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DE3687470T2 - Expression in e.coli von hybridpolypeptiden, die die sequenz des wachstumshormons ausloesenden faktors enthalten. - Google Patents

Expression in e.coli von hybridpolypeptiden, die die sequenz des wachstumshormons ausloesenden faktors enthalten.

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Publication number
DE3687470T2
DE3687470T2 DE8686102447T DE3687470T DE3687470T2 DE 3687470 T2 DE3687470 T2 DE 3687470T2 DE 8686102447 T DE8686102447 T DE 8686102447T DE 3687470 T DE3687470 T DE 3687470T DE 3687470 T2 DE3687470 T2 DE 3687470T2
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
grf
trp
amino acid
trpe
hybrid
Prior art date
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DE8686102447T
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Inventor
Umberto Canosi
Fazio Gabriele De
Silvia Donini
Stefano Villa
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Merck Serono SpA
Original Assignee
Istituto di Ricerca Cesare Serono SpA
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Publication date
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Description

  • Eine Gruppe von Substanzen mit der Bezeichnung Wachstumshormon- Releasing-Faktoren (growth hormone releasing factors (GRF)) wurde jüngst aus dem Pankreastumor eines Acromegalie-Patienten (Guillemin et al, Science 218, 585, 1982; Esch et al, J. Biol. Chem. 258, 1806, 1983) isoliert.
  • Verschiedene GRF-Formen wurden gereinigt, und ihre Aminosäuresequenzen wurden bestimmt. GRF-44 enthält die vollständige Aminosäuresequenz von GRF-40 und ist am carboxylterminalen Ende um vier Aminosäuren verlängert.
  • GRF-40 seinerseits enthält die vollständige Aminosäuresequenz von GRF-37 und ist am carboxylterminalen Ende um drei Aminosäuren verlängert. Von dem Peptid GRF-29 (J. River et al., Nature 300, 276-8, 1982) wurde ebenfalls biologische Aktivität nachgewiesen. Nur das carboxylterminale Ende GRF-44 (Leu) ist amidiert (GRF-NH&sub4;-44). Es wird angenommen, daß GRF-NH&sub4;-44 das reife Hormon ist, und daß GRF-40, 37 und 29 proteolytische Derivate davon sind, obwohl alle der oben erwähnten GRFs biologisch aktiv sind.
  • Es wurde beschrieben, daß die GRFs sowohl auf die Synthese als auch auf die Freisetzung von Wachstumshormonen über die Hirnanhangsdrüse wirken (Brazeau et al, Proc. Natl. Acad. Sci., 79, 7909, 1982; Baringa et al, Nature, 306, 84, 1983).
  • Es wurde vorgeschlagen, daß das aus dem Hypothalamus isolierte GRF-44-Peptid (hhGRF) dem identisch war, das sich von dem Pankreastumor ableitete (hpGRF), und in der Tat wurde Immunreaktivität zwischen hhGRF und Antikörpern gegen hpGRF nachgewiesen. Zusätzlich ergaben beide Peptide das gleiche Profil in der HPLC-Analyse (Bohlen et al, Biochem. Biophys. Res. Commun., 114, 930, 1983). Jüngst wurde gezeigt, daß hpGRF und hhGRF die gleiche Aminosäuresequenz besitzen (Ling et al, proc. Natl. Acad. Sci., 81, 4302, 1984).
  • Die Synthese und Charakterisierung von DNA komplementär zu Messenger-RNA, isoliert aus dem Pankreastumor, der hpGRF erzeugt, zeigten, daß GRF-44 als Präprohormon mit 107-108 Aminosäuren gebildet wird, und sich der GRF von dem Aminosäurerest 32 bis zu dem Aminosäurerest 75 erstreckt (Gubler et al, Proc. Natl. Acad. Sci., 80, 4311, 1983; Mayo et al, Nature, 306, 86, 1983).
  • Das Gly-Arg, das auf die GRF-44-Sequenz folgt, ähnelt einer typischen Amidierungsstelle (Boel et al, The EMBO J. 3, 909, 1984; Bradbury et al, Nature, 298, 686, 1982).
