspeichervakuolen, gespeichert. Diese Organellen stellen eine proteasefreie Umgebung dar und enthalten oft auch Proteaseinhibitoren. Diese Proteine werden nach dem Blühen abgebaut und dienen vermutlich als Nährquelle für sich entwickelnde Samen. Einfache Reinigungstechniken für mehrere Klassen dieser Proteine wurden beschrieben.
- Samenspeicherproteine werden allgemein auf der Basis ihrer Löslichkeit und Größe (genauer Sedimentationsrate, beispielsweise wie von Svedberg definiert) (in Stryer, L. Biochemistry, 2. Aufl., W.H. Freeman, New York, S. 599) klassifiziert. Eine spezielle Klasse von Samenspeicherproteinen wurde untersucht, die 2S-Samenspeicherproteine, die wasserlösliche Albumine sind, und so leicht von anderen Proteinen abgetrennt werden. Ihre kleine Größe vereinfacht auch ihre Reinigung. Mehrere 2S-Speicherproteine wurden auf entweder der Protein- oder cDNA-Ebene charakterisiert (Crouch et al., 1983; Sharief und Li, 1982; Ampe et al., 1986; Altenbach et al., 1987; Ericson et al., 1986; Scofield und Crouch, 1987; Josefsson et al., 1987; und die in der vorliegenden Anmeldung beschriebene Arbeit). 2S-Albumine bilden sich in der Zelle aus zwei Untereinheiten von 6 bis 9 bzw. 3 bis 4 Kilodalton (kd), die durch Disulfidbrücken verknüpft sind.
- Die Arbeit in den vorstehend genannten Dokumenten zeigte, daß 2S-Albumine als komplexes Präpropeptid synthetisiert werden, deren Organisation von den 2S-Albuminen vieler unterschiedlicher Arten geteilt wird und diagrammartig für drei dieser Arten in Fig. 2 dargestellt ist. Mehrere vollständige Sequenzen sind in Fig. 2 gezeigt.
- Bezüglich Fig. 2 wird im Hinblick auf die Proteinsequenzen der 2S-Albumine folgendes ausgeführt. Für B. napus, B. excelsia und A.thaliana wurden sowohl die Proteinals auch die DNA-Sequenzen bestimmt. Für R. communis ist nur die Proteinsequenz verfügbar (B. napus von Crouch et al., 1983 und Ericson et al., 1986; B. excelsia von Ampe et al., 1986, de Castro et al., 1987 und Altenbach et al., 1987, R. communis von Sharief et al., 1982). Kästen zeigen Homologien an, hochgestellte Punkte die Position der Cysteine.
- Der Vergleich der Proteinsequenzen zu Beginn des Vorläufers mit Standardkonsensussequenzen für Signalpeptide zeigt, daß der Vorläufer nicht ein, sondern zwei Segmente am aminoterminalen Ende besitzt, die in dem reifen Protein nicht vorhanden sind, wobei das erste eine Signalsequenz ist (Perlman und Halvorson, 1983) und das zweite als das aminoterminale prozessierte Fragment bezeichnet wurde (das sog. ATPF). Signalsequenzen dienen dazu, den kotranslationalen Transport des naszierenden Polypeptids durch die Membran des endoplasmatischen Retikulums zu gewährleisten (Blobel, 1980) und finden sich in vielen Proteintypen einschließlich aller bis heute untersuchter Samenspeicherproteine (Herman et al., 1986). Dies ist für die geeignete Kompartimentierung des Proteins wichtig. Das Protein wird weiter so gefaltet, daß korrekte Disulfidbrücken gebildet werden. Dieses Verfahren ist wahrscheinlich an der luminalen Seite der Membran des endoplasmatischen Retikulums lokalisiert, an der das Enzym Disulfidisomerase lokalisiert ist (Roden et al., 1982; Bergman und Kuehl, 1979). Man nimmt an, daß nach der Translokation durch die Membran des endoplasmatischen Retikulums die meisten Speicherproteine über das endoplasmatische Retikulum in die Golgi-Körper transportiert werden, und von den zuletzt genannten in kleinen membrangebundenen Vesikeln ("dichte Vesikel") in die Proteinkörper (Chrispeels, 1983; Craig und Goodchild, 1984; Lord, 1985). Daß das Signalpeptid kotranslational entfernt wird, bedeutet, daß die Signale, die den weiteren Transport der Samenspeicherproteine in die Proteinkörper steuern, im Rest der vorhandenen Proteinsequenz liegen müssen.
- 2S-Albumine enthalten Sequenzen am Aminoende des Vorläufers neben der Signalsequenz, die in dem reifen Polypeptid nicht vorhanden sind. Dies ist nicht allgemein bei allen Speicherproteinen so. Dieses aminoterminale prozessierte Fragment ist mit Pro in Fig. 1 und ATPF in Fig. 1A markiert.
- Zusätzlich, wie in Fig. 1 und 1A gezeigt, werden mehrere Aminosäuren, die zwischen den kleinen und großen Untereinheiten in dem Vorläufer lokalisiert sind, entfernt (markierte Bindung in Fig. 1 und IPF in Fig. 1A, das für internes prozessiertes Fragment steht). Ferner werden mehrere Reste von dem carboxylterminalen Ende des Vorläufers entfernt (als Schwanz markiert in Fig. 1 und CTPF in Fig. 1A, was für carboxylterminales prozessiertes Fragment steht). Die zelluläre Lokalisation dieser zuletzt genannten Verfahrensschritte ist ungewiß, aber wahrscheinlich finden sie in den Proteinkörpern statt (Chrispeels, 1983; Lord, 1985). Als Ergebnis dieser Prozessierungsschritte verbleiben die kleine Untereinheit (Sm1.Sub) und die große Untereinheit. Diese sind durch Disulfidbrücken, wie nachstehend diskutiert, verknüpft.
- Wenn die Proteinsequenzen der 2S-Albumine unterschiedlicher Pflanzen verglichen werden, werden große strukturelle Ähnlichkeiten beobachtet. Dies ist insbesondere in den Fig. 2 und 2A dargestellt, die die Aminosäuresequenzen der kleinen Untereinheit bzw. der großen Untereinheit von repräsentativen 2S-Samenspeicheralbuminproteinen unterschiedlicher Pflanzen zeigen, d.h.:
- R. Comm.: Ricinus communis
- A. thali.: Arabidopsis thaliana
- B. napus: Brassica napus
- B. excel.: Bertholletia excelsa (Paranuß)
- Es wird darauf hingewiesen, daß in den Fig. 2 und 2A
- - die Aminosäuresequenzen der Untereinheiten sich über mehrere Zeilen erstrecken;
- - die Cysteingruppen der Aminosäuresequenzen der beispielhaft aufgeführten Speicherproteine und identische Aminosäuren in mehreren der Proteine in vertikale Ausrichtung gebracht wurden; die Striche, die in einigen dieser Sequenzen vorkommen, stellen fehlende Aminosäuren dar, mit anderen Worten, direkte Bindungen zwischen den nächsten Aminosäuren, die sie umgeben;
- - Aminosäuresequenzen, die in den unterschiedlichen Proteinen im wesentlichen konserviert sind, eingerahmt sind.
- Es wird beobachtet, daß alle Sequenzen acht Cysteinreste enthalten (die ersten und die zweiten in der kleinen Untereinheit, der Rest in der großen Untereinheit), die an Disulfidbrücken beteiligt sein können, wie schematisch in Fig. 3 gezeigt ist, die ein hypothetisches Modell (für die Zwecke der vorliegenden Diskussion) statt einer Darstellung der echten Struktur, die experimentell für 2S-Albumin von Arabidopsis thaliana bewiesen wurde, darstellt. Das hypothetische Modell wurde durch die durch Disulfidbrücken vermittelte Schleifenbildung in tierischen Albuminen, wie Serumalbuminen (Brown, 1976), α-Fetoprotein (Jagodzinski et al., 1987; Morinaga et al.; 1983) und dem Vitamin D-bindenden Protein angeregt, bei dem analoge konstante C-C-Dubletts und C-X- C-Tripletts beobachtet wurden (Yang et al., 1985).
- Ferner sind die Entfernungen zwischen den Cysteinresten innerhalb jeder Untereinheit im wesentlichen konserviert, ausgenommen die Entfernung zwischen dem vierten und fünften Cysteinrest in der großen Untereinheit. Dies legt nahe, daß diese Anordnungen strukturell wichtig sind, aber daß eine gewisse Variation in der großen Untereinheit zwischen dem vierten und fünften Cystein zulässig ist.
- Die Erfindung beruht auf der Bestimmung der Regionen des Speicherproteins, die ohne begleitende Veränderung der Eigenschaften und des korrekten Prozessierens des modifizierten Speicherproteins in Pflanzensamen von transgenen Pflanzen modifiziert werden können. Diese Region (schematisch in Fig. 3 durch einen vergrößerten schraffierten Teil gezeigt) wird in den nachstehenden Beispielen mit dem Ausdruck "hypervariable Region" bezeichnet. Die Fig. 3 zeigt auch die jeweiligen Positionen der anderen Teile der Vorläufersequenz einschließlich des "IPF"-Abschnitts, der die kleine Untereinheit und die große Untereinheit des Vorläufers trennt, sowie die Anzahl der Aminosäuren (aa) in im wesentlichen konservierten Teilen der Cysteinreste der Proteinuntereinheiten. Die Prozessierungsspaltstellen werden durch die Symbole gezeigt.
- Die Samen vieler Pflanzen enthalten Albumine von etwa der gleichen Größe wie die vorstehend diskutierten Speicherproteine. Jedoch wird hier zur leichteren Beschreibung der Ausdruck "2S-Albumine" verwendet, und er bezieht sich auf Samenproteine, deren Gene einen Peptidvorläufer mit der in Fig. 1 gezeigten allgemeinen Organisation codieren und die zu einer Endform, bestehend aus zwei Untereinheiten, die durch Disulfidbrücken verknüpft sind, prozessiert werden. Dies soll jedoch nicht dahingehend verstanden werden, daß dadurch ausgesagt wird, daß das nachstehend beschriebene Verfahren ausschließlich auf solche 2S-Albumine anwendbar wäre.
- Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Produktion einer rekombinanten DNA-Sequenz, die ein 2S-Albumin codiert, das so modifiziert ist, daß es ein interessierendes Polypeptid enthält, umfassend:
- Modifikation einer ersten, einen Vorläufer eines 2S-Albumins codierenden Nucleinsäure in einem Bereich zwischen Codons, die den vierten und fünften Cysteinrest der großen Untereinheit des 2S-Albumins codieren, durch Insertion in den Bereich oder durch Austausch eines Teiles davon, durch eine heterologe, das interessierende Polypeptid codierende Nucleinsäureinsertion, wobei eine rekombinante, einen Voräufer eines chimären 2S-Albumins codierende DNA bereitgestellt wird, in der die heterologe Nucleinsäureinsertion und Teile der ersten sie umgebenden Nucleinsäure einen Vorläufer eines chimären 2S-Albumins codieren, der das interessierende Polypeptid umfaßt, das von Teilen der großen Untereinheit des 2S-Albumins umgeben ist.
- In einer anderen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Produktion eines interessierenden Polypeptids, umfassend:
- Produktion einer Pflanze oder eines Pflanzensamens, die in das Genom ihrer Zellen die vorstehend beschriebene rekombinante DNA unter der Kontrolle eines Promotors integriert haben, der die Expression der rekombinanten DNA in einigen oder allen Zellen der Pflanze oder des Samens bewirken kann, und wobei der Vorläufer des chimären 2S-Albumins in der Pflanze oder dem Samen exprimiert wird, und gegebenenfalls die Züchtung der Pflanze.
- So umfaßt ein erfindungsgemäßes Verfahren zur Produktion eines bestimmten interessierenden Polypeptids:
- - Züchten der aus regenerierten Pflanzenzellen oder aus Samen von Pflanzen, die aus den regenerierten Pflanzenzellen über eine oder mehrere Generationen erhalten wurden, erhaltenen Pflanzen, wobei das Erbgut oder die Information der Pflanzenzellen, die innerhalb der Pflanzen replizierbar ist, eine erste Nucleinsäuresequenz, die unter der Kontrolle eines samenspezifischen Promotors steht, umfaßt, die in die mRNA transkribiert werden kann, die mindestens einen Teil des Vorläufers eines 2S-Albumins einschließlich des Signalpeptids der Pflanze codiert, wobei die erste Nucleinsäure nachstehend auch als die den "Vorläufer codierende Nucleinsäure" bezeichnet wird,
- . wobei die erste Nucleinsäure in einer Region zwischen den Codons, die den vierten und fünften Cysteinrest der großen Untereinheit des 2S-Albumins codieren, eine Nucleotidsequenz (nachstehend als "relevante Sequenz" bezeichnet) enthält, wobei die relevante Sequenz eine nicht-wesentliche Region umfaßt, die durch eine heterologe Nucleinsäureinsertion modifiziert wurde, die einen offenen Leserahmen im Leseraster mit den nicht-modifizierten Teilen, die die Insertion in der relevanten Sequenz umgeben, bildet;
- . wobei die Insertion ein Nucleotidsegment, das das interessierende Polypeptid codiert, umfaßt;
- . wobei das heterologe Nucleotidsegment an die benachbarten Enden der umgebenden, nicht-modifizierten Teile der relevanten Sequenz durch ein oder mehrere Codon(s) geknüpft ist, deren Nucleotide entweder der Insertion oder den benachbarten Enden oder beiden angehören;
- . wobei ein oder mehrere Codons einen oder mehrere Aminosäurerest(e) codieren, die selektiv spaltbare Randstellen definieren, die das interessierende Peptid in dem chimären 2S-Albumin (oder dem Hybridspeicherprotein) oder der Untereinheit davon, die durch die modifizierte relevante Sequenz codiert wird, umgeben;
- - Gewinnen der Samen der gezüchteten Pflanzen und Extrahieren der darin enthaltenen Hybridspeicherproteine,
- - Abspalten des interessierenden Peptids von dem Hybridspeicherprotein an den Spaltstellen; und
- - Gewinnen des interessierenden Peptids in einer gereinigten Form.
- Es ist klar, daß unter den vorstehend genannten Bedingungen wirklich jede Zelle der gezüchteten Pflanze die modifizierte erste Nucleinsäure umfaßt. Jedoch wird die vorstehend definierte rekombinante (oder Hybrid-) DNA-Sequenz in großen Mengen nur oder meistens in dem Stadium der Samenbildung der gezüchteten Pflanzen exprimiert, und folglich wird das Hybridprotein meistens in den Samen produziert.
- Es ist klar, daß die vorstehend definierte "heterologe Nucleinsäureinsertion" aus einer Insertion besteht, die Nucleotidsequenzen enthält, die mindestens teilweise für die natürliche Nucleinsäure, die den Vorläufer des Speicherproteins der Samen oder der betroffenen Pflanzenzellen codiert, fremd sind. Im allgemeinsten Fall ist das Segment selbst, das das Polypeptid von Interesse codiert, für die natürliche Nucleinsäure, die den Vorläufer des Speicherproteins codiert, fremd. Trotzdem erstreckt sich der Ausdruck "heterologe Nucleinsäureinsertion" auch auf eine Insertion, die ein wie vorstehend definiertes Segment enthält, das normalerweise im Erbgut oder in der Information der Samen oder der Pflanzenzellen vorhanden ist, wobei der "heterologe" Charakter der Insertion sich dann auf ein oder mehrere Codon(s) bezieht, die diese an beiden Seiten davon umgeben und die das Segment mit den nicht-modifizierten Teilen der Nucleinsäure, die den Vorläufer codiert, verknüpfen. Unter solchen zuletzt genannten Umständen betrifft die Erfindung so ein Verfahren, das die Produktion und leichte Trennung und Isolierung eines wertvollen Proteins ermöglicht, das normalerweise in der Pflanze selbst produziert wird, entweder im Stadium der Samenbildung oder in jedem anderen Stadium der Pflanzenentwicklung und entweder in den Proteinkörpern der Samen oder jedem anderen Ort der Pflanzenzellen.
- Das "Polypeptid von Interesse" besteht üblicherweise aus einem einzelnen Polypeptid oder Protein, das bei Abspaltung von den Hybridspeicherproteinen in den letzten erfindungsgemäßen Verfahrensstadien mindestens diejenigen der biologischen Eigenschaften beibehält oder annimmt, die bei dem einzelnen Polypeptid oder Protein von Interesse als vorhanden gesucht werden. Als nicht-beschränkende Beispiele für Eigenschaften, die bei dem interessierenden Polypeptid als zurückbehalten gesucht werden, kann man beispielsweise zitieren, enzymatische oder therapeutische Aktivitäten, die Fähigkeit, von bestimmten Antikörpern erkannt zu werden, immunogene Eigenschaften, beispielsweise die Fähigkeit, in einem lebenden Wirt Antikörper zu induzieren, die ein solches interessierendes Peptid oder einen Krankheitserreger, der Antigene mit der gleichen oder einer analogen Aminosäuresequenz wie das "interessierende Polypeptid" enthält, neutralisieren können.
- Jedoch kann das "interessierende Polypeptid" auch Wiederholungen einer Einheit, insbesondere eines individuellen Peptids oder Polypeptids mit einer beliebigen gewünschten biologischen Aktivität umfassen, wobei die Einheiten miteinander über oder durch Spaltstellen verknüpft sind, die die Trennung der biologischen Wiederholungen oder Einheiten voneinander erlauben. Obwohl nicht entscheidend, sind solche Spaltstellen vorteilhafterweise für die gleichen Spaltungsmittel identisch oder ihnen gegenüber empfindlich, z.B. einem bestimmten Restriktionsenzym, wie die vorstehend definierten "Randspaltstellen", die die Abspaltung des gesamten "interessierenden Polypeptids" von dem Hybridspeicherprotein erlauben. In der Tat kann die Trennung der aktiven Einheiten voneinander dann gleichzeitig mit den vorstehend genannten "Abspalt"-arbeitsschritten erzielt werden. Jedoch können die unterschiedlichen Einheiten oder Wiederholungen über unterschiedliche Spaltstellen verknüpft sein, wobei die Trennung der Einheiten voneinander anschließend an die "Abspalt"-arbeitsschritte des "interessierenden Polypeptids" von dem Hybridspeicherprotein vorgenommen werden kann.
