DE3751081T2 - [Leu 13] Motilin, dessen kodierende DNS-Moleküle und Verfahren zu dessen Herstellung. - Google Patents
[Leu 13] Motilin, dessen kodierende DNS-Moleküle und Verfahren zu dessen Herstellung.Info
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Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft ein neuartiges Peptid, wobei es sich um ein Motilin-Analogon handelt, das Leucin (Leu) anstelle von Methionin (Met), der 13. Aminosäure von Motilin, aufweist, DNA-Moleküle, welche für dieses Peptid kodieren&sub1; rekombinante DNA-Moleküle, welche diese DNAS enthalten und Verfahren zu deren Herstellung.
- Das neue Peptid (im folgenden bezeichnet als [Leu¹³]-Motilin) gemäß vorliegender Erfindung besitzt vergleichbare Aktivität zu natürlich vorkommendem Motilin und somit kann dessen Brauchbarkeit als Medikament erwartet werden.
- Motilin ist ein physiologisch aktives Peptid, das im Blut von Säugetieren zu finden ist. Es ist bekannt, daß es die Fähigkeit besitzt, die Peristaltik des Intestinums zu aktivieren (W. Y. Chey und K. Y. Lee, Clinics in Gastroenterology, 3, 645 (1980)). Laparotomisierte Patienten zeigen eine verringerte Motilinkonzentration im Blut. Es ist bekannt, daß die Rückkehr der postoperativen Blutmotilinkonzentrationen auf einen normalen Wert im Zusammenhang steht mit der Wiederherstellung der peristaltischen Bewegung des Intestinums dieser Patienten und daß die postoperative Verabreichung von Motilin zu einer aktivierten Peristaltik des Intestinums führt.
- Natürliches Motilin kann man durch Extraktion aus tierischen Organen, jedoch nur in unzureichenden Mengen erhalten. Deshalb ist das derzeit verwendete Motilin überwiegend ein Produkt chemischer Peptidsynthese. Dieses chemische Produkt ist jedoch zwangsläufig teuer, da Motilin eine relativ lange Peptidkette aus 22 Aminosäureresten darstellt. Es ist daher wünschenswert, daß eine Substanz mit Motilinaktivität zu geringen Kosten und in großen Mengen bereitgestellt wird.
- Die 13. Aminosäure von Motilin ist Met, die leicht oxidierbar ist. Eine Oxidation von Met in die Sulfoxidform führt zu einer verringerten Motilinaktivität (M. Fujino et al., Chem. Pharm. Bull., 26, 101 (1978)).
- In Strunz, U. et al (1976) Scand. J. Gastroenterol. 11:199- 203 sind synthetische Motilinanaloga offenbart. Insbesondere ist ein Polypeptid mit der Bezeichnung 13-Leu-M offenbart, das in Position 13 den Aminosäurerest Leucin trägt. In Position 14 des Polypeptids ist die Aminosäure Glutaminsäure (Glu) zu finden.
- In der DE-B-25 44 348 sind synthetisches L-Leucin-13-Motilin, ein Verfahren zu dessen Herstellung und pharmazeutische Zusammensetzungen, welche diese Verbindungen enthalten, offenbart. Der Aminosäurerest in Position 14 dieses Motilin-Analogons ist Glutaminsäure (Glu). In diesem Dokument wird außerdem angegeben, daß die Amidgruppe in der Seitenkette von 14-Glutaminsäure keinen Einfluß auf die biologische Aktiviät besitzt.
- In Schubert, H. und J.C. Brown (1973) Can. J. Biochem. 52:7- 8 wird beschrieben, daß die Aminosäure in Position 14 von porcinem Motilin Glutamin (Gln) ist.
- Auf der Suche nach einer Methode zur Verhinderung des Motilin-Aktivitätsverlustes wurde erfindungsgemäß festgestellt, daß ein Peptid, das daraus resultiert, daß man in Motilin die 13. Aminosäure Met durch Leu ersetzt, nämlich [Leu¹³]-Motilin, eine zu Motilin vergleichbare Aktivität aufweist, jedoch keinen Aktivitätsverlust durch Oxidation erleidet.
