Hintergrund der Erfindung
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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von
Oligosacchariden, die wachstumsbeschleunigende Faktoren für
Bifidobakterien sind.
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Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren zur
Herstellung von Oligosacchariden, um eine süße Saccharid-
Mischung zu erhalten, die ein geeignetes Gleichgewicht von
als Süßstoffen brauchbaren Monosacchariden und einem Minimum
an unerwünschten Disacchariden enthält, und Süßkraft
bereitstellen kann, und Nahrungsmitteln und Getränken
Oligosaccharide mit einer geringeren Erhöhung im
Kaloriengehalt als von konventionellen Zusätzen zuführen
kann.
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In den letzten Jahren wurde es offensichtlich, daß
Oligosaccharide der Glucose/Galactose-Reihen, die durch eine
β-Galactosyl-Transferreaktion von Lactose erhalten wurden,
die Hauptbestandteile von Oligosacchariden der Muttermilch
sind, und als wachstumsbeschleunigende Faktoren für
Bifidobakterien im menschlichen Darm wirken (Japanische
Patentveröffentlichung Nr. 58-20266, usw.)
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Die durch die allgemeine Formel Gal-(Gal)n-Glc
repräsentierten Oligosaccharide (worin Gal ein Galactorest,
Glc ein Glucoserest und n eine ganze Zahl von 1 bis 4
bedeuten, nachfolgend einfach als Oligosaccharide bezeichnet)
wurden in einer Vielzahl von Bereichen weitverbreitet
verwendet, z.B. als Additive für fermentierte Milch und
gepulverte Milch für Kleinkinder.
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Ein Verfahren, bei dem Lactose mit einer β-Galactosidase von
Aspergillus oryzae (Japanische Patentveröffentlichung Nr. 58-
20266) behandelt wird, ist eine typische Methode zur
Herstellung von Oligosacchariden, aber das Reaktionsprodukt
in der vorstehend beschriebenen Enzymbehandlung erhaltene ist
eine Saccharid-Mischung, die Disaccharide (hauptsächlich
unumgesetzte Lactose) und Monosaccharide (Galactose und
Glucose) zusätzlich zu den Oligosacchariden enthält. Diese
Reaktionsprodukte werden normalerweise wie sie sind
verwendet, da bis jetzt kein Verfahren entwickelt wurde, um
gerade die Oligosaccharide aus der Mischung auf ökonomische
Weise zu erhalten, und die Süßkraft der Monosaccharide oft
vorteilhafterweise verwendet werden kann.
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Obgleich die vorstehend beschriebene konventionelle
Herstellungsmethode, die β-Galactosidase, erzeugt durch
Aspergillus oryzae, eine hohe Ausbeute an Oligosacchariden in
kürzerer Zeit bereitstellt, als dies der Fall wäre, wenn die
β-Galactosidase durch andere Mikroorganismen erzeugt wird,
hat diese Methode den Nachteil, daß sie große Mengen an
Disacchariden, insbesondere unumgesetzte Lactose, zurückhält.
Diese Disaccharide haben fast keine Süßkraft und können so
nicht als Süßmittel verwendet werden, und vom Aspekt der
Lactose-Intoleranz, ist es wünschenswert, daß im Endprodükt
so wenig Lactose wie moglich vorhanden ist.
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Ein Reaktionsprodukt, das eine geringere Menge an
Disacchariden besitzt, kann aus einer β-Galactosidase bei
einer längeren Behandlungszeit erhalten werden, aber in einem
solchen Fall kann eine merkbare Verringerung der Ausbeute an
Oligosacchariden nicht vermieden werden.
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Wenn deshalb bisher konventionelle Oligosaccharde zu
Nahrungsmitteln und Getränken zugeben werden, wird im
allgemeinen ein Produkt verwendet, das einen hohen
Oligosaccharidgehalt besitzt, und deshalb einen großen Anteil
von Disacchariden, aber eine relativ geringe Menge an
Monosacchariden. Außerdem wird ein Süßmittel, wie z.B.
