DE3853079T2

DE3853079T2 - Liposome hoher stabilität und verfahren zur herstellung und verwendung.

Info

Publication number: DE3853079T2
Application number: DE3853079T
Authority: DE
Inventors: Leonard Estis; Andrew Janoff; Alan Weiner
Original assignee: Liposome Co Inc
Current assignee: Elan Pharmaceuticals LLC
Priority date: 1987-12-04
Filing date: 1988-11-30
Publication date: 1995-06-14
Anticipated expiration: 2008-12-01
Also published as: JPH03502924A; EP0389570A1; EP0389570B1; DE3853079D1; ATE118348T1; EP0389570B2; EP0389570A4; WO1989005151A1; DE3853079T3; JP2817883B2

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein in hohem Maße unversehrtes Liposom, das für die parenterale Verabreichung bei einem Lebewesen, einschließlich des Menschen, angepaßt ist sowie ein Verfahren für dessen Herstellung. Das Liposom der Erfindung umfaßt a) wenigstens ein vollständig hydriertes stabiles Phosphatidylcholin-Lipid, das nicht Dicetylphosphat (DCP) ist; b) ein Lipidverdünnungsmittel, ausgewählt aus der Gruppe, die aus Cholesterol und α-Tocopherol besteht, und c) eine therapeutisch wirksame Menge von wenigstens einem Peptid-ähnlichen therapeutischen Mittel, das mit dem Liposom assoziiert ist, wobei das therapeutische Mittel aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Antigenen, Hormonen, Immunmodulatoren, glycosylierten Trägerproteinen und galactosylierten Trägerproteinen besteht.
Ein solches Liposom ist besonders nützlich bei der Langzeitfreisetzung von therapeutischen Peptidmitteln, und es dient dem Schutz dieser Mittel gegen Abbau in physiologischer Umgebung.

Hintergrund der Erfindung

Therapeutische Peptidmittel sind bekannt und werden in wachsendem Maße in der Pharmazie eingesetzt. Hormone, Immunmodulatoren und eine Menge neu entdeckter Peptide und Peptid-ähnlicher Verbindungen werden gegenwärtig bei Lebewesen, einschließlich des Menschen, bei therapeutischen Behandlungen verabreicht.
Übereinstimmende Nachteile bei der parenteralen Verabreichung derartiger Peptidverbindungen sind bisher die Schnelligkeit des Zusammenbruches oder des Abbaus (Verlust der "Konfiguration des nativen Zustandes") derartiger Verbindungen in physiologischer Umgebung und die Schwierigkeit, therapeutisch wirksame Langzeitdosisspiegel derartiger Mittel zu erhalten. Für die chronische Verabreichung von therapeutischen Mitteln sind Infusionspumpen verwandt worden, sowie Wachs- oder Ölimplantate mit dem Ziel, sowohl das Vorhandensein von Peptid-ähnlichen therapeutischen Mitteln zu verlängern als auch die Unversehrtheit derartiger Mittel zu gewährleisten.
Weiterhin sollte im besonderen Fall, bei dem Peptid-ähnliche therapeutische Mittel (worunter verstanden wird, daß sie ein Protein oder Hapten einschließen) als Immunogen wirken, das Peptid-ähnliche Mittel (mit besonderen Bezug auf jedes Epitop des Peptid-ähnlichen Mittels) ideal die Konfiguration des nativen Zustandes für einen verlängerten Zeitraum aufrecht erhalten und zusätzlich in einem Zustand präsentiert werden, der für die Auslösung einer Immunreaktion in dem angegriffenen Lebewesen geeignet ist.