- Auf der Suche nach einem Verfahren zur Herstellung von [Leu¹³]-Motilin bei geringen Kosten und in großer Ausbeute konnten die Erfinder zeigen, daß [Leu¹³]-Motilin mit Hilfe von Genrekombinationstechniken hergestellt werden kann.
- Es wird allgemein angenommen, daß die großtechnische Produktion kleiner Peptidmoleküle unter Verwendung von Genetic Engineering-Techniken im allgemeinen schwierig ist. Dies ist angeblich deshalb so, weil kleine Peptidmoleküle, die in Wirtszellen, wie zum Beispiel mikrobiellen Zellen, produziert werden unter der Einwirkung von Enzymen in diesen Zellen leicht abgebaut werden können. Um einen derartigen Abbau zu verhindern wurde ein Verfahren beschrieben, wobei das gewünschte Peptid in Form eines hochmolekularen Fusionsproteins produziert wird, das aus der Fusion des gewünschten Peptids mit einem anderen Protein resultiert, und wobei man anschließend das Fusionsprotein entweder enzymatisch oder chemisch abbaut, um das gewünschte Peptid zu erhalten (T. Mikuni et al., Seikagaku, 57, 854 (1985) und T. Saito et al., J. Biochem., 102, 111 (1987)).
- Die Ausbeute an gewünschtein Peptid, die mit Hilfe des obigen Verfahrens erhältlich ist, ist jedoch gering, da das auf diese Weise produzierte Fusionsprotein nur einen geringen prozentualen Anteil an gewünschtem Peptid enthält.
- Es wurde ein weiteres Verfahren vorgeschlagen, wobei man das für das gewünschte Peptid kodierende Gen seriell anordnet, wodurch man ein polymeres Peptid produziert und man anschließend das polymere Peptid enzymatisch oder chemisch abbaut, um das gewünschte inonomere Peptid zu erhalten.
- Es wurde berichtet, daß menschliches Proinsulin in polymerer Form in Escherichia coli stabiler vorliegen kann als in monomerer Form (S. -H. Shen, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 4627 (1984)). Gemäß diesem Stand der Technik wurden jedoch keine Versuche unternommen, um das polymere Peptid zum gewünschten natürlich vorkommenden monomeren Peptid umzuwandeln.
- Das oben beschriebene Verfahren wurde angewendet um die Substanz P (T. Kempe et al., Gene, 39, 239 (1985)) und den Wachstumshormon-freisetzenden Faktor (T. Kempe et al., Biotechnologv, 4, 565 (1986)) zu produzieren. In diesen Fällen weisen jedoch die monomeren Peptide, die man durch Abbau der produzierten polymeren Peptide erhält, eine andere Struktur als das gewünschte natürlich vorkommende Peptid auf.
- Erfindungsgemäß wurde nun festgestellt, daß das neuartige erfindungsgemäße Peptid aus polymerer Form hergestellt werden kann, indem man eine Vielzahl verschiedener oder identischer Gene, wovon jedes für das Peptid kodiert, in Serie in einen Vektor insertiert, die resultierende rekombinante DNA in Escherichia coli einführt und den resultierenden Transformanden aktiviert und anschließend das polymere Peptid unter Bildung des gewünschten Peptids spaltet.
- In den beigefügten Zeichnungen zeigt,
- Fig. 1 das Konstruktionsschema für Plasmid pMTA1;
- Fig. 2 das Konstruktionsschema für das Plasmid pMTA2, worin Bg, Bam und P die Erkennungsstellen für BglII, BamHI bzw. PstI angeben und MT ein [Leu¹³]-Motilin-Gen bezeichnet (im folgenden sollen die gleichen Bezeichnungen verwendet werden);
- Fig. 3 das Konstruktionsschema für das Plasmid pMTA4;
- Fig. 4 das Konstruktionsschema für das Plasmid pMTK4, worin SGH das Lachs-Wachstumshormongen bezeichnet (im folgenden soll die gleiche Bezeichnung verwendet werden);
- Fig. 5 das Konstruktionsschema für das Plasmid pMTL4, worin Tlpp den Lipoproteinterminator und Trp den Tryptophanpromotor bezeichnen;
- Fig. 6 das Konstruktionsschema für das Plasmid pMTN4;
- Fig. 7 das Konstruktionsschema für das Plasmid pMTM4;
- Fig. 8 das Konstruktionsschema für das Plasmid pMTO4;
- Fig. 9 das Konstruktionsschema für das Plasmid pMTOI4;
- Fig. 10 das Konstruktionsschema für das Plasinid pMTOII4;
- Fig. 11 das Konstruktionsschema für das Plasmid pMTOIII4;
- Fig. 12 das Konstruktionsschema für das Plasmid pTrS20;
- Fig. 13 das Konstruktionsschema für das Plasmid pGHD7;
- Fig. 14 das Konstruktionsschema für das Plasmid pArg4;
- Fig. 15 das Konstruktionsschema für das Plasmid pGEL10;
- Fig. 16 das Konstruktionsscheina für das Plasmid psGHIMl; und
- Fig. 17 die Intestinum-kontraktierende Aktivität von [Met¹³]- Motilin und von [Leu¹³]-Motilin, wobei O für [Leu¹³]-Motilin und für [Met¹³]-Motilin steht.
