JP2001245690A - グリコシドまたはオリゴ糖の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 β−ガラクトシダーゼ等のグリコシダーゼを
用いた糖転移反応におけるグリコシル基転移効率を高
め、オリゴ糖や目的とするグリコシドを安価、簡便且つ
高収率に得る方法を提供すること。 【解決手段】 カリウムイオンにより分解反応が活性化
されるグリコシダーゼを、グリコシル基供与体に作用さ
せてグリコシドを製造する方法において、該グリコシダ
ーゼをナトリウムイオン又はアンモニウムイオンの存在
下で基質に反応させることを特徴とするグリコシドの製
造方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、グリコシダーゼの
グリコシル基転移反応によって生成するグリコシドの生
成率を向上させることのできる製造法に関し、更に詳し
くは、β−ガラクトシダーゼによるガラクトオリゴ糖等
のガラクトシドの生成率を向上させる方法に関するもの
である。

【０００２】

【従来の技術】グリコシダーゼ（グリコシドヒドラー
ゼ）は、配糖体やオリゴ糖のグリコシド結合を加水分解
する酵素の総称で、グリコシド結合の加水分解だけでな
く、グリコシル基を転移する反応も触媒することが知ら
れており、各種のオリゴ糖の製造にも使用されている。
例えば、β−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌａｃｔｏｓ
ｉｄａｓｅ）は、乳糖などのβ−Ｄ−ガラクトシド結合
を加水分解する反応とともに、ガラクトシル基転移反応
も触媒することが知られており、腸内で選択的にビフィ
ズス菌を増殖させるガラクトオリゴ糖等のオリゴ糖の製
造に使用されている。

【０００３】また、この酵素は、近年、そのガラクトシ
ル基転移能を利用して、種々の生理活性物質や食品素材
の物理化学的安定性や生物学的半減期、腸管吸収性を改
善する試みがなされている。例えば、サイクロデキスト
リン、アミノ酸、ペプチド、ステビオール配糖体、アル
コール、コウジ酸、ビタミンＢ_１などを受容体として反
応し、これらの化合物のガラクトシドを合成したことが
報告されている（”Ｎｅｗ Ｆｏｏｄ Ｉｎｄｕｓｔｒ
ｙ”, Ｖｏｌ.３９,５８−６４,１９９７）。

【０００４】このような糖転移反応に使用されているグ
リコシダーゼとしては、グリコシル基を効率よく受容体
に転移させ、目的とするグリコシドを高収率で得る反応
特性を有していることが望ましく、さらに、反応環境を
最適化して転移率を高めることが重要である。

【０００５】一般に糖転移反応は、反応の基質や受容体
濃度が高いほど転移率が高まることが知られており、例
えばガラクトオリゴ糖の製造においても基質の乳糖濃度
を極限まで高めてβ−ガラクトシダーゼを作用させるこ
とで転移率を高める方法が提案されている（特公平５−
２２５１７号）。一方、ｐＨ、温度、金属塩、緩衝液の
種類や濃度などの因子は、反応速度には影響するが、糖
転移率には顕著な影響を及ぼさないと考えられていた。
また、β−ガラクトシダーゼの加水分解反応と糖転移反
応の最適条件の差異について、詳細な検討がなされたこ
とはなかった。

【０００６】これらに対して酵素の改質により、ガラク
トオリゴ糖の収率を向上させる方法も提案されている。
例えば、特開平１１−１８７６３号には、バチルス・サ
ーキュランス由来のβ−ガラクトシダーゼを加熱処理す
ることで該β−ガラクトシダーゼを改質し、ガラクトオ
リゴ糖の生成能を高める方法が開示されている。しかし
ながら、この方法も他の菌由来の酵素に適用できるもの
ではないため、より汎用性の高い糖転移率の向上方法が
求められている。

【０００７】このように、グリコシル基の転移率を向上
させ、グリコシドやオリゴ糖の収率を向上させる方法に
ついては、数々の提案がなされているが、未だ満足し得
るものはなく、製造時の経済性や利便性といった観点か
らも、更に優れた方法の確立が望まれている。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の課題
は、β−ガラクトシダーゼ等のグリコシダーゼを用いた
糖転移反応におけるグリコシル基転移効率を高め、オリ
ゴ糖や目的とするグリコシドを安価、簡便且つ高収率に
得る方法を提供することにある。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するために鋭意研究を行った結果、カリウムイオ
ンにより加水分解反応が活性化される性質を有するグリ
コシダーゼを用いてグリコシル基転移反応を行う際に、
ナトリウムイオン又はアンモニウムイオンを共存させて
反応することで、グリコシル基の転移率が向上すること
を見出し、本発明を完成した。