Zusammenfassung der Erfindung

Die Erfindung betrifft in hohem Maße unversehrte Liposomen, die für die parenterale Verabreichung an ein Lebewesen angepaßt sind, wobei die Liposomen umfassen a) wenigstens ein vollständig hydriertes stabiles Phosphatidylcholin- Lipid, das nicht Dicetylphosphat (DCP) ist; b) ein Lipidverdünnungsmittel, ausgewählt aus der Gruppe, die aus Cholesterol und α-Tocopherol besteht; und c) eine therapeutisch wirksame Menge von wenigstens einem Peptid-ähnlichen therapeutischen Mittel, das mit dem Liposom assoziiert ist, wobei das therapeutische Mittel aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Antigenen, Hormonen, Immunmodula toren, glycosylierten Trägerproteinen und galactosylierten Trägerproteinen besteht.
In einigen Ausführungsformen ist das stabile Lipid hydriertes Phosphatidylcholin oder Distearoylphosphatidylcholin. In besonderen Ausführungsformen umfaßt das therapeutische Mittel ein Antigen. Die Erfindung betrifft weiterhin Liposomen, worin das Liposom weiterhin ein Lipidverdünnungsmittel umfaßt, wie Cholesterol. In einigen Ausführungsformen, die Cholesterol enthalten, ist das Cholesterol in einem molaren Verhältnis Lipid: Cholesterol von etwa 4 : 1 bis 1 : 1 (auf Basis des Molekulargewichtes) vorhanden. In einer Auführungsform wird Distearoylphosphatidylcholin in einem Verhältnis von etwa 7 : 3 Mol-% Phospholipid zu Cholesterol verwendet.
Das Peptid-ähnliche therapeutische Mittel in den Liposomen dieser Erfindung schließt ein Hormon, einen Immunmodulator, ein glycosyliertes Trägerprotein oder ein galactosyliertes Trägerprotein mit ein, besonders hervorgehoben als Peptid-ähnliches therapeutische Mittel ist Galactose-Albumin, oder das Hormon ist ein Somatotropin oder Calcitonin einschließlich Analogen oder Derivaten davon. In Ausführungsformen, worin das therapeutische Mittel ein Immunmodulator ist, ist ein besonderes Beispiel dafür ein Interleukin, wie IL-2.
Genauer betrifft die vorliegende Erfindung eine therapeutische pharmazeutische Zusammensetzung, wie sie in den Ansprüchen 1 bis 7 beansprucht wird. Die Zusammensetzung dieser Erfindung ist für die Behandlung eines Lebewesens geeignet durch Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Dosis des Peptid- ähnlichen therapeutischen Mittels, verkapselt in im hohen Maße unversehrten Liposomen. Die Verabreichung kann intramuskulär, parenteral, intra-arteriell, subkutan, intravenös, intraperitoneal erfolgen, was einschließt, daß das Peptid- ähnliche therapeutische Mittel ein Hormon oder Immunmodulator ist.
Die Zusammensetzung zur Behandlung von Lebewesen umfaßt ebenso, daß das Peptid-ähnliche therapeutische Mittel ein Hormon, ein Immunmodulator oder ein glycosyliertes Trägerprotein oder galactosyliertes Trägerprotein ist, wie jene, wo das Peptid-ähnliche therapeutische Mittel die Hormone Rindersomatotropin oder Calcitonin darstellt, oder worin das Peptid-ähnliche therapeutischen Mitter der Immunmodulator IL-2 ist (einschließlich Analogen und Derivaten der zuvor genannten Substanzen).
Das Protein-ähnliche therapeutische Mittel der Zusammensetzung der Behandlung von Lebewesen kann ein Wachstumsbeschleuniger sein, und das zu behandelnde Lebewesen kann ein Schwein, ein Huhn, ein Fisch, ein Kuh oder ein mesch sein.
Nach einem besonderen Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Erhöhung der Milchproduktion bei Milchtieren durch Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge an Somatotropin in im hohen Maße unversehrten Liposomen an die Tiere. Nach einem Aspekt ist das Milchtier eine Kuh, und das Somatotropin ist Rindersomatotropin oder ein Analog oder Derivat davon.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 vergleicht die in situ Retention von in hohem Maße unversehrten Liposomen und von Liposomen mit unhydriertem Lipid.
Fig. 2 zeigt die Gewichtszunahme von Hyophasen-sektomisierten Ratten, an die BSTH in im hohen Maße unversehrten Liposomen verabriecht wurde.
Fig. 3 offenbart die in situ Retention der Dosierung an der Injectionsstelle.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Liposomen sind vollständig geschlossene Lipid-Bilayer-Membranen, die ein wäßriges Volumen eingeschlossen enthalten. Liposomen können unilamellare Vesikel sein (die eine Einzelmembran-Bilayer besitzen) oder multilamellare Vesikel (Onion-ähnliche Strukturen, gekennzeichnet durch Mehrfachmembran-Bilayer, von denen jede von der nächsten durch eine wäßrige Schicht getrennt ist.) Die Bilayer besteht aus zwei Lipid-Monolayern, die einen hydrophoben, "Schwanz"- Bereich und einen hydrophilen "Kopf"-Bereich haben. Die Struktur der Membran- Bilayer ist so, daß die hydrophoben (unpolaren) "Schwänze" der Lipidmonolayer sich in Richtung des Zentrums der Bilayer orienterien, während sich die hydrophilen "Köpfe" in Richtung der wäßrigen Phase orientieren.
Die ursprüngliche Liposomherstellung von Bangham et al. (J. Mol. Biol., 1965, 12:238-252) besteht im Suspendieren von Phospholipiden in einem organischen Lösungsmittel, das anschließend bis zur Trockne eingedampft wird, wobei ein Phospholipidfilm auf dem Reaktionsbehälter verbleibt. Als nächtes wird eine entsprechende Menge an wäßriger Phase hinzugegeben, und man läßt das Gemisch "quellen", und die erhaltenen Liposomen, die aus multilamellaren Vesikeln (MLVs) bestehen, werden auf mechanischem Wege dispergiert. Diese Technik stellt die Basis für die Entwicklung kleiner beschallter unilamellarer Vesikel (SUVs) dar, beschrieben von Papahadjopoulos et al. (Biochim. Biophys. acta, 1968, 135:624- 638) und großer unilamellarer Vesikel.
Unilamellare Vesikel können hergestellt werden unter Verwendung einer Extrudervorrichtung nach einem Verfahren, das in Cullis et al., PCT-Veröffentlichung WO 87/00238, 16. Januar 1986, mit dem Titel "Extrusion Techniques for Producting Unilamellar Vesicles" beschrieben wurde. Vesikel, die nach dieser Technik hergestellt werden und als LUVETS bezeichnet wurden, werden unter Druck durch ein Membranfilter extrudiert.
Eine andere Klasse von Liposomen, die verwendet werden können, sind solche, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie eine im wesentlichen gleiche lamellare Löslichkeitsverteilung haben. Diese Klass von Liposomen wird als stabile plurilamellare Vesikel (SPLV) bezeichnet, wie in der US-A-4522803 von Lenk et al. definiert, Monophasenvesikel, wie in der US-A-4558579 von Fountain et al. beschrieben, und gefrorene und wieder aufgetaute unilamellare Vesikel (FATMLV), worin die Vesikel wenigstens einem Frost-Tau-Zyklus unterworfen wurden; dieses Verfahren ist von Bally et al., PCT-Veröffentlichung 87/0043, 15. January 1987 mit dem Titel "Multilamellar Liposomes Having Improved Trapping Efficiencies" beschrieben worden. Honda et al. JP-Veröffentlichung 60-155109 beschrieben hydrierte Liposomen, die 5 % Fettsäure erfordern. Die Liposomen dieser Erfindung können hergestellt werden mit im wesentlichen nicht mehr als 5 % Fettsäure oder generell ohne das Vorhandensein von Fettsäure.