- Durch die vorliegende Erfindung wird ein neues Peptid ([Leu¹³]-Motilin) bereitgestellt, das eine Aminosäuresequenz gemäß folgender Formel aufweist: Formel
- worin die angegebenen Symbole für die folgenden Aminosäurereste stehen: Phe, Phenylalanin; Val, Valin; Pro, Prolin; Ile, Isoleucin; Thr, Threonin; Tyr, Tyrosin; Gly, Glycin; Glu, Glutaminsäure; Leu, Leucin; Gln, Glutamin; Arg, Arginin; Lys, Lysin; und Asn, Asparagin (im folgenden sollen die gleichen Bezeichnungen für die gesamte Beschreibung und die beiliegenden Ansprüche gelten).
- [Leu¹³]-Motilin kann mit Hilfe der Festphasenmethode für die Peptidsynthese (G. Barang et al., "The Peptide; Analysis, Synthesis, Biology" (herausgegeben von E. Gross und J. Meienhofen), Band 2, S. 1, Academic Press (1982)) unter Verwendung eines automatischen Peptidsynthesegeräts (z.B. Beckman Modell 990B) hergestellt werden.
- [Leu¹³]-Motilin kann auch unter Verwendung von Genetic Engineering-Techniken in folgender Weise hergestellt werden:
- Zunächst werden DNA Moleküle, die durch folgende Formeln (Formeln 3-6) definiert sind, chemisch synthetisiert: Formel
- In den obigen Formeln und im folgenden Teil stehen A, T, G und C für die Basen Adenin, Thymin, Guanin bzw. Cytosin in den Nucleotiden.
- Diese DNAS werden durch Festphasensynthese unter Anwendung der Phosphoramiditmethode mit Hilfe eines automatischen DNA- Synthesegeräts hergestellt.
- Das doppelsträngige DNA-Fragment, das aus der DNA gemäß Formel 3 (im folgenden DNA 3) und aus der DNA der Formel 4 (im folgenden DNA 4) gebildet wird und diejenige, die aus der DNA der Formel 5 (im folgenden DNA 5) und der DNA der Formel 6 (im folgenden DNA 6) gebildet wird, werden mit Hilfe von Ligase miteinander verbunden. Auf diese Weise wird eine doppelsträngige DNA der folgenden Formel (im folgenden bezeichnet als "Gen 2" konstruiert. Formel
- worin die zu den Symbolen ClaI, BGlII, BamHI und SacI hinführenden Linien die Schnittstellen für die durch die jeweiligen Symbole dargestellten Restriktionsenzyme angeben.
