DE3624816A1 - Verfahren zur herstellung von monosialgangliosid - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Monosialgangliosid.

Gangliosid bezeichnet ein Glied einer Klasse von Glycosphingolipiden, die in menschlichen und tierischen Gehirnen reichlich vorkommen, und wird durch die folgende allgemeine Formel dargestellt: worin GalNAc N-Acetylgalactosamin bedeutet, Gal Galactose bezeichnet, Glc für Glucose steht, NeuNAc N-Acetyl- und/oder N-Glycolylneuraminsäure (hier im folgenden einfach als "Sialsäure" bezeichnet) ist, Cer Ceramid (Englisch: "ceramide") bezeichnet, n eine ganze Zahl von 0 bis 3 bezeichnet und m für eine ganze Zahl von 1 bis 3 steht. In Abhängigkeit von der Anzahl und der Stellung oder den Stellungen der Bindung des Sialsäurerestes oder die Sialsäurereste, der einer seiner Bestandteile ist, gibt es viele molekulare Arten. Deshalb ist der Ausdruck "Gangliosid", wie er hier verwendet wird, eine allgemeine Bezeichnung für sie.

Gangliosid kann in Abhängigkeit von der Anzahl der Sialsäurereste, die pro Molekül gebunden sind, grob in Monosialgangliosid (Abkürzung: GM), Disialgangliosid (Abkürzung: GD), Trisialgangliosid (Abkürzung: GT) und Tetrasialgangliosid (Abkürzung: GQ), bei dem vier Sialsäurereste gebunden sind, unterteilt werden. Ganglioside können weiterhin in Abhängigkeit von der Stellung oder von den Stellungen des bzw. der gebundenen Sialsäurereste klassifiziert werden. Die folgenden molekularen Arten von Gangliosid sind auf diese Weise bekanntgeworden: GM₁ (n=0, m=1 in der allgemeinen Formel (1)) als GM, GD_1a (n=1, m=1) und GD_1b (n=0, m=2) als GD, GT_1b (n=1, m=2) als GT und GQ_1b (n=2, m=2) als GQ usw.

Andererseits zeigt die Schreibweise von GM₁ an, daß alle der vier Saccharide des grundlegenden Oligosaccharids enthalten sind. Das Oligosaccharid, das durch Eliminierung des End-Gal von GM₁ gebildet wird, wird "GM₂" genannt, und das Oligosaccharid, das durch weitere Eliminierung von GalNAc erhalten wird, wird "GM₃" genannt. Außerdem wird das Saccharid, das durch vollständige Eliminierung des Sialsäurerestes gebildet wird, ein Sialo- oder Sial- GM₁ oder GA₁ genannt.

Die Wirkung von Gangliosid in lebenden Körpern ist in den letzten Jahren klarer geworden. Es wurde berichtet, daß GM₁ für die Reparatur und die Behandlung von Unordnungen des zentralen und peripheren Nervensystems wirksam ist (z. B. Acta Neuropatholigica, 62, 46-50 (1983); Agnati, L.F., et al., Acta Physiologica Scandiniavica, 119, 347-363 (1983)).

In Italien wird ein GM₁-haltiges Gangliosid-Gemisch mit dem Namen "Cronacial®" als ein therapeutisches Mittel gegen periphere Nervenkrankheiten auf den Markt gebracht. Es ist eine Patentanmeldung für dieses Gemisch angemeldet worden (jetzt: Japanische Patent-Offenlegungsschrift No. 34 912/1977).

Als ein herkömmliches Verfahren für die Bildung von GM₁ von einer Gangliosid-Art, die eine andere als GM₁ ist, ist es bekannt, Neuraminidase, eine Desialidase, auf die Gangliosid-Art einwirken zu lassen (z. B. Richard Kuhn et al., Chemische Berichte, 96, 866 (1963)).

Außerdem ist auch berichtet worden, daß GM₁ ohne Anwendung irgendwelcher Enzyme gebildet worden ist (S. Ando et al., The Journal of Biological Chemistry, 254(23). 12 224- 12 229 (1979)). Und zwar ist berichtet worden, daß ein Gemisch von GT_1a, GT_1b, GD_1b, GD_1a und GM₁ erhalten wurde, indem GQ bei pH 3 und 80°C 30 Minuten in einer wässrigen Lösung von Ameisensäure gehalten wurde. Entsprechend dem Dünnschichtchromatogramm in diesem Report ist der Anteil von GM₁ in dem so erhaltenen Gemisch jedoch extrem klein, und es ist somit noch eine weitere Bestätigung in bezug auf die Bildung von GM₁ notwendig.