Sucrose (Rohrzucker) oder flüssiger Zucker ebenfalls
zugegeben, wenn das Nahrungsmittel oder das Getränk mehr Süße
benötigt, und deshalb besitzt das resultierende
Nahrungsmittel oder Getränk aufgrund seines außerordentlich
hohen Saccharidgehaltes einen hohen Kaloriengehalt.
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Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, die vorstehend
beschriebenen Probleme bei der Verwendung von
Oligosacchariden zu lösen.
Zusammenfassung der Erfindung
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Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren bereit zur
Herstellung von Oligosacchariden, um eine süße Saccharid-
Mischung zu erhalten, die eine geeignete Menge von
Monosacchariden besitzt, die als Süßmittel brauchbar sind,
und mit einem Minimum an unerwünschten Disacchariden. Die
Saccharid-Mischung kann Süße bereitstellen, und durch die
Zugabe von Oligosacchariden zu Nahrungsmitteln und Getränken
wird ein geringeres Ansteigen des Kaloriengehaltes, als dies
bei konventionellen Additiven der Fall ist, erhalten.
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Ein weiterer Zweck der vorliegenden Erfindung ist es, ein
Verfahren bereitzustellen, bei dem Lactose in Oligosaccharide
durch die Behandlung einer Lactose-enthaltenden Substanz, wie
z.B. Milch, mit einer β-Galactosidase überführt wird, so daß,
selbst wenn diese Oligosaccharide als Nahrungsmittel oder
Getränk verwendet werden, die Quantität unerwünschter
Disaccharide darin auf ein Minimum reduziert werden kann.
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Um diese Aufgabenstellungen zu erreichen, stellt die
vorliegende Erfindung weiters ein Verfahren zur Herstellung
von Oligosacchariden bereit, die durch die allgemeine Formel
Gal-(Gal)n-Glc dargestellt werden (worin Gal einen
Galactoserest, Glc einen Glucoserest, und n eine ganze Zahl
von 1 bis 4 bedeuten), bei dem eine Lactoselösung oder
Lactose-enthaltende Substanz mit einer Lactosekonzentration
von 10 bis 50 Gew.-% mit einer β-Galactosidase behandelt
wird, dadurch gekennzeichnet, daß die Lactoselösung oder
Lactose-enthaltende Substanz mit mindestens zwei Arten von β-
Galactosidasen, die von verschiedenen Mikroorganismen erzeugt
werden, behandelt wird, wobei die Behandlung mit β-
Galactosidasen nicht durch Zugabe eines lebenden β-
Galactosidase-erzeugenden Mikroorganismus zur Lactoselösung
oder Lactose-enthaltenden Substanz durchgeführt wird, wobei
das Verhältnis von Oligosacchariden zu Disacchariden in der
Oligosaccharid-Mischung und die Ausbeute an Monosacchariden
in der Oligosaccharid-Mischung beide im Vergleich zum durch
Behandlung der Lactose-Lösung oder Lactose-enthaltenden
Substanz mit nur einer Art von β-Galactosidase erhaltenen
Verhältnis von Oligosacchariden zu Disacchariden und zur
Ausbeute erhöht werden.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
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Die vorliegende Erfindung ist dadurch charakterisiert, daß
man eine Lactoselösung oder Lactose-enthaltende Substanz mit
einer Lactosekonzentration von 10 bis 50 Gew.-% mit
mindestens zwei Arten von β-Galactosidasen behandelt, die von
verschiedenen Mikroorganismen erzeugt werden, wobei die
Behandlung mit den β-Galactosidasen nicht durch Zugabe eines
lebenden β-Galactosidase-erzeugenden Mikroorganismus zur
Lactoselösung oder Lactose-enthaltende Substanz durchgeführt
wird.
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In dieser Herstellungsmethode ist das Saccharid-Gleichgewicht
im Endprodukt stark verbessert, weil die Menge der
Restlactose verringert werden kann, ohne die Menge an
Oligosacchariden zu verringern, obgleich der Grund dafür
nicht klar ist.
