DE3787332T2

DE3787332T2 - Immunassaysystem mit Verwendung von Licht-Streuung.

Info

Publication number: DE3787332T2
Application number: DE87305669T
Authority: DE
Inventors: Richard S Dondero; Ernest G Schutt
Original assignee: Ortho Diagnostic Systems Inc
Current assignee: Ortho Clinical Diagnostics Inc
Priority date: 1986-06-26
Filing date: 1987-06-25
Publication date: 1994-04-07
Anticipated expiration: 2007-06-26
Also published as: DE3787332D1; CA1288689C; AU7478387A; EP0254430A2; JPS638560A; EP0254430A3; MX169795B; JP2591750B2; EP0254430B1; AU597077B2; ATE94285T1

Description

Erfindungsgebiet

Diese Erfindung betrifft Immunassays im allgemeinen und stellt insbesondere ein neues System zum Durchführen von praktisch homogenen Immunassays unter Verwendung von kolloidalem Gold zur Verfügung.

Hintergrund der Erfindung

Viele menschliche Krankheitszustände werden auf der Grundlage von Immunassayverfahren nachgewiesen, die auf der Spezifität zwischen Antikörpern und Antigenen bzw. Ligandenbindungspartnern und Liganden und umgekehrt beruhen. In den letzten ca. 15 Jahren sind wesentliche Anstrengungen auf dem Gebiet der Entwicklung von Immunassayverfahren unter Verwendung der sogenannten Sandwich- und kompetitiven Verfahren unternommen worden. Das Sandwichverfahren betrifft die Immobilisierung eines Antigens durch einen Antikörper und dann das anschließende Markieren durch Anlagern eines zweiten Antikörpers, der mit einer nachweisbaren Markierung verbunden ist. Reverse Immunassays zum Nachweis von Antikörpern sind ähnlich, aber sie bringen Antigen auf die Oberfläche zur Reaktion mit dem Antikörper der Probe. Kompetitive Verfahren sind brauchbar für Antigene, die nur eine einzige Epitopstelle zur Reaktion mit einem Antikörper haben. Dementsprechend, und wie aus dem Namen hervorgeht, beruhen solche Verfahren auf der Konkurrenz des Antigens mit einem anderen markierten Antigen um eine Bindungsstelle auf einem immobilisierten Antikörper. Die Änderungen, die für Antikörpernachweistests erforderlich sind, sind offensichtlich und brauchen hier nicht ausführlich abgehandelt zu werden.
Von großer Bedeutung im Labor ist die Entwicklung von hochempfindlichen Verfahren, die entweder in Einzelproben, Testreihen oder kontinuierlichen Betriebsweisen ausgeführt werden können. Vorzugsweise sollen solche Verfahren homogen sein, das heißt, und wird hier so verwendet, daß sie ausschließlich in einem einzigen Behälter durchgeführt werden, ohne daß es dabei erforderlich ist, physikalisch Komponenten im Gefolge der Reaktionen während des Assays abzutrennen.
Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ein neues Immunassaysystem zur Verfügung zu stellen, welches hochempfindlich und homogen ist.
Das US-Patent 3 939 350 für Kronick und die darin aufgeführten Literaturstellen beschreiben ein Immunassaysystem, welches die Messung von biochemischen Analyten durch Fluoreszenz in einer flüssigen Probe ermöglicht. Kronick bedient sich eines physikalischen Phänomens, das unter dem Namen der totalen inneren Reflexion bekannt ist. Dieses optische Phänomen tritt auf, wenn bei Licht, wenn es durch ein Material mit einem hohen Brechungsindex auf die Grenzfläche dieses Materials mit einem zweiten Material mit einem niedrigeren Brechungsindex unter einem größeren als dem kritischen Winkel gerichtet wird, das gesamte Licht von dieser Grenzfläche reflektiert wird, mit Ausnahme einer mikroskopischen abklingenden Welle, die nur auf eine kurze Distanz in das zweite Material eindringt. Das zweite Material kann zum Beispiel Wasser oder ein anderes wäßriges Medium sein, in dem ein Assay durchgeführt wird. Kronick stellte fest, daß, wenn er Materialien, die fluoreszenzmarkiert worden waren, an die Grenzfläche und in das Feld der abklingenden Welle brachte, er die fluoreszierenden Moleküle anregen und Fluoreszenz nachweisen konnte, die dann in die darüberliegende Lösung ausstrahlte. Das System von Kronick betrifft jedoch Fluoreszenz, die nicht leicht durch Änderung der Fluoreszenzmarker abgeändert werden kann, um dem untersuchten System zu entsprechen. Aufgrund der Art der Spezifität des Fluoreszenzmarkers im Hinblick auf die Wellenlänge der Anregungsfrequenz ist man auf eine diskrete Lichtquelle beschränkt, welche die kritische Anregungsfrequenz zur Verfügung stellt. Bis jetzt bevorzugen die meisten Forscher die He-Ne-Laserlichtquelle aufgrund ihrer Verläßlichkeit und geringen Kosten ebenso wie der geringen Kosten der dazugehörigen Optik. Eine solche Lichtquelle bringt jedoch Schwierigkeiten beim Maßschneidern von Fluoreszenzmolekülen mit sich, die durch den He-Ne-Laser angeregt werden sollen. Die erforderlichen organischen, anorganischen und bioorganischen Verfahren sind besonders schwierig in dem Umfeld des Immunassays zu kontrollieren. Außerdem führt der Umstand, daß Kronick sich der Fluoreszenz bedient, zu zusätzlichen Nachteilen, die mit dem Ausbleichen der Fluoreszenzmoleküle und dem im allgemeinen kritischen Abgleichen der Fluoreszenzmolekülanregungswellenlänge mit der Wellenlänge des Lasers, welches erforderlich ist, um eine gute Quantenausbeute zu erhalten, verbunden sind.
Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein neues Immunassaysystem bereitzustellen, welches die Nachteile, die mit Fluoreszenzmarkern verbunden sind, und die kritische Situation, die mit dem Abgleichen einer Anregungsquelle verbunden ist, vermeidet.
Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, die Prinzipien der totalen inneren Reflexion einzusetzen, aber mit weit größerer Flexibilität im Hinblick auf die Wahl der Beleuchtungsquellen.
Das US-Patent 4 181 441 für Noller beschreibt ein System, das ähnlich dem von Kronick ist. Noller lehrte jedoch, daß der Assay durch Messung der Lichtabsorption in einer flüssigen Probe durchgeführt werden sollte, die dann mit der Anwesenheit von biochemischen Analyten korreliert werden konnte. Obwohl das System von Noller andere physikalische Prinzipien einsetzt als das System von Kronick, sind die Lichtabsorptionsmessungen in ähnlicher Weise von schlechteren Signal-Rauschverhältnissen betroffen, aufgrund von kleinen Unterschieden von großen Lichtsignalen, wodurch ein solches System schon an sich weniger empfindlich als gewünscht ist.
Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, die Verwendung von Lichtabsorptionsmessungen zu vermeiden, während weiterhin die Vorteile wahrgenommen werden, die sich aus dem Phänomen der totalen inneren Reflexion ergeben.
Das US-Patent 4 521 522 für Lundstrom lehrt noch einen weiteren Immunassay auf der Grundlage der Reflexion und der Verwendung des Brewster-Winkels. Dieses System beruht auf einem anderen optischen Phänomen, worin das Richten eines Lichtstrahls, der in der Einfallsebene polarisiert ist, auf eine Grenzfläche, zum Beispiel die zwischen einem Kunststoff und Flüssigkeit gebildete, zu der Transmission eines starken Lichtstrahls in die Flüssigkeit führt, wenn ein solches Licht die Grenzfläche unter dem Brewster-Winkel trifft. Beim Brewster-Winkel wird im wesentlichen kein Licht reflektiert.
Der Brewster-Winkel ist eine Funktion der Brechungsindizes der beiden Materialien ebenso wie der Richtung der Polarisation. Lundstrom stellte fest, daß beim Wachsen einer biochemischen Schicht an der Grenzfläche, die Bedingung des Brewster-Winkels nicht mehr erfüllt wäre, was zum Anstieg der Lichtreflexion, insbesondere bei Winkeln, die geringer sind als der Brewster- Winkel, führen würde. Unglücklicherweise funktioniert der Lundstrom-Assay nur erfolgreich mit einem Waschschritt, da die Transmission des Strahls in die Flüssigkeit ebenfalls zu der Erzeugung von Lichtstreuung und somit einem Störsignal führt.
Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Lichtstreuung zu verwenden, aber Lichtstreuung zu vermeiden, die durch die Transmission von Licht in die Flüssigkeit erzeugt wird, welche natürlicherweise auftritt, wenn Licht auf eine Grenzfläche unter dem Brewster-Winkel gerichtet wird. Dementsprechend ist es noch eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, das Verwenden einer Brewster-Winkel-Bedingung zu vermeiden.
EP-A-01 70 376 offenbart ein photometrisches Instrument zur Verwendung bei der optischen Analyse von Testproben, die lichtstreuende Eigenschaften besitzen. Das gestreute Licht, welches nachgewiesen und analysiert werden soll, wird unter Winkeln größer als 90º zu der ursprünglichen Lichtquelle gesammelt.
EP-A-00 75 353 offenbart ebenfalls ein photometrisches Instrument zur Verwendung bei der optischen Analyse von Testproben, die lichtstreuende Eigenschaften besitzen. Das gestreute Licht, das nachgewiesen und analysiert werden soll, wird mittels eines Detektors gesammelt, der der ursprünglichen Lichtquelle entgegengesetzt angebracht ist.
EP-A-01 67 335 offenbart ein Verfahren zur Beobachtung der Bindung eines Antikörpers an ein oberflächenimmobilisiertes Antigen unter Verwendung des Bragg-Streuwinkels.
Gemäß einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine Vorrichtung zur Verwendung in einem Immunassaysystem, welches eine immunologisch aktive Komponente, die mit einem lichtstreuenden Partikel zum Nachweis eines Liganden oder eines Ligandenbindungspartners in einer wäßrigen Lösung markiert ist, einsetzt, zur Verfügung gestellt, umfassend; einen Behälter zum Aufnehmen der wäßrigen Probe mit einem Brechungsindex größer als dem der wäßrigen Probe; eine Lichtquelle zur Beleuchtung; optische Kopplungsmittel zum Richten der Beleuchtung auf die Grenzfläche zwischen dem Behälter und der wäßrigen Lösung; und Ausrichtungsmittel zum Aufnehmen der Küvette in einer festen Beziehung zu dem optischen Mittel und der Lichtquelle; dadurch gekennzeichnet, daß die Beleuchtung auf die Grenzfläche zwischen dem Behälter und der wäßrigen Lösung unter einem Winkel gleich oder gerade größer als dem kritischen Winkel gerichtet ist und die Vorrichtung weiter Photodetektormittel umfaßt, die so angebracht sind, daß sie Licht empfangen, welches von dem lichtstreuenden Partikel zurück in Richtung der Lichtquelle gestreut wird.
Gemäß einem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Immunassayverfahren zum Nachweis eines Liganden oder eines Ligandenbindungspartners in einer wäßrigen Lösung unter Verwendung von kolloidalem Gold als Markierung in dem Immunassay zur Verfügung gestellt; dadurch gekennzeichnet, daß der Immunassay im Feld einer abklingenden Welle einer Beleuchtung, die auf den Liganden oder den Ligandenbindungspartner unter einem Winkel gleich oder gerade größer als dem kritischen Winkel gerichtet ist, durchgeführt wird, und worin das Verfahren die Schritte des Messens des Lichtes, das durch die Anwesenheit des kolloidalen Goldpartikels in dem abklingenden Feld in Richtung der ursprünglichen Beleuchtung rückgestreut wird; und das Korrelieren des von kolloidalem Gold gestreuten Lichtes als Funktion der Anwesenheit des zu bestimmenden Liganden oder Ligandenbindungspartners einschließt.
Gemäß einem dritten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Bestimmen der Anwesenheit eines Liganden in einer wäßrigen Probe, von der angenommen wird, daß sie den Liganden enthält, bereitgestellt, umfassend die Schritte: Bereitstellen eines ersten Ligandenbindungspartners, der für den Liganden in der wäßrigen Probe spezifisch ist, wobei der erste Ligandenbindungspartner mit einem Partikel markiert ist, welches lichtstreuende Eigenschaften in der wäßrigen Probe hat; Kombinieren des ersten Ligandenbindungspartners und der wäßrigen Probe mit einer Seite eines optisch durchlässigen Materials, wodurch eine Grenzfläche zwischen dem Material und der Probe gebildet wird, wobei das Material eine Vielzahl von zweiten Ligandenbindungspartnern hat, die an das Material in Kontakt mit der wäßrigen Probe gebunden sind und in der Lage sind, an den Liganden zu binden, wobei das optisch durchlässige Material einen Brechungsindex hat, der größer als der Brechungsindex der wäßrigen Probe ist; das Beleuchten der Grenzfläche durch das optisch durchlässige Material unter einem Winkel, der im wesentlichen gleich dem kritischen Winkel ist, um eine totale innere Reflexion in dem Material zu ergeben; und das Messen der Menge des von der Grenzfläche zurück in Richtung der ursprünglichen Beleuchtung gestreuten Lichtes, so daß die Menge des gestreuten Lichtes eine Funktion der Menge des in dem Assaymedium vorhandenen Liganden ist.