- Die Anzahl der repetitiven Einheiten in dem interessierenden Polypeptid hängt natürlich von der maximalen Länge des interessierenden Polypeptids ab, das in das betreffende Speicherprotein unter den hier definierten Bedingungen eingebaut werden kann.
- In der vorstehenden Definition des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht die sog. "nicht-essentielle Region" der relevanten Sequenz der ersten Nucleinsäure, die den Vorläufer codiert, aus einer Region, deren Nucleotidsequenz modifiziert werden kann, entweder durch Insertion der vorstehend definierten Insertion in diese oder durch Ersatz mindestens eines Teils der nicht-essentiellen Region durch diese Insertion, jedoch ohne Modifikation der so erhaltenen Gesamtkonfiguration des Hybridspeicherproteins, verglichen mit der des nicht-modifizierten natürlichen Speicherproteins, sowie den Transport des entsprechend modifizierten naszierenden Hybridspeicherproteins in die vorstehend genannten Proteinkörper.
- Erfindungsgemäß kann die vorstehend angegebene, den Vorläufer codierende Nucleinsäure natürlich aus derselben Pflanzenart stammen, wie die, die zum Zwecke der Erfindung gezüchtet wird. Sie kann jedoch von einer anderen Pflanzenart entsprechend der Lehre von Beachy et al., 1985 und Okamuro et al., 1987, auf die bereits Bezug genommen wurde, stammen.
- Auf ähnliche Weise kann der samenspezifische Promotor aus der gleichen Pflanzenart oder einer anderen stammen, der im zuletzt genannten Fall von den Polymerasen der Wirtspflanze erkannt werden muß.
- Jedes Verfahren zur Lokalisierung einer nicht-essentiellen Region in einem Speicherprotein kann verwendet werden. Sobald diese Region auf der Ebene der Proteinsequenz definiert ist, kann die entsprechende Region der den Vorläufer codierenden Nucleinsäure verändert werden. Beispielsweise können nicht-essentielle Regionen unter Verwendung von Verfahren lokalisiert werden, die auf der Erstellung von sekundären und tertiären Proteinstrukturen durch molekulares Modellieren beruhen. Solche Modelle erlauben die Identifikation von Proteinregionen, die für deren Konfiguration oder Wechselwirkung in Aggregationen höherer Ordnung kritisch sind. In Abwesenheit einer solchen Technologie können die Peptidsequenzen analoger Proteine aus verschiedenen Pflanzenarten verglichen werden. Diejenigen Teilsequenzen, die diese Peptidsequenzen gemeinsam besitzen (und die in erster Linie die Annahme unterstützen, daß sie nicht modifiziert werden könne, ohne die Struktur, das Prozessieren, den intrazellulären Durchtritt oder das Verpacken des Peptids auf nachteilige Weise zu beeinträchtigen,) können von denjenigen unterschieden werden, die sich voneinander so unterscheiden, daß sie die Annahme stützen, daß sie aus "nicht-wesentlichen Regionen" bestehen, die dann als auswählbar für die Modifikation durch eine bestimmte heterologe Insertion gelten.
- Eine solche Überlegung ist möglich, wenn die Protein- oder Nucleinsäuresequenzen mehrerer ähnlicher Speicherproteine, die aus unterschiedlichen Pflanzen stammen, bestimmt wurden (wie dies der Fall für die 2S-Albumine ist). Ein geeignetes Verfahren umfaßt dann die Identifizierung der Nucleinsaureregionen, die Peptidregionen codieren, die entweder in der Aminosäuresequenz oder in der Länge oder in beiden Variabilität zeigen, verglichen mit den Regionen, die im Gegensatz dazu eine wesentliche Konservierung der Aminosäuresequenz zwischen mehreren Pflanzenarten zeigen. Wenn die untersuchten Speicherproteine Cysteinreste enthalten, und wenn man weiterhin annimmt oder durch experimentelle Daten weiß, daß die Cysteine an Disulfidbrücken beteiligt sind, die wahrscheinlich einen wichtigen Teil bei der Erstellung der Struktur und der Konformation der betreffenden Speicherproteine spielen, sollte das Verfahren unter Berücksichtigung dieser Tatsache ausgedehnt werden. In diesem Falle sollten die Cysteinreste nicht unter denjenigen Resten sein, die durch die Modifikation des Speicherproteins verändert werden, und sofern der Sequenzvergleich der Proteinsequenzen analoger Proteine zeigt, daß die Entfernung (in Aminosäureresten) zwischen den Cysteinen konserviert ist, sollte diese Entfernung nicht durch irgendeine anschließende Modifikation verändert werden. Die sog. nicht-essentiellen Regionen in der so ausgewählten Proteinsequenz können dann durch Insertion in die entsprechende Region der den Vorläufer codierenden Nucleinsäure modifiziert werden, wobei die Nucleinsäuresegmente das gewünschte Peptidprodukt codieren, und nach der Durchführung der Modifikation kann die Expression des modifizierten Speicherproteins in den Samen, die im samenbildenden Stadium der Pflanzenentwicklung gewonnen werden können, untersucht werden.
- Ein anderes Verfahren, das einem Fachmann auf dem Gebiet verfügbar ist, um zu bestimmen, ob eine Region modifiziert werden kann, besteht darin, eine solche Modifikation durchzuführen und das chimäre Gen in irgendeinem der zahlreichen Expressionssysteme zu exprimieren, die, auch wenn sie nicht geeignet sind, ökonomisch interessierende Mengen des chimären Proteins zu produzieren, kleine Mengen zur Analyse produzieren, wenn das chimäre Protein stabil ist. In solchen Versuchen sollte das nichtmodifizierte Protein auch als Kontrolle exprimiert werden. Solche Systeme umfassen ohne Beschränkung die Xenopus laevis-Oocyten (Bassener et al., 1983), die vorübergehende Expression in Pflanzenchloroplasten (Fromm et al., 1985), Hefe (Hollenberg et al., 1985), Pflanzencallus und das Acetabularia-System. Das zuletzt genannte wurde von Brown et al. (1986) zur funktionellen Analyse der Zein-Gene und ihrer Modifikation durch Lysincodierende Sequenzen verwendet.
- Die Wahl der den Vorläufer codierenden Nucleinsäuren, die die Vorläufer der 2S- Proteine codieren, insbesondere der wasserlöslichen 2S-Proteine zur Produktion der modifizierten Nucleinsäuren, die in die zu modifizierenden Pflanzenzellen transferiert werden sollen, ist aus bereits bekannten Gründen besonders attraktiv.
- Wie aus den Fig. 2 und 2A hervorgeht, zeigen die Regionen, die zwischen die ersten und zweiten Cysteine in der kleinen Untereinheit des Proteins und zwischen die dritten und vierten Cysteine und zwischen die fünften und sechsten Cysteine in der großen Untereinheit des Proteins eingeschoben sind, einen hohen Grad an Konservierung oder Ähnlichkeit. Es erscheint somit, daß diese Regionen in gewisser Weise für die geeignete Faltung und/oder Stabilität des Proteins notwendig sind, wenn es in den Pflanzensamen synthetisiert wird.
- Im Gegensatz dazu zeigen andere Regionen wie am Ende der kleinen Untereinheit und am Beginn oder Ende der großen Untereinheit Unterschiede einer solchen Größenordnung, daß man annehmen kann, daß sie vermutlich keinen wesentlichen Einfluß auf die endgültigen Eigenschaften des Proteins besitzen. Eine Region, die als nicht wesentlich erscheint, besteht aus dem Mittelteil der in der großen Untereinheit lokalisierten Region zwischen dem vierten und fünften Cystein der großen Untereinheit des reifen Proteins. Wie in der Figur ersichtlich ist (Fig. 2), umfaßt B. napus eine CKQQM-Sequenz zwischen der Aminosäure Q, die ihr vorausgeht, und der Aminosäure V, die ihr folgt, wohingegen an derselben Stelle A. thali überhaupt keine ähnliche Sequenz zwischen den gleichen benachbarten Aminosäuren besitzt, und B. excel und R. comm umfassen kürzere CEQ- bzw. CQ-Peptide.
- So scheint, daß zusätzlich zu der fehlenden Ähnlichkeit auf der Ebene der Aminosäurereste ein Unterschied in der Länge vorzuliegen scheint, der diese Region zur Region der Wahl für Substitutionen in den längsten 2S-Albuminen und für die Addition von Aminosäuren in den kürzesten 2S-Albuminen oder zur Verlängerung von beiden macht.
- Die gleichen Beobachtungen sollten auch für den Bereich von etwa dem Ende des ersten Drittels der gleichen Region zwischen dem vierten und fünften Cystein der großen Untereinheit eines 2S-Albumins gelten; vgl. die Sequenz von R. communis, die in dieser Region viel kürzer ist als die entsprechenden Regionen der anderen beispielhaft aufgeführten 2S-Proteine.
- Experimentieren, was in den Rahmen der Fähigkeiten des Fachmanns auf dem Gebiet fällt, zeigt, wie viele der anderen Aminosäuren, die dem vorstehend genannten vierten und fünften Cystein der großen Untereinheit eines 2S-Albumins benachbart sind, weiter ersetzt werden könnten, ohne eine Störung der Stabilität und des korrekten Prozessierens des Hybridproteins hervorzurufen. Beispielsweise wird die Durchführung von Versuchen zeigen, wie viele der anderen Aminosäuren, die der vorstehend genannten GKQQM-Sequenz von B. napus stromaufwärts und stromabwärts davon benachbart sind, weiter ersetzt werden könnten, ohne zu bewirken, daß das sich wahrscheinlich bildende Hybridprotein noch weiter substituiert werden kann, ohne daß das Hybridprotein die wesentlichen Eigenschaften des normalen B. napus-2S-Albumins verliert. Die in Betracht gezogenen Modifikationen sollten bevorzugt die drei und bevorzugt die sechs Aminosäuren, die den relevanten Cysteinen, z.B. dem vierten und fünften Cystein der großen Untereinheit benachbart sind, nicht beeinträchtigen.
- Im Grunde erlaubt das erfindungsgemäße Verfahren so die Produktion von biologisch aktiven Polypeptiden im Bereich einer Länge von 3 bis 100 Aminosäuren. Dieses biologisch aktive Polypeptid kann eine Pflanze als Ursprung haben oder kann ein Polypeptid sein, das für keine Pflanzensorte spezifisch ist und von einem Bakterium, einem Pilz, einer Alge, einem Invertebraten oder Vertebraten, wie einem Säuger, abstammt.
- Die in die geeigneten Regionen des relevanten 2S-Albuminspeicherproteins zu insertierende Sequenz (Insertion) umfaßt normalerweise nicht nur das Segment, das dieses interessierende Polypeptid codiert, sondern auch die Codons (oder Teile davon, wenn benachbarte Nucleotide der nicht-modifizierten Teile der relevanten Nucleotidsequenzen der den Vorläufer codierenden Nucleinsäure zufällig adäquat die Codons ergänzen), die Aminosäuren oder Peptide codieren, die die vorstehend genannten Aminosäureverbindungen bilden, die beispielsweise durch Protease oder chemische Behandlung spaltbar sind, so daß das interessierende Peptid später von dem gereinigten 2S-Protein gewonnen werden kann. Die Verbindungssequenzen können entweder als ein doppelsträngiges Oligomer oder, sofern ein Teil eines Gens verfügbar ist, als ein Restriktionsfragment gebildet werden, aber in dem zuletzt genannten Fall müssen die Spaltstellen, z.B. Proteasespaltstellen, allgemein hinzugefügt werden.
- Die Wahl der Sequenzen, die an das interessierende Peptid grenzen, hängt von mehreren Faktoren ab, die im wesentlichen von den zur Reinigung dieses Peptids in den Endstadien des Verfahrens zu verwendenden Techniken abhängen. Das interessierende Peptid kann durch beliebige proteolytische Spaltstellen flankiert sein, vorausgesetzt, daß die Sequenz des interessierenden Peptids keine internen ähnlichen Spaltstellen enthält. Schließlich sollten die Proteasen und/oder chemischen Spaltreagenzien spezifisch und leicht verfügbar sein. Sie sollten die insertierte Sequenz korrekt sowohl am amino- als auch am carboxylterminalen Ende spalten. Beispielsweise spaltet die Protease Trypsin nach Arginin- oder Lysinresten, sofern ihnen kein Prolin folgt. So, wenn weder Arginin- noch Lysinreste in dem interessierenden Peptid vorhanden sind (oder auf sie ein Prolin folgt), kann die Sequenz von Codons flankiert werden, die eine dieser zwei Aminosäuren codieren. Das Peptid kann dann aus dem Hybridprotein unter Verwendung von Trypsin herausgespalten werden, wobei eine Behandlung mit der Exoprotease Carboxypeptidase B folgt, um das überschüssige carboxylterminale Arg oder Lys zu entfernen. Auf ähnliche Weise spaltet die Protease endo-Lys-C (Jekel et al., 1983) nach Lysinresten, so daß ein Peptid zwischen zwei solche Reste insertiert werden könnte, aus dem 2S-Albumin unter Verwendung dieser Protease gespalten werden könnte, und dann das überschüssige Lysin wieder unter Verwendung von Carboxypeptidase B entfernt wird. Eine solche Strategie ist besonders nützlich, wenn das 2S-Albumin verwendet wird, da das zuletzt genannte wenig Lysine besitzt, so daß nur ein paar Fragmente erzeugt werden, was eine leichte Reinigung zur Folge hat. Bromcyan dient als Beispiel für ein chemisches Spaltungsreagens. Die Behandlung mit diesem Reagens spaltet an der Carboxylseite von Methionin. So muß für jeden Fall eine separate Strategie entwickelt werden, aber die breite Vielzahl von verfügbaren Proteasespalttechniken erlaubt die Anwendung der gleichen Grundprinzipien. So oft wie möglich sollten die Strategien sparsame, im Handel erhältliche Proteasen oder Reagenzien und eine begrenzte Anzahl von Reinigungsstufen verwenden. Bezüglich Übersichtsartikel verschiedener enzymatischer und chemischer Spaltungstechniken vergleiche die Bände 19 (1970) und 47 (1977) von Methods of Enzymology.
- Schließlich kommen in der Natur einige Peptide mit C-terminalen α- Amidstrukturen vor (α-Melanotropin, Calcitonin und andere; vgl. Hunt und Dayhoff, 1976). Es wurde gezeigt, daß diese posttranslationale Modifikation von wesentlicher Bedeutung für die biologische Aktivität des Peptids ist. Ein solches C-terminal amidiertes Peptid kann durch Transformation eines C-terminalen Glycinrests in eine Amidgruppe (Seiringer et al., 1985) erhalten werden. Daher können solche Peptide aus dem 2S- Hybridprotein durch Hinzufügen eines C-terminalen Glycinrests an das Peptid, das nach Reinigung in eine Amidgruppe überführt wird, erzeugt werden.
- Wenn die vollständige Proteinsequenz der in das Speicherprotein zu insertierenden Region bestimmt wurde, einschließlich sowohl des interessierenden Polypeptids als auch der Aminosäuren der Peptide, die die vorstehend beschriebenen spaltbaren Verbindungen bilden, muß die Nucleotidsequenz, die die Proteinsequenz codiert, bestimmt werden. Es ist klar, daß, obwohl vielleicht nicht absolut notwendig, der Codongebrauch der codierenden Nucleinsäure, sofern möglich, ähnlich dem des zu modifizierenden Gens sein sollte. Der Fachmann auf dem Gebiet besitzt Zutritt zu geeigneten Analysemitteln per Computer, um den Codongebrauch zu bestimmen.
- Jedes geeignete gentechnologische Verfahren kann zum Ersatz eines Teils der ausgewählten, den Vorläufer codierenden Nucleinsäure durch die Insertion oder zu deren Insertion in die geeignete Region der den Vorläufer codierenden Nucleinsäure verwendet werden. Die allgemeinen in vitro-Rekombinationstechniken, auf die die Clonierung in Bakterien folgt, können zur Herstellung der chimären Gene verwendet werden. Ortsspezifische Mutagenese kann für die gleichen Zwecke verwendet werden, wie nachstehend beispielhaft weiter ausgeführt wird. DNA-Rekombinanten, z.B. Plasmide, die für die Transformation von Pflanzenzellen geeignet sind, können ebenfalls nach in der gegenwärtigen technischen Literatur veröffentlichten Techniken produziert werden. Das gleiche gilt schließlich für die Produktion der transformierten Pflanzenzellen, in denen das von den relevanten Teilen der ausgewählten, den Vorläufer codierenden Nucleinsäure codierte Hybridspeicherprotein exprimiert werden kann. Als Beispiel kann auf die veröffentlichte europäische Patentanmeldung Nr. 116 718 oder die internationale Anmeldung WO 84/02913 (worauf hiermit Bezug genommen wird) Bezug genommen werden, die geeignete Techniken in dieser Hinsicht beschreiben. Es ist klar, daß der Fachmann auf dem Gebiet als Insertion eine Sequenz auswählen wird, die Wiederholungen des biologisch aktiven Peptids codiert, worin jede Sequenz, die das biologisch aktive Peptid codiert, von der anderen durch Grenzsequenzen, die ausgewählte Spaltstellen codieren, getrennt ist, die ihre Abtrennung während der Reinigung erlauben.