  • Die GRFs können therapeutisch auf den meisten Gebieten, die nun als Kandidaten zur Behandlung durch Wachstumshormon gelten, verwendet werden. Beispiele für solche therapeutische Verwendungen umfassen die Behandlung von Zwergwuchs der Hirnanhangsdrüse, Diabetes durch abnormale Erzeugung von Wachstumshormon, Behandlung von Wunden und schweren Verbrennungen.
  • Die Größe des GRFs in seinen verschiedenen Formen ist so, daß sie dessen Herstellung durch konventionelle Verfahren der Peptidsynthese erlaubt. Verschiedene GRF-Derivate wurden unter dessen nach diesen Verfahren erzeugt und als biologisch aktiv befunden (Murphy et al, Biochem. Biophys. Res. Commun., 112, 469, 1983; Thorner et al, Lancet, Januar 1/8, 24, 1983; Adams et al, Lancet, 14. Mai, 1100, 1983; Rosenthal et al, J. Clin. Endocr. Metab., 57, 677, 1983). Ferner ist es möglich, Peptide, die eine amidierte Carboxylgruppe an der terminalen Aminosäure enthalten, zu synthetisieren. Jedoch ist die Erzeugung von GRF-44 durch chemische Mittel relativ teuer, und die Erzeugung des Peptids durch die rekombinanten DNA-Techniken erscheint geeigneter.
  • Die europäische Patentanmeldung mit der Veröffentlichungs-Nr. 0108387 beschreibt die Herstellung von synthetischen DNA-Molekülen, die verschiedene Formen von GRF, denen ein Methioninkodon vorausgeht, kodieren, was nach Inserierung in einen geeigneten Expressionsvektor die direkte Synthese eines methionylierten GRFs durch einen geeigneten Mikroorganismus erlaubt. Beschrieben wird ein Verfahren, bei dem zwei Serien von Oligodesoxyribonucleotidfragmenten hergestellt werden, die bei Aneinanderfügen in der geeigneten Sequenz zwei doppelsträngige DNA-Moleküle, die die amino- bzw. carboxylterminalen Enden des GRF-Peptids kodieren, ergeben.
  • Die EP-A-0 160 190 beschreibt neue Plasmidvektoren, die das ganze Trp-Regulatorsystem einschließlich Promotor, Operator, Leader und Attenuator enthalten, und Verfahren zur Expression der hybriden Polypeptide in E. coli. Die hybriden Polypeptide können die heterologe Sequenz von Somatostatin enthalten.
  • Die EP-A-0 129 073 betrifft Verfahren und Präparate zur effizienten Erzeugung eines sezernierten Wachstumshormon-Releasing-Faktors. Die Präparate gewährleisten die Transkription der DNA-Sequenz, die den Faktor kodiert, in Phase mit den Signalen zur Sekretion und zum Processing, zur Spaltung an den Processing-Signalen und Entfernung des N-terminalen Polypeptids in Hefe.
  • Die zwei doppelsträngigen DNA-Moleküle werden aneinander legiert und ergeben das gewünschte GRF-Strukturen. Die bevorzugten Expressionsvektoren sind Derivate des Plasmids pBR322, das den PL-Promotor enthält und aus DNA von dem Bakteriophagen Lambda isoliert wurde und die tet®- und amp®-Gene inseriert wurde. Das Vorliegen der zusätzlichen Methioninaminosäure am N-terminalen Ende des GRF-Moleküls eröffnet die Möglichkeit einer unerwünschten immunologischen Reaktion, insbesondere bei längeren Therapien.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft die Erzeugung eines GRFs mittels eines hybriden Polypeptids, das durch die rekombinanten DNA-Techniken erhalten worden ist, und das darin verwendete Material.
  • Das hybride Polypeptid enthält die Aminosäuren 1-323 von TrpE in Sequenz gekoppelt an die Aminosäure Trp und die Aminosäuresequenz von GRF. Ein nicht-amidierter GRF kann durch Reduktion und Carboxyamidomethylierung, spezifische Spaltung des Trp-Rests und anschließende Gelfiltration und Reinigung des GRFs mittels HPLC erhalten werden.
  • Folglich ist es eine Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zur Erzeugung von GRF als hybrides Polypeptid, das durch ein Plasmid kodiert wird und auf der Verwendung des E. coli Trp-Promotors/Operators gefolgt von dem Trp-Leader und Attenuator, der ribosomalen Bindungsstelle des TrpE-Gens, der DNA, die für die ersten zwei Drittel des TrpE-Polypeptids kodiert, einem Trp-Kodon und dem Gen, das das GRF-Peptid kodiert, bereitzustellen.
  • Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung der Synthese des DNA-Moleküls, das den GRF kodiert, dem ein TGG-Kodon für Trp verausgeht und der Nukleotidsequenz, die die Insertion dieses Moleküls in ein Plasmid, das das TrpE-Strukturgen trägt unter Beibehaltung in einem korrekten Leseraster erlaubt.
  • Eine weitere Aufgabe dieser Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur Züchtung des Mikroorganismus, der das erfindungsgemäße Plasmid enthält, um die Synthese einer großen Menge des hybriden TrpE- GRF-Polypeptids zu ermöglichen.
  • Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur Extraktion des hybriden Polypeptids und zur Abtrennung des gewünschten GRF-Peptids daraus durch eine Reihe von Stufen.
  • Diese und andere Aufgaben der vorliegenden Erfindung gehen für einen Fachmann aus der folgenden ausführlichen Beschreibung hervor. Darin bedeuten:
  • Fig. 1 die Nukleotidsequenz des Gens für GRF-44. Das DNA-Molekül wurde chemisch nach dem Festphasenphosphotriesterverfahren unter Verwendung von Dinucleotiden als Baublöcken und Polystyrol als festem Träger synthetisiert. Bgl II, Xbal, BstXI, NarI und BamHI zeigen die Stellen, die von diesen Restriktionsendonucleasen erkannt wurden, an. Stopp bedeutet das Kodon zur Beendigung der Proteinsynthese;
  • Fig. 2 eine Restriktionskarte des Plasmidvektors pSP2, worin die dünne Linie pBR322-DNA bedeutet, die dicke Linie chromosomale DNA aus E. coli, die den Trp-Promotor/Operator, die Trp-Leader-Sequenz (TrpL), das vollständige TrpE-Strukturgen und teilweise das TrpD-Strukturgen (ΔTrpD) trägt, bedeutet, Ap® und Tc® bedeuten Gene, die Ampicillin- bzw. Tetracyclinresistenz verleihen, und "Ori" ist der Replikationsursprung dieses Plasmids;
  • Fig. 3 ein Fließdiagramm, das die Konstruktion des Plasmids pSP2del aus dem Plasmid pSP2 zeigt, worin ΔE das unvollständige TrpE-Strukturgen bedeutet;
  • Fig. 4 ein Fließdiagramm zur Konstruktion des Plasmids pSP19 aus dem Plasmid pSP2del; und
  • Fig. 5 eine schematische Struktur der Aminosäuresequenz des hybriden TrpE-GRF-Polypeptids, das die vollständige Aminosäuresequenz des TrpE-Teils und die ersten fünf Aminosäuren von GRF zeigt. Die vollständige Sequenz von GRF-44 ist in Fig. 1 dargestellt.
  • Wegen des Vorliegens verschiedener Restriktionsenzymschnittstellen auf dem GRF-44-DNA-Molekül ist es möglich, weitere drei Moleküle abzuleiten, die einen weiteren Gesichtspunkt dieser Erfindung ausmachen, d. h. solche, die GRF-40-, GRF-37- und GRF-29-Peptide kodieren.
  • In der Tat kann das DNA-Molekül mit dem Restriktionsenzym NarI abgebaut werden, und das 3'-endständige Fragment kann durch das folgende Oligonucleotid ersetzt werden:
  • um ein DNA-Molekül für GRF-40 zu erzeugen.
  • Das DNA-Molekül für GRF-37 kann wie folgt erhalten werden:
  • a) Die DNA in Fig. 1 wird mit dem Restriktionsenzym BstXI abgebaut, wodurch das folgende 3'-Ende erzeugt wird:
  • b) Der einzelsträngige Schwanz wird mittels S1-Exonuclease entfernt.
  • c) Das folgende Oligonucleotid:
  • wird an das 3'-Ende unter Regeneration des 37sten Kodons angefügt.
  • Durch Abbau des DNA-Moleküls in Fig. 1 mit dem Restriktionsenzym XbaI und durch Ersatz des 3'-ständigen Fragments mit dem folgenden Oligonucleotid:
  • wurde ein DNA-Molekül für GRF-29 erhalten.