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Im konventionellen Verfahren, bei dem Oligosaccharide durch
Reaktion einer Art von β-Galactosidase mit Lactose
hergestellt werden, werden Produkte erzeugt, die große Mengen
an Disacchariden enthalten, wie z.B. solche aus unumgesetzter
Lactose, auch wenn die Ausbeute an Oligosacchariden hoch ist,
und die ökonomische Trennung der Produkte ist schwierig, was
ein Hindernis für ihre Verwendung darstellt. Gemäß der
vorliegenden Erfindung, in der zwei Arten von β-
Galactosidasen verwendet werden, wird die Ausbeute an
Oligosacchariden verbessert, und ferner wird die Ausbeute an
Monosacchariden erhöht, während die Menge an Disacchariden
bemerkenswert verringert wird. Dieser Effekt ist insbesondere
auffallend, wenn eine β-Galactosidase, erzeugt von
Aspergillus oryzae in einer ersten Behandlung verwendet wird
(siehe die nachfolgenden Beispiele 1 bis 3). Erfindungsgemäß
kann deshalb eine Saccharid-Mischung erhalten werden, die
große Anteile an waschstumsbeschleunigender Faktor brauchbar
sind, und Monosaccharide, die als Süßmittel brauchbar sind,
können effizient erhalten werden, und die hervorragenden
Eigenschaften der Oligosaccharide können weitverbreitet
verwendet werden, ohne sie über ein Ansteigen der
Kalorienmenge oder über eine Lactoseintoleranz Sorgen machen
zu müssen.
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Es ist allgemein bekannt, daß β-Galactosidasen aus einer
Vielzahl von Schimmelpilzen, Bakterien oder Herfen erzeugt
werden können, aber alle Kombinationen dieser Mikroorganismen
sind erfindungsgemäß möglich, solang die Mikroorganismen zur
Herstellung von Nahrungsmitteln geeignet sind. Mit den durch
verschiedene Mikroorganismen erzeugten β-Galactosidasen ist
es jedoch wünschenswert, eine Kombination mit
Enzymeigenschaften zu verwenden, die so verschieden wie
möglich sind, wie z.B. eine Kombination von β-Galactosidasen,
die aus Schimmelpilz und Hefe erzeugt werden.
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Die β-Galactosidasen, die im erfindungsgemäßen
Herstellungsverfahren verwendet werden können, sind die
Substanzen, die mit Hilfe der folgenden Mikroorganismen
erzeugt werden:
Schimmelpilze:
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Aspergillus oryzae, Aspergillus niger, Aspergillus flavus,
Mucor pusillus.
Bakterien:
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Streptococcus thermophilus, Streptococcus lactis,
Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus salivarius,
Lactobacillus leichimanni, Lactobacillus helveticus, Bacillus
stearothermophilus, Bacillus brevis, Thermus thermophilus,
Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium longum,
Bifidobacterium breve, Bifidobacterium adolescentis.
Hefen:
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Kluyveromyces fragilis, Kluyveromyces lactis, Candida
pseudotropicalis.
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Obgleich in der vorliegenden Erfindung die Umsetzung mittels
einer Behandlung durch eine Mischung von zwei Arten von β-
Galactosidasen vervollständigt werden kann, sind
hintereinanderfolgende Behandlungen, in denen eine Behandlung
mit einer β-Galactosidase durchgeführt wird, und, nach
Inaktivierung des Enzyms, eine Behandlung mit einer anderen
β-Galactosidase durchgeführt wird, vorteilhaft, weil die
Reaktion dann leicht kontrolliert werden kann, und ein
besseres Verfahrenswirkungsgrad erhalten werden kann. In
jedem Fall können eine oder beide der beiden Arten von β-
Galactosidasen in Form von immobilisierten Enzymen verwendet
werden.