【００１０】すなわち、本発明は、カリウムイオンによ
り加水分解反応が活性化されるグリコシダーゼを、グリ
コシル基供与体に作用させてグリコシドを製造する方法
において、該グリコシダーゼをナトリウムイオン又はア
ンモニウムイオンの存在下で基質に反応させることを特
徴とするグリコシドの製造方法を提供するものである。

【００１１】また、本発明は、カリウムイオンにより加
水分解反応が活性化される性質を有するグリコシダーゼ
を、グリコシル基供与体に作用させてオリゴ糖を製造す
る方法であって、該グリコシダーゼをナトリウムイオン
又はアンモニウムイオンの存在下で基質に反応させるこ
とを特徴とするオリゴ糖の製造方法を提供するものであ
る。

【００１２】更に、本発明は、グリコシダーゼを基質に
反応させてオリゴ糖を含む一次反応液を調製し、次いで
この一次反応液をカリウムイオンにより加水分解反応が
活性化される先のグリコシダーゼとは別のグリコシダー
ゼを用いてナトリウムイオン又はアンモニウムイオンの
存在下で処理することを特徴とするオリゴ糖の製造方法
をも提供するものである。

【００１３】

【発明の実施の形態】本発明において使用される、カリ
ウムイオンにより加水分解反応が活性化される性質を有
するグリコシダーゼとは、活性発現に金属イオンを要求
する酵素のうち、特にカリウムイオンによって活性化さ
れるタイプの酵素を指称する。

【００１４】このような酵素は微生物などに広く存在す
るが、上記の酵素に関する報告としては、例えばクリベ
ロマイセス・ラクチス由来の酵素（ＡＮＮ.Ｎ.Ｙ.Ａｃ
ａｄ.Ｓｃｉ.７９９，１８３−１８９（１９９６）やス
トレプトコッカス・サーモフィルス由来の酵素（ＮＺＪ
Ｄａｉｒｙ Ｓｃｉ. Ｔｅｃｈｎｏｌ., ２０, ４３−
５６（１９８５））等を挙げることができる。本発明で
使用するグリコシダーゼは、前記したようにカリウムイ
オンによって活性化されるものであるが、特に、カリウ
ムイオンによって最も活性化されるものがこのましい。
そして、あるグリコシダーゼがカリウムイオンにより加
水分解反応が活性化される性質を有するか否かは、例え
ば常法に従って金属塩を含まない緩衝液に各種の一価カ
チオンを加え、カリウムイオンによって基質の加水分解
反応が最も進むかどうかを調べることにより判断するこ
とが可能である。

【００１５】本発明で用いる上記グリコシダーゼとして
は、α−およびβ−グリコシダーゼ、α−及びβ−ガラ
クトシダーゼ、α−及びβ−マンノシダーゼ、β−フラ
クトシダーゼ、キシロシダーゼ等が挙げられ、中でもβ
−ガラクトシダーゼを使用する際に、本発明の方法を適
用することが好ましい。

【００１６】特に、クリベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒ
ｏｍｙｃｅｓ）属、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔ
ｃｏｃｃｕｓ）属、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃ
ｉｌｌｕｓ）属、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属又はバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓ）属等に属する微生物由来のグリコシダーゼは、ナト
リウムイオン又はアンモニウムイオンの存在下でグリコ
シドの生成率を高める効果が高いため好ましく、更に、
クリベロマイセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃ
ｅｓ ｌａｃｔｉｓ）、クリベロマイセス・フラギリス
（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ）、
ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｃ
ｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトバチ
ルス・ブルガリクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂ
ｕｌｇａｒｉｃｕｓ）、ビフィドバクテリウム・ブレー
ベ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ）由
来のものが好ましい。

【００１７】本発明で用いるグリコシダーゼの入手容易
なものを、例えばβ−ガラクトシダーゼについて示せ
ば、クリベロマイセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍ
ｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）由来のＧＯＤＯ−ＹＮＬ（合
同酒精株式会社製）、マキシラクトＬＸ５０００（ロビ
ン株式会社製）やクリベロマイセス・フラギリス（Ｋｌ
ｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ）由来のラ
クトザイム３００ＯＬ（ノボノルディスク社製）、スト
レプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｃｏｃ
ｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のラクターゼ
Ｙ−ＳＴ（ヤクルト薬品工業社製）等を挙げることがで
きる。