- Das erfindungsgemäße Verfahren nützt somit die Fähigkeit eines 2S-Albuminspeicherproteins) daß es als geeigneter Vektor zur Produktion eines bestimmten interessierenden Polypeptids oder Wiederholungen davon in Samen verwendet wird.
- Die Erfindung betrifft die Tatsache, daß bei Vorliegen des interessierenden heterologen Polypeptids oder Wiederholungen davon als ein Teil eines Hybrid-2S-Albumins in einer Pflanze diese einerseits der Einwirkung des Pflanzenproteins Disulfidisomerase während der Membrantranslokalisation unterliegen, wodurch die Chancen erhöht werden, daß die korrekten Disulfidbrücken in dem Hybridvorläufer wie in dessen normaler Vorläufersituation gebildet werden, und daß andererseits das interessierende Polypeptid oder Wiederholungen davon gegen die verschiedenen Nachteile geschützt werden, die vorstehend im Hinblick auf gentechnologische Standardverfahren zur Produktion fremder Peptide in Wirtsmikroorganismen aufgeführt wurden.
- Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren werden rekombinante Nucleinsäuren verwendet, insbesondere:
- - ein rekombinanter Vorläufer, der eine im Rahmen des Verfahrens definierte Nucleinsäure codiert;
- - rekombinante Nucleinsäuren, die die den modifizierten Vorläufer codierende Nucleinsäure unter der Kontrolle eines samenspezifischen Promotors enthalten, unabhängig davon, ob der zuletzt genannte aus der gleichen DNA wie die den Vorläufer codierende Nucleinsäure oder aus der DNA einer anderen Pflanze stammt,
- - Vektoren, insbesondere Pflanzenplasmide, z.B. Ti-abgeleitete Plasmide, die durch jede der vorstehend genannten rekombinanten Nucleinsäuren zur Verwendung bei der Transformation der vorstehend genannten Pflanzenzellen modifiziert sind.
- Das chimäre Gen sollte mit einer geeigneten Signalsequenz versehen werden, sofern es keine besitzt (was bei allen Speicherproteinen der Fall ist).
- Das erfindungsgemäße Verfahren stellt eine regenerierbare Quelle für ein interessierendes Polypeptid bereit, das entweder von Pflanzenzellen einer samenbildenden Pflanze gebildet wird, wobei die Pflanzenzellen zu einer vollständigen Pflanze regeneriert werden können, oder von Samen der samenbildenden Pflanzen gebildet wird, wobei die Pflanzen oder Samen als Ergebnis einer oder mehrerer Generationen der Pflanzen, die aus der Regeneration der Pflanzenzellen stammen, erhalten worden sind, wobei weiter die DNA, die die genetische Information der Pflanzenzellen oder Samen trägt, eine Nucleinsäure oder einen Teil davon umfaßt, einschließlich der Sequenzen, die das Signalpeptid codieren, die in die mRNA entsprechend dem Vorläufer eines Speicherproteins der Pflanze transkribiert werden können, wobei sie unter der Kontrolle eines samenspezifischen Promotors steht, und
- . wobei die Nucleinsäuresequenz eine relevante modifizierte Sequenz, die das reife Speicherprotein codiert, oder eine von einigen Subsequenzen enthält, die eine oder einige der entsprechenden Untereinheiten des reifen Speicherproteins codiert/codieren,
- . wobei weiter die Modifikation der relevanten Sequenz in einer ihrer nichtwesentlichen Regionen stattfindet und aus einer heterologen Nucleinsäureinsertion besteht, die einen offenen Leserahmen im Leseraster mit nicht-modifizierten Teilen bildet, die die Insertion in der relevanten Sequenz umgeben,
- . wobei die Insertion ein das interessierende Polypeptid codierendes Nucleotidsegment umfaßt,
- . wobei das heterologe Nucleotidsegment an die benachbarten Enden der umgebenden nicht-modifizierten Teile der relevanten Sequenz durch ein oder mehrere Codon(s) geknüpft ist, deren Nucleotide entweder der Insertion oder den benachbarten Enden oder beiden angehören,
- . wobei das eine oder die mehreren Codon(s) einen oder mehrere Aminosäurerest(e) codiert/codieren, die selektiv spaltbare Randstellen definieren, die das interessierende Peptid in dem Hybridspeicherprotein oder in der durch die modifizierte relevante Sequenz codierten Untereinheit des Speicherproteins umgeben.
- Es ist zu berücksichtigen, daß, obwohl die Erfindung nicht darauf begrenzt sein sollte, die Nucleinsäureinsertionen, die das interessierende Polypeptid oder Wiederholungen davon codieren, in den meisten Fällen künstlich hergestellte synthetische Oligonucleotide oder von viralen oder bakteriellen Genen oder von von viralen oder bakteriellen RNAs abgeleiteten cDNAs oder weiter von nicht-pflanzlichen eukaryontischen Genen abgeleitete Oligonucleotide sind, die alle normalerweise nicht an den geeigneten Stellen der Pflanzenzellen oder Samen gemäß der Erfindung durch biologische Verfahren unabhängig von ihrer Natur insertiert werden. Mit anderen Worten, diese Insertionen sind üblicherweise "nicht pflanzensortenspezifisch", speziell in der Hinsicht, daß sie in unterschiedliche Pflanzenarten insertiert werden können, die genetisch miteinander überhaupt nicht verwandt sind und so kein genetisches Material nach biologischen Standardverfahren, einschließlich natürlicher Hybridisierungsverfahren, austauschen können.
- So betrifft die Erfindung weiter ein Verfahren zur Gewinnung von samenbildenden Pflanzen, die aus den transformierten Pflanzenzellen oder Samen erhalten wurden, wobei die Pflanzen dadurch gekennzeichnet sind, daß sie die den Vorläufer codierenden Hybridnucleinsauren in Assoziation mit einem Samenpromotor in ihren Zellen tragen, wobei die Insertionen jedoch exprimiert werden und die entsprechenden Hybridproteine meistens in den Samen der Pflanzen produziert werden.
- Es folgt ein Abriß des Verfahrens, das zur Modifikation der Gene der 2S- Samenspeicherproteine, ihrer Expression in transgenen Pflanzen, der Reinigung des 2S- Speicherproteins und der Gewinnung des biologisch aktiven interessierenden Peptids verwendet werden kann. Auf den hier gegebenen Abriß des Verfahrens folgt ein spezifisches Beispiel. Es ist für einen Fachmann auf dem Gebiet jedoch klar, daß das Verfahren in geeigneter Weise der Modifikation anderer Gene der 2S-Samenspeicherproteine angepaßt werden kann.
- 1. Ersatz oder Ergänzung der hypervariablen Region des Gens des 2S- Speicherproteins durch die interessierende Sequenz.
- Entweder die cDNA oder der genomische Clon des 2S-Albumins kann verwendet werden. Ein Vergleich der Sequenzen der hypervariablen Regionen der Gene in Fig. 2 zeigt, daß sie in ihrer Länge variieren. Daher kann, wenn die interessierende Sequenz kurz ist und ein 2S-Albumin mit einer relativ kurzen hypervariablen Region verwendet wird, die interessierende Sequenz insertiert werden. Andererseits wird ein Teil der hypervariablen Region entfernt, um durch die das interessierende Segment oder die interessierende Sequenz und ggf. die Randcodons enthaltende Insertion ersetzt zu werden. Das so erhaltene Hybridspeicherprotein kann länger oder kürzer als das nicht-modifizierte natürliche Speicherprotein sein, das modifiziert wurde. In beiden Fällen können zwei Standardtechniken angewendet werden; geeignete Restriktionsspaltstellen können genützt werden, oder Mutagenesevektoren (z.B. Stanssens et al., 1987) können verwendet werden. In beiden Fällen muß Sorge getragen werden, daß der Leserahmen der Information erhalten bleibt.
- 2. Die veränderte 2S-Albumin codierende Region wird unter die Kontrolle eines samenspezifischen Genpromotors gestellt.
- Ein samenspezifischer Promotor wird verwendet, um die anschließende Expression nur in den Samen zu gewährleisten. Dies erleichtert die Gewinnung des gewünschten Produkts und vermeidet mögliche Zwänge auf andere Teile der Pflanze. Im Prinzip kann der Promotor des modifizierten 2S-Albumins verwendet werden. Dies ist jedoch nicht notwendig. Jeder andere Promotor, der den gleichen Zweck erfüllt, kann verwendet werden. Der Promotor kann gemäß seiner Effizienz in der zu transformierenden Pflanzenart ausgewählt werden. In den nachstehenden Beispielen werden ein Lectinpromotor aus Sojabohnen und ein 2S-Albuminpromotor aus Arabidopsis verwendet. Wenn ein chimäres Gen so konstruiert wird, muß ebenfalls eine ein Signalpeptid codierende Region aufgenommen werden, entweder aus dem modifizierten Gen oder aus dem Gen, dessen Promotor verwendet wird. Die tatsächliche Konstruktion des chimären Gens wird unter Verwendung von molekularbiologischen Standardtechniken durchgeführt (vgl. das Beispiel).
- 3. Die chimäre Genkonstruktion wird in die geeignete Wirtspflanze überführt.
- Wenn die chimäre oder modifizierte Genkonstruktion vollständig ist, wird sie in ihrer Gesamtheit in einen Pflanzentransformationsvektor überführt. Eine breite Vielzahl davon, basierend auf entschärften (nicht-oncogenen) Ti-Plasmiden, die von Agrobacterium tumefaciens abgeleitet sind, ist verfügbar, sowohl in den binären als auch in den Kointegrationsformen (De Blaere et al., 1987). Ein Vektor einschließlich eines selektierbaren Markers für die Transformation, üblicherweise eine Antibiotikumresistenz, sollte gewählt werden. Auf ähnliche Weise gibt es zahlreiche Verfahren zur Transformation von Pflanzen, und sie sind der individuellen Pflanze angepaßt. Meistens beruhen sie entweder auf der Protoplastentransformation (Marton et al., 1979) oder der Transformation eines kleinen Gewebsstücks aus der adulten Pflanze (Horsch et al., 1985). In dem nachstehenden Beispiele ist der Vektor ein binärer entschärfter Ti-Plasmidvektor, der Marker eine Kanamycinresistenz und das Blattscheibenverfahren der Transformation wird verwendet.
- Calli aus dem Transformationsverfahren werden auf der Basis des selektierbaren Markers ausgewählt und zu adulten Pflanzen durch geeignete hormonelle Induktion regeneriert. Diese variiert wieder mit der verwendeten Pflanzenart. Die regenerierten Pflanzen werden dann verwendet, um eine stabile Linie aufzubauen, aus der Samen gewonnen werden können.
- 4. Isolierung der biologisch aktiven Polypeptide.
- Die Reinigung der 2S-Pflanzenalbumine ist gut etabliert (Youle und Huang, 1981; Ampe et al., 1986). Es ist ein Hauptprotein in reifen Samen und in wäßrigen Puffern sehr gut löslich. Eine typische Reinigung der 2S-Speicherproteine umfaßt die folgenden Schritte: 1. Homogenisieren der Samen in Trockeneis und Extraktion mit Hexan; 2. Extraktion mit einem salzreichen Puffer und Dialyse gegen destilliertes Wasser, Präzipitation der verunreinigenden Globuline; 3. weitere Reinigung der wasserlöslichen Fraktion durch Gelfiltrationschromographie, die die kleineren 2S-Speicherproteine von den größeren Verunreinigungen trennt; und 4. abschließende Reinigung durch Ionenaustauschchromatographie. Die genauen, hier verwendeten Verfahren sind für die hier beschriebene Technik nicht kritisch, und ein weiter Bereich klassischer Techniken einschließlich Gelfiltration, Ionenaustausch- und Umkehrphasenchromatographie, und Affinitäts- oder Immunaffinitätschromatographie können sowohl zur Reinigung des chimären 2S-Albumins als auch des biologisch aktiven Peptids nach dessen Abspaltung von dem Albumin verwendet werden. Die genauen Techniken,
- die für die Spaltung verwendet werden, werden entsprechend der gewählten Strategie zum Zeitpunkt der Entwicklung der flankierenden Sequenzen (siehe vorstehend) bestimmt. Da 2S-Albumine gegenüber Proteasen etwas resistent sind, sollten Denaturierungsstufen oft vor der Proteasebehandlung eingeschoben werden (siehe Beispiel).
- 5. Tests auf biologisch aktive Peptide.
- Tests auf das gewonnene Produkt hängen klar von dem Produkt als solchem ab. Für das anfängliche Absuchen der Pflanzen können immunologische Assays verwendet werden, um die Anwesenheit des interessierenden Peptids nachzuweisen. Antikörper gegen das gewünschte Produkt funktionieren oft, selbst wenn es immer noch Teil des Hybrid-2S- Proteins ist. Sofern dies nicht der Fall ist, muß es teilweise oder vollständig von dem Hybrid freigesetzt werden, wonach Peptidgemische verwendet werden können. Das Absuchen mit Antikörpern kann entweder nach klassischen ELISA-Techniken (Engvall und Pesce, 1978) durchgeführt werden oder kann auf Nitrocelluloseblots von zuvor mittels Polyacrylamidgelelektrophorese getrennten Proteinen (Western Blotting, Towbin et al., 1979) durchgeführt werden. Das gereinigte Peptid kann weiter analysiert werden, und dessen Identität kann durch die Aminosäurezusammensetzung und die Sequenzanalyse bestätigt werden.
- Biologische Tests auf die biologische Aktivität hängen natürlich von der Natur und Funktion des interessierenden Endpeptids ab.
- Es ist zu verstehen, daß die vorliegende Erfindung auch auf die Produktion von markierten Proteinen anwendbar ist, die biologisch aktiv sein können, wobei die Pflanzensamspeicherproteine als geeignete Vektoren verwendet werden. In diesem Falle muß die Pflanzenregeneration der so erhaltenen Transformanten, wie unter dem vorstehenden Punkt 3 beschrieben, unter Bedingungen stattfinden, unter denen markierte Kohlenstoffquellen (¹³C) und/oder Stickstoffquellen (¹&sup5;N) und/oder Wasserstoffquellen (²H) und/oder Schwefelquellen (³&sup5;S) und/oder Phosphorquellen (³²P) den transformierten wachsenden Pflanzen zur Verfügung gestellt werden müssen (Kollman et al., 1979; Jung und Jèttner, 1972; De Wit et al., 1978).
- Die weiteren Eigenschaften der Erfindung gehen aus der folgenden nichtbeschränkenden Offenbarung spezifischer Beispiele hervor, insbesondere auf der Basis der Figuren, wobei:
- - die Fig. 1, 1A, 2A, 2 und 3 auf die Gesamteigenschaften der 2S-Speicherproteine, wie vorstehend diskutiert, Bezug nehmen,
- - die Fig. 4 einen Teil der Sequenz des Paranuß-2S-Albumins, erhalten aus dem pBN2S1-Plasmid, das, wie vorstehend angegeben, erhalten wurde, und verwandte Elemente darstellt,
- - die Fig. 5, die bei den in den anderen Figuren gezeigten Konstruktionen verwendeten Restriktionsspaltstellen zeigt,
- - die Fig. 6 und 7 schematisch die aufeinanderfolgenden Phasen der Konstruktion eines chimären Plasmids einschließlich eines Restriktionsfragments zeigen, das die einen Vorläufer codierende Nucleinsäure enthält, (nachstehend die sog. "Vorläufer-codierende Nucleinsäure"), die für die Modifikation durch eine Insertion von DNA-Sequenzen, die ein interessierendes Polypeptid codieren, insbesondere durch die ortsspezifische Mutagenese, geeignet ist,
- - die Fig. 8, die Restriktionsspaltstellen und die Genkarte eines für die Durchführung der ortsspezifischen Mutagenese geeigneten Plasmids zeigt,
- - die Fig. 9 schematisch die unterschiedlichen Schritte des ortsspezifischen Mutageneseverfahrens nach Stanssens et al. (1987), wie es allgemein für die Modifikation von Nucleinsäure an geeigneten Stellen anwendbar ist, zeigt,
- - die Fig. 10, 11 und 12 schematisch die weiteren Schritte der Modifikation des vorstehend genannten chimären Plasmids einschließlich der Vorläufernucleinsäure zeigen, wobei hier in eine Insertion, die ein interessierendes Polypeptid, beispielsweise Leu- Enkephalin in der folgenden Offenbarung, codiert, in eine nicht-essentielle Region seiner Vorläufernucleinsäuresequenz aufgenommen wurde,
- - die Fig. 13 die Sequenz des 1 kb-Fragments, das das Arabidopsis thaliana-2S- Albumingen enthält, darstellt und verwandte Elemente zeigt,
- - die Fig. 14 die Proteinsequenz der großen Untereinheit des vorstehenden Arabidopsis-2S-Proteins zusammen mit verwandten Oligonucleotidsequenzen zeigt,
- - die Fig. 15 die Restriktionskarte von pGSC1703 zeigt,
- - die Fig. 16 die Restriktionskarte von pGSC1703A zeigt,
- - die Fig. 17A ein Chromatogramm eines Aliquots des synthetischen Peptids YGGFLK, das als Marker verwendet wurde, auf einer C4-Säule zeigt. Der Gradient (gepunktete Linie) ist isokratisch bei 0 % Lösungsmittel zwischen 0 und 5 min und Lösungsmittel B ansteigend auf 100 % in 70 min. Lösungsmittel A: 0,1 % TFA in Wasser; Lösungsmittel B: 0,1 % TFA in 70 % CH&sub3;CN,
- - die Fig. 17B ein Chromatogramm einer tryptischen Spaltung von oxidiertem 2S unter den gleichen Bedingungen wie Fig. 17A zeigt. Der schraffierte Peak wurde gewonnen und weiter gereinigt,
- - die Fig. 18A ein Chromatogramm eines Aliquots des synthetischen Peptids YGGFLK, das als Marker verwendet wurde, über eine C18-Säule zeigt. Der Gradient (gepunktete Linie) ist isokratisch bei 0 % Lösungsmittel B zwischen 0 und 5 min, und Lösungsmittel B ansteigend auf 100 % in 70 min. Lösungsmittel A: 0,1 % TFA in Wasser; Lösungsmittel B: 0,1 % TFA in 70 % CH&sub3;CN,
- - die Fig. 18B die nochmalige Chromatographie auf der C18-Säule des YGGFLK enthaltenden Peaks, erhalten aus der HPLC auf der C4-Säule (vgl. Fig. 17B) zeigt. Die Laufbedingungen sind die gleichen wie für Fig. 18A,
- - die Fig. 19 die Ergebnisse der Aminosäuresequenzbestimmung von YGGFLK zeigt. Der Kasten in der linken Ecke zeigt die Standards der PTH-Aminosäuren (je 20 pmol). Das Signal für die Zyklen 1 bis 6 ist verglichen mit der Referenz 8fach gedämpft,
- - die Fig. 20A ein Chromatogramm darstellt, das das als Marker verwendete YGGFL-Peptid zeigt. Dieses Peptid ist das Ergebnis der Spaltung des synthetischen Peptids YGGFLK mit Carboxypeptidase B. Die Laufbedingungen sind die gleichen wie in Fig. 17A,
- - die Fig. 20B die Isolierung des IGGFL-Peptids, das mit * gekennzeichnet ist, nach Spaltung des YGGFLK-Peptids mit Carboxypeptidase B, das aus dem Pflanzenmaterial isoliert wurde, zeigt,
- - die Fig. 21 schematisch die aufeinanderfolgenden Phasen der Konstruktion eines chimären 2S-Albumingens von Arabidopsis thaliania zeigt, umfassend die Deletion praktisch aller Teile der hypervariablen Region und ihren Ersatz durch eine AccI-Spaltstelle, die Insertion der Sequenzen, die GHRF codieren, und der Spaltstellen, die beispielhaft in der nachstehenden Offenbarung angegeben sind, in die AccI-Spaltstelle, insbesondere durch ortsspezifische Mutagenese und die Clonierung des chimären Gens in einen für die Pflanzentransformation geeigneten Pflanzenvektor,
- - die Fig. 22A die acht Oligonucleotide, die bei den Konstruktionen der GHRFS- und GHRFL-Gene verwendet werden, zeigt. Die Enden der Oligonucleotide sind durch vertikale Linien angegeben, und die Ziffern über und unter den Oligonucleotiden zeigen ihre Anzahl an. In den Oligonucleotiden 4 und 8 sind die in den Kasten eingeschlossenen Basen ausgeschlossen, was zu dem Gen, das GHRFS codiert, führt. Die Peptidsequenz von GHRFS und GHRFL und die Methioninsequenzen, die die CNBr-Spaltstellen ergeben, sind über der DNA-Sequenz angezeigt,
- - die Fig. 22B die AccI-Spaltstelle des modifizierten AT2S1-Gens und die Insertion von GHRF in die AccI-Spaltstelle so, daß der offene Leserahmen beibehalten wird, zeigt.