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Für das Verfahren der Behandlung von Lactose oder einer
Lactose-enthaltende Substanz durch β-Galactosidase kann die
konventionelle Methode verwendet werden. Mit anderen Worten
wird eine Lactose-enthaltende Substanz, wie z.B. Lactose
selbst, Milch oder Molke, mit einer Lactosekonzentration von
10 bis 50 Gew.-%, einer Enzymkonzentration von 1 bis 100
Einheiten/ml, und bei Bedingungen, die in der Nähe des
optimalen pH-Wertes und der Temperatur für das verwendete
Enzym sind, behandelt. Obgleich die Konzentration an
Monosacchariden, wie z.B. Glucose und Galactose, und
Oligosacchariden mit fortschreitender Reaktion zunächst
praktisch linear ansteigt, treten in nachfolgenden Reaktionen
etwas kompliziertere Veränderungen auf, so daß die
Oligosaccharide nach einer bestimmten Zeit allmählich
abnehmen. In der anfänglichen Enzymbehandlung in den
nacheinander erfolgenden Behandlungen, oder der gemischten
Behandlung, wird die Reaktionszeit wünschenswerterweise auf
die Zeit eingestellt, die zum Erhalt der Höchstausbeute an
Oligosacchariden erforderlich ist, oder auf die Zeit, bei der
das Verhältnis von Oligosacchariden zu Disacchariden ein
Maximum ist. Nachdem die anfängliche Enzymbehandlung in den
hintereinander erfolgenden Behandlungen beendet ist, wird das
Enzym durch Erhitzen inaktiviert, und die nächste
Enzymbehandlung durchgeführt. Da in der zweiten
Enzymbehandlung insbesondere die Mengen an Disacchariden
merklich abnehmen, und die Oligosaccharide je nach den
Differenzen in den Behandlungsbedingungen, wie z.B. dem
Ursprung des verwendeten Enzyms und der Reaktionstemperatur,
zunehmen oder abnehmen, kann die Reaktion bei einer
gewünschten Stufe beendet werden, wobei man das Gleichgewicht
zwischen den für das Produkt erforderlichen Oligosacchariden
und Monosacchariden in Betracht zieht.
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Die Reaktionsprodukte können so wie sie sind, verwendet
werden, oder nach Entfärbung, Reinigung, Aufkonzentrierung,
Trocknung oder anderen Aufarbeitungsbedingungen, die zur
Bildung von Nahrungsmitteln oder Getränken erforderlich sind,
und können als süße Saccharidmischungen oder als
Nahrungsmittel oder Getränk verwendet werden; das eine
Bifidobakterium-wachstumsbeschleunigende Wirkung besitzt. Das
Reaktionsprodukt kann natürlich zur Herstellung von
gereinigten Oligosacchariden verwendet werden, und die
Oligosaccharide einer hohen Reinheit können leicht erhalten
werden, weil die Menge an Disacchariden gering ist.
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Nachfolgend wird die vorliegende Erfindung durch Beispiele
und Vergleichsbeispiele veranschaulicht.
Beispiel 1
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40 kg Lactose wurden in heißem Wasser gelöst, um eine
Gesamtmenge von 80 l zu ergeben und 800000 Einheiten β-
Galactosidae, erzeugt durch Aspergillus oryzae (Lactase Y-
400, KK Yakult Honsha) wurden zu Lactose zugegeben. Dann
wurden beide Substanzen bei 50 ºC, und bei einem pH-Wert von
6,5 5 Stunden lang umgesetzt. Das Enzym wurde dann durch
Erhitzen der Reaktionsflüssigkeit inaktiviert, um eine leicht
gelbliche primäre Reaktionsflüssigkeit zu erhalten.
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Dann wurden 1 l der primären Reaktionsflüssigkeit und 10 ml
1 M Kaliumphosphat-Pufferlösung (pH = 6,7) genommen und 1500
Einheiten β-Galactosidase (Lactozym, Novo Co), erzeugt aus
Kluyveromyces fragilis zu der primären Reaktionsflüssigkeit
zugegeben, und dann die Umsetzung bei 40 ºC 16 Stunden lang
fortgesetzt. Das Enzym wurde durch Erhitzen der
Reaktionsflüssigkeit inaktiviert, und das Produkt mittels
50 g Aktivkohle entfärbt, um eine farblose transparente
Saccharid-Lösung zu erhalten.