- Dieses Gen 2 besitzt eine Basensequenz, die für ein Peptid aus 30 Aminosäuren kodiert, wobei Asparaginsäure (Asp)-Glutamin (Gln)-Isoleucin (Ile)-Phenylalanin (Phe)-Methionin (Met) an den Aminoterminus von [Leu¹³]-Motilin und Arginin (Arg)-Isoleucin (Ile)-Leucin (Leu) an den Carboxyterminus gebunden sind. Die DNA- Segmente, die für die an den Aminoterminus und an den Carboxyterminus von [Leu¹³]-Motilin gebundenen Aminosäuren kodieren, enthalten Erkennungsstellen für die Restriktionsenzyme BglII und BamHI. Diese Stellen werden für die Konstruktion von Genen verwendet, die für [Leu¹³]-Motilin-Polymere kodieren. Gen 2 wurde so konstruiert, daß zwei benachbarte [Leu¹³]-Motilin-Monomere in den Polymeren, die auf Basis dieser Gene produziert werden, miteinander über ein Peptid (Spacerpeptid) verbunden sind, das aus 4 Aminosäuren, nämlich Arg-Ile-Phe-Met, zusammengesetzt ist. Dieses Spacerpeptid kann entfernt werden, indem man nacheinander mit Cyanogenbromid, Carboxypeptidase A und Carboxypeptidase B behandelt, wobei man monomeres [Leu¹³]-Motilin erhält. An beiden Enden des Gens 2 sind Erkennungsstellen für die Restriktionsenzyme ClaI und SacI zur Einführung in Vektoren angeordnet. Die in Gen 2 verwendeten Kodons sind überwiegend solche Kodons, die mit großer Häufigkeit in Genen gefunden werden, die für Proteine kodieren, die in großen Mengen in Escherichia coli herstellbar sind (M. Goug et al., Nucleic Acids Res., 10, 7055 (1982))
- Gen 2 wird dadurch synthetisiert, daß man das doppelsträngige DNA-Fragment aus DNA 3 und DNA 4 mit dem doppelstängigen DNA- Fragment aus DNA 5 und DNA 6 mit Hilfe von Ligase verbindet. Für einen effizienten Verlauf dieser Ligationsreaktion wurde Gen 2 so ausgebildet, daß identische Sequenzen oberhalb einer bestimmten Länge in der Basensequenz von Gen 2 nicht enthalten sind.
- Das Plasmid pTrS20 (hergestellt gemäß dem Verfahren von Referenzbeispiel 1) wird mit den Restriktionsenzymen ClaI und SacI geschnitten und ein größeres DNA-Fragment (im folgenden bezeichnet als DNA 7) wird isoliert. DNA 7 wird mit dem Gen aus Schritt 1 unter Verwendung von Ligase verbunden, wobei das Plasmid pMTAL gebildet wird.
- Das Plasmid pMTAL wird mit den Restriktionsenzymen PstI und BglII geschnitten und ein DNA-Fragment, das das [Leu¹³]-Motilin- Gen enthält (im folgenden DNA 8) wird isoliert. Getrennt davon wird pMTA1 mit PstI und BamHI geschnitten und ein DNA-Fragment, das das [Leu¹³]-Motilin-Gen enthält (im folgenden DNA 9) wird isoliert. Durch Ligation von DNA 8 mit DNA 9 unter Verwendung von Ligase erhält man das Plasmid pMTA2, das zwei [Leu¹³]-Motilin-Gene enthält. Die aus der Behandlung mit den Restriktionsenzymen BglII und BamHI resultierenden Spaltungsenden sind identisch und können deshalb miteinander verbunden werden. Die Ligationsstelle (gekennzeichnet durch Bg/Bam in Fig. 2) wird jedoch von keinem dieser Restriktionsenzyme geschnitten, da sie nunmehr eine andere Basensequenz als die Erkennungsstellen der beiden Restriktionsenzyme aufweist.
- Konstruktion eines Plasmids das vier [Leu¹³]-Motilin-Gene enthält:
- pMTA 2 wird mit PstI und BglII geschnitten. Da wie oben erwähnt, die Bg/Bam-Stelle nicht geschnitten wird, erhält man ein DNA-Fragment, das zwei [Leu¹³]-Motilin-Gene enthält. Getrennt davon spaltet man pMTA2 mit PstI und BamHI, wobei man ein DNA- Fragment erhält, das zwei [Leu¹³]-Motilin-Gene in ähnlicher Weise enthält. Durch Vereinigung beider DNA-Fragmente mit Ligase erhält man pMTA4, das vier [Leu¹³]-Motilin-Gene enthält.
- Die Plasmide pMTA8, pMTA16 und pMTA32, die acht, sechzehn bzw. zweiunddreißig [Leu¹³]-Motilin-Gene enthalten, können in gleicher Weise wie für die Konstruktion von pMTA4 aus pNTA2 beschrieben, hergestellt werden. Im folgenden werden diese Plasmide allgemein als "pMTAS" bezeichnet.