- Als ein erstes Beispiel des beschriebenen Verfahrens wird ein Verfahren zur Produktion von Leu-Enkephalin angegeben, einem Pentapeptid mit Opiataktivität in dem menschlichen Gehirn und anderen Nervengeweben (Hughes et al., 1975a). Ein synthetisches Oligomer, das das Peptid codiert, und spezifische Proteasespaltstellen werden für einen Teil der hypervariablen Region in einem cDNA-Clon, der das 2S-Albumin von Bertholletia excelsa (Paranuß) codiert, ersetzt. Dieses chimäre Gen wird an ein Fragment, das die den Promotor und das Signalpeptid codierenden Regionen des Sojabohnenlectingens enthält, füsioniert. Lectin ist ein 7S-Albuminsamenspeicherprotein (Goldberg et al., 1983). Die vollständige Konstruktion wird in Tabakpflanzen unter Verwendung eines Agrobacterium-vermittelten Transformationssystems überführt. Pflanzen werden regeneriert, und nach dem Blühen werden die Samen gewonnen und die 2S-Albumine gereinigt. Das Enkephalinpeptid wird von dem 2S-Albumin unter Verwendung der zwei spezifischen Proteasen, deren Spaltstellen in das Oligonucleotid eingebaut werden, gespalten, und dann unter Verwendung von HPLC-Techniken isoliert.
- 1. Synthese der cDNA und Absuchen der cDNA.
- Gesamt-RNA wird aus fast reifen Samen der Paranuß unter Verwendung des von Harris und Dure (1981) beschriebenen Verfahrens isoliert. Poly A+-RNA wird dann unter Verwendung der Oligo-dT-Chromatographie (Maniatis et al., 1982) isoliert. Die Synthese der cDNA und die Clonierung können unter Verwendung jedes beliebigen von mehreren veröffentlichten Verfahren (Maniatis et al., 1982; Okayama und Berg, 1982; Land et al., 1981; Gubler und Hoffman, 1983) durchgeführt werden. Im vorliegenden Fall wurde das 2S-Albumin aus Paranuß sequenziert (Ampe et al., 1986), und ein auf der Aminosäuresequenz basierendes Oligonucleotid wurde konstruiert. Dieses wurde verwendet, um eine cDNA-Bank abzusuchen, die unter Verwendung des Verfahrens von Maniatis et al. (1982) hergestellt worden war. Der so erhaltene Clon erwies sich als zu kurz, und eine zweite Bank wurde unter Verwendung des Verfahrens von Gubler und Hoffman (1983) hergestellt und unter Verwendung des ersten kürzeren cDNA-Clons abgesucht. Eine rekombinante DNA, die die Paranuß-2S-Albuminsequenz enthielt, wurde isoliert. Die zuletzt genannte wurde weiter in das Plasmid pUC 18 cloniert (Yanisch- Perron, C., Vieira, J. und Massino, J. (1985) Gene 33,. S. 103-119).
- Das gewonnene Plasmid wurde als pBN 2S1 bezeichnet. Die abgeleitete Proteinsequenz, die DNA-Sequenz, die zu ersetzende Region und die relevanten Restriktionsspaltstellen sind in der Fig. 4 gezeigt.
- Die abgeleitete Proteinsequenz (erhalten von dem Plasmid pBN2S1) ist über der DNA-Sequenz gezeigt, und die proteolytischen Prozessierungs-Stellen sind angegeben (in Fig. 4). Das Ende der Signalsequenz ist ebenfalls angegeben. Die für die Konstruktion in den Fig. 6, 7, 10, 11 und 12 verwendeten Restriktionsspaltstellen sind angegeben. Der Polylinker des Clonierungsvektors ist gezeigt, um die PstI-Spaltstelle, die in dem zuletzt genannten Teil der Konstruktion verwendet wurde, anzuzeigen. Die Protein- und DNA- Sequenzen des zu insertierenden Peptids sind unter der cDNA-Sequenz gezeigt, ebenso der Rest des Oligonucleotids, das bei der Mutagenese verwendet wird. Während des Mutageneseverfahrens hybridisiert das gezeigte Oligonucleotid mit dem entgegengesetzten cDNA-Strang (vgl. Fig. 10).
- 2. Konstruktion eines chimären Gens.
- Das 2S-Albumingen wird zuerst an das den Promotor und das Signalpeptid des SojabohnenLectingens codierende DNA-Fragment füsioniert. Die Spaltstelle des Signalpeptids sowohl bei dem Lectin als auch in der Paranuß ist von Standardkonsensussequenzen abgeleitet (Perlman und Halvorson, 1983). Die relevanten Sequenzen sind nachstehend sowie in Fig. 4 gezeigt.
- Die Protein- und doppelsträngigen DNA-Sequenzen in den Regionen der Sequenzen des Signalpeptids/reifen Proteins in den Plasmiden pLE1, pSOYLEA 1 und pBN2S1 sind in der Fig. 5 gezeigt. Die Positionen und die Erkennungsstellen der Restriktionsspaltstellen, die bei den in den Figuren gezeigten Konstruktionen verwendet wurden, sind gekennzeichnet. * bezeichnet die Proteinspaltstelle am Ende der Signalsequenz.
- Der Startpunkt für die Konstruktion ist das Plasmid pLE1 (Okamuro et al., 1987), das ein genomisches HindIII-Fragment aus Sojabohnen enthält. Dieses Fragment umfaßt das vollständige Sojabohnenlectingen, seinen Promotor und Sequenzen stromaufwärts des Promotors, die für die samenspezifische Expression wichtig sein können. Aus diesem Fragment wurde eine geeignete Sojabohnenlectinpromotorsignalsequenz-Kassette konstruiert, wie in Fig. 6a gezeigt ist. Eine DdeI-Spaltstelle ist am Ende der Sequenz, die die Signalsequenz (SS) codiert, vorhanden, und deren Spaltstelle (C/TCAG) entspricht der Prozessierungs-Stelle. Um eine nützliche Restriktionsspaltstelle an dieser Prozessierungs- Stelle zu erhalten, wird ein KpnI-DdeI-Fragment der SS-Sequenz (nachstehend als "ss" bezeichnet) aus pLE1 isoliert und in pLK57 (Botterman, 1986) cloniert, das als solches mit KpnI und BglII linearisiert wurde. Die DdeI- und BglII-Enden werden mit Klenow-DNA- Polymerase I aufgefüllt. Dies rekonstruiert die BglII-Spaltstelle (A/GATCT), die nun der Prozessierungs-Stelle der Signalsequenz entspricht (vgl. Fig. 6, 7a). Das so erhaltene Plasmid pSOYLEA1 besteht somit aus dem Plasmid pLK57, bei dem das KpnI-DdeI- Fragment der SS-Sequenz (ss), das anfänglich in pLE1 enthalten war, an die Stelle des anfänglichen KpnI-BglII-Fragments von pLK57 gesetzt worden ist. Eine HindIII-Spaltstelle wird vor dieses Fragment durch Setzen eines KpnI-PstI-Fragments, das die HindIII-Spaltstelle aus pLK69 (Botterman, 1986) enthält, an die Stelle des PstI-KpnI-Fragments gesetzt, welches mit (1) in pSOYLEA1 bezeichnet ist, wie schematisch in Fig. 4 gezeigt ist. Diese Zwischenkonstruktion wird als pSOYLEA2 bezeichnet. In einer zweiten Stufe wird der Lectinpromotor durch Insertion des HindIII-KpnI-Fragments (2) von pLE1 in pSOYLEA2 rekonstruiert. Da eine weitere BglII-Spaltstelle stromaufwärts des Promotorfragments existiert, ist die Lectinpromotor/-signalsequenz-Kassette nun als ein BglII-BglII-Fragment in dem Plasmid pSOYLEA3 vorhanden.
- Diese Kassette wird nun im Leseraster mit einem 205 bp Paranuß-cDNA-Fragment des Plasmids pBN2S1, das die codierende Sequenz für das Paranuß-Pro-2S-Albumin (d.h. das vollständige Vorläufermolekul, ausgenommen die Signalsequenz) enthält, fusioniert. Dies wird, wie in Fig. 5 gezeigt, durchgeführt. Das nach der Spaltung des cDNA-Clons pBN2S1 (Fig. 4) mit BglI, Behandlung mit Klenow-DNA-Polymerase I, um die überstehenden BglI-Enden abzuspalten, und Spaltung mit PstI erhaltene 205 bp-Fragment wird in pUC18 (Yannish-Perron et al., 1985) cloniert, das durch Spaltung mit SmaI und PstI linearisiert worden war. Das so erhaltene Plasmid pUC18-BN1 wird sowohl mit EcoRI als auch mit AvaI gespalten, beide Enden werden aufgefüllt und religiert. Dies führt zur Rekonstruktion eines neuen Plasmids mit der Bezeichnung pUC18-BN2, das die gewünschte codierende Paranuß-Sequenz mit einer EcoRI-Spaltstelle am Beginn enthält (Fig. 7).
- Um die codierende Paranuß-Sequenz im Leseraster an die Lectinpromotor/-signalsequenz-Kassette zu fusionieren, wird pUC18-BN2 mit EcoRI gespalten und die Enden teilweise unter Verwendung des Klenow-Enzyms in Gegenwart von dATP allein aufgefüllt. Die verbleibenden überstehenden Nucleotide werden mit S1-Nuclease entfernt, wonach eine PstI-Spaltung durchgeführt wird. Dies ergibt ein Fragment mit einem glatten Ende und ein mit PstI gespaltenes Ende. Das Lectinpromotor/-signalsequenz-Fragment wird aus pSOYLEA1 (Fig. 7) als ein EcoRI-BglII-Fragment mit aufgefüllten BglII-Enden entnommen. Die zwei Fragmente werden mit PstI-EcoRI gespaltenem pUC18 aneinander ligiert. Dies führt zu pUC18SLBN1 mit einer rekonstruierten BglII-Spaltstelle an der Verbindung der das Signalpeptid codierenden Sequenz und der Paranußsequenzen (Fig. 7). pUC18SLBN1 besteht somit aus dem pUC18-Plasmid, in das das BglII-EcoRI-Fragment (gezeigt durch (3) in Fig. 6) von pSOYLEA1 und stromaufwärts davon in Transkriptionsrichtung das EcoRI-Pst-EcoRI-Fragment, das von pUC18BN2 stammt und die 205 bp-cDNA-codierende Sequenz für das Paranuß-Pro-2S-Albumin enthält, insertiert wurden.
- Jedoch wird der Leserahmen nicht korrekt aufrechterhalten. Um dies zu korrigieren, wird das Plasmid mit BglII linearisiert, mit S1-Nuclease behandelt und religiert. Dieses Zwischenprodukt wird als pUC18SLBN2 bezeichnet. Diese Konstruktion wird schließlich in zwei Schritten durch Insertion des KpnI-Fragments vollendet, das den 5'-Teil des Promotors aus pSOYLEA3 enthält, wodurch pUC18SLBN3 erhalten wird, und durch Insertion des PstI-Fragments in das zuletzt genannte Plasmid, das den 3'-Teil der Paranuß-cDNA aus pBN2S1 enthält. Die so erhaltene Endkonstruktion pUC18SLBN4 enthält die Lectinpromotor/-signalsequenz-Paranuß-cDNA-SequenzfUsion in einem BamHI-Fragment.
- 3. Substitution eines Teils der hypervariablen Region durch Sequenzen, die Enkephalin und Proteasespaltstellen codieren.
- Das Leu-Enkephalinpeptid besitzt die Sequenz Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu (Hughes et al., 1975b). Um das intakte Polypeptid aus dem Hybrid-2S-Albumin nach der Reinigung gewinnen zu können, werden Lysin-codierende Codons auf beide Seiten der Enkephalincodierenden Sequenzen angebracht. Dies erlaubt die anschließende Spaltung des Enkephalinpolypeptids aus dem 2S-Albumin mit den Endopeptidasen Endolysin-C und Carboxypeptidase B in den stromabwärts stattfindenden Prozessierungsschritten. Schließlich werden zusätzliche Sequenzen, die zu den beizubehaltenden Paranußsequenzen komplementär sind, aufgenommen, damit das Oligonucleotid mit dem "Gap-Duplex"- Molekül während der Mutagenese hybridisieren kann (siehe nachstehend). Die genaue Sequenz des Oligonucleotids, die nach der Untersuchung des Codongebrauchs in mehreren Pflanzenspeicher-proteingenen bestimmt wurde, lautet
- 5'-GCAACAGGAGAAGTACGGTGGATTCTTGAAGCAGATGCG-3'.
- Der Ersatz eines Teils der die hypervariable Region des Paranuß-2S-Albumins codierenden Sequenz wird unter Verwendung ortsspezifischer Mutagenese mit dem Oligonucleotid als Primer durchgeführt (Fig. 4 und 10). Das System von Stanssens et al. (1987) wird verwendet.
- Das Verfahren nach Stanssens et al. ist in Fig. 9 erläutert und wird nachstehend näher besprochen. Bei ihm wird das Plasmid pMac5-8 verwendet, dessen Restriktions- und Genkarte in Fig. 8 gezeigt sind, und dessen Haupteigenschaften ebenfalls nachstehend besprochen werden.
- Die Positionen der relevanten Genorte von pMac5-8 sind in Fig. 8 angegeben. Die Pfeile bezeichnen ihre funktionelle Orientierung. fdT: zentraler Transkriptionsterminator des Phagen fd; F1-ORI: Replikationsorigin des filamentösen Phagen fl; ORI: ColE1-Typ- Replikationsorigin; BLA/APR: Region, die β-Lactamase codiert; CAT/CmR: Region, die Chloramphenicolacetyltransferase codiert. Die Positionen der Ambermutationen in pMc5- 8 (das bla-am-Gen enthält keine ScaI-Spaltstelle) und in pMc5-8 (cat-am; die Mutation beseitigt die einzige PvuII-Spaltstelle) sind angegeben. Die Suppression der cat- Ambermutation sowohl in supE- als auch supF-Wirten führt zu Resistenz gegenüber mindestens 25 µg/ml Cm. pMc5-8 verleiht Resistenz gegenüber ±20 µg/ml und 100 µg/ml Ap nach Suppression von Ambermutationen in supE- bzw. supF-Stämmen. Die in dem Wildtyp-cat-Gen vorhandenen EcoRI-, BalI- und NcoI-Spaltstellen (gekennzeichnet mit einem Sternchen) wurden unter Verwendung von Mutagenesetechniken entfernt.