Gemäß verschiedenen Aspekten und den Prinzipien der vorliegenden Erfindung wird ein Immunassaysystem zur Verfügung gestellt, welches gestreute totale innere Reflexion (STIR) als Maß der Anwesenheit von speziellen Liganden, die in einer wäßrigen Lösung bestimmt werden sollen, verwendet. Die Erfindung beruht teilweise auf der Bestimmung des kritischen Winkels, der mit der totalen inneren Reflexion verbunden ist. Der Winkel ist größtenteils eine Funktion des Brechungsindexes des Materials, durch welche eine einfallende Lichtwelle gerichtet wird, zum Beispiel Kunststoff, und des relativ niedrigeren Brechungsindexes des Materials, in dem der Immunassay durchgeführt wird, zum Beispiel einer wäßrigen Lösung. Er wird von einer Linie, die senkrecht zu der Grenzfläche zwischen den zwei Materialien ist, gemessen und wird somit bei seinem Maximum, 90º, in der Ebene der Grenzfläche liegen.
Licht, das durch den Kunststoff auf die durch die wäßrige Probe und Kunststoffmaterialien gebildete Grenzfläche unter dem kritischen Winkel gerichtet wird, wird zu einer totalen inneren Reflexion des Lichtes in dem Kunststoff führen. Es versteht sich, daß kein Material in Wirklichkeit perfekt ist und demgemäß ist es bevorzugt, daß das einfallende Licht auf die Grenzfläche unter einem Winkel, der einige Grade größer ist als der kritische Winkel, am meisten bevorzugt im Bereich von annähernd 6º größer gerichtet wird, um sicherzustellen, daß die grundlegenden Bedingungen der totalen inneren Reflexion erfüllt sind. Unter einem solchen Winkel wird ein einfallendes kollimiertes Licht, vorzugsweise aus einem Laser, total innen in dem Kunststoff reflektiert, mit Ausnahme der Weiterleitung der abklingenden Welle, die zu der Oberfläche des Kunststoffs parallel ist und annähernd 1/4 λ. von der Oberfläche. In ähnlicher Weise werden glatte Oberflächen an der Grenzfläche für eine optimale Signalqualität bevorzugt. Anders als herkömmliche Fluoreszenzmethoden, einschließlich derjenigen von Kronick, ist das vorliegende Assaysystem flexibel im Hinblick auf die Lichtwellenlänge, da die Partikelgröße leicht angepaßt werden kann, um der verfügbaren Lichtquelle (oder umgekehrt) zu entsprechen, um eine annehmbare Lichtstreuung zu ergeben. Fluoreszierende Moleküle können im Hinblick auf die Anregungswellenlänge nicht leicht angepaßt werden.
Im Idealfall ist die Lichtquelle eine He-Ne-Lichtquelle, jedoch sind andere Laser mit verschiedenen Wellenlängen verwendet worden und noch weitere Lichtquellen, einschließlich von lichtemittierenden Dioden und anderen Lichtquellen, die keine Laser sind, bieten sich an.
Das Immunassaysystem des Anmelders beruht weiter auf herkömmlichen Immunassaymethoden, aber mit einem wichtigen Unterschied. Der Anmelder setzt idealerweise einen partikelförmigen Marker mit einem höheren Brechungsindex als dem der Lösung und am meisten bevorzugt auch höher als dem des ersten lichtdurchlässigen Materials, zum Beispiel von Kunststoff in dem vorhergehenden Beispiel, ein. Solche Partikel würden zum Beispiel einschließen rote Blutzellen, andere Materialien mit einer hochreflektierenden Oberfläche wie metallische Partikel, und nichtmetallische Substanzen wie etwa Glas oder Kunststoffe, zum Beispiel Latexpartikel und dergleichen. Am meisten bevorzugt wird kolloidales Gold als Marker für die immunologisch aktive Komponente der Lösungsphase verwendet. Obwohl kolloidales Gold als Marker bekannt ist, siehe zum Beispiel US 43 13 734 für Leuvering, ist bisher beinahe keine nicht auf die Agglutinierung bezogene Verwendung des Markers erfolgt, aufgrund der Schwierigkeiten die mit dem Nachweis, insbesondere in homogenen Systemen, verbunden sind. Es wurde überraschenderweise von den Erfindern entdeckt, daß die einzigartige Kombination von STIR mit kolloidalem Gold zu einem extrem leistungsfähigen und empfindlichen homogenen Assaysystem geführt hat. Man nimmt an, ist aber nicht ganz sicher, daß dies hauptsächlich auf der Wechselwirkung der kolloidalen Goldpartikel mit der abklingenden Welle beruht. In der Tat zeigt die Erfahrung, daß Partikel mit einem zunehmend höheren Brechungsindex als dem des darunterliegenden Feststoffs im allgemeinen zu einer Zunahme der Lichtstreuung führen. Obwohl Partikel mit geringeren Brechungsindizes als dem des darunterliegenden Feststoffs unter der Voraussetzung, daß sie auch nicht gleich zu dem des wäßrigen Mediums sind, ebenfalls Licht streuen, sind diese weniger bevorzugt.
Wenn wir einmal eine herkömmliche Sandwichmethode annehmen, wird ein Immunglobulin oder Ligandenbindungspartner auf der Oberfläche immobilisiert und bindet zu bestimmendes Antigen oder andere Liganden. Danach (oder gleichzeitig, oder wenn nicht zuvor) bindet ein zweites Immunglobulin, das gegen eine zweite Epitopstelle auf dem Ligand gerichtet ist und direkt oder indirekt mit kolloidalem Gold markiert ist, an den Liganden, wobei das sogenannte "Sandwich" gebildet wird. In dieser Anordnung unterbricht die Anwesenheit des kolloidalen Goldes die Fortleitung der abklingenden Welle, was zu gestreutem Licht führt, welches durch einen Photomultiplier oder einen anderen Lichtsensor nachgewiesen werden kann, um ein Antwortsignal zu ergeben. Ein weiterer wichtiger Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die physikalische Plazierung des Detektors. Der Detektor wird idealerweise unter einem Winkel, der größer ist als der kritische Winkel, und in einer Position angeordnet, wodurch nur Licht nachgewiesen wird, welches rückwärts in Richtung der Lichtquelle gestreut wird. Diese Position vermeidet dadurch in idealer Weise den Nachweis von störendem Streulicht in dem Volumen des flüssigen Mediums.
Ein anderes Merkmal der vorliegenden Erfindung ist, daß die Immunassays diffusionsgeschwindigkeitskontrolliert und nicht besonders temperaturabhängig sind. Dies steht in starkem Gegensatz zu ELISA und verschiedenen anderen Immunassaymethoden, worin die Temperaturkontrolle kritisch ist, da kleine Änderungen der Temperatur in solchen Systemen zu großen Abweichungen der Assay- Ergebnisse pro Zeiteinheit führen.
Es wurde überraschenderweise von den Erfindern gefunden, daß als Ergebnis der Kombination dieser Elemente rasche empfindliche Ergebnisse in einer homogenen Umgebung erhalten werden konnten, ohne daß die komplizierte Ausrüstung erforderlich war, die zuvor mit Assaymethoden mit kolloidalem Gold verbunden war.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung und beste Ausführungsform