【００１８】本発明においては、これらの酵素をナトリ
ウムイオン又はアンモニウムイオンの存在下で作用させ
ることによりグリコシル基受容体へのグリコシル基の転
移反応が活性化されるため、各種グリコシドの収率も上
昇するのである。特に、ナトリウムイオンの存在下で反
応させた場合には、転移反応が顕著に活性化され、グリ
コシドの収率も増加するため好ましい。このような作用
は、グリコシダーゼを基質のみに反応させる場合、及び
基質とは別にグリコシル基受容体を共存させる場合、す
なわちグリコシル基受容体と供与体が共存している場合
のいずれにおいても充分に奏される。これらの基質ある
いはグリコシル基供与体としては、グリコシダーゼが作
用するグリコシル結合を有する化合物であれば何でも良
いが、化合物の構造によっては最も活性化される一価の
カチオンの種類が異なることがあるので、カリウムイオ
ンによって加水分解反応が最も活性化される化合物であ
ることが好ましい。なお、本明細書において、基質と
は、そのものがグリコシル基の受容体と供与体とを含ん
でいる単独の基質である場合、及びグリコシル基受容体
と供与体が別途共存している場合のいずれをも包含する
ものであり、更には該基質を含む天然物等も含むもので
ある。

【００１９】反応時に用いるナトリウムイオン、アンモ
ニウムイオンは実際には専ら塩の形態で添加される。そ
の形態は特に限定されるものではなく、塩化物、炭酸
塩、酢酸塩、リン酸塩等の形態で使用可能であり、これ
らを単独あるいは組み合わせて、もしくは緩衝液として
反応系に添加すればよい。

【００２０】ナトリウムイオンやアンモニウムイオンの
添加量は使用する酵素の種類により異なる場合もある
が、一般的には反応系中に１ｍＭ以上添加すればよく、
その効果を顕著に発揮させるためには１０ｍＭ〜１００
ｍＭが、生成物の収率等の点から好ましい。また、添加
量の上限は酵素の反応が極端に遅延したり、酵素が失活
しない範囲に留める必要がある。一方、カリウムイオン
の存在はこれらのイオンによる転移率の向上を妨げるの
で反応液中に持ち込まないようにするのが望ましいが、
もし基質にカリウム塩が混在していて反応系への混入が
避けられない場合には、ナトリウムイオンやアンモニウ
ムイオンをカリウムイオン濃度以上に添加するのが望ま
しく、さらに生成物の収率を最大限に高めたい場合には
１０倍以上の添加が好ましい。また、酵素によってはカ
リウムイオンとマグネシウムイオンが共存すれば、相乗
的に反応速度を速めることが知られているが、糖転移反
応における転移率には顕著な影響はない。

【００２１】本発明の製造方法の適用例としては、例え
ばβ−ガラクトシダーゼの場合には、乳糖やｏ−ニトロ
フェニル−β−Ｄ−ガラクトシドなどをガラクトシル供
与体とし、乳糖、ショ糖、Ｎ−アセチルグルコサミン、
ラクチトール、サイクロデキストリン等の糖質や、アミ
ノ酸、ペプチド、ステビオール配糖体、アルコール、コ
ウジ酸、ビタミンＢ₁ 等の水酸基を有する受容体を共存
させて反応させ、各種のガラクトシドを製造する方法等
の、グリコシル基供与体から受容体にグリコシル基を転
移してグリコシドを製造する方法が挙げられる。

【００２２】また別の適用例としては、マルトースにα
−グルコシダーゼを反応させてイソマルトオリゴ糖を製
造する方法、乳糖にβ−ガラクトシダーゼを反応させて
ガラクトオリゴ糖を製造する方法、蔗糖にβ−フラクト
シダーゼを作用させてフラクトオリゴ糖を製造する方
法、乳糖を受容体として蔗糖にβ−フラクトシダーゼを
作用させてラクトスクロースを製造する方法等のオリゴ
糖の製造法が具体的に挙げられる。中でも、本発明の方
法は各種オリゴ糖の製造に用いることが好ましく、特
に、β−ガラクトシダーゼを用いたカラクトオリゴ糖の
製造に適用することが好ましい。