  • Die Konstruktion des Plasmids pSP19 und die Herstellung des von dem Plasmid abgeleiteten hybriden Polypeptids TrpE-GRF-44 wurden wie folgt durchgeführt.
    • 1) Konstruktion des Plasmids pSP2
  • Das Plasmid pSP2 wurde, ausgehend von pBR322 (Bolivar et al., Gene, 2, 95-113, 1977) und λED10f (Amstrong et al., Science, 196, 172, 1977 und Helinski et al., in: Recombinant Molecules, Tenth Miles Internationnal Symposium, Raven Press, 1977, S. 151-165), der als Quelle für die E. coli-Trp-Operon-DNA verwendet wurde und der sich von dem Promotor bis zu dem TrpD-Strukturgen erstreckt, konstruiert. pBR322 und λED10f wurden mit den Restriktionsenzymen EcoRI und HindIII abgebaut. Das EcoRI- HindIII-Fragment aus λED10f und mit den regulatorischen Funktionen für das Trp-Operon, das vollständige TrpE-Strukturgen und das 5'-Ende des TrpD-Strukturgens wurden mit dem größeren HindIII-EcoRI-Fragment von pBR322 mittels T4-DNA-Ligase ligasiert. Das Ligasierungsgemisch wurde verwendet, um E. coli W3110 ΔTrp E5/tna2-Zellen (Nichols und Yanofsky, Methods in Enzymology, 101, 155, 1983) zu transformieren. Die transformierten Zellen wurden auf Minimalmediumplatten ohne Tryptophan plattiert. Ein Trp+-Klon wurde als Quelle für die rekombinante DNA des Plasmids pSP2 verwendet. Die Zellen dieses Klons wurden gezüchtet und in reichem Medium (z. B. NB, Difco) unter Zusatz von 50 ug/ml Ampicillin (Ap) gelagert. Die Restriktionskarte von pSP2 ist in Fig. 2 gezeigt, darin trägt das dicke EcoRI-HindIII-Fragment die E. coli-Trp-Funktionen und leitet sich von dem λED10f ab, wohingegen die andere DNA sich von pBR322 ableitet.
    • 2) Konstruktion des Plasmids pSP2del
  • Die DNA des Plasmids pSP2 wurde mit der Endonuclease Bgl II abgebaut, und das größere Fragment wurde mittels Agarosegelelektrophorese gereinigt und in sich mittels T4-DNA-Ligase geschlossen. Das Ligasierungsgemisch wurde zur Transformation von W3110 ΔTrpE5/tna 2-Zellen verwendet. Die Ap®-Transformanten wurden auf Nähragar (Difco), der 50 ug/ml Ap enthielt, ausgewählt. Ein Ap®-Klon wurde als Quelle für pSP2del-DNA, deren Restriktionskarte in Fig. 3 gezeigt ist (siehe Beschreibung der Fig. 2 bezüglich der Einzelheiten) verwendet.
  • Die Entfernung des Bgl II-Fragments aus dem Strukturgen von TrpE verursachte die Expression eines TrpE-Teil-Polypeptids unter Verlust dessen enzymatischer Aktivität. Die das pSP2del tragenden W3110- ΔTrpE Stna 2-Zellen dürfen daher nicht in Gegenwart von Tryptophan gezüchtet werden.
  • Die Verbindung der Bgl II-Schnittstellen in pSP2del erzeugt ein neues Stoppkodon der Proteinsynthese (Nichols et al, J. Mol. Biol. 146, 45-54, 1981).
  • Das von pSP2del abgeleitete Teil-TrpE (ΔTrpE) enthält somit 342 Aminosäuren gegen die 520 des gesamten Proteins, das von dem pSP2-Plasmid (vergleiche wieder Fig. 3) kodiert wird.
    • 3) Klonierung des Trp-GRF-44-Gens
  • pSP2del-DNA wurde mit den Restriktionsenzymen Bgl II und BamHI abgebaut, und das größere Fragment wurde mittels Agarosegelelektrophorese gereinigt. Diese DNA wurde mit den synthetischen DNA-Molekülen für Trp- GRF-44 (siehe Fig. 1) gemischt und mit T4-DNA-Ligase behandelt.