- Das Prinzip des Stanssens-Verfahrens, das auch auf den Ersatz der ausgewählten hypervariablen Region der hier beispielhaft aufgeführten 2S-Albuminregion durch das Leu- Enkephalinpeptid angewendet wurde, wie nachstehend beschrieben, wird als erstes näher ausgeführt:
- Im wesentlichen wird die für den vorstehend genannten Ersatz verwendete Mutagenese wie folgt durchgeführt. Es wird auf Fig. 9 Bezug genommen, worin die Ambermutationen in den selektierbaren Ap- und Cm-Markern durch geschlossene Kreise gezeigt sind. Das Symbol zeigt das mutagene Oligonucleotid an. Die Mutation als solche ist durch eine Pfeilspitze gekennzeichnet.
- Die einzelnen Schritten des Verfahren sind wie folgt:
- - Clonieren des Ziel-DNA-Fragments in pMa5-8 (I). Dieser Vektor trägt eine Ambermutation in dem CmR-Gen und spezifiziert Ampicillinresistenz.
- - Herstellen einer einzelsträngigen DNA aus dieser Rekombinanten (II) aus pseudoviralen Teilchen.
- - Herstellen eines Restriktionsfragments aus dem komplementären pMc-Typ-Plasmid (III). pMc-Typ-Vektoren enthalten das Wildtyp-CmR-Gen, während eine Ambermutation in den Ap-Resistenzmarker eingebaut wird.
- - Konstruktion der "Gap-Duplex"-DNA (nachstehend als gdDNA bezeichnet) gdDNA (IV) durch in vitro-DNA/DNA-Hybridisierung. In der gdDNA sind die Zielsequenzen als einzelsträngige DNA exponiert. Präparative Reinigung der gdDNA von den anderen Komponenten des Hybridisierungsgemisches ist nicht notwendig.
- - Anelieren des synthetischen Oligonucleotids an die gdDNA (V).
- - Auffüllen der verbleibenden Lücken und Versiegeln der Strangbrüche durch gleichzeitige in vitro DNA-Polymerase/DNA-Ligasereaktion (VI).
- - Transformation eines mutS-Wirts, d.h. eines Stammes, dem eine Fehlpaarungsreparatur fehlt, Selektion auf Cm-Resistenz. Das führt zur Produktion einer gemischten Plasmidnachkommenschaft (VII).
- - Eliminieren der von dem Matrizenstrang abstammenden Nachkommenschaft (pMa- Typ) durch Retransformation eines Wirts, der Ambermutationen nicht unterdrücken kann (VIII). Selektion auf Cm-Resistenz führt zur Anreicherung der von dem lückenhaften Strang abstammenden Nachkommen, d.h. dem Strang, in den das mutagene Oligonucleotid eingebaut wurde.
- - Absuchen der Clone als Ergebnis der Retransformation auf die Anwesenheit der gewünschten Mutation.
- In dem in Fig. 9 dargestellten Mutageneseexperiment wird die Cm-Resistenz als indirekte Selektion auf den synthetischen Marker verwendet. Es ist offensichtlich, daß ein Experiment so durchgeführt werden kann, daß der Ap-selektierbare Marker genützt wird. In dem zuletzt genannten Fall gehören die einzelsträngige Matrize (II) und das Fragment (III) dem pMc- bzw. pMa-Typ an. Ein einzelner Mutageneseschritt führt nicht nur zur Einschleusung der gewünschten Mutation, sondern auch zur Umwandlung des Plasmids vom pMa-Typ in den pMc-Typ oder umgekehrt. So kann der cyclische Wechsel zwischen diesen zwei Konfigurationen (mit einer alternierenden Selektion auf Ampicillin- oder Chloramphenicolresistenz) verwendet werden, um mehrfache Mutationen in einer Zielsequenz im Verlauf aufeinanderfolgender Mutageneserunden zu konstruieren.
- Unter Zurückkehren auf das vorliegende Beispiel bezüglich der Substitution eines Teils der Sequenz, der die hypervariable Region des Paranuß-2S-Albumins codiert, wird das System nach Stanssens et al. wie folgt angewendet:
- Das PstI-EcoRI-Fragment des chimären Gens, das die interessierende Region enthält (vgl. die Fig. 10, 11 und auch Fig. 4), wird in einen pMa-Vektor insertiert, der ein intaktes β-Lactamasegen und ein Chloramphenicolacetyltransferasegen mit einer Ambermutation gemäß Fig. 10 enthält, so daß das Ausgangsplasmid nur Ampicillinresistenz, nicht aber Chloramphenicolresistenz verleiht. Einzelsträngige DNA (die den zu dem in Fig. 4 gezeigten Strang entgegensetzten Strang darstellt) wird hergestellt und mit der EcoRI-PstI-linearisierten Form eines pMc-Typ-Plasmids aneliert, wodurch ein "Gap- Duplex"-Molekül erhalten wird. Das Oligonucleotid wird an diese "Gap-Duplex"-DNA aneliert. Die einzelsträngigen Lücken werden mit DNA-Klenow-Polymerase I aufgefüllt, ligiert, und das Gemisch wird in den geeigneten Wirt transformiert. Clone, die die gewünschte Mutation tragen, sind ampicillinempfindlich, aber chloramphenicolresistent. Chloramphenicolresistente Transformanten werden ausgewählt und durch Sequenzieren der DNA analysiert. Abschließend wird das Hybrid-Genfragment zurück in das Lectin/Paranuß-chimäre Fragment durch Ersatz des PstI-NcoI-Fragments in pUC18SLBN4 durch das mutagenisierte Fragment aus pMC58BN (Fig. 11) insertiert. Das so erhaltene Plasmid pUC18SLBN5 enthält den Lectinpromotor und die Lectinsignalsequenz in Fusion an das Hybrid-Paranuß-Enkephalingen auf einem BamHI-Fragment.
- 4. Transformation von Tabakpflanzen.
- Das das chimäre Gen enthaltende BamHI-Fragment wird in die BamHI-Spaltstelle des binären Vektors pGSC1702 (Fig. 12) insertiert. Dieser Vektor enthält Funktionen zur Selektion und Stabilität sowohl in E. coli als auch in A. tumefaciens sowie ein T-DNA- Fragment für den Transfer von Fremd-DNA in Pflanzengenome (Deblaere et al., 1987). Das zuletzt genannte besteht aus den terminalen repetitiven Sequenzen der Octopin-T- Region. Die BamHI-Spaltstelle, in die das Fragment cloniert wird, befindet sich vor dem Polyadenylierungssignal des T-DNA-Gens 7. Ein chimäres Gen, bestehend aus dem Nopalinsynthase (nos)-Promotor, der das Neomycinphosphotransferaseprotein codierenden Region (neo) und dem 3'-Ende des OCS-Gens, ist vorhanden, so daß die transformierten Pflanzen kanamycinresistent werden. Unter Verwendung von Standardverfahren (Deblaere et al., 1987) wird das Plasmid in den Agrobacterium-Stamm C58C1Rif, der das Plasmid pGV2260 trägt, überführt. Das zuletzt genannte liefert in trans die vir-Genfunktionen, die für den erfolgreichen Transfer der T-DNA-Region in das Pflanzengenom benötigt werden. Dieses Agrobacterium wird dann zur Transformation von Tabakpflanzen des Stammes SR1 unter Verwendung von Standardverfahren (Deblaere et al., 1987) verwendet. Auf Calli wird mit 100 µg/ml Kanamycin selektiert, und resistente Calli werden zur Regeneration von Pflanzen verwendet. Die aus diesen Pflanzen hergestellte DNA wird auf die Anwesenheit des Hybridgens durch Hybridisierung mit dem Paranuß-2S-Albumin-cDNA- Clon oder dem Oligonucleotid überprüft. Positive Pflanzen werden hochgezogen und, wie nachstehend beschrieben, weiterverarbeitet.
- 5. Reinigung der 2S-Albumine aus Samen.
- Positive Pflanzen werden zur Samenreife gebracht, was etwa 15 Wochen benötigt. Samen der einzelnen Pflanzen werden geerntet, auf Trockeneis homogenisiert und mit Hexan extrahiert. Der verbleibende Rückstand wird in Laemmli-Probenpuffer aufgenommen, gekocht und auf ein SDS-Polyacrylamidgel (Laemmli, 1970) gegeben. Die getrennten Proteine werden auf Nitrocellulosefolien mit Hilfe eines Elektroblot-Geräts transferiert (Towbin et al., 1979) und mit einem im Handel erhältlichen polyclonalen Antikörper gegen das Leu-Enkephalin-Antigen (UCB cat. £ i72/001, ib72/002) getestet.
- Unter Verwendung der vorstehenden immunologischen Tests wird auf stark positiv reagierende Pflanzen selektiert. Sie werden dann in größeren Mengen gezüchtet, und ihre Samen werden geerntet. Ein Hexanpulver wird hergestellt und mit einem stark salzhaltigen Puffer (0,5 M NaCl, 0,05 M Na-Phosphat, pH 7,2) extrahiert. Dieser Extrakt wird dann gegen Wasser dialysiert und durch Zentrifugation (50.000 xg für 30 min) geklärt, und der Überstand wird weiter durch Gelfiltration über eine Sephadex G-75-Säule, die mit dem gleichen stark salzhaltigen Puffer behandelt wurde, gereinigt. Die Proteine werden weiter von nicht-ionischem nicht-proteinhaltigem Material durch Ionenaustauschchromatographie auf einer DEAE-Cellulosesäule gereinigt. Fraktionen, die das 2S-Proteingemisch enthalten, werden dann vereinigt, gegen 0,5 % NH&sub4;HCO&sub3; dialysiert und lyophilisiert.
- 6. Isolierung des Leu-Enkephalins.
- Das Gemisch aus gereinigten endogenen 2S-Speicherproteinen und Hybrid-2S- Proteinen wird mit Endo-Lys-C gespalten. Um einen effizienten proteolytischen Abbau zu gewährleisten, werden die 2S-Proteine zuerst mit Perameisensäure (Hirs, 1956) oxidiert. Der Oxidationsschritt öffnet die Disulfidbrücken und denaturiert das Protein. Da Leu- Enkephalin keine Aminosäurereste enthält, die mit Perameisensäure reagieren könnten, wird das Opiat durch diese Behandlung nicht verändert. Die Endo-Lys-C-Spaltung wird in einer 0,5%igen NH&sub4;HCO&sub3;-Lösung 12 h bei 37ºC durchgeführt und durch Lyophilisation beendet. Die Spaltung setzt Leu-Enkephalin frei, das aber immer noch an den C-terminalen Lysinrest gebunden ist. Da das Hybridprotein sehr wenig andere Lysinreste enthält, ist die Anzahl der Endo-Lys-C-Peptide sehr gering, was die weitere Reinigung des Peptids erleichtert. Die Enkephalin-Lys-Peptide werden durch Umkehrphasen-HPLC- Chromatographie unter Verwendung einer C18-Säule (z.B. derjenigen, die unter dem Warenzeichen VYDAC vertrieben wird) gereinigt. Der Gradient besteht aus 0,1 % Trifluoressigsäure als Anfangslösungsmittel (A) und 70 % Acetonitril in 0,1 % Trifluoressigsäure als verdünnendes Lösungsmittel (B). Ein Gradient aus 1,5 % Lösungsmittel B in A pro min wird unter den von Ampe et al., (1987) offenbarten Bedingungen verwendet. Das gereinigte Enkephalin-Lys-Peptid wird durch Aminosäureanalyse und/oder immunologische Techniken identifiziert. Es wird weiter mit Carboxypeptidase B, wie von Ambler, (1972) beschrieben, behandelt, um den carboxylterminalen Lysinrest zu entfernen. Schließlich wird die Trennung und Reinigung des Opioidpeptids abschließend durch Umkehrphasen-HPLC gemäß dem von Lewis et al., (1979), beschriebenen Verfahren erzielt.
- Andere Verfahren sind verfügbar, wie in Beispiel II erläutert ist.
- 7. Test auf die biologische Leu-Enkephalin-Aktivität.
- Enkephaline hemmen die Bindung von [³H]-Naloxon in natriumfreien Homogenaten von Meerschweinchengehirn. Die Opioidaktivität kann als die Fähigkeit, die spezifische [³H]-Naloxonbindung an Membranen von Rattengehirnen zu hemmen (Pasternak et al., 1975), wie vorstehend beschrieben (Simantov et al., 1976), getestet werden. Eine Einheit Opioidaktivität "Enkephalin" wurde als die Menge definiert, die eine 50%ige Bindung in einem 200 µl-Test (Colquhaun et al., 1973) ergibt.
- Als Nachweis der Flexibilität der Technik wird ein Verfahren zur Produktion von Leu-Enkephalin unter Verwendung eines anderen 2S-Albumins angegeben. In diesem Falle wird anstelle der Verwendung eines cDNA-Clons aus Bertholletia excelsa als Basis für die Konstruktion ein aus Arabidopsis thaliana isolierter genomischer Clon verwendet. Da ein genomischer Clon verwendet wird, wird der eigene Promotor des Gens verwendet, was die Konstruktion beträchtlich vereinfacht. Um weiter die Allgemeingültigkeit der Technik zu zeigen, wird das veränderte 2S-Albumingen in drei verschiedenen Pflanzen zur Expression gebracht: Tabak, Arabidopsis und Brassica napis, eine Verwandte von Arabidopsis, die ebenfalls ein 2S-Albumin besitzt (vgl. Einleitung). Viele der Einzelheiten dieses Beispiels sind dem Vorstehenden ähnlich und werden deshalb kürzer beschrieben.
- Angesichts der Leichtigkeit der Reinigung von 2S-Albumin (siehe Einleitung, Beispiel 1) ist die direkteste Art, das Arabidopsis-2S-Albumingen zu clonieren, die Konstruktion von auf der Proteinsequenz basierenden Oligonucleotidsonden. Die Proteinsequenz wurde durch Standardtechniken im wesentlichen auf die gleiche Art, wie die des Paranuß-2S-Albumins (Ampe et al., 1986) bestimmt. Die Fig. 13 zeigt die Sequenz des 1 kb HindIII-Fragments, das das Arabidopsis thaliana-2S-Albumingen enthält. Die abgeleitete Proteinsequenz ist über der DNA-Sequenz gezeigt, und proteolytische Spaltstellen sind angegeben. Das Ende der Signalsequenz ist ebenfalls angegeben, und SSU bezeichnet die kleine Untereinheit. Die Protein- und DNA-Sequenzen des Peptids, die insertiert werden sollen, sind unter der cDNA-Sequenz gezeigt, ebenso der Rest des bei der Mutagenese zu verwendenden Oligonucleotids. Während des Mutageneseverfahrens wird das gezeigte Oligonucleotid an den entgegengesetzten Strang der gezeigten DNA-Sequenz hybridisiert. Die NdeI-Spaltstelle, die verwendet wird, um die Orientierung des HindIII-Fragments während der Konstruktion zu überprüfen, ist unterstrichen (bp-117). Das Numerierungssystem ist so, daß das A des Initiationscodons als Basenpaar 1 gezählt wird.
- Die Schwierigkeit bei der Verwendung von Oligonucleotidsonden ist, daß mehr als ein Codon eine Aminosäure codieren kann, so daß eine zweifelsfreie Bestimmung der DNA-Sequenz aus der Proteinsequenz nicht möglich ist. Daher wurde an zweideutigen Positionen die Base Inosin verwendet. Die Struktur von Inosin ist so, daß sie die Stärke der Hybridisierung zwar nicht erhöht, aber auch nicht erniedrigt (Ohtsuka et al.,1985; Takahashi et al., 1985). Auf dieser Grundlage wurden drei Oligonucleotidsonden entwickelt, wie in Fig. 14 gezeigt, die die Proteinsequenz der großen Untereinheit des 2S- Albumins von Arabidopsis thaliana zeigt. Unter der Proteinsequenz befinden sich die Sequenzen der als Hybridisierungssonden zur Clonierung des Gens verwendeten Oligonucleotide. I bezeichnet Inosin.
- Die drei Oligonucleotide wurden verwendet, um eine in dem Phagen Charon 35 (Loenen und Blattner, 1983) konstruierte genomische Bank von Arabidopsis-DNA abzusuchen, wobei Standardverfahren verwendet wurden (Maniatis et al., 1982; Benton und Davis, 1977). Die Oligonucleotide wurden mit Kinase behandelt (Miller und Barnes, 1986), und die Hybridisierungen wurden in 5 x SSPE (Maniatis et al., 1982), 0,1 % SDS, 0,02 % Ficoll, 0,02 % Polyvinylpyrolidin und 50 µg/ml beschallter Heringssperma-DNA bei 45ºC durchgeführt. Die Filter wurden in 5 x SSPE, 0,1 % SDS bei 45ºC für 4 bis 8 min gewaschen. Unter diesen Bedingungen wurde ein Clon isoliert, der mit allen drei Oligonucleotidsonden hybridisierte. Geeignete Regionen wurden in pUC18 subcloniert (Yanisch-Perron et al., 1985), wobei Standardtechniken verwendet wurden (Maniatis et al., 1982), und unter Verwendung des Maxam-Gilbert-Verfahrens (1980) sequenziert. Die Sequenz der das Gen enthaltenden Region ist in Fig. 13 gezeigt.
- Das vorstehend isolierte Gen wurde direkt zur Konstruktion eines Leu- Enkephalin/2S-Albumin-chimären Gens verwendet. Wie in dem ersten Beispiel wurde ein Oligonucleotid entwickelt, das die Leu-Enkephalinsequenz und die Lysin-codierenden Codons auf beiden Seiten davon enthielt, um das Enkephalinpolypeptid in den stromabwärts stattfindenden Prozessierungs-Schritten isolieren zu können, und das zu den flankierenden Arabidopsis-Sequenzen komplementäre zusätzliche Sequenzen enthielt, damit das Oligonucleotid an das "Gap-Duplex"-Molekül während der Mutagenese hybridisieren kann. Das so erhaltene Oligonucleotid besitzt die Sequenz:
- 5'-CAAGCTGCCAAGTACGGTGGATTCTTGAAGCAGCACCAAC- 3' dessen Position in der Sequenz in Fig. 8 gezeigt ist.