Eine Vorrichtung, welche die Prinzipien von STIR ausführt, wurde konstruiert unter Verwendung eines gleichseitigen Flintglasprismas, Modell 01-PES-007, das von Melles-Grio erhalten wurde. Das Prisma wurde auf einen Träger montiert, wobei eine Seite waagrecht gehalten wurde. Eine antikörperüberzogene Küvette in Form einer Mikrotiterplattenvertiefung, die von Dynatech unter dem Handelsnamen IMMUNOLON TWO (Styrol) erhältlich ist, wurde optisch an die waagrechte Prismaoberfläche mit Standardmikroskopöl gekoppelt. Ein fünf Milliwatt-Helium-Neonlaser (Hughes 3225-H-PC) wurde verwendet, um einen Teil der Oberfläche des Küvettenbodens unter einem Winkel von 6º über dem kritischen Winkel zu beleuchten. Gegebenenfalls kann eine zylindrische Linse verwendet werden, um beim Fokussieren des Laserlichtstrahls behilflich zu sein.
Der kritische Winkel wurde zuerst bestimmt durch Befüllen einer unüberzogenen Küvette, die optisch auf dem Prisma montiert war, mit einem streuenden wäßrigen Medium, das ein Gemisch aus kolloidalem Goldsol, welches nach dem Verfahren hergestellt worden war, das in Scanning Electron Microscopy Band II, 9-31 (1981) Sear Inc., ANF, O'Hare, Chicago, beschrieben ist, wodurch Partikelgrößen von etwa 30-50 nm erzeugt wurden, und Serum umfaßte. Das Prisma wurde entlang einer Achse, die diagonal zu der Achse des einfallenden Lichtes war, gedreht, bis der Laserstrahlweg, der innerhalb der Küvette sichtbar war, optisch verschwand, was anzeigte, daß im wesentlichen das gesamte einfallende Licht an der Küvette- Flüssigkeit-Grenzfläche reflektiert wurde, welches das innere Reflexionsphänomen ist, das bekanntermaßen beim kritischen Winkel auftritt. Dieser kritische Winkel zwischen einer Senkrechten durch die Oberfläche mit der optisch montierten Küvette und dem Laserstrahl wurde gemessen, das Prisma wurde erneut eingerichtet, um eine waagrechte Oberfläche zu ergeben, und der Laser so eingestellt, daß er die Oberfläche innerlich durch das Prisma unter einem Winkel gleich 6º plus dem kritischen Winkel beleuchtete. Wenn auch ein polarisierter Laser verwendet wurde, dessen Polarisation mit dem elektrischen Feld parallel zu der Ebene der Styrol- Flüssigkeit-Grenzfläche ausgerichtet war, so ist dies nur bevorzugt aber nicht notwendig. In der Tat genügt praktisch jede kollimierte Lichtquelle. Gleichermaßen kann, obwohl ein Prisma gut geeignet war, jede optische Kopplungsvorrichtung zum Richten der Beleuchtung auf die Grenzfläche zwischen der wäßrigen Lösung und dem Feststoff verwendet werden, so daß die totale innere Reflexion durch diese Grenzfläche erreicht werden kann.
Ein Photodetektor (Hammamatzu Nr. G1742 Photodiode) wurde unter einem Winkel oberhalb des kritischen Winkels, aber von weniger als 90º in einer Position, die physikalisch in der Nähe des Lasers war, angebracht, so daß er Licht nachweisen würde, das in Richtung des Lasers zurückgestreut wird. In dieser Position wird ein Minimum an Laserlicht vor dem Assay nachgewiesen, trotz Unvollkommenheiten, die an der Grenzfläche vorhanden sind.
Folglich wird angenommen, daß die Plazierung des Photodetektors oberhalb des kritischen Winkels sehr wichtig ist, um sicherzustellen, daß Licht, das durch die Lösung hindurchgeht, zum Beispiel gerades Licht oder sekundäres Streulicht, das durch irrelevante Quellen induziert wird, nicht den Detektor erreichen kann. Als damit zusammenhängender Vorteil vermindert dies sehr stark die Wirkung der Farbe oder Trübung der Probe oder von Blasen, die an der Flüssigkeitsgrenzfläche vorhanden sind.
Das elektrische Signal aus dem Photodetektor wurde elektrisch mit einem Hochleistungsstromverstärker (Kiethly Electrometer 610-C) gekoppelt und die Anzeige von einem Bandschreiber aufgezeichnet oder digital von einem Computerdatenerfassungssystem (HP Controller 3497A mit HP 9836 Computer) aufgezeichnet. Reaktionsraten wurden dann graphisch auf dem Schreiberausdruck bestimmt oder in herkömmlicher Weise mit dem Computer berechnet.