  • Fig. 4 zeigt die Konstruktion des Plasmids pSP19 durch Insertion des synthetischen Gens in das pSP2del-Plasmid.
  • TcS zeigt die Tetracyclinsensitivität an.
  • Das Ligasierungsgemisch wurde zur Transformation von W3110 ΔTrpE/ tna2-Zellen verwendet, und Ap®-Klone wurden auf Platten, die 50 ug/ml Ap enthielten, ausgewählt.
  • Ein Ap®-Klon, der sich als gegenüber Tetracyclin sensitiv erwies (TcS) wurde als Quelle für pSP19-DNA verwendet.
  • Die Nucleotidsequenz des Trp-GRF44-Gens erlaubt die Synthese eines hybriden Polypeptids aus Teil-TrpE und GRF44 getrennt durch einen Tryptophanrest. Das Trp ist durch Iodosobenzoesäure, wie im folgenden beschrieben, abbaubar. Das von der DNA des Plasmids pSP19 kodierte Hybrid besitzt die in Fig. 5 gezeigte Aminosäuresequenz und wird üblicherweise als TrpE- GRF bezeichnet.
  • Die ersten 323 Aminosäuren stellen die ersten zwei Drittel von TrpE dar, an die sich ein Trp-Rest und die Aminosäuresequenz von GRF44 anschließen. Der TrpE-GRF besteht daher aus 368 Aminosäuren.
    • Erzeugung des hybriden TrpE-GRF-44-Proteins
  • Zellen des Stammes W3110 ΔTrpE5tna2 (pSP19) wurden über Nacht in 300 ml SMM (Spizizer Minimalmedium), das pro Liter wäßrige Lösung wie folgt zusammengesetzt war, gezüchtet:
  • (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; 2 g
  • KH&sub2;PO&sub4; 6 g
  • K&sub2;HPO&sub4; 14 g
  • Na-Citrat·2H&sub2;O 1 g
  • MgSO&sub4; 0,2 g
  • Nach Sterilisation durch Autoklavieren wurden die folgenden Bestandteile zugesetzt:
  • 10 ml 40%ige Glukose
  • 3,5 ug/ml Indol.
  • Die Kultur (etwa 4,3·10&sup8; Zellen/ml) wurde in 10 l des gleichen Mediums verdünnt, und die Zellen wurden unter Rühren und Belüften mit 1 l Luft bei einem Druck von 1 atm pro Minute gezüchtet.
  • Die Zusammensetzung des Mediums und die Wachstumsbedingungen in einem 10 l Fermentor erwiesen sich als ideal, um das Plasmid pSP19, das den Trp-Promotor trägt, dereprimiert zu halten (was die Expression des TrpE-GRF-Polypeptids ermöglicht) und somit das Wachstum der Zellen zu ermöglichen.
  • Nach 22 bis 25-stündigem Wachstum erreichte die Kultur eine OD von etwa 3,0 bei 590 nm. Die Zellen wurden durch Zentrifugation gewonnen und bei -80ºC gelagert. Eine Probe dieser Zellen wurde verwendet, um den Proteingehalt durch Polyacrylamidgelelektrophorese, die das Vorliegen des gewünschten TrpE-GRF-Polypeptids zeigte, zu analysieren.
    • Reinigung des TrpE-GRF-Polypeptids
  • Die gefrorenen Zellen wurden in dem folgenden Puffer aufgetaut: 0,2 M Tris-HCl, pH 7,6; 0,2 M NaCl; 0,01 M CH&sub3;COOMg; 0;01 M β-Mercaptoethanol und 5 % Glycerin. Die Zellen wurden in Gegenwart von Aluminiumoxid vermahlen, und die Zelltrümmer wurden durch Zentrifugation entfernt.
  • Die wäßrige Phase wurde viermal mit H&sub2;O verdünnt, und das Hybridprotein wurde durch Zugabe von 144 g (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; pro Liter Endlösung ausgefällt.
  • Die ausgefällten Proteine wurden durch Zentrifugation pelletisiert, in Wasser aufgelöst und extensiv gegen 10 mM NH&sub4;HCO&sub3; dialysiert.
  • Das Dialysat wurde dann mittels PAGE analysiert und lyophilisiert.