【００２３】本発明方法における酵素反応の条件として
は、反応系中にナトリウムイオン或いはアンモニウムイ
オンを存在せしめる以外は通常のグリコシド製造時に用
いられている条件と同様に設定すればよく、例えばオリ
ゴ糖製造時であれば酵素の安定性やオリゴ糖の対糖収率
等の点を考慮して、良好な反応条件を決定すればよい。
具体的には、出発原料として乳糖を用いる場合には、糖
濃度が１５〜６５重量％が好ましい。さらに、一般的に
は乳糖濃度が高い方が転移率が向上するので好ましい
が、酵素によってはこの範囲の中で至適の濃度が存在す
る場合もある。

【００２４】使用する酵素量や反応温度、反応時間も通
常の酵素反応におけるのと同様の条件でよく、例えば、
酵素にＧＯＤＯ−ＹＮＬを用いる場合には、乳糖１ｇあ
たり２０〜５００Ｕ添加し、３０〜５０℃で１〜２０時
間程度反応させればよい（酵素量はメーカーの測定法に
よる活性値で示した）。

【００２５】また、本発明は、２種のグルコシダーゼを
用いた逐次反応によるグリコシドやオリゴ糖の製造にも
適用できる。例えば、特公平５−２２５１６号公報や特
許第２７３９３３５号公報に記載された２種のβ−ガラ
クトシダーゼを用いた逐次反応によるガラクトオリゴ糖
の製造法にも適用でき、ここで示されているオリゴ糖収
率を向上させることができる。

【００２６】すなわち、一次反応用酵素としてガラクト
オリゴ糖の最大生成時に未反応の乳糖の残存量の多いβ
−ガラクトシダーゼを選択し、この酵素で１次反応液を
調製した後、２次反応としてナトリウムイオン又はアン
モニウムイオンを共存させて同様に前記のβ−ガラクト
シダーゼで処理すれば、ガラクトオリゴ糖の生成率が更
に増加するのである。

【００２７】１次反応液の調製に用いるグリコシダーゼ
としては、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）
属、プレラ（Ｂｕｌｌｅｒａ）属又はバチルス（Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓ）属に属する微生物由来のグリコシダーゼが
好ましく、特にアスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇ
ｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・ニガー
（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギ
ルス・フラバス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕ
ｓ）、ブレラ・シンギュラリス（Ｂｕｌｌｅｒａ ｓｉ
ｎｇｕｌａｒｉｓ）、バチルス・サーキュランス（Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）由来のものを用い
ることが好ましい。このような酵素として、具体的に
は、バチルス・サーキュランス由来のビオラクタＮ５
（大和化成社製）等が挙げられる。

【００２８】この逐次反応は、単独の基質を処理する場
合であっても、またグリコシル基供与体と受容体が別途
共存している場合のいずれにおいても適用可能である。
１次反応液調製時の反応条件も通常のグリコシド製造条
件にしたがって適宜設定すればよい。例えばオリゴ糖製
造時であれば酵素の安定性やオリゴ糖の対糖収率等の点
を考慮して、良好な反応条件を決定すればよい。具体的
には、出発原料として乳糖を用いる場合には、糖濃度が
１５〜６５重量％が好ましい。さらに、一般的には濃度
が高い方が転移率が向上するので好ましいが、酵素によ
ってはこの範囲の中で至適の濃度が存在する場合もあ
る。

【００２９】また２次反応も、酵素としてカリウムイオ
ンにより分解反応が活性化されるグリコシダーゼを用
い、第１次反応液にナトリウム塩或いはアンモニウム塩
を添加することを除いては、通常の酵素反応条件で実施
できる。例えば、酵素にＧＯＤＯ−ＹＮＬを用いる場合
には、この酵素を乳糖１ｇあたり２０〜５００Ｕと、前
記量のナトリウム塩或いはアンモニウム塩とを添加し、
３０〜５０℃で１〜２０時間程度反応させればよい（酵
素量はメーカーの測定法による活性値で示した）。な
お、反応液中にカリウムイオンが共存すると転移反応が
阻害され（加水分解反応が促進され）、転移生成物の収
量が低下する場合があるので、カリウムイオンは少ない
ほうが望ましい。

【００３０】ガラクトオリゴ糖が生成した反応液は、そ
のまま、あるいは適宜活性炭による脱色やケイソウ土に
よる濾過、イオン交換樹脂による脱塩、濃縮機による濃
縮を行い、液糖のまま食品素材として使用したり、噴霧
乾燥機などによって粉末化も可能である。