Es ist auch bekannt, daß der Sialsäurerest oder die Sialsäurereste von Gangliosid durch Azidolyse eliminiert werden (z. B. E. Klenk, Hoppe-Seyler's-Zeitschrift für Physiologische Chemie, 270, 185 (1941) und L. Svennerholm et al., The Journal of Biological Chemistry, 248, 740 (1973)).

In jedem Fall sind diese bekannten Verfahren darauf gerichtet, die ganze Sialsäure zu eliminieren, und die Reaktionsprodukte sind GA₁ und neutrale Glycosphingolipide, die durch Eliminieren von 1 bis 3 Sacchariden von dem Grund-Oligosaccharid gebildet worden sind. Sie sind nicht darauf gerichtet, GM₁ zu bilden.

Als Lieferquellen für Gangliosid, die zur Zeit in der Industrie angewendet werden, werden Gehirne von Rindern, Schweinen und dergleichen verwendet. Gangliosid, das aus diesen Gehirnen erhältlich ist, enthält im allgemeinen molekulare Arten von anderem Gangliosid als GM₁ in höheren Anteilen als GM₁. Die Erfinder der vorliegenden Erfindung erhielten Gangliosid in einer gereinigten Form durch ein Verfahren, das an sich bekannt ist, nämlich durch Dehydratisierung von Rindergehirn mit Aceton, Extrahieren desselben mit einem gemischten Lösungsmittel aus Chloroform, Methanol und Wasser durch das Verfahren, das von Svennerholm et al. (Biochemical et Biophysica Acta, 617, 97-109 (1980)) vorgeschlagen worden ist, Umwandeln des Extraktes in eine wässrige Lösung von Gangliosid durch die Folch'sche Verteilung (J. Folch, The Journal of Biological Chemistry, 226, 497-509 (1957)), Reinigen desselben durch DEAE-Sephadex- A25 (R.W. Ledeen et al., Journal of Neurochemistry, 21, 829 (1973)) und dann Hindurchleiten desselben durch eine Silicagel-Kolonne. Die Zusammensetzung des wie vorstehend beschrieben gereinigten Gangliosids war 14% GM₁, 45% GD_1a, 10% GD_1b, 22% GT_1b und 2% GQ_1b.

In der oben beschriebenen Gangliosid-Zubereitung "Cranacial®" beträgt der Gehalt an GM₁ 21% entsprechend dem Begleitzettel für die Zubereitung. Wenn die anderen molekularen Arten von Gangliosid als GM₁ in dem Gangliosid-Gemisch GM₁ umgewandelt werden können, kann dementsprechend der wirksame Bestandteil in einem größeren Volumen erhalten werden. Obgleich GM₁ gebildet werden kann, indem Neuraminidase auf Gangliosid einwirken gelassen wird, ist dieses Enzym teuer und deshalb erscheint dieses Verfahren nicht als ein vorteilhaftes Verfahren vom wirtschaftlichen Standpunkt aus.

Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben Vergleichsversuche über die Hydrolysierbarkeit verschiedener molekularer Arten von Gangliosid und Gangliosid-Gemischen durchgeführt. Als Ergebnis fanden sie, daß die Bereitschaft für Hydrolyse von einer molekularen Art zur anderen verschieden ist.

So ist die Reaktionsgeschwindigkeit von GD_1a zu GM₁ und die von GM₁ zu GA₁ verschieden, obgleich die Reaktionen insofern gleich sind, als in jeder der Reaktionen eine Sialsäure von dem Molekül eliminiert wird. Es wurde gefunden, daß die Reaktionsgeschwindigkeit von GD_1a zu GM₁ schnell ist, während die Reaktionsgeschwindigkeit von GM₁ zu GA₁ langsam ist.