Beispiel 1 - hCG Sandwichassay

Eine Anti-hCG-Antikörper-beschichtete Küvette (beschichtet durch dem Standard entsprechende physikalische Adsorption) wurde auf dem ölüberzogenen Prisma in Position gebracht, wobei ein Laser innen vom Zentrum der Küvette aus reflektierte. 35 ul Assaypuffer (0,01 M phosphatgepufferte Salzlösung bei einem pH von 7,4, welche 1% Rinderserumalbumin, 1 N NaCl und 1, 5 mg/ml Maus-IgG enthielt) wurde in die Küvette gegeben. 50 ul nichtblockierender Anti-hCG- Antikörper, der mit kolloidalem Gold gekoppelt war (ungefähr 44 nm groß) wurde dann zugegeben und durch Aufsaugen mit der Pipette vermischt. 25 ul der Serumprobe oder eines Standards auf Serumbasis (Gilford) wurde dann zu der Küvette gegeben und vermischt. Die Intensität des Streusignals wurde durch einen Bandschreiber und durch ein digitales Datenerfassungssystem aufgezeichnet. Die Reaktionsrate wurde die ersten fünf Minuten lang equilibrieren gelassen, um dem System zu erlauben, linear zu werden und dann kinetisch während der nächsten fünf Minuten gemessen. Reaktionsraten (zum Beispiel Signalanstiege) von unbekannten Serumproben wurden mit den Reaktionsraten von Standards verglichen, um die hCG-Konzentrationen zu berechnen. Die Ergebnisse waren wie folgt:
Standard Signalanstieg (willkürliche Einheiten)
0 mIU 1,00
10 mIU 7,43
25 mIU 16,33
50 mIU 32,03
100 mIU 68,67
200 mIU 130,97.

Beispiel 2 - Test auf Antikörper (reverser hCG-Sandwichassay)

hCG-Antigen wurde auf Immunolon-Küvetten aufgetragen und auf dem ölbeschichteten Prisma wie in Beispiel 1 in Position gebracht. 50 ul von kollodialem Gold (annähernd 45 nm), welches mit hCG beschichtet war, wurden zu der Küvette zusammen mit 35 ul Assaypuffer, wie in Beispiel 1 beschrieben, zugegeben und vermischt. 25 ul monoklonaler Maus-anti-hCG-haltiger Standard (verdünnt in pH 8,3 HEPES/TRIS 0,225 M + 0,5% BSA) wurden zugegeben und vermischt. Nach einem Zeitraum von fünf Minuten zur Equilibrierung wurde die Rate wie in Beispiel 1 gemessen. Da die Anti-hCG-Konzentrationen bis zu 10 ug pro ml erhöht wurden, wurden ansteigende Lichtstreuungsraten beobachtet, wobei die Raten oberhalb dieser Konzentrationabnahmen und den erwarteten Hakeneffekt ergaben (zum Beispiel aufgrund von nicht ausreichendem markierten und immobilisierten Antigen, um alle vorhandenen Antikörper abzufangen). Es ergaben sich folgende Daten:
Maus IgG Konzentration (ng) Signalanstieg (willkürliche Einheiten)
0 ng 8,02
10 ng 10,27
100 ng 12,35
1 ug 75,84
10 ug 91,39
100 ug 37,00.