【００３１】こうして得られる各種のグリコシドは、こ
れをそのままあるいは適宜加工して、食品、化粧品、医
薬品、ファインケミカルズ等として使用することができ
る。例えばオリゴ糖であれば、これをそのままテーブル
シュガーとして使用することができ、また、発酵乳、乳
酸菌飲料、パン、ジャムや菓子類等の飲食品に添加する
ことも可能である。その際の添加濃度には特に限定され
ず、風味や物性等を鑑みて適宜決定すればよい。また、
例えばコウジ酸にガラクトシル基を転移させたガラクト
シルコウジ酸はコウジ酸と同様のメラニン生成抑制活性
があり、各種化粧水、乳液、マッサージクリーム等の化
粧品に添加してもよい。また、ガラクトシルグリセロー
ルは界面活性剤として使用できる。

【００３２】更に上記食品や化粧品には、その他一般的
に用いられている食品素材、化粧品素材を添加すること
も可能である。このような食品素材としては、例えばグ
ルコース、シュークロース、フラクトース、峰蜜等の糖
類、ソルビトール、キシリトール、エリスリトール、ラ
クチトール、パラチニット等の糖アルコール、ショ糖脂
肪酸エステル、グリセリン糖脂肪酸エステル、レシチン
等の乳化剤、寒天、ゼラチン、カラギーナン、グァーガ
ム、キサンタンガム、ペクチン、ローカストビーンガム
等の増粘（安定）剤が挙げられる。この他にも、ビタミ
ンＡ、ビタミンＢ類、ビタミンＣ、ビタミンＥ等の各種
ビタミン類やハーブエキス等が挙げられる。

【００３３】

【実施例】以下、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説
明するが、本発明はこれらにより何ら制約されるもので
はない。

【００３４】なお、以下の実施例において採用する分析
方法は下記の通りである。 ＜ 高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による分
析条件 ＞ 糖鎖長別の分析（分析法１） カラム：Ｓｈｏｄｅｘ Ｓｕｇａｒ ＫＳ−８０２ 移動相：精製水 流 速：０.５ｍＬ／ｍｉｎ 検 出：示差屈折計 ２糖異性体^＊組成の分析（分析法２） カラム：ＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＰｏｌｙａｍｉｎｅII 溶 媒：アセトニトリル／水＝６５／３５ 流 速：１.０ｍＬ／ｍｉｎ 検 出：示差屈折計 * 乳糖および転移反応によって生成した二糖（以下、
「転移２糖」と称する）

【００３５】実 施 例 １ ５００ｍＬ容のコルベンに乳糖を２２５ｇ入れ、これに
２５ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７.２）を２２５ｇ加
えて沸騰水浴中で加熱溶解したものを４つ準備した。各
コルベンに２５０ｍＭの塩化リチウム、塩化ナトリウ
ム、塩化カリウム、塩化アンモニウム溶液をそれぞれ５
０ｇずつ加え、各塩溶液を含む４５重量％の乳糖溶液を
調製した。これにＧＯＤＯ−ＹＮＬ（合同酒精株式会社
製）を乳糖１ｇあたり３００単位添加して４０℃で反応
させ、経時的に糖組成を分析法１で分析した。同様にし
て、一価の塩類を添加しない４５重量％の乳糖溶液でも
反応させた。これらの反応で３糖以上のガラクトオリゴ
糖の生成量が最大となった時の生成率（対乳糖収率）を
表１に示した。

【００３６】

【表１】

【００３７】３糖以上のオリゴ糖の最大生成率は、ナト
リウムイオンを共存させた時が最も高く、次いでアンモ
ニウムイオンが高かった。また、カリウムイオンの最大
生成率は、無添加よりも低かったことから、転移反応の
面から見るとカリウムイオンは阻害的に働いていると考
えられた。