- Die Region, die das Gen und ausreichend flankierende Regionen, um alle notwendigen regulatorischen Signale zu umfassen, enthält, ist auf einem 3,6 kb-BglII- Fragment, das in den Clonierungsvektor pJB65 (Botterman et al., 1987) insertiert ist, enthalten. Der Clon wird pAT2S1Bg genannt. Die zu mutierende Region ist auf einem 1 kb-HindIII-Fragment innerhalb des 3,6 kb-BglII-Fragments enthalten, und dieses kleinere Fragment wird in die HindIII-Spaltstelle des pMa5-8-Vektors von Stanssens et al., (1987), (Fig. 5c) insertiert. Die Orientierung wird unter Verwendung einer asymmetrischen NdeI- Spaltstelle (Fig. 8) überprüft. Die Mutagenese wird unter Verwendung genau der in Schritt 3 von Beispiel 1 beschriebenen Strategie durchgeführt. Anschließend wird das Hybridgen in das größere Fragment zusammen mit dem mutierten insertiert, wobei Standardtechniken (Maniatis et al., 1982) verwendet werden. Die Orientierung wird erneut unter Verwendung der NdeI-Spaltstelle überprüft.
- Das BglII-Fragment, das das Hybridgen und ausreichend flankierende Sequenzen sowohl 5' als auch 3' der codierenden Region, um zu gewährleisten, daß geeignete Signale zur Genregulation vorhanden sind, enthält, wird in die BamHI-Spaltstelle des gleichen binären Vektors pGSC1702, der in Beispiel 1 (Fig. 12) verwendet wurde , insertiert. Dieser Vektor ist in Abschnitt 4 von Beispiel 1 beschrieben. Die Transformation von Tabakpflanzen wird genau, wie dort beschrieben, durchgeführt. Die Techniken zur Transformation von Arabidopsis thaliana und Brassica napus sind so, daß genau die gleiche Konstruktion in dem gleichen Vektor verwendet werden kann. Nach der Mobilisierung in Agrobacterium tumefaciens, wie in Abschnitt 4 von Beispiel 1 beschrieben, werden die Verfahren von Lloyd et al., (1986) und Klimaszewska et al., (1985), zur Transformation von Arabidopsis bzw. Brassica verwendet. In jedem Falle kann, wie bei Tabak, auf Calli mit 100 µg/ml Kanamycin selektiert werden, und resistente Calli werden verwendet, um die Pflanzen zu regenerieren. Die aus solchen Pflanzen hergestellte DNA wird auf die Anwesenheit des Hybridgens durch Hybridisierung mit dem bei der Mutagenese verwendeten Oligonucleotid überprüft (Im Falle von Tabak und Brassica könnten größere Teile der Hybrid-Konstruktion verwendet werden, aber im Falle von Arabidopsis würden diese mit dem endogenen Gen hybridisieren.).
- Bei dieser erfindungsgemäßen Ausführungsform wird das BglII-Fragment, das das Hybridgen und ausreichende flankierende Sequenzen sowohl 5' als auch 3' der codierenden Region enthält, um zu gewährleisten, daß geeignete Signale für die Genregulation vorhanden sind, in die BglII-Spaltstelle der binären Vektoren pGSC1703 (Fig. 15) oder pGSC1703A (Fig. 16) insertiert. pGSC1703 enthält Funktionen zur Selektion sowohl in E. coli als auch in Agrobacterium, sowie die T-DNA-Fragmente, die den Transfer von Fremd-DNA in Pflanzengenome erlauben (Deblaere et al., 1987). Es enthält weiter den bidirektionalen Promotor TR (Velten et al., 1984) mit der das Neomycin- Phosphotransferaseprotein-codierenden Region (NPTII) und das 3'-Ende des ocs-Gens. Es enthält kein Gen, das Ampicillinresistenz codiert, wie pGSC1702, so daß Carbenicillin ebenso wie Claforan zur Abtötung der Agrobacterien nach dem Infektionsschritt verwendet werden können. Der Vektor pGSC1703A enthält die gleichen Funktionen wie der Vektor pGSC1703 mit einem zusätzlichen Gen, das Hygromycintransferase codiert. Dies erlaubt die Selektion auf die Transformanten sowohl mit Kanamycin als auch mit Hygromycin. Die Transformation von Tabakpflanzen wird genau, wie in Abschnitt 4 von Beispiel I beschrieben, durchgeführt, wobei das Hybridgen in den Pflanzentransformationsvektor pGSC1703 insertiert wird. Die Transformation von Arabidopsis thaliana und Brassica napus wurde mit pGSC1703A durchgeführt, in das das Hybrid-AT2S1-Gen insertiert wurde. Nach der Mobilisierung in Agrobacterium tumefaciens C58C1Rif, das das Plasmid pMP90 trägt (Koncz und Schell, 1986), wobei das zuletzt genannte in trans vir-Genfunktionen bereitstellt, aber kein Ampicillinresistenzcodierendes Gen enthält, wurden die Verfahren von Lloyd et al. (1986) und Klimaszewska et al. (1985) zur Transformation von Arabidopsis bzw. Brassica verwendet. Carbenicillin wird zur Abtötung des Agrobacteriums nach erfolgter gemeinsamer Züchtung verwendet. In jedem Falle kann auf die Calli wie bei Tabak mit 100 µg/ml Kanamycin selektiert werden, und resistente Calli werden zur Regeneration der Pflanzen verwendet. Die aus solchen Pflanzen hergestellte DNA wird auf die Anwesenheit des Hybridgens durch Hybridisierung mit dem bei der Mutagenese verwendeten Oligonucleotid überprüft. (Im Falle von Tabak könnten größere Teile der Hybrid-Konstruktion verwendet werden, aber im Falle von Brassica und Arabidopsis würden diese mit dem endogenen Gen hybridisieren.)
- Positive Pflanzen aus jeder Art werden zur Samenreife gebracht. Im Falle von Tabak benötigt dies etwa 15 Wochen, während für Arabidopsis und Brassica etwa 6 Wochen bzw. 3 Monate benötigt werden. Die Verwendung unterschiedlicher Sorten kann diese Zeitspannen verändern. Die Reinigung der 2S-Albumine aus Samen, die Gewinnung von Leu-Enkephalin und das Testen des zuletzt genannten auf die biologische Aktivität werden wie folgt durchgeführt.
- Zwei Verfahren wurden verwendet, um Enkephalin aus Arabidopsissamen zu isolieren. Zuerst wurde eine kleine Menge an Samen, die aus mehreren individuellen Transformanten isoliert wurde, auf die Anwesenheit chimärer 2S-Albumine abgesucht. Dies wird durchgeführt, weil, wie von Jones et al. (1985) beschrieben, die Expression von eingeschleusten Genen zwischen individuellen Transformanten in weiten Bereichen variieren kann. Samen aus individuellen Pflanzen, die durch dieses einleitende Absuchen erkannt wurden, wurden dann verwendet, um größere Mengen zu isolieren und um die Ausbeuten genauer zu bestimmen. Beide Verfahren sind nachstehend beschrieben.
- Samen von individuellen Pflanzen (etwa 50 mg) wurden gewonnen und in einem Eppendorf-Röhrchen mit einem kleinen Kunststoffstampfer, der auf die Paßform des Röhrchens geformt war, vermahlen. Kein Trockeneis wird bei diesem Verfahren verwendet. Die so erhaltene Paste wurde dreimal mit 1 ml Heptan extrahiert, und der verbleibende Rückstand wurde getrocknet. Das Pulver wurde in 0,2 ml 1 M NaCl suspendiert und 5 min in einem Eppendorf-Röhrchen zentrifügiert. Diese Extraktion wurde dreimal wiederholt und die Überstände vereinigt, wodurch ein Gesamtvolumen von etwa 0,5 ml erhalten wurde. Diese Lösung wurde 20fach mit Wasser verdünnt, was eine NaCl- Endkonzentration von 0,05 M ergab. Sie wurde über Nacht bei 4ºC gelagert und bei 5000 UpM in einem Sorvall SS-34-Rotor für 40 min zentrifügiert. Der so erhaltene Überstand wurde durch eine Einweg-C18-Patrone (SEP-PAC, Millipore, Milford, Massachusetts, USA) geleitet. Die Patronen wurden durch Injizieren von 10 ml Überstand mit einer Spritze durch die Säulen mit einer Geschwindigkeit von 5 ml/min beladen. Die Patrone wurde dann mit 2 ml 0,1 % TFA gewaschen, und die Proteine wurden durch eine stufenweise Elution mit 2 ml Anteilen einer 0,1%igen TFA-Lösung, die 7 %, 14 %, 21 % etc. bis zu 70 % Acetonitril enthielt, desorbiert. Die im Bereich von 28 bis 49 % Acetonitril eluierenden Fraktionen sind mit 2S-Albuminen angereichert, wie durch SDS- Polyacrylamidgelelektrophorese, die bei Teilmengen von unterschiedlichen Fraktionen durchgeführt wurde, beurteilt wurde. Die das 2S-Albumin enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt und in einem Speed-Vac-Konzentrator (Savant Instruments) getrocknet.
- Die vereinigten Fraktionen wurden in 0,95 ml 0,1 % TFA in Wasser rekonstituiert, durch ein HV-4-Millex-Filter (Millipore) flltriert und auf eine Umkehrphasen-C&sub4;-Säule mit einer Länge von 25 cm und einem Durchmesser von 0,46 cm (Vydac 214TP54, Porengröße 300 Angström, Teilchengröße 5 µm) aufgebracht. Die HPLC-Ausrüstung bestand aus zwei Pumpen (Modell 510), einer Vorrichtung zur Kontrolle eines Gradienten (Modell 680) und einem LC-Spektrophotometerdetektor (Lambda-Max-Modell 481, alle von Waters, Milford, Massachussetts, USA). Die Gradienten wurden wie folgt gefahren: Die Lösung A war 0,1 % TFA in H&sub2;O, die Lösung B 0,1 % TFA in 70 % CH&sub3;CN. Für 5 min wurde eine Lösung aus 0 % B und 100 % A über die Säule geschickt, wonach die Konzentration von B auf 100 % linear über 70 min erhöht wurde. Das Säuleneluat wurde durch die Absorption bei 214 nm detektiert. Die 2S-Albumine-enthaltenden Fraktionen wurden gewonnen und in einem Speed-Vac-Konzentrator getrocknet.
- Um eine vollständigere Spaltung durch die Proteasen zu erhalten, ist es empfehlenswert, die Proteine durch Oxidieren der Disulfidbrücken mit Perameisensäure zu denaturieren. Dies wird durch Zugabe von 0,5 ml einer durch Vermischen von 9 ml Ameisensäure und 1 ml 30%igem H&sub2;O&sub2; bei Raumtemperatur hergestellten Lösung durchgeführt. Die Lösung wurde 2 h vor Gebrauch hergestellt. Die Reaktion wird 30 min bei 0ºC durchgeführt und durch Trocknen in einem Speed-Vac-Konzentrator beendet. Spuren verbleibender Perameisensäure wurden durch zweimalige Zugabe von 500 µl Wasser und Lyophilisieren der Probe entfernt.
- Der Rückstand wurde in 0,75 ml 0,1 M Tris-HCl, pH 8,5, erneut aufgelöst, wonach 4 µg TPCK-behandeltes Trypsin (Worthington) zugesetzt wurden. Die Reaktion wurde 3 h bei 37ºC durchgeführt, wonach sie durch Zugabe von 10 µl TFA beendet wurde und bei -20ºC vor der Analyse gelagert wurde. Das so erhaltene Peptidgemisch wurde durch HPLC unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Säulen und Gradientengemische getrennt. Als Standard wurde ein Peptid der gleichen Sequenz wie der erwarteten (YGGFLK) unter Verwendung von Standardtechniken auf einem Biolynx 4175- Peptidsynthesegerät (LKB) synthetisiert. Dieses Peptid wurde über die Säule geschickt und die Retentionszeit wurde bestimmt. Das Peptidgemisch, das aus der tryptischen Spaltung hervorging, wurde dann auf die gleiche Säule geladen, und Peptide mit der gleichen Retentionszeit wie der Standard wurden gewonnen, getrocknet und erneut auf eine C18-Umkehrphasensäule geladen. Die Elutionszeit des Markerpeptids diente erneut als Referenz für die korrekte Position des Enkephalin-enthaltenden Peptids. Die Identität dieses Peptids wurde durch Aminosäuresequenzierung bestätigt, was auch eine grobe quantitative Bestimmung erlaubte. Es wurde gezeigt, daß vier Pflanzen der sechs analysierten Transformanten signifikante Mengen von Leu-Enkephalin enthielten. Als Beispiel sind nachstehend eine ausführliche Analyse und Verfahrensstufen für eine dieser vier Pflanzen angegeben.
- 2,11 g Samen aus der Pflanze wurde in einem Mörser in Trockeneis vermahlen. Die Lipide wurden aus dem so erhaltenen Pulver durch dreimaliges Extrahieren mit 5 ml Heptan entfernt. Der so erhaltene Rückstand wurde getrocknet.
- Das Pulver wurde in etwa 4 ml 1,0 M NaCl aufgelöst. Die so erhaltene Paste wurde in einem SS-34-Rotor bei 17.500 UpM 40 min zentrifugiert. Nach jedem Zentrifugieren wurde der Überstand in ein frisches Röhrchen überführt, und das Pellet wurde erneut in 4 ml 1,0 M NaCl resuspendiert. Dieses Verfahren wurde dreimal wiederholt. Die drei Überstände (insgesamt 12 ml) wurden über ein 0,45 µm Filter (HA, Millipore) geleitet.
- Die 12 ml der Lösung aus dem vorstehenden Schritt wurden über eine Sephadex G-50-Mediumsäule (Pharmacia) in zwei Chargen zu je 6 ml geleitet. Die Säule hatte einen Durchmesser von 2,5 cm, eine Länge von 100 cm und wurde mit einer Fließgeschwindigkeit von etwa 27 ml/h in 0,5 M NaCl betrieben. Fraktionen zu etwa 7 ml wurden gewonnen. Die Fraktionen wurden auf das Protein auf zwei Arten überprüft. Zuerst wurde das Gesamtprotein durch Aufbringen von 10 µl jeder Fraktion auf ein Stück Whatman 3MM-Papier nachgewiesen, wobei die Fraktionsnummern mit einem Bleistift angegeben wurden. Die Flecken wurden 1 min in warmer Luft getrocknet, und die Proteine durch rasches (30 s) Eintauchen des Papierblatts in eine 10%ige TCA-Lösung fixiert. Das Blatt wurde dann in eine Commassie-Blau-Lösung überführt, die ähnlich der war, die für die Polyacrylamidgelfärbung verwendet wurde. Nach 1 min wurde das Papier entfernt und mit Leitungswasser gespült. Proteinhaltige Fraktionen zeigen einen blauen Fleck auf einem weißen Hintergrund. Die minimale Nachweisgrenze der Technik beträgt etwa 0,05 mg/ml. Diejenigen Fraktionen, die Protein enthielten, wurden auf die Anwesenheit von 2S-Albuminen durch Zugabe von 2 µl der 7 ml Fraktion zu 10 µl des Probenpuffers und anschließendes Laden von 6 µl dieses Gemisches auf ein 17,5%iges Polyacrylamid-Minigel getestet. Diejenigen Fraktionen, von denen gezeigt wurde, daß sie 2S-Albumine enthalten, wurden vereinigt; das Gesamtvolumen der vereinigten Fraktionen betrug 175 ml.
- Dies wurde mittels HPLC über eine C&sub4;-Säule mit einer Länge von 25 cm und einem Durchmesser von 0,46 cm (Vydac 214TP54, Porengröße 300 Angström, Teilchengröße 5 µm) durchgeführt. Die HPLC-Ausrüstung bestand aus zwei Pumpen (Modell 510), einer Vorrichtung zur Kontrolle eines Gradienten (Modell 680) und einem LC-Spectrophotometer-Detektor (Lambda-Max-Modell 481, alle von Waters, Milford, Massachusetts, USA). 21 ml der 175 ml wurden auf dieses System in 6 Läufen zu je 3,5 ml geladen. Die Gradienten wurden wie folgt gefahren: Die Lösung A war 0,1 % TFA in H&sub2;O und die Lösung B 0,1 % TFA in 70 % CH&sub3;CN. Für 5 min wurde eine Lösung aus 0 % B und 100 % A über die Säule geschickt, wonach die Konzentration von B auf 100 % linear über 70 min erhöht wurde. Während jedes Laufes wurde die 2S-Albuminfraktion gewonnen, und nach allen 6 Läufen wurden diese Fraktionen vereinigt und in 3 Röhrchen aufgeteilt, von denen jedes 7/175 der 2S-Albumine aus den 2,11 g Samen enthielt. Jedes der Aliquote wurde weiter getrennt verarbeitet und zur quantitativen Abschätzung der Ausbeuten verwendet.
- Vor der Spaltung mit Trypsin wurden die drei Aliquote, wie vorstehend beschrieben, oxidiert. Die Spaltung mit Trypsin wurde im wesentlichen, wie vorstehend beschrieben, durchgeführt. 0,95 ml 0,1 M Tris-HCl, pH 8,5, wurden jedem Aliquot zugesetzt, das mit 50 µg Trypsin (Worthington) versetzt wurde, und die Reaktion wurde 4 h bei 37ºC durchgeführt.