- Das Plasmid pSGHIM1 (hergestellt gemäß dem Verfahren von Referenzbeispiel 2), das für die Expression des Lachs-Wachstumshormon (SGSH)-Gens brauchbar ist, wird mit den Restriktionsenzymen BglII und SacI geschnitten und ein größeres DNA-Fragment (im folgenden DNA 10) wird isoliert. Getrennt davon wird Plasmid pMTA4 mit BglII und SacI geschnitten und ein DNA-Fragment, das vier [Leu¹³]-Motilin-Gene enthält (im folgenden DNA 11) wird isoliert. Durch Vereinigung von DNA 10 und DNA 11 unter Verwendung von Ligase erhält man das Expressionsplasmid pMTK4.
- Unter Verwendung von pMTA8 oder pMTA 16 anstelle von pMTA4 und mit Hilfe obiger Verfahrensweise erhält man die Expressionsplasmide pMTKB oder pMTKL6, die acht bzw. sechzehn [Leu¹³]-Motilin-Gene enthalten. Diese Plasmide werden im folgenden allgemein als "pMTKs" bezeichnet.
- Einführung eines Terminators in das Expressionsplasmid: Das Plasmid pSGHIMl wird mit den Restriktionsenzymen PstI und BamHI geschnitten und ein Promotor-enthaltendes DNA-Fragment wird isoliert. Getrennt davon wird Plasmid pGHD7 (Referenzbeispiel 4) mit PstI und BamHI geschnitten, wobei man ein Terminator-enthaltendes DNA-Fragment erhält. Durch Vereinigung beider DNA-Fragmente mit Hilfe von Ligase wird das Plasmid pSGHIME1 konstruiert, das keine Erkennungsstellen für das Restriktionsenzym BglII, jedoch eine MluI-Erkennungsstelle stromabwärts vom Terminator aufweist.
- Das größere DNA Fragment, das man durch Schneiden von pSGHIME1 mit BglII und SacI erhält, wird mit dem [Leu¹³]-Motilin enthaltenden DNA-Fragment ligiert, welches man durch Schneiden von pMTL4 mit BQLII und SacI erhält. Die Ligation erfolgt in Gegenwart von Ligase, wobei man das Plasmid pMTL4 erhält, das vier [Leu¹³]-Motilin-Gene enthält. Unter Verwendung von pMTKB oder pMTKL6 anstelle von pMTA4 und Befolgung des obigen Verfahrens erhält man das Plasmid pMTL8 oder pMTLL6, das acht bzw. sechzehn [Leu¹³]-Motilin-Gene enthält. Im folgenden werden diese allgemein als "pMTLs" bezeichnet.
- Die Plasmide pMTKs und pMTLs enthalten jeweils ein Gen, das stromabwärts vom Tryptophan-Promotor angeordnet ist und für die 104 Aminosäuren (vom Aminoterminus) des Lachs-Wachstumshormons kodiert. Stromabwärts dieses Gens ist ein Gen angeordnet, das das [Leu¹³]-Motilin-Gen enthält. Darüber hinaus ist der Terminator für das Lipoproteingen stromabwärts vom letzten [Leu¹³]-Motilin-Gen eingeführt. Der Unterschied zwischen den pMTK-Plasmiden und den pMTL-Plasmiden liegt darin, daß die pMTKs eine Erkennungsstelle für das Restriktionsenzym BglII stromabwärts vom Terminator aufweisen, während die pMTLs keine derartige Stelle aufweisen.
- Die [Leu¹³]-Motilin-Gen-Expressionsplasmide pMTKs und pMTLs werden jeweils in Escherichia coli eingeführt. Die Transformanden produzieren ein Fusionsprotein, bestehend aus einem [Leu¹³]-Motilin-Tetramer, -Octamer oder -Hexadecamer und dem Lachs-Wachstumshormon. Die auf diese Weise produzierten Fusionsproteine sind als Granula in den Escherichia coli-Zellen zu beobachten. Die Produktion der Fusionsproteine mit dem [Leu¹³]-Motilin-Gen-Tetramer ist am höchsten und entspricht etwa 10 % der Gesamtmenge der zellproteine. Der Gehalt an [Leu¹³]-Motilin in den Granula beträgt 42 % für pMTL4, 56 % für pMTL8 und 68 % für pMTL16.