【００３８】実 施 例 ２ ５００ｍＬ容のコルベン４つに乳糖をそれぞれ７５ｇ、
１５０ｇ、２２５ｇ、３００ｇ入れ、各コルベンに３０
ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６.５；以下、「Ｋ
−ＰＢＳ」と略す）をそれぞれ４２５ｇ、３５０ｇ、２
７５ｇ、２００ｇずつ加えて沸騰水浴中で加熱溶解し、
１５、３０、４５、６０重量％の乳糖溶液を調製した。
これに、ＧＯＤＯ−ＹＮＬを乳糖１ｇあたりそれぞれ１
５０、２００、２５０、４００単位添加して４０℃で反
応させ、経時的に糖組成を分析法１および分析法２で分
析した。同様にして、３０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝
液（ｐＨ６.５；以下、「Ｎａ−ＰＢＳ」と略す）で調
製した１５、３０、４５、６０重量％の乳糖溶液にＧＯ
ＤＯ−ＹＮＬを添加して反応させた。このとき、総ガラ
クトオリゴ糖（３糖以上のガラクトオリゴ糖と転移２糖
の合計）の最大生成率を図１に示した。

【００３９】Ｎａ−ＰＢＳ添加とＫ−ＰＢＳ添加の比較
では、総ガラクトオリゴ糖の最大生成率はいずれの糖濃
度においてもＮａ−ＰＢＳ添加の方が高かった。また、
Ｋ−ＰＢＳおよびＮａ−ＰＢＳのいずれにおいても、糖
濃度３０％（ｗ／ｗ）、４５％（ｗ／ｗ）での生成率が
高かった。

【００４０】実 施 例 ３ １Ｌのコルベンに乳糖を４５０ｇ入れ、これに０.１ｍ
Ｍの塩化マグネシウムを含む５０ｍＭのＫ−ＰＢＳ（ｐ
Ｈ６.５）を５５０ｇ加え、沸騰水浴中で溶解して４５
重量％乳糖溶液を調製した。このような乳糖溶液を４つ
準備し、これらにそれぞれ乳糖１ｇあたり２００単位の
ＧＯＤＯ−ＹＮＬ（クリベロマイセス・ラクチス由来、
合同酒精製）、８０単位のラクトザイム３０００Ｌ（ク
リベロマイセス・フラギリス由来、ノボノルディスク社
製）、６０単位のラクターゼＹ−ＳＴ（ストレプトコッ
カス・サーモフィルス由来、ヤクルト薬品工業製）を加
えて４０℃で反応させ、経時的に糖組成を分析法１で分
析した。また、５０ｍＭのＮａ−ＰＢＳ（ｐＨ６.５）
で４５重量％の乳糖溶液を調製し、同様に反応させた。
さらに、５０ｍＭのリン酸カリウム−クエン酸緩衝液
（ｐＨ４.５）あるいはリン酸ナトリウム−クエン酸緩
衝液（ｐＨ４.５）で調製した４５重量％の乳糖溶液
に、１５単位のラクターゼＹ−ＡＯ（アスペルギルス・
オリゼ由来、ヤクルト薬品工業製）を添加して４０℃で
反応させ、経時的に糖組成を分析法１で分析した。な
お、酵素量はすべて各メーカーの測定法による活性値で
示した。このように各酵素を用いて反応したときの、３
糖以上のガラクトオリゴ糖の生成率を表２に示した。な
お使用した酵素のうち、前３者はカリウムイオンにより
加水分解反応が活性化されるものであり、最後のアスペ
ルギルス・オリゼ由来のものはカリウムイオンにより加
水分解反応が活性化されないものである。

【００４１】

【表２】

【００４２】実 施 例 ４ （１）一次反応液の調製 １５Ｌ容のステンレス製反応装置にイオン交換水を５ｋ
ｇ入れ、乳糖を５ｋｇ加えて８０℃まで昇温して溶解
後、その後５０℃まで冷却し、５％水酸化カリウム溶液
を加えてｐＨ６.０に調整した。この乳糖溶液にビオラ
クタＮ５（大和化成社製）を乳糖１ｇあたり２.５単位
添加して２０時間反応させ、液温を９０℃に昇温し、こ
の温度で１０分間保持することで反応を停止した。同様
に、５％水酸化ナトリウム溶液を加えてｐＨ６.０に調
整し、同酵素を作用させて得た一次反応も調製した。こ
れらの糖組成を分析法１で測定したところ、ともに３糖
以上、２糖および単糖の比率が４０：４２：１８であっ
た。また、分析法２で２糖中の乳糖と転移２糖の比率
は、ともに８２：１８であった。