- Das den carboxylterminalen Lysinrest enthaltende Enkephalinpeptid wurde unter Verwendung zweier aufeinanderfolgender HPLC-Schritte isoliert. Wie in dem vorstehenden, in kleinem Umfang durchgeführten Isolierungsverfahren beschrieben, wurde ein Peptid der gleichen Sequenz, wie erwartet, synthetisiert, und über ein HPLC-System unter Verwendung der gleichen Säule und der gleichen Gradientenbedingungen, die in der vorstehenden Entsalzungsstufe beschrieben wurden, geschickt. Die Retentionszeit des synthetischen Peptids wurde bestimmt (Fig. 17A). Die drei tryptischen Spaltungsprodukte wurden dann (getrennt) auf die gleiche Säule geladen, und das Material mit der gleichen Retentionszeit wie bei dem synthetischen Peptid wurde gewonnen (die schraffierte Fläche in Fig. 17B) und getrocknet. Das gleiche Verfahren wurde dann unter Verwendung der gleichen Ausrüstung und Gradienten verwendet, ausgenommen, daß eine C18-Säule (25 x 0,46 cm, Vydac 218TP104-Material mit einer Porengröße von 300 Angström und einer Teilchengröße von 10 µm) verwendet wurde. Wieder wurde das Material mit der gleichen Retentionszeit wie das synthetische Peptid gewonnen (Fig. 18A und 18B). Dies führte zu drei Präparaten, jeweils abgeleitet von 7/175 des gesamten 2S-Albumins.
- 1/20 des Materials in einem dieser drei Aliquote wurde verwendet, um die Sequenz des isolierten Peptids zu überprüfen. Diese wurde durch automatisierte Gasphasensequenzierung unter Verwendung eines Gasphasensequenators von Applied Biosystems Inc. (USA)-470A bestimmt. Die schrittweise freigesetzten Phenylthiohydantoinaminosäurederivate (PTH) wurden durch einen On-Line-PTH-Aminosäureanalysator (Applied Biosystems Inc. 120A) analysiert. Der Sequenator und der PTH-Analysator wurden gemäß den Angaben des Herstellers betrieben. Die HPLC-Chromatogramme der freigesetzten PTH-Aminosäuren aus den Zyklen 1 bis 6 sind in Fig. 19 gezeigt. Die Sequenz war, wie erwartet, YGGFLK. Die Ausbeute der PTH-Aminosäure des ersten Zyklus wurde verwendet, um die Ausbeute dieses Zwischenpeptids zu berechnen (251-277 nmol/g Samen).
- Die drei aus dem vorherigen Schritt erhaltenen Aliquote wurden in 100 µl 0,2 M N-Ethylmorpholin, pH 8,5, (Janssen Chimica, Belgien) resuspendiert, und jeweils ein Drittel wurde mit 0,2 µg Carboxypeptidase B (Boehringer Mannheim, Sequenzierreinheit) bei 37ºC behandelt. Die drei Aliquote wurden 5, 12 bzw. 17 min lang behandelt, aber alle drei Spaltungen erwiesen sich als gleich effektiv. Nach der Spaltung wurde das Enkephalin mittels HPLC unter Verwendung der gleichen Ausrüstung, Säule und Gradienten, wie bei der vorstehenden Entsalzung beschrieben, gereinigt.
- Die Endausbeute des Enkephalins wurde durch Durchführen einer Aminosäureanalyse bestimmt. Ein Aliquot entsprechend 1/150 der Gesamtmenge der vorstehend genannten drei Aliquote wurde in 400 µl 6 N HCl, 0,05 % Phenol bei 110ºC für 24 h hydrolysiert. Das Hydrolysat wurde getrocknet, und die Aminosäuren zu Phenylthiocarbamoyl (PTC)-Resten derivatisiert (Bildingmeyer et al., 1984). Drei getrennte Aliquote des PTC-Restgemisches wurden unter Verwendung des PICO-TAG- Aminosäureanalysesystems (Waters, Millipore, Milford, Massachusetts, USA) quantitativ bestimmt. Die Ausbeuten des Enkephalinpeptids wurden für jede der drei Proben unter Verwendung von α-Aminobuttersäure als interner Standard berechnet. Basierend auf demtDurchschnitt der drei Bestimmungen wurde eine Endausbeute von 206 nmol Enkephalin/g Samen berechnet.
- Die Identität des am Schluß erhaltenen Peptids wurde auf drei Arten bestätigt. Erstens, dessen Aminosäurezusammensetzung, die Molverhältnisse von Gly, 1,76; Tyr, 1,00; Leu, 1,15 und Phe, 1,02 zeigte. Zweitens, dessen Retentionszeit auf einer Umkehrphasen-HPLC-Säule entspricht der eines Referenz-Enkephalinpeptids (Fig. 20) und schließlich wurde dessen Aminosäuresequenz bestimmt. Diese Kriterien identifizieren zweifelsfrei das von chimären 2S-Albuminen isolierte Peptid als Leu-Enkephalin.
- Als drittes Beispiel des beschriebenen Verfahrens wird ein Verfahren zur Produktion der zwei Wachstumshormon-Releasingfaktor (GHRF)-Analoga angegeben. Synthetische und natürliche Analoga des ursprünglich isolierten 44 Aminosäurepeptids (Guillemin et al., 1982), worin das Methionin in Position 27 durch ein Leucin ersetzt worden war und worin der Carboxylterminus auf verschiedene Arten modifiziert ist oder sogar um vier Aminosäuren verkürzt ist, wurden als aktiv nachgewiesen (Kempe et al., 1986; Rivier et al., 1982). In diesem Fall werden zwei verschiedene Analoga, die nachstehend als GHRFL und GHRFS bezeichnet werden, produziert. Beide Fälle besitzen die Leucin-Substitution anstelle von Methionin in Position 27. GHRFL wird so produziert, daß der Carboxylterminus Leu-NH&sub2; ist, wie er in einer natürlichen Form des Peptids vorkommt (Guillemin et al., 1982). GHRFS endet auf Arg-Hse-NH&sub2;, worin Hse für Homoserin steht. Von Kempe et al. (1986) wurde gezeigt, daß dieses Analogon biologisch aktiv ist. Beide Analoga sind von Methionincodons in dem 2S-Albumin flankiert, so daß sie durch Behandlung mit CNBr herausgespalten werden können. Dies ist möglich, da keines der Analoga ein internes Methionin enthält. Nach der Isolierung der zwei Peptide unter Verwendung von HPLC-Techniken werden sie chemisch modifiziert, so daß Leu- NH&sub2; und Arg-Hse-NH&sub2;-Carboxyltermini erhalten werden.
- Ein Satz synthetischer Oligonucleotide, die die zwei GHRF-Analoga und die CNBr-Spaltstellen codieren, ersetzen im wesentlichen die vollständige hypervariable Region in einem genomischen Clon, der das 2S-Albumin von Arabidopsis thaliana codiert. Nur ein paar den sechsten und siebten Cysteinresten benachbarte Aminosäuren blieben. Dieses chimäre Gen steht unter der Kontrolle seines natürliche Promotors und Signalpeptids. Das Verfahren und die Konstruktionen sind schematisch in den Fig. 21 und 22 dargestellt. Die vollständige Konstruktion wird in Tabak-, Arabidopsis thaliana- und Brassica napus-Pflanzen unter Verwendung eines Agrobacterium-vermittelten Transformationssystem überführt. Die Pflanzen werden regeneriert, und nach der Blüte werden die Samen gewonnen, und die 2S-Albumine gereinigt. Die GHRF-Peptide werden aus dem 2S-Albumin unter Verwendung von CNBr gespalten, wobei die Spaltstelle in das Oligonucleotid eingebaut ist, und dann unter Verwendung von HPLC-Techniken isoliert.
- Das Arabidopsis thaliana-Gen wurde gemäß der Beschreibung in Beispiel II cloniert (vgl. auch Krebbers et al., 1988). Wie bereits beschrieben, wird das das Gen enthaltende Plasmid als pAT2S1 bezeichnet. Die Sequenz der Region, die das sogenannte AT2S1-Gen enthält, ist in der Fig. 13 gezeigt.
- Ein Teil der hypervariablen Region von AT2S1 wird durch das folgende Oligonucleotid ersetzt:
- 5'- CCA ACC TTG AAA GGT ATA CAC TTG CCC AAC-3' 30-mer
- P T L K G I H L P N
- worin die unterstrichenen Sequenzen die AccI-Spaltstelle und die umgebenden Sequenzen Sequenzen zeigen, die komplementär zu der codierenden Sequenz der hypervariablen Region des beizubehaltenden Arabidopsis-2S-Albumingens sind. Dies führt schließlich zu der unter dem Oligonucleotid angegebenen Aminosäuresequenz.
- Die Deletion und die Substitution eines Teils der die hypervariable Region von AT2S1 codierenden Sequenz wird unter Verwendung der ortsspezifischen Mutagenese mit dem Oligonucleotid als Primer durchgeführt. Das System von Stanssens et al. (1987) wird, wie in Beispiel I beschrieben, verwendet.
- Die einzelnen Schritten des Verfahrens sind wie folgt:
- - Clonierung des HindIII-Fragments von pAT2S1, das die codierende Region des AT2S1-Gens enthält, in pMa5-8 (I). Dieser Vektor trägt eine Ambermutation in dem CmR-Gen und spezifiziert Ampicillinresistenz. Das so erhaltene Plasmid wird als pMacAT2S1 bezeichnet (siehe Fig. 21, Schritte 1).
- - Herstellung der einzelsträngigen DNA dieser Rekombinante (II) aus pseudoviralen Teilchen.
- - Herstellung eines HindIII-Restriktionsfragments aus den komplementären pMc- Typ-Plasmid (III). pMc-Typ-Vektoren enthalten das Wildtyp-CmR-Gen, während eine Ambermutation in den Ap-Resistenzmarker eingeführt wird.
- - Konstruktion einer "Gap-Duplex"-DNA (nachstehend als gdDNA bezeichnet) dgDNA (IV) durch in vitro DNA/DNA-Hybridisierung. In der gdDNA sind die Zielsequenzen als einzelsträngige DNA freigelegt. Eine Reinigung der gdDNA vor dem Arbeitsschritt von den anderen Komponenten des Hybridisierungsgemisches ist nicht notwendig.
- - Anelieren des 30-meren synthetischen Oligonucleotids an die gdDNA (V).
- - Auffüllen der verbleibenden einzelsträngigen Lücken und Versiegeln der Strangbrüche durch eine gleichzeitige in vitro Klenow-DNA-Polymerase I/DNA- Ligasereaktion (VI).
- - Transformation eines mutS-Wirts, d.h. eines Stammes mit der Unfähigkeit zur Reparatur von Fehlpaarungen, wodurch auf eine Cm-Resistenz selektiert wird. Dies führt zur Produktion einer gemischten Plasmidnachkommenschaft (VII).
- - Elimination der Nachkommenschaft, die von dem Matrizenstrang (pMa-Typ) abgeleitet ist, durch erneute Transformation eines Wirts, der Ambermutationen (VIII) nicht unterdrücken kann. Selektion auf Cm-Resistenz führt zu einer Anreicherung der von dem Lücken-(gapped)-Strang abgeleiteten Nachkommen, d.h. dem Strang, in den das mutagene Oligonucleotid eingeschleust wurde.
- - Absuchen der aus der erneuten Transformation hervorgehenden Clone auf die Anwesenheit der gewünschten Mutation. Das so erhaltene Plasmid, das die deletierte hypervariable Region von AT2S1 enthält, wird als pMacAT2S1C40 bezeichnet (siehe Fig. 21, Schritt 2).
- Wie vorstehend angegeben, wenn die Sequenzen, die den Hauptteil der hypervariablen Schleife codieren, entfernt wurden, wurde eine AccI-Spaltstelle an dieser Stelle insertiert. Die interessierenden Sequenzen werden in diese AccI-Spaltstelle insertiert, aber eine zweite AccI-Spaltstelle ist auch in dem HindIII-Fragment, das das modifizierte Gen enthält, vorhanden. Daher wird das NdeI-HindIII-Fragment, das das modifizierte Gen enthält, in den Clonierungsvektor pBR322 (Bolivar, 1977), der ebenfalls mit NdeI und HindIII gespalten wurde, subcloniert. Die Position der NdeI-Spaltstelle in dem 2S-Albumingen ist in Fig. 4 angegeben. Der so erhaltene Subclon wird als pBRAT2S1 bezeichnet (Fig. 21, Schritt 3). Sequenzen, die die zwei Versionen des Wachstumshormons codieren, werden in die AccI-Spaltstelle von pBRAT2S1 durch Konstruktion einer Reihe von komplementären synthetischen Oligonucleotiden insertiert, die bei Anelierung die vollständige GHRF-Sequenz bilden. Der Codongebrauch wurde so gewählt, daß er etwa zu dem von AT2S1 paßte, eine für diagnostische Zwecke zu verwendende Restriktionsspaltstelle (StyI) wurde aufgenommen, und an den Enden der GHRF-codierenden Sequenzen wurden zu BamHI- und PstI-Spaltstellen komplementäre überstehende Enden zusammen mit zusätzlichen Basen aufgenommen, um zu gewährleisten, daß nach den nachstehend beschriebenen Schritten der Leserahmen des 2S-Albumingens beibehalten würde. Die in den zwei Konstruktionen verwendeten acht Oligonucleotide sind in Fig. 22 gezeigt. In Fig. 22A sind die Grenzen der Oligonucleotide durch vertikale Linien angegeben, und die Ziffern über und unter der Sequenz bezeichnen ihre Nummern. In den Oligonucleotiden 4 und 8 sind die in dem Kasten eingeschlossenen Basen ausgeschlossen, was zu der GHRFS-Version der Konstruktion führt. Es wurde gefunden, daß die durch ein * in Fig. 22A markierten Basen zu einem T in dem für die weitere Konstruktion von GHRFL (pEK7) verwendeten Clon mutiert waren, aber da diese Veränderungen die Aminosäuresequenz nicht beeinflußten, wurden diese Veränderungen nicht korrigiert. Die Peptidsequenz des GHRF-Peptids und die für CNBr-Spaltstellen aufgenommenen Methionine sind über der DNA-Sequenz gezeigt. Die überstehenden Basen an jedem Ende dienen der Ligierung der Fragmente in BamHI- und PstI-Spaltstellen. Diese werden durch S1-Spaltung entfernt. Das glattendige Fragment wird dann in die mit Klenow behandelte AccI-Spaltstelle von pBRAT2S1 ligiert, wie in Fig. 22B gezeigt ist. Der Leserahmenkontext der AccI-Spaltstelle ist in dem oberen Teil der Figur gezeigt, wobei die Spaltstellen durch ein ' gekennzeichnet sind. Die Ergebnisse der Manipulation befinden sich darunter, wobei die aus der AccI-Spaltstelle hervorgehenden Basen und deren Auffüllung in Fettdruck gezeigt sind.
- Alle sechs bei jeder Konstruktion verwendeten Oligonucleotide wurden mit Kinase behandelt. Für die Anelierungsreaktion wurden 2 pmol jedes Oligonucleotids in einem Gesamtvolumen von 12 µl vereinigt. Das Gemisch wurde 10 min bei 90ºC inkubiert, bei Raumtemperatur auf etwa 65 bis 70ºC für 10 min gebracht und dann langsam auf 30 bis 35ºC über eine Zeitspanne von 30 bis 45 min abgekühlt. Am Ende dieser Zeitspanne wurden Ligasepuffer (Maniatis et al., 1982) und 1,5 Einheiten T4-Ligase zugesetzt, das Volumen auf 15 µl eingestellt und das Gemisch über Nacht bei 16ºC inkubiert. Das Gemisch wurde dann 5 min bei 65ºC inkubiert, wonach 2,5 µl 100 mM NaCl-Restriktionsendonuclease-Puffer (Maniatis et al., 1982) und 5 bis 10 Einheiten jeweils an BamHI und PstI zugesetzt wurden, und das Volumen auf 25 µl eingestellt wurde. Diese Spaltung dient der Spaltung aller vorhandener Concatemeren, die sich während des Ligierungschritts gebildet hatten. Nach 45minütiger Spaltung wurde der Reaktionsansatz mit Phenol/Chloroform extrahiert, ausgefällt und in 10 µl resuspendiert, wovon 5 µl mit pUC18 (Yanisch-Perron et al., 1985) ligiert wurden, der mit BamHI und PstI gespalten und mit bakterieller alkalischer Phosphatase behandelt worden war. Nach der Transformation der bakteriellen Zellen nach Standardtechniken (Maniatis et al., 1982) wurden rekombinante Kolonien nach dem Verfahren von Grunstein (1975) unter Verwendung des mit ³²P endmarkierten Oligonucleotids Nr.1 abgesucht. Clone aus jeder Version des GHRF-Gens wurden sequenziert, und ein Clon für jede Version mit der Bezeichnet pEK7 (enthaltend GHRFL) und der Bezeichnung pEK8 (enthaltend GHRFS) wurden in den weiteren Schritten verwendet (vgl. Schritt 4 in Fig. 21).