Beispiel 3 - Konkurrenz mit Antigen-beschichteter Küvette

Thyroxin (T&sub4;) wurde kovalent an BSA unter Verwendung des folgenden Verfahrens gebunden, wobei annähernd 20 T&sub4;-Moleküle pro BSA-Molekül gebunden wurden. T&sub4;-BSA-Konjugat wurde hergestellt durch Koppeln von BSA mit T&sub4;MC, L-Thyroxinyl-4-(N-maleimido-methyl)-cyclohexan-1- carbonat, durch eine nukleophile Addition bei pH 9-10 durch Aminogruppen von BSA an die Maleimid-Gruppe von T&sub4;MC. T&sub4;MC wurde aus SMCC, Succinimidyl-4-(N-maleimido-methyl)-cyclohexan-1- carboxylat (Pierce Chemical), mit L-Thyroxin durch Amidierung bei neutralem pH abgeleitet. T&sub4;-BSA-Konjugat wurde an herkömmliche Mikrotiter-Streifenvertiefungen durch Inkubieren von 0, 1 ml von 0,17 mg/ml des Konjugats in 0,01 M Phosphatpuffer, der auf pH 7 eingestellt war, bei Raumtemperatur während 18 h absorbiert. Die Vertiefungen wurden dreimal mit 0, 25 M HEPES/TRIS-Puffer (enthaltend 0,05% NaN&sub3;, 0,15 M NaCl bei einem pH von 8,3) gewaschen. Die Vertiefungen wurden dann 72 h lang bei Raumtemperatur mit 0,2 ml HEPES/TRIS-Puffer plus 1% BSA inkubiert. Die Vertiefungen wurden dann erneut dreimal mit HEPES/TRIS-Puffer gewaschen und mit Puffer bei 4ºC bis zur Verwendung gelagert.
Monoklonales Anti-T&sub4;-IgG wurde mit kolloidalem Gold mit einem mittleren Durchmesser von 40 nm durch zuvor beschriebene Verfahren beschichtet. Die Mikrotiterstreifen-Küvetten wurden auf dem Prisma wie im Beispiel 1 montiert und 65 ul PBS von pH 7,4, welches 0,02% NaN&sub3; und 2% Rindergammaglobulin enthielt, wurde der Küvette zugegeben, gefolgt von 10 ul T&sub4;-Standard im gleichen Puffer. 25 ul von Anti-T&sub4;-Antikörper beschichtetem kolloidalen Gold wurden dann zu der Küvette zugegeben und vermischt. Die Reaktionsrate wurde nach einer Equilibrierungsperiode gemessen. Wie erwartet korrelierten zunehmende T&sub4;-Konzentrationen mit abnehmenden Signalraten von rückgestreutem Lichtsignal wie folgt:
T&sub4; (ug/dl) Signalanstieg (willkürliche Einheiten)
0 51,1
2 41,9
4 25,3
8 9,08
12 6,51
24 2,96

Beispiel 4

Konkurrenz mit Antigen-beschichtetem kolloidalen Gold

Küvetten aus Immunolon-Mikrotiterstreifen-Vertiefungen wurden mit 0,1 ml von 5 ug pro ml Anti-Digoxin und 0,1 M KPO4 bei pH 7,4 beschichtet und bei 40 C bis zur Verwendung gelagert. Die Vertiefungen wurden dann dreimal mit 0,01 M PBS bei pH 7,4 gewaschen. Kolloidale Goldpartikel mit einem mittleren Durchmesser von 40 nm wurden mit 1 mg pro ml Digoxin-BSA-Konjugat (annähernd 5 Digoxine pro BSA-Molekül) nach dem in einem Artikel von T. W. Smith, Biochemistry 9 : 331-337 (1970) angegebenen Verfahren beschichtet und dann 1 : 4 verdünnt. 35 ul Puffer (0,01 M PBS, 1,0 M NaCl, 1% BSA bei pH 7,6) wurden der Küvette zugegeben, worauf rasch die Zugabe von 25 ul Serumproben oder Serum-Basisstandard und 50 ul Digoxin-beschichteter kolloidaler Goldsuspension folgte und dann wurde gemischt. Die Reaktionsrate wurde während der nächsten fünf Minuten gemessen und die Ergebnisse betrachtet. Zunehmende Digoxinkonzentrationen führten zu verminderten Reaktionsraten wie folgt:
Digoxin (u/ml) Signalanstieg (willkürliche Einheiten, 2 Bestimmungen)
0 372, 296
0,25 127, 86
0,50 30, 29

Beispiel 5

Innerer kinetischer Kalibrator

Es versteht sich, daß von Vertiefung zu Vertiefung zwischen den Assays ebenso wie zwischen den in die Vertiefungen gegebenen flüssigen Reagenzien Abweichungen bestehen können. Diese Unterschiede führen zu Abweichungen der kinetischen Antworten, die ohne Korrektur zu falschen Ergebnissen führen könnten. Ein bevorzugtes Korrekturverfahren ist die Verwendung eines inneren kinetischen Kalibrators. Zu diesem Zweck wird eine Kontrollprobe mit niedrigen Gehalt in die Vertiefung am Beginn eines jeden Assays gegeben und die Reaktionsrate während eines kurzen Zeitraumes vor der Zugabe der Probe in die gleiche Vertiefung beobachtet. Die Kontrollprobe kann so verwendet werden, um jede einzelne Vertiefung zu kalibrieren, z. B. durch Messen der Empfindlichkeit der Vertiefung und Verwenden dieser Information zum Korrigieren der Probenwerte, wodurch Unterschiede in der Einheitlichkeit der Struktur oder der Reagenzbeschichtung ausgeglichen werden. Dementsprechend können Assays mit homogener Rate in idealer Weise durchgeführt werden, indem zuerst eine Kontrollprobe zugegeben wird und die Höhe der Detektorausgabe festgestellt wird. Ein damit verbundener Vorteil ist, daß dieses Verfahren die Notwendigkeit beseitigt, doppelte Assays durchzuführen, wodurch Zeit und Mittel gespart werden. Ein solches Kalibrierungsverfahren wendet auch von der Probe Probenabweichungen in der Lichtstreuleistung der Partikel ab, welche eine starke Funktion des Brechungsindexes der einzelnen Proben ist. Das folgende Beispiel des Verfahrens zeigt die zugrundeliegenden Prinzipien.
Geformte Polycarbonatküvetten wurden mit Anti-hCG-Antikörper adsorptionsbeschichtet. 150 ul Assaypuffer (aus Beispiel 1), 100 ul Anti-hCG-beschichtetes kolloidales Gold (annähernd 40 nm Durchmesser), 75 ul Kalibrator auf der Basis von nach Gilford behandelten Serum mit 10 mIU/ml wurde in jede Küvette gegeben und vermischt. Nach einer fünfminütigen Inkubation wurde die Rate der Zunahme der Intensität des gestreuten Lichtes (Anstieg) während der nächsten fünf Minuten gemessen. Nachdem dieser Kalibrierungsanstieg aufgenommen worden war, wurden 75 ul von Standard auf der Basis von Gilford-Serum als Probe zugegeben, vermischt und fünf Minuten lang inkubiert, bevor der Anstieg des gestreuten Lichtes während der nächsten fünf Minuten abgelesen wurde. Der kalibrierte Netto- Anstieg jeder Küvette wurde nach der Gleichung berechnet:
Kalibrierter Netto-Anstieg = [Anstieg des Standards/Anstieg des Kalibrators] - 0,8826
wobei 0,8826 der durchschnittliche Anstieg von sechs Null-hCG- Standards geteilt durch ihren jeweiligen Kalibrierungsanstieg war.
Der CV (Variationskoeffizient) von sechs Replikaten der folgenden Standards wurde auf der Basis des kalibrierten Netto-Anstiegs berechnet und mit den unkorrigierten Anstiegen dieser Standards verglichen. Die Daten waren wie folgt: mIU/ml des Standards CV ohne Korrektur CV des kalibrierten Netto-Anstiegs
In allen Fällen ist ersichtlich, daß eine größere Genauigkeit und Wiederholbarkeit durch Verwendung des Verfahrens der internen Kalibrierung erhalten wurde.