【００４３】（２）二次反応 （１）で調製した一次反応液のうち、水酸化カリウムで
ｐＨ調整した方に３００ｍＭ Ｋ−ＰＢＳ（ｐＨ６.
５）を１.１ｋｇ加え、水酸化ナトリウムでｐＨ調整し
た方に３００ｍＭ Ｎａ−ＰＢＳ（ｐＨ６.５）を１.１
ｋｇ加えた。これらにＧＯＤＯ−ＹＮＬを残存乳糖１ｇ
あたり１００単位添加して４０℃で反応させ、経時的に
反応液を少量サンプリングして糖組成を分析した。表３
に、Ｋ−ＰＢＳを添加した場合とＮａ−ＰＢＳを添加し
た場合のガラクトオリゴ糖の最大生成率を比較した。

【００４４】

【表３】

【００４５】３糖以上のガラクトオリゴ糖含量も転移２
糖の含量も、Ｎａ−ＰＢＳを添加した方が高くなること
が判った。また、Ｋ−ＰＢＳ、Ｎａ−ＰＢＳの両反応と
も、３糖以上のガラクトオリゴ糖の主成分はβ−Ｄ−ガ
ラクトピラノシル（１−４）β−Ｄ−ガラクトピラノシ
ル−Ｄグルコースとβ−Ｄ−ガラクトピラノシル（１−
４）β−Ｄ−ガラクトピラノシル（１−４）β−Ｄ−ガ
ラクトピラノシル（１−４）−Ｄ−グルコースで、転移
２糖の主成分はβ−Ｄ−ガラクトピラノシル（１−６）
−Ｄ−グルコースであることを確認した。

【００４６】実 施 例 ５ （１）一次反応液の調製 １００Ｌ容のジャケット付きステンレス製反応装置に温
水を４０ｋｇ入れ、これに乳糖を５０ｋｇと２００ｍＭ
Ｋ−ＰＢＳ（ｐＨ６．５）を１０ｋｇ加え、撹拌しな
がら８０℃まで昇温して溶解し、その後６０℃まで冷却
した。この乳糖溶液にビオラクタＮ５（大和化成製）を
乳糖１ｇ当たり６単位添加して４時間反応させ、液温を
９０℃に昇温し、この温度で１０分間保持することで反
応を停止させて一次反応液を得た。同様に、温水４０ｋ
ｇ、乳糖５０ｋｇと２００ｍＭＮａ−ＰＢＳ（ｐＨ６.
５）１０ｋｇで調製した溶液に酵素を作用させた一次反
応液も得た。これらの反応液の糖組成を分析法１で測定
したところ、共に３糖以上、２糖および単糖の比率は３
９：４４：１７であった。また、分析法２での２糖中の
乳糖と転移２糖の比率は、共に８６：１４であった。

【００４７】（２）二次反応 （１）で得られた２つ反応停止液に、それぞれ１００ｍ
Ｍの塩化マグネシウムを１００ｇ加え、これらにラクタ
ーゼＹ−ＳＴ（ヤクルト薬品工業製）を残存乳糖１ｇ当
たり１００単位添加して５０℃で反応を開始した。経時
的に反応液を少量サンプリングして、３糖以上のガラク
トオリゴ糖含有量が最大になった時点で９０℃まで昇温
させて反応を停止させた。表４に得られた糖液の糖組成
を示した（Ｎａ−ＰＢＳで二次反応した方が総ガラクト
オリゴ糖の比率が高かった）。

【００４８】

【表４】

【００４９】（３）糖液の精製 上記の糖液のうち、Ｎａ−ＰＢＳで二次反応した液につ
いて以下の処理を行った。反応停止液に粉末状の活性炭
を３００ｇ加えて３０分間撹拌し、ケイソウ土（ラヂオ
ライト＃６００）をプレコートしたフィルタープレスで
濾過を行った。この溶液をＰＫ２１８とＰＡ３１６（三
菱化学製）の混床樹脂塔を通してイオン交換し、透明な
糖溶液を得た。この溶液を０.５μｍのカートリッジフ
ィルターで精密濾過した後、濃縮機でＢｘ７５になるま
で濃縮し、透明で粘調な糖液を得た。このようにして調
製した液糖は上品な甘味を有しており、各種の食品への
添加が可能であった。