Zur Bildung von Liposomen kann eine breite Vielzahl von sowohl gesättigten als auch ungesättigten Lipiden verwendet werden (siehe Iga et al., EP-A-240346, veröffentlicht 7. Oktober 1987 mit dem Titel "Method of Producing Liposome").
Geho et al., US-A-4603044, vom 29. Juli 1986 mit dem Titel "Hepatocyte Directed Vesicle Delivery System" beschrieben eine Lipidzusammensetzung, die Distearoyllecithin (DSL), Dicetylphosphat (DCP) und Cholesterol enthält. Die vorliegende Erfindung verwendet kein DCP. Martin et al., PCT-Veröffentlichung WO 88/01864, veröffentlicht am 3. März 1988 mit dem Titel "High Concentration Liposome Processing Method" verwenden teilweise hydriertes Soja-Phosphatidylcholin (PHSPC).
Mezei, EP-A-177233, vom 9. April 1986 mit dem Titel "Pharmaceutical Multiphase Composition" offenbart Zusammensetzungen von Liposomen, die alle für topische Formulierungen sind.
Felgner et al., EP-A-172007, veröffentlicher am 19. Februar 1986 mit dem Tital "Stable Liposomes with aqueous-soluble medicaments and methods for their preparation" beschreiben die Kombination eines stabilen Lipids und eines Lipid- Verdünnungsmittels, ausgewählt unter Cholesterol und α-Tocopherol. Die Literaturstelle schließt DPPG als eine wesentliche Komponente ein.
Matumoto et al., EP-A-220797, veröffentlicht am 6. Mai 1987 mit dem Titel "Process for the Preparation of Liposome" zeigen die Verwendung einer Vielzahl von Phospholipiden, gesättigten und ungesättigten, hydrierten und unhydrierten, mit einem Detergens zur Bildung eines Liposoms.
Milhalko et al., PCT-Veröffentlichung WO 86/06959, veröffentlicht am 21 Mai 1986 mit dem Titel "Liposome Inhalation Method and System" beschreiben pharmazeutische Zusammensetzungen, die den Atemwegen durch Inhalation zugeführt werden. Es werden verschiedene Lipide zur Verwendung in dieser Zusammensetzung diskutiert, sowohl stabile als auch nichtstabile Lipide.
Zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung werden Cholesterol und α- Tocopherol verwendet, um Liposomen zu bilden; siehe speziell Janoff et al., PCT- Veröffentlichung WO 85/04578, veröffentlicht 24. Oktober 1985, mit dem Titel "Steroidal Liposomes". Mayhew et al., PCT-Veröffentlichung WO 85/00968, veröffentlicht 14. März 1985, beschreiben ein Verfahren zur Verringerung der Toxizität durch Verkapselung in Liposomen, die aus α-Tocopherol und bestimmten Derivaten davon bestehen. Est ist auch eine Vielzahl von Tocopherolen und deren wasserwösliche Derivate verwendet worden, um Liposomen zu bilden, siehe Janoff et al., PCT-Veröffentlichung WO 87/02219, veröffentlicht 23. April 1987, mit dem Titel "Alpha-Tocopherol-Based Vesicles".
Der Begriff Lipid, wie er hier verwendet wird, bedeutet ein beliebiges Material, das eine Bilayer hat, so daß ein hydrophober Teil des Lipidmaterials sich in Richtung zum Inneren der Bilayer orientiert, während eine hydrophiler Teil sich in Richtung der wäßrigen Phase orientiert. Lipide umfassen weiterhin in hohem Maße hydrophobe Verbindungen, wie Triglyceride, Sterole wie Cholesterol, die in die Bilayer einbezogen sein können. Der Begriff Lipid umfaßt keine Fettsäuren.Spezielle Lipide sind Phospholide, wie Phosphatidylcholin (PC), Phosphatidylethanolamin (PE), Distearoylphosphatidylcholin (DSPC), Phosphatidylserin (PS), Phosphatidylglycerol (PG), Phosphatidsäure (PA), Phosphatidylinositol (PI), Sphingomyelin (SPM) und ähnliche, allein oder in Kombination. Die Phosphilipide können synthetisch sein oder aus natürlichen Quellen herrühren, wie Ei oder Soja. Einige synthetische Phospholipide sind Dimyristoylphosphatidylcholin (DMPC) und Dimyristoylphosphatidylglycerol (DMPG). Liposomen könne auch andere Steroidkomponenten enthalten, wie Polyethylengylcol-Derivate von Cholesterol (PEG-Cholesterole), Coprostanol, Cholestanol oder Cholestan und Kombination von PC und Cholesterol. Liposomen können auch Glycolipide enthalten.
"Stabiles Lipid" ist als Lipide zu verstehen, die resistent sind gegen oxidativen Katabolismus, hervorgerufen durch Veränderungen des pH, der Temperatur, durch freie Sauerstoffradikale (z.B. wie jene, die durch Infiltration von Immunzellen während einer Entzündungsreaktion produziert werden) oder anderen Streß der physiologischen Umgebung.
Daraus ist zu schließen, daß stabil eine Eigenschaft in der Natur eines Kontinuums ist, bei der die normale Lipidfestigkeit durch ein Stabilisierungsverfahren wie die Hydrierung modifiziert wird. Bei Einsatz in einer Umgebung mit niedrigem pH, wie einer Umgebung im Magen, sind von der Gruppe der stabilen Lipide solche Lipide ausgenommen, wie Cholesterol-hemisucciant oder Tocopherolhemisucciant, die in den physiologischen pH-Bereichen, wie sie in den gastrointestinalen Systemen von Lebewesen gefunden werden, abgebaut werden. Bei solch niedrigen pH-Applikationen sind diese ohne Rücksicht auf die Festigkeit ausgeschlossen. Somit ist ein stabiles Lipid zuerst ein Lipid, das beständig ist gegen oxidativen Katabolismus, der durch Veränderungen im pH hervorgerufen wird, sowie resistent gegen Temperatur, freie Sauerstoffradikale oder anderen Streß der physiologischen Umgebung, und sie werden zweitens nicht abgebaut bei üblichen physiologischen pH-Bereiche, wie sie die in vivo Umgebung bei ihrem Einsatz darstellt. Stabile Lipide behalten, wenn sie in Liposomen organisiert sind, ihre strukturelle Unversehrtehit für eine verlängerten Zeitraum, insbesondere im Vergleich mit anderen Liposomen.
Der Begriff "Peptid-ähnlich" ist so zu verstehen, daß damit kurzkettige Peptide sowie Proteine gemeint sind. Eine bevorzugte Klasse von Peptiden sind Immunmodulatoren, wie Interleukine, Kolonie-stimulierende Faktoren und Interferone. Eine zusätzliche bevorzugte Klasse von Proteinen sind Antigene, wie sie in Impfstoffen verwendet werden.
Der Begriff "Konfiguration des nativen Zustandes" ist so zu verstehen, daß damit die Organisation eines Teiles gemeint ist, das wenigstens ein Epitop hat, wie ein Peptid, wie es bei seinem Vorhandensein in vivo gestaltet ist, nämlich anders als die Konfiguration des nicht-nativen Zustandes (denaturiert), worin das Teil verändert ist hinsichtlich der Bioaktivität oder der Immun-Reaktivität gegenüber der in vivo-Organisation.
Der Begriff "Epitop" ist so zu verstehen, daß der kleinste Teil eines Antigenteiles gemeint ist, der durch die Kombinationsstelle eines Immunglobulins erkennbar ist.
Wenn ein Protein nur als makromolekularer Proteinträger des therapeutischen Mittels verwendet wird, ist die Aufrechterhaltung des nativen Zustands eines solchen Proteins von geringerer Wichtigkeit, solange die Trängerfunktion nicht im wesentlichen beeinträchtigt ist. Zum Beispiel ist von Albumin berichtet worden, daß es als "Trägerprotein" für therapeutisch Mittel verwendet wurde, insbesondere verbunden mit Galactose "Galactose-Albumin" oder mit Glucose ("glycosyliertes Albumin"), wodurch die Leberaufnahme erleichtert wird, wen es in liposomaler Form präsentiert wird (z. B. US-A-4376765. Der hier verwendete Begriff "Galactose-Albumin" (und ähnlich glycosyliertes Albumin) bezieht sich auf den Teil der Galactose (oder der Glucose) der an das Albumin gebunden ist. Ein solches Teil - Glucose- oder Galactose/Trägerprotein - ist nützlich, ein therapeutisches Mittel zur Leber zu führen. Das Teil wird vorzugsweise von der Leber aufgenommen, und durch kovalente Bindung eines therapeutischen Mittels an das Trägerprotein wird das therapeutische Mittel in ähnlicher Weise durch die Leber aufgenommen. So können beispielsweise die therapeutischen Mittel Doxorubicin, Daunarubicin oder Primarchin an das Trägerprotein gebunden werden, das dann in der Leber konzentriert wird, wodurch die therapeutische Wirkung des Mittels (hier: Antikrebs-Wirkung und antiparasitäre Wirkung) lokalisiert wird.