- Die BamHI-PstI-Fragmente von pEK7 und pEK8 wurden in die AccI-Spaltstelle von pBRAT2S1 insertiert (Fig. 21, Schritt 5). Die Einzelheiten der Behandlungen, die durchgeführt wurden, um den offenen Leserahmen beizubehalten, sind in Fig. 22 gezeigt. pEK7 und pEK8 wurden jeweils sowohl mit BamHI als auch PstI gespalten, mit S1- Nuclease behandelt, und die die GHRF-codierenden Sequenzen enthaltenden Fragmente wurden nach Gelelektrophorese isoliert. Diese Fragmente wurden dann getrennt mit pBRAT2S1 ligiert, das mit AccI gespalten worden war, und wurden mit dem Klenow- Fragment der DNA-Polymerase I behandelt. Die so erhaltenen Clone wurden auf die geeignete Orientierung der GHRF-codierenden Sequenzen durch Spaltung mit StyI, dessen Spaltstelle in die synthetischen Sequenzen zu diesem Zweck eingeführt worden war, und HindIII überprüft. Mehrere Clone, von denen festgestellt wurde, daß sie Insertionen in der korrekten Orientierung enthielten, wurden sequenziert. Dieser zuletzt genannte Schritt ist notwendig, weil die Spaltung mit S1-Nuclease nicht immer streng kontrolliert werden kann. Es wurde bestätigt, daß ein Clon für jede der zwei GHRF-Konstruktionen die korrekte Sequenz hatte, und dieser wurde in den weiteren Schritten verwendet. Sie wurden als pEK100 und pEK200 für GHRFL bzw. GHRFS bezeichnet.
- Das vollständige chimäre Gen wird wie folgt rekonstruiert (siehe Fig. 21): Der Clon pAT2S1Bg enthält ein 3,6 kb-BglII-Fragment, das in den Clonierungsvektor pJB65 (Botterman et al., 1987) insertiert war und nicht nur das 1,0 kb-HindIII-Fragment, das die codierende Region des Gens AT2S1 enthält, sondern auch ausreichend Sequenzen stromaufwärts und stromabwärts dieses Fragments enthält, um alle notwendigen Regulatorelemente für die geeignete Expression des Gens zu enthalten. Dieses Plasmid wird mit HindIII gespalten und das 5,2 kb-Fragment (d.h. der Teil des Plasmids, der die codierende Region von AT2S1 nicht enthält) wird isoliert. Der Clon pAT2S1 wird mit HindIII und NdeI gespalten, und das so erhaltene 320 bp-HindIII-NdeI-Fragment wird isoliert. Dieses Fragment stellt dasjenige dar, das aus dem modifizierten 2S-Albumin bei der Konstruktion von pBRAT2S1 (Schritt 3 von Fig. 21) entfernt wurde, um die Insertion der Oligonucleotide in Schritt 5 der Fig. 21 ohne die Komplikationen aufgrund einer zusätzlichen AccI-Spaltstelle zu ermöglichen. Diese zwei isolierten Fragmente werden dann in einer Ligierung umfassend drei Teile mit den NdeI-HindIII-Fragmenten aus pEK100 bzw. pEK200 (Fig. 21, Schritt 6), welche die modifizierte codierende Sequenz enthalten, ligiert. Die einzelnen Transformanten können abgesucht werden, um die geeignete Orientierung des rekonstruierten HindIII-Fragments mit dem BglII-Fragment unter Verwendung irgendeiner beliebigen Anzahl von Spaltstellen zu überprüfen. Die so erhaltenen Plasmide pEK502 und pEK6011 bestehen aus einem 2S-Albumingen, das nur in der hypervariablen Region modifiziert ist, und von den gleichen flankierenden Sequenzen und so dem gleichen Promotor wie das nicht-modifizierte Gen umgeben ist, wobei die ganze Einheit auf einem BglII-Fragment enthalten ist.
- Das das chimäre Gen enthaltende BglII-Fragment wird in die BglII-Spaltstelle des binären Vektors pGSC1703A (Fig. 16) (vgl. auch Fig. 21, Schritt 6) insertiert, der in Abschnitt 3 von Beispiel 2 verwendet und beschrieben wurde. Das so erhaltene Plasmid wird als pTAD12 bezeichnet. Unter Verwendung von Standardverfahren (Deblaere et al., 1987) wird pTAD12 in den Agrobacterium-Stamm C58C1Rif, der das Plasmid pMP90 trägt und ebenfalls in Abschnitt 3 von Beispiel II verwendet wurde, überführt. Dieses Agrobacterium wird dann zur Transformation von Pflanzen verwendet. Tabakpflanzen des Stammes SR1 werden unter Verwendung von Standardverfahren (Deblaere et al., 1987) transformiert. Auf die Calli wird mit 100 µg/ml Kanamycin selektiert, und resistente Calli werden zur Regeneration von Pflanzen verwendet.
- Die Techniken zur Transformation von Arabidopsis thaliana und Brassica napus sind so, daß genau die gleichen Konstruktionen in dem gleichen Vektor verwendet werden können. Nach der Übertragung in Agrobacterium tumefaciens, wie vorstehend beschrieben, werden die Verfahren von Lloyd et al. (1986) und Klimaszewska et al. (1985) zur Transformation von Arabidopsis bzw. Brassica verwendet. In jedem Falle kann wie für Tabak auf Calli mit 100 µg/ml Kanamycin selektiert werden, und resistente Calli werden zur Regeneration von Pflanzen verwendet.
- Bei allen drei Arten werden in einem frühen Stadium der Regeneration die regenerierten Pflanzen auf die Transformation überprüft, indem ein Callus aus einem Blatt auf einem mit Kanamycin supplementierten Medium induziert wird (vgl. auch Punkt 6).
- Bei allen drei Arten werden regenerierte Pflanzen bis zur Samenreife gebracht. Da erwartet werden kann, daß unterschiedliche transformierte Pflanzen variierende Expressionsgrade haben ("Positionseffekte", Jones et al., 1985), müssen zuerst mehr als ein Transformant analysiert werden. Dies kann im Prinzip entweder auf der RNA- oder der Proteinebene durchgeführt werden. In diesem Fall wurde Samen-RNA, wie in Beachy et al., 1985 beschrieben, hergestellt, und Northern-Blots wurden unter Verwendung von Standardtechniken (Thomas et al., 1980) durchgeführt. Da im Fall des vollständigen chimären Gens sowohl von Brassica als auch Arabidopsis eine Kreuzhybridisierung mit endogenen Genen das Ergebnis sein würde, wurden zu der Insertion mit dem 2S-Albumin komplementäre Oligonucleotidsonden verwendet; eines der Oligonucleotide, das zur Herstellung der Konstruktion verwendet wurde, kann verwendet werden. Für jede Art wurden 1 oder 2 individuelle Pflanzen für die weitere Analyse, wie nachstehend beschrieben, verwendet.
- Zuerst wurde die Kopienzahl des chimären Gens durch Herstellen von DNA aus Blattgewebe der transformierten Pflanzen (Dellaporta et al., 1983) und Absuchen mit dem vorstehend verwendeten Oligonucleotid bestimmt.
- Die 2S-Albumine werden durch Extraktion bei hohem Salzgehalt, Gelfiltration und Umkehrphasen-HPLC, wie in Beispiel II beschrieben, gereinigt.
- Die korrekten Elutionszeiten der chimären 2S-Albumine werden durch immunologische Techniken unter Verwendung von im Handel erhältlichen Antikörpern (UCB-Bioprodukts, Drogenbos, Belgien) gegen das natürliche GHRF bestimmt.
- Die entsalzten, mittels HPLC gereinigten GHRF enthaltenden 2S-Albumine werden dann mit CNBr behandelt (Gross und Witkop, 1961). CnBr setzt die GHRF-Analoga frei, wobei ein zusätzliches Homoserin/Homoserinlacton immer noch an das COOH-terminale Ende gebunden ist. Die GHRF-Analoga werden unter Verwendung klassischer Umkehrphasen-HPLC-Techniken, wie in Beispiel II beschrieben, gereinigt, und ihre Aminosäuresequenz wird unter Verwendung des in Beispiel II beschriebenen Verfahrens bestimmt. Das isolierte GHRFS-Analogon wird unter Verwendung von Ammoniak, n- Butylamin und n-Dodecylamin, wie von Kempe et al., 1986, beschrieben, amidiert. Dies führt zu dem beschriebenen Arg-Hse-NH&sub2;-Terminus.
- -Das zweite Analogon, GHRFL, bei dem ein zusätzliches Methionin noch am carboxylterminalen Ende vorhanden ist, wird zuerst mit Carboxypeptidase B behandelt, wodurch der carboxylterminale Homoserinrest entfernt wird (Ambler, 1972). Dies führt zu einem Leu-Gly-COOH-Terminus. Die Behandlung mit D-Aminosäureoxidase in Gegenwart von Katalase und Ascorbat, wie in Kreil (1984) beschrieben, wandelt das Glycin-COOH-Ende in das terminale Amid-CONH&sub2; und Glyoxylsäure um. Dieser Satz von enzymatischen Schritten führt zu dem abschließend erhaltenen amidierten GHRFL- Analogon.
- Die Beispiele gaben somit eine vollständige Erläuterung, wie 2S-Albuminspeicherproteine modifiziert werden können, um in sie eine Insertion, die Leu- Enkephalin oder den Wachstumshormon-Releasing-Faktor codiert, einzubauen, gefolgt von der Transformation von Tabak-, Arabidopsis- und Brassica-Zellen mit einem geeigneten Plasmid, das die entsprechende modifizierte Vorläufer-Nucleinsäure enthält, der Regeneration der transformierten Pflanzenzellen in entsprechende Pflanzen, die Züchtung davon bis zum samenbildenden Stadium, die Gewinnung der Samen, die Isolierung des Hybrid-2S-Albumins daraus und schließlich die Gewinnung von Leu- Enkephalin oder GHRF aus dem Hybridprotein in einer gereinigten Form.
- Es ist leicht verständlich, daß die Erfindung somit einen Durchbruch auf dem Gebiet der gentechnisch hergestellten Proteine oder Polypeptide und deren Produktion in beträchtlichen Mengen unter Bedingungen, die sie in einer Konfiguration ergeben, die ihrer natürlichen nahekommt, bietet.
- Es versteht sich von selbst, daß die Erfindung nicht auf die vorstehenden Beispiele beschränkt ist. Der Fachmann wird in jedem Falle in geeigneter Weise die Speicherproteine für die Produktion irgendeines bestimmten interessierenden Polypeptids oder Peptids auswählen, wobei dessen Natur z.B. von den adäquaten Restriktionsspaltstellen, die es enthält, abhängt, um am besten die entsprechende DNA-Insertion anzupassen, wobei die Wahl des geeignetsten samenspezifischen Promotors von der Natur der samenbildenden Pflanze abhängt, die zur Produktion des entsprechenden Hybridproteins transformiert werden soll, woraus das interessierende Peptid schließlich gespalten, gewonnen und gereinigt werden kann.
- Es folgt eine Liste von Literaturstellen, auf die im Verlauf der vorliegenden Offenbarung in dem Umfang Bezug genommen wurde, daß auf bekannte Verfahren zur Durchführung einiger der hier in Bezug genommenen Verfahrenschritte oder auf allgemeines Wissen, das vor der Durchführung der Erfindung gesichert wurde, Bezug genommen wurde.
- Es wird weiterhin bestätigt, daß
- - das Plasmid pSOYLEA³ bei der DSM als Nr.4205 am 3. August 1987 hinterlegt wurde; und
- - das Plasmid pBN2S1 bei der DSM als Nr.4204 am 3. August 1987 hinterlegt wurde;
- - die Plasmide pMa5-8 und pMc5-8 bei der DSM als Nr.4567 bzw. Nr.4566 am 3. Mai 1988 hinterlegt wurden;
- - das Plasmid pAT2S1 bei der DSM als Nr.4879 am 7. Oktober 1988 hinterlegt wurde;
- - das Plasmid pAT2S1Bg bei der DSM als Nr.4878 am 7. Oktober 1988 hinterlegt wurde;
- - das Plasmid pGSC1703A bei der DSM als Nr.4880 am 7. Oktober 1988 hinterlegt wurde;
- - das Plasmid pEK7 bei der DSM als Nr.4876 am 7. Oktober 1988 hinterlegt wurde;
- - das Plasmid pEK8 bei der DSM als Nr.4877 am 7. Oktober 1988 hinterlegt wurde;
- trotz der Tatsache, daß sie alle aus Konstruktionen bestehen, die ein Fachmann auf dem Gebiet aus verfügbarem genetischem Material ohne Durchführung irgendeiner erfinderischen Arbeit reproduzieren kann.
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Claims (22)
1. Verfahren zur Produktion einer rekombinanten
DNA-Sequenz, die 2S-Albumin codiert, das so modifiziert ist,
daß es ein interessierendes Polypeptid enthält,
umfassend:
Modifikation einer ersten einen Vorläufer eines
2S-Albumins codierenden Nucleinsäure in einem Bereich zwischen
Codons, die den vierten und fünften Cysteinrest der
großen Untereinheit des 2S-Albumins codieren, durch
Insertion in den Bereich oder durch Austausch eines Teils
davon durch eine heterologe,das interessierende
Polypeptid codierende Nucleinsäure-Insertion, wobei eine
rekombinante, einen Vorläufer eines chimären 2S-Albumins
codierende DNA bereitgestellt wird, in der die heterologe
Nucleinsäure-Insertion und Teile der ersten sie
umgebenden Nucleinsäure einen Vorläufer eines chimären
2S-Albumins codieren, der das interessierende Polypeptid
umfaßt, das von Teilen der großen Untereinheit des
2S-Albumins umgeben ist.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Enden der
heterologen Nucleinsäure-Insertion mit einem oder mehreren
Codons verknüpft sind, die einen oder mehrere
Aminosäurereste codieren, die die ersten selektiv spaltbaren
Randstellen innerhalb des chimären 2S-Albumins angeben.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das
interessierende Polypeptid aus sich wiederholenden Einheiten eines
kleineren Polypeptids oder Proteins gebildet ist, und
die Einheiten voneinander durch zweite selektiv
spaltbare Randstellen trennbar sind.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die
erste Nucleinsäure im Bereich zwischen dem vierten
Codon, das stromabwärts des den vierten Cysteinrest
codierenden Codons liegt, und dem sechsten Codon, das
stromaufwärts des den fünften Cysteinrest codierenden Codons
liegt, modifiziert ist.
5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei die erste Nucleinsäure
zwischen dem sechsten Codon, das stromabwärts des den
vierten Cysteinrest codierenden Codons liegt, und dem
sechsten Codon, das stromaufwärts des den fünften
Cysteinrest codierenden Codons liegt, modifiziert ist.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die
erste Nucleinsäure ein 2S-Albumin von Arabidopsis
thaliana codiert und zwischen den Codons modifiziert
ist, die die Aminosäurereste 31 und 57 der großen
Untereinheit des 2S-Albumins codieren.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das
2S-Albumin aus 2S-Albuminen von Ricinus communis,
Arabidopsis thaliana, Brassica napus und Bertholletia
excelsa ausgewählt ist.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die
Nucleinsäure-Insertion ein Polypeptid mit einer Länge
von 3 bis 100 Aminosäuren codiert.
9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei die
Nucleinsäure-Insertion ein Polypeptid mit einer Länge von 5 bis 46
Aminosäuren codiert.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei das
Polypeptid Enkephalin oder menschlicher Wachstumshormon-
Releasingfaktor ist.
11. Verfahren zur Produktion eines interessierenden
Polypeptids, umfassend:
Produktion einer Pflanze oder eines Pflanzensamens, die
in das Genom ihrer Zellen rekombinante DNA nach einem
der Ansprüche 1 bis 10 unter der Kontrolle eines
Promotors integriert haben, der die Expression der
rekombinanten DNA in einigen oder allen Zellen der Pflanze
oder des Samens bewirken kann, und wobei der Vorläufer
des chimären 2S-Albumins in der Pflanze oder dem Samen
exprimiert wird; und gegebenenfalls die Züchtung der
Pflanze.
12. Verfahren zur Produktion eines interessierenden
Polypeptids, umfassend
(a) Bereitstellung einer Pflanze oder eines Samens nach
Anspruch 11, in denen der Vorläufer des chimären 2S-
Albumins exprimiert wird; und
(b) Gewinnung des chimären, das interessierende
Polypeptid umfassenden 2S-Albumins aus den Pflanzen oder
Samen.
13. Verfahren nach Anspruch 12, wobei die Enden der
heterologen Nucleinsäure-Insertion in der rekombinanten DNA
mit einem oder mehreren Codons verknüpft sind, die eine
oder mehrere Aminosäurereste codieren, die die ersten
selektiv spaltbaren Randstellen innerhalb des chimären
2S-Albumins angeben, und das weiterhin das Abspalten der
interessierenden Polypeptide von dem chimären 2S-Albumin
durch Spaltung der selektiv spaltbaren Randstellen und
das Abtrennen des interessierenden Polypeptids umfaßt.
14. Verfahren nach Anspruch 12 oder 13, wobei das
interessierende Polypeptid aus sich wiederholenden Einheiten
eines kleineren Polypeptids oder Proteins gebildet ist,
die voneinander durch zweite, selektiv spaltbare
Randstellen trennbar sind und durch Spaltung der zweiten
selektiv spaltbaren Randstellen getrennt werden,
vorzugsweise während oder nach der Spaltung der ersten
spaltbaren Randstellen.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 14, wobei die
Pflanze eine samenbildende Pflanze ist und die
rekombinante DNA unter der Kontrolle eines samenspezifischen
Promotors ist.
16. Verfahren nach Anspruch 15, wobei der samenspezifische
Promotor natürlicherweise mit der ersten Nucleinsäure
verbunden ist.
17. Verfahren nach Anspruch 15, wobei der samenspezifische
Promotor zu der ersten Nucleinsäure heterolog ist.
18. Verfahren nach Anspruch 16 oder 17, wobei der
samenspezifische Promotor zu der Pflanze heterolog ist.
19. Verfahren nach Anspruch 16 oder 17, wobei der
samenspezifische Promotor in der Pflanze endogen ist.
20. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 19, wobei die
Nucleinsäuresequenz in der Pflanze endogen ist.
21. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 19, wobei die
Nucleinsäuresequenz zu der Pflanze heterolog ist.
22. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 21, wobei die
Pflanze eine Brassica-Art ist, vorzugsweise Brassica
napus.
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