Ähnliche Ergebnisse wurden auch in bezug auf andere molekulare Arten GT_1b von Gangliosid beobachtet. Die Erfinder haben dann Bedingungen für die Hydrolyse in näheren Einzelheiten untersucht. Als Ergebnis wurden hydrolytische Bedingungen gefunden, unter denen andere molekulare Arten von Gangliosid als GM₁ der Hydrolyse unterworfen werden und dadurch zu GM₁ umgewandelt werden, wobei GM₁ ziemlich stabil bleibt, und dies führte zur Fertigstellung dieser Erfindung.

Es wurde nämlich gefunden, daß GM₁ mit einer hohen Umwandlungsrate gebildet wird, wenn zu einer Lösung von Gangliosid eine Säure hinzugegeben wird, wenn es nötig ist, und sie dann auf eine geeignete Temperatur bei pH 3,5 bis 7 erhitzt wird, was schließlich zu der vorliegenden Erfindung führte.

Gemäß dem Verfahren dieser Erfindung können mehr als 50% molekulare Arten von Gangliosid, die andere als GM₁ sind, in GM₁ umgewandelt werden, welches eine hohe Einsatzmöglichkeit als Arzneimittel besitzt, und zwar durch das einfache Verfahren, bei dem eine Lösung von Gangliosid im Anschluß an seine pH-Einstellung erhitzt wird. Das Verfahren dieser Erfindung ist deshalb ein wirksames Verfahren zum Herstellen von GM₁.

Diese Aufgabe der Erfindung, weitere Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung ergeben sich deutlicher aus der folgenden Beschreibung und den beigefügten Patentansprüchen.

Das Verfahren dieser Erfindung wird im folgenden näher beschrieben.

Das Gangliosid, das als ein Ausgangsmaterial für die Herstellung von GM₁ geeignet ist, ist Gangliosid vom Gangliotetraose- Typ. Die anderen molekularen Arten von Gangliosid werden nicht als völlig geeignet angesehen, aber es entsteht kein Problem oder keine Schwierigkeit, wenn sie gemischt werden.

Als molekulare Arten von Gangliosid, die als Ausgangsmaterialien bei der praktischen Durchführung dieser Erfindung brauchbar sind, können molekulare Arten von Gangliosid genannt werden, bei denen zwei oder mehr Sialsäurereste pro Molekül von Gangliotetraose gebunden sind, Mischungen von solchen molekularen Arten von Gangliosid, Gangliosid- Gemische von den vorstehend genannten Mischungen mit darin eingemischtem GM₁, Roh-Gangliosid, das diese molekularen Arten von Gangliosid mit niederen Gehalten enthält, usw.

Zuerst werden diese molekularen Arten von Gangliosid in einem Lösungsmittel gelöst. Obgleich Wasser am besten als dieses Lösungsmittel geeignet ist, kann auch ein wasserhaltiges organisches Lösungsmittel verwendet werden. Als Lösungsmittel können Methanol, Äthanol, Isopropanol, Tetrahydrofuran, Dimethylsulfoxid, Chloroform und dergleichen genannt werden. Sie können entweder allein oder in Kombination eingesetzt werden. Es wird üblicherweise bevorzugt, Wasser als Lösungsmittel zu verwenden, aber wenn das Ausgangs- Gangliosid roh ist und eine niedrige Löslichkeit in Wasser besitzt, können vorteilhafte Ergebnisse erhalten werden, wenn ein organische Lösungsmittel in geeigneter Weise verwendet wird.

Es wird dann eine Säure zu der Gangliosid-Lösung hinzugegeben, um ihren pH auf 3,5 bis 7 einzustellen, wenn dies notwendig ist. Als ein Beispiel für eine hierbei brauchbare Säure kann eine organische Säure wie Ameisensäure, Essigsäure oder Propionsäure oder eine Mineralsäure wie Chlorwasserstoffsäure, Schwefelsäure oder Phosphorsäure genannt werden.

Wenn ein Alkalimetallsalz wie Natrium- oder Kaliumsalz oder ein Erdalkalimetallsalz wie Calcium- oder Bariumsalz von Roh-Gangliosid als ein Ausgangsmaterial verwendet wird, wird eine Säure zu seiner Lösung hinzugegeben, um den pH der Lösung auf ein vorherbestimmtes Niveau einzustellen.