In einigen Ausführungsformen wirken die Liposomen dieser Erfindung in Assoziation mit Peptiden als Adjuvanz.
"Labile" therapeutische Mittel, wenn dieser Begriff hier verwendet wird, bedeutet die Neigung zum Abbau oder zur Denaturierung des therapeutischen Mittels in einem Lebewesen durch Reaktionen, die anders sind als die beabsichtigten therapeutischen Reaktionen.
Bevorzugte Liposomen dieser Erfindung werden hergestellt aus vollständig hydriertem Soja-Phosphatidylcholin und Cholesterol in Verhältnissen von etwa 4:1 bis etwa 1:1 (Phosphatidylcholin:Cholesterol-Molverhältnis). Diese Liposomen werden an Lebewesen verabreicht, und die Lebewesen werden anschließend auf die Retention des verabreichten Materials für einen Zeitraum bis zu etwa 2 Wochen nach der Verabreichung getestet. Es wurde gefunden, daß das verabreichte Material an der Stelle der Verabreichung für bis zu 2 Wochen mit einem Spiegel von etwa 20 % vorhandet ist, wenn est intramuskulär oder subkutan verabreicht wurde. Die verlängerte Retention an der Injetionsstelle erleichterte die verzögerte Freisetzung von Peptiden über diesen Zeitraum bei gleichzeitiger Aufrechterhaltung der Unversehrtheit des verabreichten Materials, insbesondere der Peptide. Andere bevorzugte Liposomen sind aus DSPC.
Das therapeutisch angezeigte Verabreichungsprofil wird durch mancherlei Erwägungen beeinflußt, einschließlich der zunehmenden Leichtigkeit der Handhabung der stabilen Lipide, des in die Liposomen einzuschließenden therapeutsichen Mittels, der Stelle der Verabreichung der Liposompräparation und der Art und des Zustandes des zu behandelten Lebewesens.
Der Begriff vervollkommnete Freisetzung, wie er hier verwendet wird, ist so zu verstehen, daß darunter die Freisetzung therapeutischer Mittel aus einer liposomalen Verkapselung über einen Zeitraum von mehr als etwa 24 Stunden gemeint ist, und in einigen Ausführungsformen von einem langen Zeitraum von etwa 2 bis 3 Wochen.
Die strukturelle Unversehrtheit der Liposomen, als hier verwendeter Begriff, bedeutet die substantielle Beibehaltung der pharmazeutischen Wirksamkeit der verkapselten Substanz über einen Zeitraum der vervollkommneten Langzeitfreisetzung. Diese strukturelle Unversehrtheit ist als gegeben anzunehmen bei einer Fortdauer der Bilayer-Anordnung des Lipidmaterial, das die Liposomen und die dazugehörige substantielle Aufrechterhaltung einer eingeschlossenen wäßrige Phase für den Zeitraum der vervollkommneten Freisetzung umfaßt. Strukturelle Unversehrtheit kann verliehen werden durch Bildung von Liposomen aus Kombinationen von Lipiden, die ausreichend stabiles Lipid umfassen, um die erforderliche Struktur zu halten, wenn durch physiologische Bedingungen, die in dem Lebewesen vorhanden sind, Veränderungen eintreten. In besonderen Ausführungsformen wird bei den im hohen Maße unversehrten Liposomen dieser Erfindung die strukturelle Unversehrtheit auch dann aufrecht erhalten, wenn ein stabiles Lipid mit einem Lipidverdünnungsmittel oder einem zweiten Lipid vermischt wird, das nicht stabil ist. In der Praxis dieser Erfindung können Liposomen mit ausreichender struktureller Unversehrtheit für die beabsichtigte Verwendung ausgewählt werden durch Variation der Festigkeit der Lipidmembranbestandteile oder durch Variation des Anteiles, in dem das stabile Lipid mit einem Verdünnungsmittel oder einem zweiten Lipid vermischt wird.
Bei der vorliegenden Erfindung sind Veränderungen von diesen oben aufgeführten Verfahrensweisen zur Herstellung von Liposomen erforderlich infolge der hohen Festigkeit der stabilen Lipide. Bei den meisten stabilen Lipiden, wie dem vollständig hydrierten Phosphatidylcholin, kann, wenn ein Lipidfilm beim Herstellungsverfahren entsteht, dieses in einem organischen Lösungsmittel bei erhöhter Temperatur, oftmals etwa 50 bis 60º C, solubilisiert werden. Dies erhöht die Flexibilität des Lipids und gestattet die Bildung von Liposomen.
Stabile Lipide mit größerer Flexibilität können durch eine Vielzahl von Verfahren hergestellt werden. Die Hydrierung des Lipids bis zu einem Punkt, der unterhalb der vollständigen Hydrierung liegt, führt zu einem Lipid mit einer erhöhten, jedoch weniger als maximalen Festigkeit. Zusätzlich können teilweise hydrierte Lipide oder anderer stabile Lipide mit ungesättigten flexiblen Lipiden vermischt werden. Cholesterol als ein zuzumischendes Materials ist unerreicht in seiner Fähigkeit, stabile Lipide flexibler zu machen, während es umgekehert die Eigenschaft hat, flexible Lipide fester zu machen. Cholesterol ist ein bevorzugt zuzumischendes Lipid zur Erhöhung der Flexibilität der stabilen Lipidkomponente der erfindungsgemäßen Liposomen. Zusätzlich kann α-Tocopherol als ein zuzumischendes Lipid dienen.
Im hohen Maße unversehrte Liposomen dieser Erfindung können mit therapeutischen Mitteln gefüllt werden nach Verfahren, die aus dem Stand der Technik bekannt sind, wie die der US-A-4522803 und der US-A-4588578 sowie gemäß des Artikels von Mayer, siehe oben. Besondere Ausführungsformen in der Praxis dieser Erfindung sind die Einbeziehung von therapeutischen Peptidmitteln, wie Wachstumshormon oder Wachstumshormon-Freisetzungsfaktor. Besondere Vorteile der Liposomen dieser Erfindung sind die Verstärkung des Arzneitmitteleinschlusses nach Bildungder Liposomen und die Verstärkung der Menge an Arzneimittel pro Lipidmenge (Beladung).
Der Einschluß von bis zu 70 % des verfügbaren Peptid-ählichen therapeutischen Mittels sind durch das vorliegende Verfahren möglich. Es ist wichtig festzustellen, daß die Niveaus des Peptideinschlusses abhängig sind von den speziellen eingeschlossenen Peptid-ähnlichen therapeutischen Mitteln.
Liposomen schließen ein wäßriges Medium ein, das durch die Lipid-Bilayer umschlossen wird. Das wäßrige Medium kann zum Beispiel Wasser sein oder Wasser, das ein gelöstes Salz oder einen Puffer enthält. Beispiele derartige Salze oder Puffer können sein Natriumchlorid und Phosphat-gepufferte Salzlösung (PBS). Zu anderen Puffern gehören Boart, Citrat, Tris-HCl (Tris(hydroxymethyl)-aminomethan-Hydrochlorid) und HEPES (N-2-Hydroxyethylpiperazin-N¹-2-ethansulfonsäure). Puffer können in dem pH-Bereich zwischen etwa 2,0 und etwa 14,0 liegen. In besonderen Ausführungsformen sind die Präparationen hydriert mit HEPES-Puffer (150 mM NaCl, 20 mM HEPES), pH 7,0 Borat-Puffer (100 mM Na&sub2;CO&sub3;, 50 mM H&sub3;BO&sub3;), pH 8,5, oder Citrat-Puffer (150 mM Na-Citrat), pH 8,5, oder 0,01 M Natriumcarbonatpuffer (pH 9 bis 11). Die Beladung der Liposomen (d.h. Lipid:Peptid) wird auch verstärkt durch die Verwendung von stabilen Lipiden bei der praktischen Ausübung der Erfindung. Wenn zum Beispiel Liposomen, die BSTH einschließen, in Gegenwart von Lipid:BSTH mit 2:1 gebildet werden, beträgt das Verhältnis der so gebildeten Liposomen 6,1:1 Lipid:Peptid, im Gegensatz zu 16,2:1 für ähnliche Liposomen, die aus unhydrierten Lipiden gebildet werden. In anderen Fällen führten Liposomen, die aus Lipid-Galactose-Albumin (1,8:1 Zuführung) hergestellt wurden, zu einem Lipid:Peptid-Galactose-Albumin-Liposom mit 4,3:1, im Gegensatz zu 7,1:1 für unhydrierte Liposomen bei einem ähnlichen Lipid-Galactose-Albumin- Zuführungsverhältnis.