- Das obige Verfahren unter Verwendung der Plasmide pMTK und pMTL ergibt [Leu¹³]-Motilin in Form des gewünschten Peptids, verbunden mit dem Proteinanteil des Lachs-Wachstumshormons, umfassend 104 Aminosäuren. Es ist wünschenswert, daß dieser Lachs- Wachstumshormon-Anteil so klein wie möglich ist. Ein Plasmid mit einem kleineren Teil des Lachs-Wachstumshormons kann in der im folgenden beschriebenen Weise konstruiert werden, um die Produktion von [Leu¹³]-Motilin zu steigern.
- Ein Deoxyoligonucleotid der im folgenden angegebenen Formel (Formel 13) (im folgenden DNA 13) und ein Deoxyoligonucleotid der folgenden Formel (Formel 14) (im folgenden DNA 14) werden chemisch synthetisiert. Die Synthese erfolgt durch Festphasensynthese über die Phosphoramiditmethode unter Verwendung eines automatisierten DNA-Synthesegeräts. Formel
- Die beiden DNAs werden mit einem Linker der im folgenden angegebenen Formel (Formel 12) vermischt. Formel
- Der Linker 12 enthält ein Gen, das für das Lachs-Wachstumshormon von der aminoterminalen Aminosäure bis zur 8. Aminosäure kodiert, wobei auf beiden Seiten des Gens die gleichen kohäsiven Enden vorliegen, die durch die Restriktionsenzyme HindIII und BglII produziert werden.
- Das Plasmid pMTL4, das vier [Leu¹³]-Motilin-Gene enthält, wird mit den Restriktionsenzymen PstI und BglII geschnitten und es wird ein [Leu¹³]-Motilin-Gen-enthaltendes DNA-Fragment (im folgenden DNA 15) isoliert. Getrennt davon schneidet man pMTL4 mit den Restriktionsenzymen PstI und HindIII und isoliert ein Promotor-enthaltendes DNA-Fragment (im folgenden DNA 16). DNA 15, DNA 16 und Linker 12 werden mit Hilfe von Ligase miteinander verbunden. Auf diese Weise erhält man Plasmid pMTN4.
- Die Verwendung von pMTL8 anstelle von pMTL4 im Rahmen des obigen Verfahrens führt zur Konstruktion von pMTN8. Die Plasmide pMTN4 und pMTN8 enthalten jeweils ein Gen, das für ein Protein kodiert, bestehend aus dem entsprechenden [Leu¹³]-Motilin-Polymer und den 12 Aminosäuren Met-Ile-Gln-Asn-Gln-Arg-Leu-Phe-Gln-Ile- Phe-Met, die an den Aminoterminus des Polymers gebunden sind. pMTN4 umfaßt vier [Leu¹³]-Motilin-Gene und pMTN8 umfaßt acht [Leu¹³]-Motilin-Gene. Die Plasmide pMTN4 und pMTN8 werden jeweils in Escherichia coli insertiert. Die resultierenden Transformanden produzieren die gewünschten Proteine in annähernd den gleichen Mengen wie die Transformanden, welche die Plasmide pMTK oder pMTL tragen. Jedes der Proteine ist in Form von Granula in den Escherichia coli-Zellen zu beobachten. Der [Leu¹³]-Motilin-Gehalt der Granula beträgt 77-80 % und ist somit sehr viel höher als bei den pMTK- oder pMTL-tragenden Transformanden.
- [Leu¹³]-Notilin kann zwar in großen Mengen dadurch produziert werden, daß man die Plasmide pMTK, pMTL und pMTN in Escherichia coli einführt. [Leu¹³]-Motilin kann jedoch mit sehr viel höheren Ausbeuten produziert werden, indem man einen Teil der Plasmid-DNA in folgender Weise eliminiert.