【００５０】実 施 例 ６ ５００ｍＬのコルベンに乳糖を１８０ｇ入れ、これに
０.１ｍＭの塩化マグネシウムを含む３０ｍＭ Ｋ−ＰＢ
Ｓ（ｐＨ６.５）を１３０ｍＬ加えて加熱溶解した後、
グリセロールを８２.３ｇと同緩衝液を加えて液量を２
９０ｍＬとした。同様に、０.１ｍＭの塩化マグネシウ
ムを含む３０ｍＭ Ｎａ−ＰＢＳ（ｐＨ６.５）に乳糖を
溶解し、グリセロールを加えて２９０ｍＬとした溶液を
調製した。これらの溶液にＧＯＤＯ−ＹＮＬをそれぞれ
１０ｍＬ（５４０００単位）ずつ添加して４０℃で反応
させ、経時的に糖組成を分析法１で分析した。上記のよ
うにガラクトシル供与体としての乳糖と受容体としての
グリセロールが、それぞれ１Ｍと３Ｍ含む溶液中に生成
した、ガラクトシルグリセロール（グリセロールにガラ
クトースが１分子結合したもの）の対糖収率を表５に示
した。

【００５１】

【表５】

【００５２】ガラクトシルグリセロールの対糖収率の最
大値は、カリウムイオンに比べナトリウムイオンの存在
下で反応した方が高い収率となることが判った。なお、
得られたガラクトシルグリセロールの構造の詳細な解析
は、以下の方法で行った。ゲルろ過カラムクロマトグラ
フィー（Ｂｉｏ ｇｅｌ Ｐ２）でガラクトシルグリセロ
ールに相当するピークを分画し、そのピーク成分をさら
にアミドカラムによるＨＰＬＣで分析したところ８対９
２の割合で成分１と２が生成していた。各成分をＨＰＬ
Ｃで分取して、質量分析、水素核および炭素核ＮＭＲス
ペクトルを測定して構造を解析し、成分１はβ−Ｄ−ガ
ラクトピラノシル（１−２）グリセロール、成分２はβ
−Ｄ−ガラクトピラノシル（１−１）グリセロールと決
定した。

【図面の簡単な説明】

【図１】 実施例２での、各種乳糖濃度下で反応させた
ときの３糖以上のオリゴ糖と転移２糖の最大生成率を、
使用緩衝液毎に示した図面。 以 上

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 木村 一雅 東京都港区東新橋１丁目１番19号 株式会 社ヤクルト本社内 (72)発明者 渡邉 陽子 東京都港区東新橋１丁目１番19号 株式会 社ヤクルト本社内 Ｆターム(参考） 4B050 CC10 DD02 DD03 HH01 LL01 LL02 LL03 LL05 4B064 AF04 AF41 CA21 CB07 CB30 CC01 CC04 CD02 CD09 CD10 CE07 CE10 CE11 DA01 DA10 DA13

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 カリウムイオンにより加水分解反応が活
   性化されるグリコシダーゼを、グリコシル基供与体に作
   用させてグリコシドを製造する方法において、該グリコ
   シダーゼをナトリウムイオン又はアンモニウムイオンの
   存在下で基質に反応させることを特徴とするグリコシド
   の製造方法。
2. 【請求項２】 グリコシダーゼがβ−ガラクトシダーゼ
   であることを特徴とする請求項１記載のガラクトシドの
   製造方法。
3. 【請求項３】 グリコシダーゼがクリベロマイセス属、
   ストレプトコッカス属、ラクトバチルス属、ビフィドバ
   クテリウム属又はバチルス属に属する微生物由来のもの
   であることを特徴とする請求項１又は２記載のグリコシ
   ドの製造方法。
4. 【請求項４】 ナトリウムイオン又はアンモニウムイオ
   ンの濃度が１ｍＭ以上である請求項第１項ないし第３項
   の何れかの項記載のグリコシドの製造方法。
5. 【請求項５】 カリウムイオンにより加水分解反応が活
   性化される性質を有するグリコシダーゼを、グリコシル
   基供与体に作用させてオリゴ糖を製造する方法であっ
   て、該グリコシダーゼをナトリウムイオン又はアンモニ
   ウムイオンの存在下で基質に反応させることを特徴とす
   るオリゴ糖の製造方法。
6. 【請求項６】 グリコシダーゼを基質に反応させてオリ
   ゴ糖を含む一次反応液を調製し、次いでこの一次反応液
   をカリウムイオンにより加水分解反応が活性化される先
   のグリコシダーゼとは別のグリコシダーゼを用いてナト
   リウムイオン又はアンモニウムイオンの存在下で処理す
   ることを特徴とするオリゴ糖の製造方法。