In einem anderen Beispiel wurden DSPC-Liposomen gemischt mit Cholesterol (bevorzugtes Molverhältnis von Phospholipid zu Cholersterol 7:3 Mol-%) gebildet, die Calcitonin einschlossen. Calcitonin ist in verschiedenen Formen erhältlich, und Analoge und Derivage von Calcitonin sind entwickelt worden oder sind nun verfügbar, und alles was darunter verstanden wird ist in dem Begriff Calcitonin eingeschlossen. DSPC ist erhältlich von Avanti Polar Lipids (Birmingham, Ala.). Die im hohen Maße unversehrten Liposomen dieser Erfindung verlängern das Vorhandensein von bestimmbaren Calcitonin von etwa 1 Stunde für freies Calcitonin auf etwa 3 bis 7 Tage.
In einem Liposom-Arzneitmittel-Transportsystem ist das therapeutische Mittel in dem Liposom verkapselt (entweder in der Lipid- oder in der wäßrigen Phase) und wird dann dem zu behandelnden Lebewesen verabreicht. Siehe zum Beispiel Rahmann et al., US-A-3993754; Sears, US-A-4145410; Papahadjopoulos et al., US-A-4235871; Schneider, US-A-4224179; Lenk et al., US-A-4522803; und Fountain et al., US-A-4588578.
Die Liposomen können dehydratisiert sein, wodurch die Lagerung für längere Zeiträume bis zur Zeit des Einsatzes ermöglicht wird. Zur Dehydratisierung der Liposomen kann eine standardmäßige Gefriertrocknungs-Einrichtung oder ein äquivalentes Gerät eingesetzt werden. Liposomen können auch einfach dehydratisiert werden, indem sie unter vermindertem Druck gebracht werden. Alternative dazu können die Liposomen und deren umgebendes Medium vor der Dehydratisierung in flüssigem Stickstoff eingefroren werden. Die Dehydratisierung mit vorherigem Einfrieren kann in Gegenwart von einem oder mehrerern Schutzzuckern in der Präparation durchgeführt werden nach dem Verfahren von Janoff et al., US-Anmeldung 759419, eingereicht 26. Juli 1985 mit dem Titel "Dehydrated Liposomes". Beispiele von zu verwendenden Schutzzuckern schließend ein, sind jedoch nicht darauf beschränkt, Trehalose, Maltose Saccharosie, Glucose, Lactose und Dextran. Wenn dehydratisierte Liposomen verwendet werden, erfolgt eine Rehydratisierung durch Verfahren, die einfach aus dem Hinzusetzen einer wäßrigen Lösung, beispielsweise destilliertem Wasser, zu den Liposomen bestehen, wodurch diese wieder hydratisiert werden.
Die therapeutischen Mittel dieser Erfindung können in Assoziation mit Liposomen verabreicht werden sowie im Gemisch mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger, der ausgewählt wird im Hinblick auf den beabsichtigten Weg der Verabreichung und nach pharmazeutischer Standardpraxis.
Therapeutische Mittel sind Peptid-ähnliche therapeutische Mittel, die Peptid-ähnliche therapeutische Mittel einschließen, wie Galactose-Albumin- Träger, Immunmodulatoren (z.B. Interleukine) und Hormone (z.B. Somatotropine). Unter besonderen therapeutischen Mittel auf die Bezug genommen wird, sind die zu verstehen, die Analoge und Derivate derartiger Mittel einschließen sowie auch biologisch aktive Fragmente, wenn nicht besonders angegeben ist, daß die diese nicht einschließen.
Pharmazeutische Dosierungsformen der vorliegenden Erfindung können Liposomen und beliebige geeignete Träger einschließen. Eine bevorzugte Klasse von Trägern sind wäßrige Träger, einschließlich von sowohl destilliertem Wasser als auch isotonischer Salzlösung. Die Verabreichung von in hohem Maße unversehrten Liposomen könnte auf üblichen Wege erfolgen, wobei die subkutane und intramuskuläre Verabreichung bevorzugt sind. Parenterale Verabreichung im Sinne des hier verwendeten Begriffes bedeutet intramuskuläre, intravenöse, intraartikuläre und intraokulare Verabreichung. Der parenterale Verabreichung angepaßte Dosierungen können allerdings nach einer Vielzahl von Verabreichungsmethoden erfolgen.
Dosierungen für therapeutische Mittel, die mit Liposomen assoziiert sind, entsprechen oftmals der der therapeutischen Mittel allein; die Dosierungen werden durch den behandelnden Arzt festgelegt unter Berücksichtigung vieler Faktoren, einschließlich des Alters, des Gewichtes, und des Zustandes des Patienten. Das Verhältnis von therapeutischem Mittel zu Träger hängt natürlich von der chemischen Art, der Löslichkeit, der Einschlußeffektivität und der Stabilität des therapeutischen Mittels ab wie der beasichtigten Dosierung. Für die parenterale Verabreichung oder für die Injektion über solche Wege wie den intravenösen, den intraperitonealen, intramuskulären, subkutanen oder intramammären Weg, werden sterile Lösungen der Liposomzusammensetzung hergestellt. Für die intravenös Verwendung sollte die Gesamtkonzentration des Gelösten so eingestellt werden, daß die Präpapartion isotonisch wird.
Bei der Anwendung dieser Erfindung bei Haustieren sollte für den Fachmann auf diesem Gebiet klar sein, daß die Verwendung von in hohen Maße unversehrten Liposomen mit der Verabreichung einer Anzahl therapeutischer Mittel einhergehen kann, einschließlich von Wachstumsbeschleunigern (z.B. Wachstumshormon und Wachstumsfreisetzungensfaktor) sowie die Laktation beschleunigende Mittel, wie BSTH. Die Verabreichung derartiger Mittel in therapeutisch wirksamen Mengen kann die Produktivität beschleunigen.
Die Dosierung und Verabreichung von therapeutischen Mitteln in dieser Erfindung setzt therapeutisch wirksame Mengen voraus. Therapeutisch wirksame Mengen von hier verwendeten therapeutischen Mitteln bedeutet eine Menge an therapeutischem Mittel, die eine therapeutische Wirkung hervorruft. Diese Menge kann mit dem besonderen Mittel oder dem Analog oder dem Derivat davon variieren, sowie mit dem zu behandelnden Zustand, der Stelle, der Art und der Dauer der Verabreichung und anderen Überlegungen, die dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannt sind.
Bei der Anwendung dieser Erfindung für Impfstoffe des Standes der Technik wird die notwendige Dosis als immunogene Dosis verstanden. Es wird eingeschätzt, daß eine immunogene Menge eines Antigenproteins der Betrag ist, der die Reaktionszellen eines Lebewesens dazu stimuliert, Immunglobuline gegen das Antigen zu produzieren. Diese Menge hängt von der Potenz des Adjuvanz ad, der Art der Verabreichung und der Art und dem Zustand des Lebewesens, ist jedoch leicht durch einen der bekannten Tests fü Immunglobuline bestimmbar mit einer Erhöhung des Immunglobulins, das die immunogene Reaktion repräsentiert.