- Die pMTL-Plasmide weisen stromabwärts von den [Leu¹³]-Motilin-Genen einen Terminator auf. Ein Plasmid, dem die nichttranslationale (untranslatierte) DNA-Region zwischen diesem Terminator und dem letzten [Leu¹³]-Motilin-Gen fehlt, wird konstruiert. Hierbei wird das Plasmid pArg4 (Referenzbeispiel 5) mit den Restriktionsenzymen PstI und BamHI geschnitten und ein Promotorenthaltendes DNA-Fragment wird isoliert. Getrennt davon schneidet man pGHD7 mit PstI und BamHI und isoliert ein Terminator-enthaltendes DNA-Fragment. Beide Fragmente werden unter Verwendung von Ligase miteinander verbunden, wobei das Plasmid pargel konstruiert wird, das keine BglII-Erkennungsstelle stromabwärts vom Terminator aufweist.
- pArgeEl spaltet man mit PstI und EcoRV und isoliert ein Terminator-enthaltendes DNA-Fragment (im folgenden DNA 17).
- Das Plasmid pMTK4 wird mit dem Restriktionsenzym SacI geschnitten und die einzelsträngigen Abschnitte, die den Schnittstellen entsprechen, werden durch Hydrolyse mit DNA-Polymerase I (Klenow Fragment) geglättet. Das DNA-Fragment wird außerdem mit PstI geschnitten und ein [Leu¹³]-Motilin-Gen-enthaltendes DNA- Fragment (im folgenden DNA 18) wird isoliert. Durch Vereinigung von DNA 17 mit DNA 18 unter Verwendung von Ligase erhält man das Plasmid pMTM4.
- Verwendet man pMTL4 anstelle des Plasmids pMTK4 und verfährt in oben beschriebener Weise so erhält man das Plasmid pMTM4.
- Unter Verwendung von pMTL8 anstelle von pMTK4 in obigem Verfahren erhält man das Plasmid pMTM8, das acht [Leu¹³]-Motilin- Gene enthält.
- pMTM8 kann aus pMTM4 in gleicher Weise hergestellt werden, wie pMTA8 aus pMTA4. pMTM4 spaltet man mit den Restriktionsenzymen PstI und BglII und isoliert ein [Leu¹³]-Motilin-Gen-enthaltendes DNA-Fragment. Dieses DNA-Fragment verbindet man in Gegenwart von Ligase mit dem [Leu¹³]-Motilin-Gen-enthaltenden DNA-Fragment, das man durch Spaltung von pMTM4 mit PstI und BamHI erhalten hat, wobei pMTM8 gebildet wird.
- Bei Verwendung von pARG4 anstelle des Plasmids pArgE1 und Anwendung des für die Konstruktion von pMTM4 oder pMTM8 beschriebenen Verfahrens erhält man die Plasmide pMTm4 und pMTm8. Der Unterschied zwischen pMTMs und pMTms liegt darin, daß pMTms eine Erkennungsstelle für das Restriktionsenzym BglII stromabwärts vom Terminator aufweisen, während pMTMs keine derartigen Stellen besitzen.
- Die Plasmide pMTM und pMTm weisen eine Struktur auf, bei der 160 Basenpaare (im folgenden bp) der nichttranslationalen Genregion stromaufwärts vom Terminator aus pMTKs und pMTLs eliminiert wurden.
- Bei Einführung von pMTM4 in Escherichia coli HB101 beträgt der Proteingehalt an [Leu¹³]-Motilin-Polymer 17 % des Gesamtproteingehalts.
- Die pMTN-Plasmide weisen einen Terminator stromabwärts von der [Leu¹³]-Motilin-Genregion auf. Plasmide, aus denen der nichttranslationale Genabschnitt zwischen dem Terminator und dem [Leu¹³]-Motilin-Genabschnitt eliminiert wurde, werden wie folgt konstruiert:
- Das Plasmid pargel wird mit PstI und EcoRV geschnitten und ein Terminator-enthaltendes DNA-Fragment (im folgenden DNA 19) wird isoliert. Das Plasmid pMTN4 schneidet man mit dem Restriktionsenzym SacI und die einzelsträngigen Regionen, die den Schnittstellen entsprechen, werden durch Hydrolyse unter Verwendung von DNA Polymerase I (Klenow Fragment) in gerade Enden umgewandelt. Nach einer weiteren Spaltung mit dem Restriktionsenzym PstI isoliert man ein [Leu¹³]-Motilin-Gen-enthaltendes DNA- Fragment (im folgenden DNA 20). Eine Ligation beider DNA- Fragmente unter Verwendung von Ligase ergibt das Plasmid pMT04.