Beispiel 6

Kompetitiver hCG-Assay unter Verwendung von Latexpartikeln

Immunolon-Microtiterstreifen-Vertiefungen wurden, wie in Beispiel 1 oben angegeben, beschichtet. 35 ul Assay-Puffer wurde in jede Vertiefung gegeben. 25 ul hCG, gelöst in Gilford-Serum (stripped serum (Gilford)) wurde dann zugegeben und vermischt. Nach einer fünfminütigen Inkubation wurden 50 ul "Ortho Beta-hCG Slide Test for Pregnancy"-hCG-beschichteter Styrollatex (Durchmesser 0,375 um) (Ortho Diagnostic Systems Inc.) zugegeben und vermischt. Die Reaktionsrate wurde fünf Minuten lang equilibrieren gelassen, wobei der Anstieg des Streulichtsignales während der nächsten fünf Minuten berechnet wurde. Die Ergebnisse waren wie folgt: HCG-Standard-Konzentration Signalanstieg (willkürliche Einheiten) Durchschnitt

Beispiel 7

Direkter Erthrocyten-Antigentest unter Verwendung von Erthrocyten-Partikeln (annähernd 8 um Durchmesser)

Polycarbonatküvetten wurden durch Adsorption mit Anti-D (anti-Rh&sub0;) für einen RH-Faktortest und mit Anti-A für einen AB0- Blutgruppentest beschichtet. 0,5 ml menschliches Vollblut wurde zentrifugiert, in 5 ml Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) mit pH 7,4 resuspendiert, zentrifugiert und in 2 ml PBS resuspendiert. 300 ul dieser Probensuspension wurden zu der beschichteten Küvette zugegeben und vermischt. Nach einer zweiminütigen Inkubation wurde der Anstieg der Intensität des gestreuten Lichtes über die nächsten 8 oder 18 Minuten berechnet. Die Ergebnisse waren wie folgt:
Anstieg in anti-A-beschichteten Küvetten
Roter Zellen-Phänotyp Anstieg (zeit)
Probenblut-Typ (RK-Typ)
A- 267 (8 Min.)
A+ 240 (18 Min.)
B+ -18,6 (8 Min.)
O 14,9 (18 Min.)
Anstieg in anti-D-beschichteten Küvetten
Probenblut-Typ (RH-Typ) Anstieg (Zeit)
A+ 56,6 (18 Min.)
B+ 10,2 (18 Min.)
O-D- (hoher positiver RH)* 32,3 (18 Min.)
A- 4,3 (18 Min.)
O- 4,5 (18 Min.)
* seltener Blut-Typ
Fachleuten ist klar, daß ein gewisses Maß an physikalischer Manipulation an diesen System vorgenommen werden kann, ohne im wesentlichen vom Geist oder Umfang der vorliegenden Erfindung abzuweichen. Zum Beispiel können die Küvetten und Prismaanordnung eine integrale Einheit sein, worin die Küvetten-Mikrotiter- Vertiefung mit einem Kunststoffprisma geformt ist, welches ein Teil der Küvette bildet. Desgleichen versteht sich, obwohl ein Winkel von 60 über dem kritischen Winkel als der am meisten bevorzugte gefunden wurde, daß in Abhängigkeit von den optischen Eigenschaften der Beleuchtungsquelle und des Photodetektors bestimmte Abweichungen oberhalb des kritischen Winkels besser sein können und deshalb als gleichwertig zu dem hier angegebenen Winkel angesehen werden. Weitere Messungen können an der Seite oder dem Boden der Küvette vorgenommen werden.
Ferner sollte anerkannt werden, daß, obwohl kolloidale Partikel wie Gold, Latex und rote Blutzellen in den Beispielen beschrieben worden sind, Partikel und der Größenbereich der Partikel nicht als Beschränkungen verstanden werden sollen, sondern nur beispielhaft für den weiten Bereich der Möglichkeiten sind. Tatsächlich sollte die Größe der Partikel im allgemeinen unter Berücksichtigung der Wellenlänge des Lichtes in dem flüssigen Medium (ihrerseits eine Funktion des Brechungsindexes des Mediums) gewählt werden, der Brechungsindex des Partikels sollte idealerweise unter Berücksichtigung des Brechungsindexes des wäßrigen Mediums und des Feststoffes gewählt werden, so daß die Netto-Wirkung ein optimales Signal ist, welches am vorteilhaftesten erhalten wird, wenn Resonanz des Systems auftritt. Obwohl die Vorhersagbarkeit außerordentlich schwierig auf dem gegenwärtigen Niveau des Verständnisses dieser komplizierten Wechselwirkungen ist, sind die tatsächlichen Optimierungsverfahren relativ einfach und werden leicht von Fachleuten durchgeführt.