Beispiel 2
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1 l der primären Reaktionsflüssigkeit von Beispiel 1 wurde
ein zweites mal mittels β-Galactosidase, erzeugt von
Streptococcus thermophilus, behandelt, um eine transparente
Saccharid-Lösung zu erhalten.
Beispiel 3
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1 l der primären Reaktionsflüssigkeit von Beispiel 1 wurde
ein zweites mal mittels β-Galactosidase, erzeugt von
Lactobacillus bulgaricus, behandelt, um eine transparente
Saccharid-Lösung zu erhalten.
Beispiel 4
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10 kg Lactose wurde in heißem Wasser gelöst, um eine
Gesamtmenge von 20 l zu erhalten, und 200 ml 1 M
Kaliumphosphat-Pufferlösung (pH = 6,7) und 100000 Einheiten
β-Galactosidase, erzeugt von Kluyveromyces fragilis wurden zu
Lactose zugegeben, und dann wurden diese Substanzen bei 40 ºC
4 Stunden lang reagieren gelassen. Das Enzym wurde durch
Erhitzen der Reaktionsflüssigkeit inaktiviert, um eine leicht
gelbe primäre Reaktionsflüssigkeit zu erhalten. 1 l der
primären Reaktionsflüssigkeit wurde ein zweites Mal mittels
β-Galactosidase, erzeugt von Aspergillus oryzae, behandelt,
um eine transparente Saccharid-Lösung zu erhalten.
Beispiel 5
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1 l der primären Reaktionsflüssigkeit von Beispiel 4 wurde
ein zweites Mal mittels β-Galactosidase, erzeugt von
Streptococcus thermophilus, behandelt, um eine transparente
Saccharid-Lösung zu erhalten.
Beispiel 6
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1 l der primären Reaktionsflüssigkeit des Beispiels 4 wurde
ein zweites Mal mittels β-Galactosidase, erzeugt von
Lactobacillus bulgaricus behandelt, um eine transparente
Saccharid-Lösung zu erhalten.
Beispiel 7
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10 kg Lactose wurden in heißem Wasser gelöst, um eine
Gesamtmenge von 20 l zu erhalten, und 200 ml 1 M
Kaliumphosphat-Pufferlösung (pH = 6,7) und 300000 Einheiten
β-Galactosidase, erzeugt von Streptococcus thermophilus,
wurden zugegeben, und die Substanz wurde bei 40 º 16 Stunden
lang umgesetzt. Das Enzym wurde durch Erhitzen der
Reaktionsflüssigkeit inaktiviert, um eine leichtgelbe primäre
Flüssigkeit zu erhalten.
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Dann wurden 1 l der primären Reaktionsflüssigkeit genommen
und ein zweites Mal mittels β-Galactosidase, erzeugt von
Aspergillus oryzae, behandelt, um eine transparente
Saccharid-Lösung zu erhalten.
Beispiel 8
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1 l der primären Reaktionsflüssigkeit von Beispiel 7 wurde
ein zweites Mal mittels β-Galactosidase, erzeugt von
Kluyveromyces fragilis behandelt, um eine transparente
Saccharid-Lösung zu erhalten.
Beispiel 9
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1 l der primären Reaktionsflüssigkeit von Beispiel 7 wurde
ein zweites Mal mittels β-Galactosidase, erzeugt von
Lactobacillus bulgaricus, behandelt, um eine transparente
Saccharid-Lösung zu erhalten.
Beispiel 10
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10 kg Lactose wurden in heißem Wasser gelöst, um eine
Gesamtmenge von 20 l zu bilden, und 200 ml 1 M
Kaliumphosphat-Pufferlösung (pH = 6,7) und 30000 Einheiten β-
Galactosidase, erzeugt von Lactobacillus bulgaricus, wurden
hinzugegeben, und die Substanz bei 40 ºC 16 Stunden lang
umgesetzt. Das Enzym wurde durch Erhitzen der
Reaktionsflüssigkeit inaktiviert, und eine leicht gelbe
Reaktionsflüssigkeit erhalten.