    • Abtrennung von GRF-44 aus dem hybriden TrpE-GRF-Polypeptid
  • Das TrpE-GRF-Polypeptid wurde einer Reihe von chemischen Reaktionen, die im folgenden beschrieben sind, unterworfen, um eine Abtrennung des GRF-Peptidrests zu ermöglichen.
    • 1) Reduktion und Carboxyamidomethylierung der Cys-Reste
  • Die Bedingungen zur Reduktion und Carboxyamidomethylierung wurden aus einem Manuskript von G. Allen: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Band 9, S. 28, verlegt von T.S. Work und R.H. Burdon, Elsevier, 1981, entnommen. Das zuvor hergestellte und lyophilisierte TrpE-GRF-Polypeptid wurde in dem folgenden Puffer aufgelöst: Tris- HCl 0,5 M; EDTA 01%; Guanidin-HCl 6 M, pH 8,5.
  • Die Endkonzentration an Protein betrug 2%. DTT wurde dann in einer Konzentration von dem 15-fachen des Cys-Gehalts in dem Protein zugesetzt.
  • Das Gemisch wurde dann 2 h bei 50ºC inkubiert, und Iodacetamid wurde in der doppelten DTT-Konzentration zugesetzt. Nach 30-minütiger Inkubation im Dunkeln bei Raumtemperatur wurde die Reaktion durch Zugabe von β-Mercaptoethanol unterbrochen.
  • Das Reaktionsgemisch wurde dann 2 h gegen Wasser und über Nacht gegen 10 mM NH&sub4;HCO&sub3; dialysiert. Dieses Material, das das carboxyamidomethylierte TrpE-GRF-Polypeptid enthielt, wurde dann lyophilisiert.
    • 2) Reaktion mit Iodosobenzoesäure
  • Das verwendete Verfahren entsprach im wesentlichen dem von A. Fontana et al.: Biochemistry 20, 6997, 1981 beschriebenen Verfahren. 5 mg Iodosobenzoesäure wurden in 375 ul 4 M Guanidin-HCl, 80% Essigsäure, aufgelöst. Dieser Lösung wurden 7,5 ul p-Cresol zugesetzt, und dann wurden 5 mg carboxyamidomethylierter TrpE-GRF aufgelöst.
  • Die Reaktion ließ man 20 h im Dunkeln bei Raumtemperatur ablaufen. 750 ul Wasser wurden dann zugesetzt, und nach 10 min wurde das Gemisch 5 min bei 12000 G zentrifugiert. Die wäßrige Phase enthielt Peptide, darunter auch GRF-44.
    • 3) Reinigung von GRF-44
  • Die vorstehend erhaltene, wäßrige Lösung wurde mittels Gelfiltration durch eine 1·50 cm Sephadex G-25-Säule, die gegen 5%ige Essigsäure equilibriert worden war, entsalzt. Die Flußrate betrug etwa 3 ml/h. Das ausgeschlossene Material wurde gewonnen, und sein Volumen durch Eindampfen verringert. Die so erhaltene, konzentrierte Lösung wurde mittels HPLC unter Verwendung einer C18-Säule, die mit 10 mM H&sub3;PO&sub4;, das mit Et&sub3;N auf pH 3,5 gebracht worden war, equilibriert worden war, analysiert.
  • Die Peptide wurden mit Acetonitril eluiert und in Fraktionen, die dann anschließend mittels RIA analysiert wurden, gewonnen.
  • Die Ergebnisse zeigten das Vorliegen von Immunaktivität in dem Haupt-Peak.
  • Die hybriden Polypeptide TrpE-GRF40, TrpE-GRF37 und TrpE-GRF29 und die entsprechenden Peptide GRF40, GRF37 und GRF29 können mittels Verfahren, die denen für die Erzeugung von TrpE-GRF44 und GRF44, wie oben beschrieben, analog sind, erhalten werden.