Wenn jedoch Gangliosid, das durch Adsorbieren von Gangliosid an einem anionischen Austauschharz und nachfolgendes Eluieren desselben mit Ammoniumacetat gereinigt worden ist, oder Gangliosid vom Ammoniumsalz-Typ, das durch Behandeln von Gangliosid mit einem Kationen-Austauschharz (vom NH₄-Typ) als Ausgangsmaterial verwendet wird, ist der pH seiner Lösung im wesentlichen neutral, d. h. liegt im Bereich von 6 bis 7. Es ist deshalb unnötig, irgendeine Säure hinzuzugeben.

Es ist vorzuziehen, die Reaktion bei einer niedrigeren Temperatur durchzuführen, wenn sie bei einem niedrigen pH durchgeführt wird, jedoch die Reaktion bei einer höheren Temperatur durchzuführen, wenn sie bei einem höheren pH durchgeführt wird. Es ist notwendig, auf eine Temperatur zu erhitzen, die höher als 50°C ist.

Der pH der Reaktionsmischung fällt, wenn die Reaktion fortschreitet. Wenn der pH auf ein tieferes Niveau eingestellt wird, ist der Grad dieses pH-Abfalls kleiner. Es ist jedoch vorzuziehen, daß der pH nicht unter 3,5 während der Reaktion fällt. Es ist somit empfehlenswert, ein Alkali hinzuzufügen, um einen eventuellen übermäßigen Abfall des pH zu vermeiden, wenn dies notwendig sein sollte. Die Erhitzungszeit kann von 30 Minuten bis zu 30 Stunden reichen, beträgt jedoch üblicherweise 1 Stunde bis 15 Stunden.

Der Grad des Fortschreitens der Reaktion und die Steuerung von Reaktionsprodukten werden auf die folgende Weise durchgeführt.

Ein Reaktionsgemisch und eine gereinigte standardmäßige molekulare Art Gangliosid, jedes in einer vorherbestimmten Menge, werden durch einen Dünnschichtchromatographen entwickelt, und nachdem sie mit Resorcinol-Reaktionsmittel gefärbt worden sind, werden sie mit einem Zwei-Wellenlängen- Farbabtaster (Two-Wavelength chromatoscanner) so abgetastet, daß ihre Mengen bestimmt werden (Seitaimaku Jikkenho (Vital Membrane Experimentation Procedures) Vol. I, Special Edition von "Tanpaku, Kakusan, Koso (Proteins, Nucleic Acids and Enzymes", The Kyoritsu Publishing Co., Ltd., 205 (1974)).

Wenn für die Hydrolyse geeignete Bedingungen gewählt werden, werden etwa 65% molekulare Arten von Gangliosid, die von GM₁ verschieden sind, zu GM₁ umgewandelt.

Nach Fertigstellung der Hydrolyse wird das Reaktionsgemisch mit wässrigem Ammoniak neutralisiert, und dann wird GM₁ fraktioniert und durch ein bekanntes Verfahren gereinigt (z. B. Momoi et al., Biochimica et Biophysica Acta, 441, 448-497 (1976)). Hierbei wird das neutralisierte Reaktionsgemisch gezwungen, durch eine DEAE-Sephadex A25 (CH₃COO^--Typ)-Säule zu strömen, und wird dann mit 0,05 N Ammoniumacetat/Methanol eluiert. Nach dem Dialysieren und Entsalzen von GM₁-Fraktionen werden sie weiter durch eine Kieselsäure (Iatrobeads)-Säule gereinigt, um GM₁ zu erhalten. Die Ausbeute reicht bis zu 50 bis 54% ihrer stöchiometrischen Ausbeute.

Beispiel 1

In 188 ml Wasser wurden 6,0 g des Natriumsalzes eines Gangliosid-Gemisches, das von Rindergehirn erhalten worden war und 14% GM₁ enthielt, gelöst, woraufhin Zugabe von 12 ml 0,1 N Essigsäure folgte. Der pH der entstandenen Lösung betrug 4,81.

Die Lösung wurde 6 Stunden auf 80°C erhitzt und dann gekühlt. Ihr pH betrug 4,31. Als Ergebnis einer Analyse des Reaktionsgemisches wurde gefunden, daß die Menge an GM₁ auf das 3,7-fache im Vergleich zu seiner Menge vor der Reaktion erhöht worden war.