Beispiel 1

Herstellung von in hohem Maße unversehrten Liposomen

Eine Lösung von 14 g somatotrophischem Rinderhormon (BSTH) in 140 ml Carbonatpuffer von pH 10,9 wurde hergestellt. Anschließend wurden 21,1,g hydriertes Soja-Phosphatidylcholin (HSPC) in gepulverter Form und 6,9 g Cholesterol in gepulverter Form gelöst in 50 ml Chloroform und zu einem Pulver durch Rotationsverdampfung getrocknet. Der auf diese Weise gebildete Lipidfilm wurde in 140 ml Diethylether resuspendiert bei 47º unter Zusatz von BSTH in Puffer beschallt. Die Beschallung wurde fortgsetzt, bis im wesentlichen der gesamte Ether verdampft war. Ein Strom von Stickstoff mit 20º C wurde anschließend auf das erhaltene Material gerichtet, bis der restliche Ether entfernt war.
Das erhaltene Material wurde anschließend in 800 ml Puffer bei 47 bis 50 ºC resuspendiert, und die darin enthaltenen Liposomen wurden zweimal durch wiederholte Zentrifugierung bei etwa 20000 x g für 30 Minuten gewaschen. Die gewaschenen Liposomen wurden anschließend bis zu einem Endvolumen von 164 ml resuspendiert.
Die erhaltene, in hohen Maße unversehrte Liposomsuspension enthielt 27,5 mg BSTH/ml, 128,0 mg HSPC/ml und 42,0 Cholesterol/ml.

Beispiel 2

Erhöhung der Milchproduktion

Die Liposompräparationvon Beispiel 1 wurde zwei Kühen mit 350 mg Dosismengen pro Kuh verabreicht, wobei die zweite Dosis 2 Wochen nach der ursprünglichen Dosis gegeben wurde. Dieses Regime führte zu einem 14,9 %igem Anwachsen der Milchproduktion im Vergleich zu unbehandelten Kühen. Weiterhin war im Vergleich zu zwei Kühen, die mit einer täglichen Injektion von 12,5 mg freiem BSTH behandelt worden waren, zwei Injektion von BSTH in hydriertem Soja-Phosphatidylcholin-Liposomen um 28,8 % effektiver. Liposomen von unhydriertem Soja- Phosphatidylcholin, gegeben in 3 Wochen-Dosen von 175 mg BSTH über 3 Wochen waren nur 15,7 % so wirksam wie tägliche Dosen.

Beispiel 3

Vervollkommnete Langzeitfreisetzung/Retention von in hohem Maße unversehrten Liposomen in situ

Präparation:

6,0 g BSTH wurden in 60,0 ml Carbonatpuffer, pH 9,4 gelöst. Gepulvertes HSPC (3,52 g) und gepulvertes Cholesterol (1,73 g) wurden in 20 ml Chloroform in einem 00 ml Rundkolben gelöst. Zu dieser Lösung wurde 1,2 x 10&sup6; dpm ³H- Dipalmitoyl-Phosphatidylcholin hinzugegeben. Die Lipide wurden anschließend durch Rotationsverdampfung getrocknet und in 75 ml Diethylether resuspendiert. Der Koben und dessen Inhalt wurde anschließend in ein Beschallungsgerät mit Wasserbad von 45º C gebracht. Die BSTH-Lösung wurde anschließend in dem Maße zu der Diethylether-Lösung unter Beschallung zugegeben, wie der Ether verdampfte. Nach 15 Minuten wurde der restliche Ether durch Ausrichten eines Stickstoffgasstromes auf den Kolbeneinhalt entfernt. Der Kolbeneinhalt wurde anschließend in 150 ml Carbonatpuffer resuspendiert, und die erhaltenen Liposomen wurden zweimal durch Zentrifugieren gewaschen und auf ein Endvolumen von 34,0 ml gebracht.

Vervollkommnung/Retention:

Eine Dosis von 0,320 ml der Liposomsuspension wurde intramuskulär (Bein bzw. Pfote) bei jeder von 30 Schweiz-Wistar-Mäusen injiziert. Dies entspricht 9,77 x 10&sup5; dpm pro Tier. Drei Mäuse wurden zu jedem Zeitpunkt getötet über einen Zeitraum von 27 Tagen. Der Prozentsatz an Radioaktivität, der and der Injektionsstelle verblieb, wurde mit einer ähnlichen Injektion von nichthydrierten Liposomen (Ei-Phosphatidylcholin mit Ei-Phosphatidylehtanolamin) vergleichen. Die Radioaktivität in den Mäusen, die in hohem Maße unversehrte Liposomen erhielten, war noch nach 27 Tagen vorhanden, während die Radioaktivität der nichtydrierten Liposomen bald vollständig verschwunden war, wie dies aus Fig. 1 hervorgeht.