  • W3110 ΔTrpE5 tna 2-Zellen, die die hier beschriebenen Plasmide enthalten, wurden bei der ATCC unter den folgenden Hinterlegungsnummern hinterlegt:
  • W3110 ΔTrpE5 tna 2 (pSP2) ATCC Nr. 53056
  • W3110 ΔTrpE5 tna 2 (pSP2-del) ATCC Nr. 53058
  • W3110 ΔTrpE5 tna 2 (pSP19) ATCC Nr. 53054
    • Expression von hybriden Polypeptiden, die die Sequenz für den Releasing- Faktor des Wachstumshormons enthalten, in E. coli ZUSAMMENFASSUNG
  • Beschrieben werden neue Plasmidvektoren, die das vollständige Trp- Regulon einschließlich Promotor, Operator, Leader und Attenuator enthalten, sowie Verfahren zur Expression der hybriden Polypeptide in E. coli.
  • Die hybriden Polypeptide enthalten die heterologe Sequenz von GRF-44, 40, 37 oder 29.

Claims (20)

1. Trp-GRF-kodierendes Strukturgen, worin dem ersten N- terminalen Tyrosinkodon unmittelbar ein Trp-Kodon vorausgeht.
2. Hybridgen, umfassend eine DNA-Sequenz, die eine dem TrpE homologe Aminosäuresequenz kodiert, fusioniert im Leseraster an das Gen nach Anspruch I.
3. Hybridgen nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die dem TrpE homologe Aminosäuresequenz die Aminosäuren 1 bis 323 von TrpE enthält.
4. Hybridgen nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß der GRF aus GRF-44, GRF-40, GRF-37 und GRF-29 ausgewählt ist.
5. Hybridgen nach einem der Ansprüche 1 bis 4, funktionell gebunden an eine DNA-Sequenz, die die mikrobielle Expression des Strukturgens bewirken kann.
6. Replizierbares, mikrobielles Expressionsvehikel, enthaltend ein Hybridgen nach Anspruch 5.
7. Replizierbares, mikrobielles Expressionsvehikel nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet daß das Vehikel ein Plasmid ist.
8. Mikroorganismus, transformiert mit den Expressionsvehikeln nach den Ansprüchen 6 oder 7.
9. Mikroorganismus nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß er ein E. coli-Stamm ist.
10. Verfahren zur Herstellung eines hybriden Polypeptids, umfassend einen Trp-GRF, worin der ersten N-terminalen Aminosäure Tyr unmittelbar die Aminosäure Trp vorausgeht, dadurch gekennzeichnet, daß ein Mikroorganismus nach einem der Ansprüche 8 bis 9 in einem geeigneten Kulturmedium gezüchtet wird.
11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Expressionsvehikel ein hybrides Gen nach einem der Ansprüche 3 bis 5 enthält und die Mikroorganismen in Gegenwart einer Indolkonzentration, die ausreichend ist, um die Zellen wachsen zu lassen und auch um das Trp-Operon dereprimiert zu halten, gezüchtet werden.
12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gek e n n zeichnet ' daß die Zellen unter Belüftung mit einem Luftvolumen, das ausreichend ist, um Indol teilweise zu inaktivieren, gezüchtet werden.
13. Verfahren zur Gewinnung von GRF aus einem hybriden Polypeptid, das ein Trp-GRF, worin der ersten N-terminalen Aminosäure Tyr unmittelbar die Aminosäure Trp vorausgeht, enthält, dadurch gekennzeichnet daß der Trp-Rest, der an die GRF-Aminosäuresequenz angefügt ist, abgespalten wird.
14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Spaltung durch Behandlung mit Iodosobenzoesäure durchgeführt wird.
15. Verfahren nach Anspruch 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, daß irgendwelche Cys-Reste, die -in dem hybriden Polypeptid vorhanden sind, vor der Trp- Spaltung reduziert und carboxymethyliert werden.
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß der GRF aus GRF 44, 40, 37 und 29 ausgewählt wird.
17. Hybrides Polypeptid, enthaltend einen Trp-GRF, worin der ersten N-terminalen Aminosäure Tyr unmittelbar die Aminosäure Trp vorausgeht.
18. Hybrides Polypeptid nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß der Trp-GRF-Sequenz eine dem TrpE homologe Aminosäuresequenz vorausgeht.
19. Hybrides Polypeptid nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß die dem TrpE homologe Aminosäuresequenz 1 bis 323 von TrpE ist.
20. Hybrides Polypeptid nach einem der Ansprüche 17 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß die GRF- Sequenz aus GRF 44, 40, 37 und 29 ausgewählt ist.
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