Das Reaktionsgemisch wurde mit 0,1 N wässrigem Ammoniak neutralisiert und dann durch 600 ml DEAE-Sephadex A-25 (CH₃COO^-) strömen gelassen. Wasser ( 1 l), Methanol (1,5 l), Chlorform-Methanol (1 : 1) (0,7 l) und Methanol (1 l) wurden dann der Reihe nach durch die Säule strömen gelassen, so daß die Säule gewaschen wurde.

Die Säule wurde dann mit 2 l einer 0,05 N Methanollösung von Ammoniumacetat eluiert. GM₁ wurde in den 500 bis 1750 ml-Fraktionen des Eluats eluiert. Diese GM₁ Fraktionen wurden bis zur Trockenheit konzentriert, woraufhin ihr Auflösen in 150 ml Wasser folgte. Nach Dialysieren und Entsalzen der entstandenen Lösung wurde sie bis zur Trockenheit konzentriert. Das Trockengewicht betrug 3,2 g.

Sie wurde dann in 150 ml Chloroform-Methanol-Wasser (55 : 45 : 2) aufgenommen und dann durch eine Säule strömen gelassen, die mit 600 ml Kieselsäure (Iatrobeads) bepackt und mit dem gleichen Lösungsmittel äquilibriert worden war. Die Säule wurde der Gradient-Eluierung mit Lösungsmitteln unterworfen, d. h. 1 Liter Chloroform-Methanol- Wasser (55 : 45 : 2) und 1,25 l Chloroform-Methanol- Wasser (10 : 90 : 2). Die entstandenen GM₁-Fraktionen wurden bis zur Trockenheit konzentriert.

Der Rückstand wurde in einer kleinen Menge Chloroform- Methanol (2 : 1) gelöst, woraufhin eine Zugabe von 300 ml Aceton folgte. Die entstandene Lösung wurde eisgekühlt und die entstandenen Kristalle wurden durch Zentrifugieren zum Ausfallen gebracht. Nach Entfernung der überstehenden Flüssigkeit wurden die Kristalle getrocknet, wodurch 2,65 g GM₁ erhalten wurden.

Beispiel 2

In 400 ml Wasser wurden 800 mg Ammoniumsalz (Reinheit: 99% oder höher) von GD_1a gelöst. Der pH der entstandenen Lösung betrug 6,17. Die Lösung wurde 5 Stunden auf 100°C erhitzt. Als Ergebnis einer Analyse des Reaktionsgemisches zeigte sich, daß GM₁ in einer Menge von 66% seiner stöchiometrischen Menge gebildet worden war. Die Reaktionslösung wurde auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 behandelt, um GM₁ zu isolieren und zu reinigen, wodurch 360 mg GM₁ erhalten wurden (Ausbeute: 54%).

Beispiel 3

1 Gramm des Natriumsalzes eines Gangliosid-Gemisches, das 14% GM₁ enthielt, wurde in 100 ml Wasser gelöst, und die entstandene Lösung wurde über 2 Stunden durch eine Säule strömen gelassen, die mit 10 ml eines Ionenaustauschharzes, "Amberlyst 15 (NH₄⁺-Typ)" bepackt war. Das Harz wurde mit 200 ml Wasser gewaschen. Der Säulenauslauf und die Waschflüssigkeit wurden miteinander kombiniert und dann auf ein Gesamtvolumen von 500 ml verdünnt, um eine wässrige Lösung des Ammoniumsalzes von Gangliosid herzustellen. Diese Lösung besaß einen pH von 6,66.

Die Lösung wurde 8 Stunden bei 80°C erhitzt, und das Reaktionsgemisch wurde analysiert. Als ein Ergebnis wurde gefunden, daß die Menge von GM₁ auf das 3,6-fache ihrer Menge vor der Reaktion angestiegen war. Der pH des Reaktionsgemisches betrug 4,46. Auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 wurde die Reaktionslösung isoliert und gereinigt, wodurch 432 mg GM₁ erhalten wurden.