Beispiel 4

Präparation:

0,75 BSTH wurden in 15 ml Carbonatpuffer von pH 10,9, gelöst. 1,13 g HSPC und 0,37 g Cholesterol wurden in 5 ml Chloroform gelöst. Das Gesmich wurde unter Rotationsverdampfung wie in Beispiel 3 getrocknet und das Lipid in 20 ml Diethylether resuspendiert und in einen Rundkolben gegeben.
Der Kolben und dessen Inhalt wurden in ein Beschallungsgerät mit Wasserbad bei 47º C gebracht, und das Beschallungsgerät wurde angestellt. Anschließend wurde BSTH in wäßriger Phase hinzugegeben. Die Beschallung wurde fortgesetzt bis das Gewicht des Gemisches gleich dem Gesamtgewicht des getrockneten Lipidfilmes und der wäßrigen Phase war. Ein Strom von Stickstoffgas wurde anschließend angewandt, um den restlichen Ether zu entfernen. Der Inhalt des Kolbens wurde anschließend in 40 ml Carbonatpuffer bei 47 bis 50º C resuspendiert, und die darin enthaltenden Liposomen wurden zweimal durch wiederholtes Zentrifugieren bei etwa 20000 g für 30 Minuten gewaschen. Die Liposomsuspension wurde anschließend auf ein Endvolumen von 11,1 ml gebracht.
Fig.2 zeigt die Wirkung dieser Liposomen und zeigt die wesentliche Gewichtszunahme über 28 Tage durch bei Hypophysen-sektomisierten Ratten (75 bis 85 g/Ratte) verabreichten BSTH in den in hohem Maße unversehrten Liposomen im Vergleich mit Hypophysen-sektomisierten Ratten, denen einfach eine identische Menge von 80 um/Tag (2400 ug insgesamt pro Tier) an BSTH in nichthydrierten Liposomen in die hintere Pfote i.m. injiziert wurde.

Beispiel 5

IL-2 Retention und Freisetzung

67,0 g HSPC und 33,0 mg Cholesterol wurden aus Chloroform getrocknet durch Rotationsverdampfung in einem Rundkolben. Anschließend wurden 5 ml wasserfreier Diethylether zu dem Kolben gegeben. Zu diesem wurden 1 mg IL-2 in 1 ml von 5 mM Ammoniumacetat (pH 5), 0,9 % Natriumchlorid zusammen mit 6,0 x 10&sup6; dpm von ³H-IL-2 gegeben.
Die erhaltene Dispersion der wäßrigen Lösung in Ether wurde in einem Wasserbad bei 45º C bis 50º C beschallt und gleichzeitig mit einem Stickstoffgasstrom getrocknet, bis keine Spuren des Ethers nach Geruchsprobe mehr vorhanden waren. Zu der erhaltenen trockenen Liposompaste wurden 10 ml Phosphatgepufferte Salzlösung gegeben. Das Gemisch wurde stark verwirbelt, um jegliches Material zu entfernen, das an der Kolbenwandung haftete. Aliquote von diesem Gemisch wurden für eine Tritium-Zählung genommen.
Das verbliebene Gemisch, eine Liposomsuspension, wurde für 20 Minuten in einem J-20-Rotor (Beckman Instruments, Mountainview, CA.) bei 10000 U/Min zentrifugiert. Das Überstehende wurde entfernt, und zusätzliche 10 ml der Phosphatgepufferten Salzlösung wurden dazu verwendet, die Liposomen des Pellets zu resuspendieren.
Tabelle 1 zeigt den wesentlichen Zeitraum (14 Tage), über den IL-2 an der Injektionsstelle bei Mäusen verbliebe, die 2,7 mg/kg in 10 mg in hohen Maße integrierten Liposomen erhalten hatten.
Tabelle 2 zeigt, daß die Retention begleitet war von einer Fortdauer des verfügbaren bioaktiven Interleukins. Eine solche Fortdauer ist erkennbar sichtlich ausgeprägt im Vergleich mit freiem Interleuking oder liposomalem Interleukin mit anderen als dem im hohen Maße unversehrten Liposomen.

Beispiel 6

Galactose-Albumin-Primaquin

HSPC:Cholesterol-Liposomen wurden nach dem Verfahren von Beispiel 1 hergestellt. Kurz gesagt wurde Lipid in Chloroform als ein dünnder Film auf dem Boden eines Rundkolbens durch Rotationsverdampfung getrocknet. 5 ml des Diethylethers wurden in den Kolben gegeben und das Lipid von den Kolbenwänden durch Aufwirbeln entfernt. In diesem Beispiel war das einzukapselnde Material Human-Serumalbumin konjugiert an Tritium-markierte Galactose ("Galactose-Albumin") und Primaquin ("Galactose-Albumin-Primaquin"). Das Galactose-Albumin-Primaquin in 0,3 ml wäßriger Lösung wurde zu den 5 ml des Ether-Lipid-Gemisches gegeben.
Die Konjugatbilding erfolgt durch gleichzeitige Beschallung und Trocknung des Gemisches unter Verwendung eines sanften Stickstoffstromes. Die Beschallung und Trocknung wurde unterbrochen, als kein Ethergeruch mehr festgesellt werden konnte. Das Konjugatmaterial lag in Form einer Paste vor, die mit 10 bis 20 ml Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) gewaschen wurde. Die erfolgte durch Zugabe von PBS zu dem Koben und starkes Verwirbeln, um alle Reste von den Kolbenwänden zu entfernen.
Die erhaltene Liposomsuspension wurde anschließend bei 4º C für 10 bis 20 Minuten bei 10000 U/Min zentrifugiert (Zentrifuge J-20, Roter JA-20, Beckman). Das erhaltene Überstehende wurde abgegossen und das Pellet in frischem PBS resuspendiert, aufgewirbelt und noch zwei weiterer Male zentrifugiert unter den gleichen Bedingungen, um nicht eingeschlossenes Material zu entfernen.
193 mg des erhaltenen Material, das mit 10&sup7; Zerfälle pro Minute aufwies, wurde intramusulär in die hintere Pfote der Mäuse injiziert.
Die Retention der im hohen Maße unversehrten Liposomen, die Galactose- Albumin enthielten, kann aus Tabelle 3 und Tabelle 4 mit wenigstens 14 Tagen entnommen werden. Tabelle 3 offenbart die Retention an der Injektionsstelle der Radioaktivität für bis zu 14 Tage, wenn das radioaktive Material in Liposomen mit hoher Unversehrtheit verkapselt war, während im Gegensatz dazu, freies radioaktives Material an einem einzigen Tag eliminiert worden war. Tabelle 4 offenbart, daß das injizierte verkapselte Material, das an der Injektionsstelle verblieb, eine Bioaktivität für einen verlängerten Zeitraum zeigte, im Vergleich mit der Aktivitätsretention des nichtverkapselten Materials.