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Dann wurde 1 l der Reaktionsflüssigkeit genommen und ein
zweites Mal mittels β-Galactosidase, erzeugt von Aspergillus
oryzae, behandelt, um eine transparente Saccharid-Lösung zu
erhalten.
Beispiel 11
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1 l der primären Reaktionsflüssigkeit von Beispiel 10 wurde
ein zweites Mal mittels β-Galactosidase, erzeugt von
Kluyveromyces fragilis, behandelt, um eine transparente
Saccharid-Lösung zu erhalten.
Beispiel 12
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1 1 der primären Reaktionsflüssigkeit von Beispiel 10 wurde
ein zweites Mal mittels β-Galactosidase, erzeugt von
Streptococcus thermophilus, behandelt, um eine transparente
Saccharid-Lösung zu erhalten.
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Der Süßheitsgrad wurde bestimmt durch Herstellung einer Probe
jeder Testflüssigkeit, die gegenüber Brix 10 und Rohrzucker-
Lösungen von Brix 2 bis 10 eingestellt wurden, und 10
erfahrene Personen eines Testgremiums beurteilten den Bereich
der Konzentrationswerte, bei denen eine Süße erreicht wurde,
die der der Testflüssigkeit gleich war. Das Ergebnis wurde
ausgedrückt als relativer Wert bezogen auf einen
Süßigkeitsgrad von Rohrzucker mit einem Wert von 100.
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Die Ergebnisse der Saccharid-Lösungen jedes Beispiels und die
Zusammensetzung seiner Saccharide sind in Tabelle 1
zusammengestellt. In der Tabelle ist der Gehalt der
Vergleichsbeispiele der folgende:
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Vergleichsbeispiel 1: primäre Reaktionsflüssigkeit von
Beispiel 1
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Vergleichsbeispiel 2: primäre Reaktionsflüssigkeit von
Beispiel 4
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Vergleichsbeispiel 3: primäre Reaktionsflüssigkeit von
Beispiel 7
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Vergleichsbeispiel 4: primäre Reaktionsflüssigkeit von
Beispiel 10
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In jedem dieser Vergleichsbeispiele (primäre
Reaktionsflüssigkeit jedes Beispiels) wird die Behandlung
während der Reaktionszeit durchgeführt, die erforderlich ist,
um den höchsten Gehalt an Oligosacchariden zu erhalten, was
durch vorbereitende Experimente für die für das Verfahren
verwendeten β-Galactosidasen bestätigt wurde.
Tabelle 1
Beispiel 13
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36 kg gepulverter entrahmter Milch wurden in warmem Wasser
gelöst, um eine Gesamtmenge von 100 1 zu ergeben, und 1000000
Einheiten β-Galactosidase, erzeugt von Aspergillus oryzae,
wurden zu der Milch zugegeben. Die Mischung wurde bei 60 ºC 1
Stunde lang reagieren gelassen, und das Enzym durch Erhitzen
bei 80 ºC während 2 Stunden inaktiviert. Die
Reaktionsflüssigkeit wurde bei 60 ºC gehalten, und 500000
Einheiten β-Galactosiäase, erzeugt von Lactobacillus
bulgaricus, zugegeben und 2 Stunden lang umgesetzt.
Schließlich wurden 300 l Wasser bei 90 ºC zugegeben, um die
Mischung zu verdünnen, und gleichzeitig das Enzym zu
inaktivieren, um eine Oligosaccharide enthaltende behandelte
Milch zu erhalten, die einen geringen Grad an Lactose
enthielt, aber süß war. Der Saccharidgehalt dieser Milch war
der folgende: 1,35 % Qligosaccharide, 1,40 % Disaccharide,
und 1,76 % Monosaccharide.