Beispiel 4

1 Gramm des Natriumsalzes von einem Gangliosid-Gemsich, das 14% GM₁ enthielt, wurde in 400 ml Wasser gelöst, woraufhin Zugabe von verdünnter Chlorwasserstoffsäure folgte, um ihren pH auf etwa 6,5 einzustellen. Es wurde dann Wasser hinzugegeben, um das gesamte Volumen auf 500 ml zu bringen. Die entstandene Lösung, deren pH zu 6,47 bestimmt worden war, wurde 2 Stunden bei 100°C erhitzt. Als ein Ergebnis einer Analyse des Reaktionsgemisches wurde gefunden, daß die Menge an GM₁ auf das 4,0-fache der Menge vor der Reaktion angestiegen war. Der pH betrug 5,61. Das Reaktionsgemisch wurde dann auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 behandelt, wodurch 450 mg GM₁ erhalten wurden.

Beispiel 5

Es wurden auf die gleiche Weise wie in Beispiel 4 Reaktionen durchgeführt, indem Chlorwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Ameisensäure und Essigsäure verwendet wurden. Die entstandenen Reaktionsgemische wurden analysiert. Testergebnisse sind in Tabelle 1 angegeben.

Tabelle 1

Beispiel 6

200 mg des Ammoniumsalzes von GD_1a wurden zu 100 ml Methanol mit einem Wassergehalt von 0,2% hinzugegeben, woraufhin ihre Reaktion bei 100°C über 8 Stunden in einem Autoklaven folgte. Als ein Ergebnis einer Analyse des Reaktionsgemisches wurde gefunden, daß GM₁ in einer Menge von 70% seiner stöchiometrischen Ausbeute gebildet worden war.

Beispiel 7

200 mg des Ammoniumsalzes von GD_1a wurden zu 100 ml Methanol, das 10^-4 Mol Essigsäure enthielt und einen Wassergehalt von 0,2% besaß, hinzugeben, woraufhin ihre Reaktion bei 100°C in einem Autoklaven folgte. Von dem Reaktionsgemisch wurden periodisch Proben entnommen, um die Menge des gebildeten GM₁ in Werten ihrer Anteile (%) zu ihrer stöchiometrischen Ausbeute zu analysieren.

Tabelle 2

Beispiel 8

200 mg des Natriumsalzes von Gangliosid, das 14% GM₁ enthielt, wurden zu einer 6 : 4 : 1-Mischung aus Chloroform, Methanol und Wasser hinzugegeben, die 10^-5 Essigsäure enthielt. Dieses Gemisch wurde bei 100°C 8 Stunden in einem Autoklaven umgesetzt. Als Ergebnis einer Analyse des Reaktionsgemisches wurde gefunden, daß die Menge an GM₁ auf das 4,6-fache ihrer Menge vor der Reaktion erhöht worden war.

Vergleichsbeispiel

200 mg des Ammoniumsalzes von GD_1a wurden in 100 ml 0,01 N Ameisensäure gelöst. Die entstandene Lösung, deren pH 3,13 betrug, wurde 80 Minuten bei 100°C erhitzt. Als ein Ergebnis einer Analyse des Reaktionsgemisches wurde gefunden, daß die Menge des Ausgangsmaterials GD_1a, das noch in dem Reaktionsgemisch verblieben war, in der Größenordnung von Spurenmengen lag und die Menge des gebildeten GM₁ nur 7% ihrer stöchiometrischen Ausbeute betrug. Ein Dünnschicht- Chromatogramm des Reaktionsgemisches wurde veranlaßt, mit dem Resorcinol-Reaktionsmittel eine Farbe zu entwickeln. Es wurden eine Anzahl von Flecken beobachtet, aber die Hauptreaktionsprodukte waren neutrale Glycolipide, die keine Sialsäurereste wie GA₁ aufwiesen.

Nach Beschreibung der Erfindung sieht der Fachmann, daß noch viele Änderungen und Abwandlungen vorgenommen werden können, ohne daß der Grundgedanke oder der Umfang der Erfindung verlassen wird.

Claims (4)

1. Verfahren zur Herstellung von Monosialgangliosid, dadurch gekennzeichnet, daß Gangliosid bei einer Temperatur, die höher als 50°C liegt, in einem flüssigen Medium erhitzt wird, das Wasser enthält.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der pH des flüssigen Mediums von 3,5 bis 7 reicht.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das flüssige Medium einen Alkohol oder Chloroform enthält.

4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das flüssige Medium einen Alkohol oder Chloroform enthält.