Beispiel 7

Calcitonin-DSPC

8,27 mg DSPC (1 : 1 Anfangsverhältnis von L : D) und 1,73 mg Cholesterol (7 : 3 Verhältnis von DSPC : Cholesterol in Mol-%), beide in Chloroform, wurden in einen 50 ml Rundkolben gegeben. Die Lipide wurden zu einem Film getrocknet unter Vakuum bei Einsatz der Rotationsverdampfung. Die Lipide wurden anschließend in 0,500 ml Methanol solubilisiert unter Erhitzen für 1 bis 2 Minuten in einem Wasserbad von 60º C.
10 mg Calcitonin (Mitsubishi Chemical co., Japan, MCI-536) wurden in 0,100 mg Natriumacetatpuffer solubilisert. Diese Lösung wurde zu dem Lösungsmittelgemisch gegeben.
Das Lösungsmittel wurde unter Vakuum unter Einsatz der Rotationsdampfund in einem 60º C-Wasserbad entfernt. Nachdem das Lösungsmitel entfernt war, wurde der Lipid-Arzneimittel-Film resuspendiert in 0,5 ml Natriumacetatpuffer von 60º C. Die Präparation wurde durch Zugabe von 0,5 ml Natriumacetatpuffer von 60º C gewaschen, gefolgt von einer Zentrifugierung bei 12100 x g für 10 Minuten.
Das Überstehende wurde abdekandiert und das liposomale Pellet mit 1 ml Natriumacetatpuffer von 60º C resuspendiert. Die Suspension wurde nochmals mit 12100 x g für 10 Minuten zentrifugiert und dann resuspendiert. Die resuspendierten DSPC-Cholesterol-Liposomen, die Calcitonin enthielten, wurden s.c. an Mäuse verabreicht, um die Retention der liposomalen Präparation mit der von freien Calcitonin zu vergleichen. Freies Calcitonin war nach einer Stunde b ei den Mäusen nicht mehr bestimmbar. Das Calcitonin der Lipsomen der vorliegenden Erfindung war wenigstens mit etwa 70 Prozent einen Tage nach der Verabreichung vorhanden und bleib für etwa 3 bis 7 Tage vorhanden, was einen wesentlichen Anstieg der Retentionszeit gegenüber dem freien Calcitonin bedeutet. Tabelle 1 Langsame Freisetzung von i.m. verabreichten ³H-markierten Peptiden aus HSPC/- Cholr-Liposomen bei Mäusen % der Dosis, die an der Injektionsstelle verbleib Zeit nach der Injektion Interleukin 2 Stunde Tage Tabelle 2 Wiedergewinnung von "bioaktivem" Peptid an der Injektionsstelle (IL&sub2;) % des bioaktiven Anfangs-IL-&sub2;, das an der Injektionsstelle verbleib Zeit freies IL&sub2; SPLV ND = nicht bestimmbar Tabelle 3 Langsame Freisetzung von i.m. verabreichten ³H-markierten Peptiden aus HSPC/Chol-Liposomen bei Mäusen % der Dosis, die an der Injektionsstelle verbleib Zeit nach der Injektion HSPC Galactose-Albumin freies Galactose-Albumin Stunde Studen Tag Tage Tabelle 4 Veränderung bei der Fragmentierung von Peptid nach der Liposom-Verkapselung % fragmentiertes Peptid an der Injektiosstelle Zeit freies Galactose-Albumin-Primaquin HSPC/C verkapseltes Galactose-Albumin-Primaquin Stunde Stunden Tag Tage

Claims

1. Therapeutische pharmazeutische Zusammensetzung fü die parenterale Verabreichung, die vervollkommnete Langzeit-Freisetzungseigenschaften bei parenteraler Verabreichung bei Lebewesen zeigt, wobei die Zusammensetzung im hohen Maße unversehrte Liposomen umfaßt, die a) wenigstens ein vollständig hydriertes stabiles Phosphatidylcholin-Lipid, das nicht Dicetylphosphat (DCP) ist; b) ein Lipidverdünnungsmittel, ausgewählt aus der Gruppe, die aus Cholesterol und α- Tocopherol besteht; und c) eine therapeutisch wirksame menge von wenigstens einem Peptid-ähnlichen therapeutischen Mittel, das mit den Liposomen assoziiert ist, wobei das therapeutische Mittel aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Antigenen, Hormonen, Immunmodulatoren, glycosylierten Trägerproteinen und galactosylierten Trägerproteinen besteht, umfaßt.

2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin das stabile Lipid hydriertes Sojabohnen-Phosphatidylcholin oder Distearoyl-phosphatidylcholin ist.

3. Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, worin das Lipidverdünnungsmittel Cholesterol ist mit einm molaren Verhältnis Lipid-Cholesterol von 4:1 bis 1:1.

4. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin das Peptid- ähnliche therapeutische Mittel Galactose-Albumin, Calcitonin, ein Somatotropin, ein Interleukin oder ein Analog oder Derivat eines dieser Mittel ist.

5. Zusammensetzung nach Anspruch 4, worin das Peptid-ähnliche therapeutische Mittel Interleukin-2 ist.

6. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin das Peptid- ähnliche therapeutische Mittel ein Peptid ist und die Liposomen als Adjuvans fungieren.

7. Zusammensetzung nach Anspruch 5, worin das Peptid-ähnlich therapeutische Mittel Calcitonin oder ein Analog oder Derivat davon ist, und das Lebewesen ist ein Schwein, ein Huhn, ein Lachs, eine Kuh oder ein Mesch.

8.Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die eine vervollkommnete Langzeit-Freisetzung zeigt und für die parenterale Verabreichung geeigent ist, nach einem der Ansprüche 1 bis 7, umfassend die Assoziierung von in hohem Maße unversehrten Liposomen, die wenigstens ein vollständig hydriertes stabiles Phosphatidylcholin-Lipid, das nicht Dicetylphosphat (DCP) ist, umfassen, und b) eines Lipidverdünnungsmittels, ausgewählt aus der Gruppe, die aus Cholesterol und α--Tocopherol besteht, mit einer therapeutisch wirksamen Menge von wenigstens einem Peptid-ähnlichen therapeutischen Mittel, das mit den Liposomen assoziiert ist, zur Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung eines Lebewesens durch Verabreichung einer therapeutische wirksamen Dosis der Zusammensetzung an das Lebewesen, und worin das therapeutische Mittel aus der Gruppe ausgewähtl ist, die aus Antigenen, Hormonen, Immunmodulatoren, glycosylierten Trägerporteinen und galactosylierten Trägerproteinen beseht.

9. Verfahren zur Erhöhung der Milchleistung von Milchvieh durch Verabreichung einer therapeutische wirksamen Menge eines Somatotropins oder eines Analogen oder Derivates davon in der pharmazeutischen Zusammensetzung von Anspruch 4 an die Tiere.