Claims

1. Vorrichtung zur Verwendung in einem Immunassay-System, welches eine immunologisch aktive Komponente, die mit einem Licht streuenden Partikel markiert ist, zum Nachweis eines Liganden oder Ligandenbindungspartners in einer wäßrigen Lösung einsetzt, umfassend:

einen Behälter zum Aufnehmen der wäßrigen Probe mit einem Brechungsindex größer als dem der wäßrigen Probe;

eine Lichtquelle zum Beleuchten;

optische Kopplungsmittel zum Richten der Beleuchtung auf die Grenzfläche zwischen dem Behälter und der wäßrigen Lösung; und

Ausrichtungsmittel zum Aufnehmen der Küvette in einer fixierten Beziehung zu den optischen Mitteln und der Lichtquelle;

dadurch gekennzeichnet, daß

die Beleuchtung auf die Grenzfläche zwischen dem Behälter und der wäßrigen Lösung unter einem Winkel gerichtet ist, der gleich oder etwas größer als der kritische Winkel ist, und

die Vorrichtung weiter Photodetektormittel umfaßt, die so angeordnet sind, daß sie Licht empfangen, welches von dem Licht streuenden Partikel zurück in Richtung der Lichtquelle gestreut wird.

2. Vorrichtung nach Anspruch 1, worin die Beleuchtung unter einem Winkel ausgerichtet ist, der annähernd 6º größer als der kritische Winkel ist.

3. Vorrichtung nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin das Photodetektormittel so angeordnet ist, daß es Licht empfängt, welches unter einem Winkel gestreut wird, der annähernd 6º größer als der kritische Winkel ist.

4. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin die Lichtquelle eine kollimierte Beleuchtung bereitstellt und das optische Kopplungsmittel ein Prisma ist, welches optisch mit dem Behälter gekoppelt ist.

5. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin die Lichtquelle ein Laser ist.

6. Immunassayverfahren zum Nachweis eines Liganden oder eines Ligandenbindungspartners in einer wäßrigen Lösung, welches kolloidales Gold als Markierung in dem Immunassay verwendet; dadurch g e k e n n n zeichnet, daß

der Immunassay in dem Feld einer abklingenden Welle einer Beleuchtung durchgeführt wird, die auf den Liganden oder Ligandenbindungspartner unter einem Winkel gerichtet ist, der gleich oder etwas größer als der kritische Winkel ist; und worin das Verfahren die Schritte einschließt:

Messen von Licht, welches durch die Anwesenheit des kolloidalen Goldpartikels in dem abklingenden Feld zurück in Richtung der ursprünglichen Beleuchtung gestreut wird; und

das Korrelieren des vom kolloidalen Gold gestreuten Lichtes als Funktion der Anwesenheit des Liganden oder Ligandenbindungspartners, der bestimmt werden soll.

7. Verfahren zum Bestimmen der Anwesenheit eines Liganden in einer wäßrigen Probe, von der angenommen wird, daß sie den Liganden enthält, umfassend die Schritte:

Bereitstellen eines ersten Ligandenbindungspartners, der für den Liganden in der wäßrigen Probe spezifisch ist, wobei der erste Ligandenbindungspartner mit einem Partikel markiert ist, welches Licht streuende Eigenschaften in der wäßrigen Probe hat;

Kombinieren des ersten Ligandenbindungspartners und der wäßrigen Probe mit einer Seite eines optisch durchlässigen Materials, wodurch eine Grenzfläche zwischen dem Material und der Probe gebildet wird, wobei das Material eine Vielzahl von zweiten Ligandenbindungspartnern an das Material in Kontakt mit der wäßrigen Probe gebunden hat und in der Lage ist, an den Liganden zu bilden, wobei das optisch durchlässige Material einen Brechungsindex hat, der größer ist als der Brechungsindex der wäßrigen Probe;

Beleuchten der Grenzfläche durch das optisch durchlässige Material unter einem Winkel, der gleich oder etwas größer ist als der kritische Winkel, um eine totale innere Reflexion innerhalb des Materials zu ergeben; und

das Messen der Menge des von der Grenzfläche zurück in Richtung der ursprünglichen Beleuchtung gestreuten Lichtes, so daß die Menge des gestreuten Lichtes eine Funktion der Menge des in dem Assaymedium vorhandenen Liganden ist.

8. Verfahren nach Anspruch 7, worin der Meßschritt unter einem Winkel durchgeführt wird, der annähernd 60 größer als der kritische Winkel ist.

9. Verfahren nach Anspruch 7 oder Anspruch 8, worin die Ligandenbindungspartner Antikörper von monoklonaler oder polyklonaler Herkunft sind, mit welchen der Ligand spezifisch reagiert.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 9, worin der zu bestimmende Ligand in der Probe ein Antikörper ist und die zweiten Ligandenbindungspartner, die an das Material gebunden sind, Antigene oder Haptene sind, die spezifisch mit den Antikörpern der Probe reagieren.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 10, worin die Partikel kolloidales Gold, Latexartikel, Glaspartikel, metallische Partikel, nicht-metallische Partikel oder rote Blutzellen sind.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 11, worin der Beleuchtungsschritt das Beleuchten der Oberfläche mit Licht von einem Helium-Neonlaser umfaßt.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 12, worin der erste Ligandenbindungspartner zu dem optisch durchlässigen Material vor der Zugabe der wäßrigen Probe zugegeben wird.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 12, worin die wäßrige Probe zu dem optisch durchlässigen Material vor der Zugabe des ersten Ligandenbindungspartners zugegeben wird.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 12, worin die wäßrige Probe und der erste Ligandenbindungspartner vermischt werden, bevor sie mit dem optisch durchlässigen Material kombiniert werden.

16. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 15, worin der Meßschritt mehrmals durchgeführt wird, um eine Rate abzuleiten, die mit der Anwesenheit von Liganden in der wäßrigen Probe korreliert werden kann.