- pMT08 konstruiert man unter Verwendung von pMTN8 anstelle von pMTN4 und unter Befolgung des obigen Verfahrens. Wie pMTM8 so kann auch pMT08 mit Hilfe des Verfahrens zur Konstruktion von pMTA8 aus pMTA4 hergestellt werden.
- Es wurde eine Reihe von pMTo-Plasmide konstruiert, wobei man in gleicher Weise wie oben beschrieben pArg4 anstelle von pArgE1 verwendet. Die pMTO-Plasmide unterscheiden sich von den pMTo- Plasmiden dadurch, daß letztere eine Erkennungsstelle für das Restriktionsenzym BglII stromabwärts vom Terminator aufweisen, während die erstgenannten Plasmide keine solche Stelle besitzen.
- Die pMTo- und pMTo-Plasmide weisen eine Struktur auf, bei der etwa 160 bp des nichttranslationalen Genabschnitts stromaufwärts vom Terminator aus pMTNs eliminiert wurden. pMT04 wird zur Proteinexpression in Escherichia coli eingeführt. Der Transformand produziert das Protein in gleich großen Mengen wie mit pMTN4. Das Protein ist in Form von Granula in dem Transformanden zu finden. Der [Leu¹³]-Motilin-Gehalt in den Granula beträgt 77 %.
- Das Plasmid pMTO4 enthält zwei Tryptophan-Promotoren, die in Reihe geschaltet sind (Ptrp x 2) und der Abstand zwischen der Shine-Dalgarno (SD)-Sequenz und dem Startkodon (ATG) (SD-ATG) entspricht 10 Basen. Das Plasmid pMT04 schneidet man mit den Restriktionsenzymen HindIII und PstI und isoliert ein [Leu¹³]- Motilin-Gen-enthaltendes DNA-Fragment (im folgenden DNA 21). Getrennt davon schneidet man das Plasmid pKYP10 (Europäische Patentanmeldung, Veröffentlichungsnr. 83069A) mit den Restriktionsenzymen HindIII und PstI und isoliert ein Promotor-enthaltendes DNA-Fragment (im folgenden DNA 22). Die Ligation von DNA 21 mit DNA 22 unter Verwendung von Ligase ergibt das Plasmid pMT0I4 (vgl. Fig. 9). Das Plasmid pMTOI4 enthält einen Tryptophanpromotor (Ptrp) und der SD-ATG-Abstand darin beträgt 14 Basen.
- Das Plasmid pGEL1 (Europäische Patentanmeldung, Veröffentlichungsnr. 166444a; FERM BP-612), das anstelle des Plasmids pKYP10 verwendet wird, wird mit den Restriktionsenzymen HindIII und PstI geschnitten und ein Promotor-enthaltendes DNA-Fragment (im folgenden DNA 23) wird isoliert. DNA 21 (hergestellt aus Plasmid pXTO4 und DNA 23 werden unter Verwendung von Ligase miteinander verbunden, wobei man das Plasmid pMTOII4 erhält (vgl. Fig. 10). Das Plasmid pMTOII4 enthält zwei Promotoren (Ptrp x 2) und der SD-ATG-Abstand beträgt darin 14 Basen.
- Das Plasmid pGHA2 (Europäische Patentanmeldung, Veröffentlichungsnr. 152613A; IGHA2; FERM BP-400), das anstelle des Plasmids pGEL verwendet wird, wird mit den Restriktionsenzymen HindIII und PstI geschnitten und ein Promotor-enthaltendes DNA- Fragment (im folgenden DNA 24) wird isoliert. DNA 21 (hergestellt aus Plasmid pMTO4) und DNA 24 werden unter Verwendung von Ligase miteinander verbunden, wobei man das Plasmid pMTOIII4 erhält (vgl. Fig. 11). Das Plasmid pMTOIII4 enthält einen "let"-Promotor (Plet) und der SD-ATG-Abstand beträgt darin 14 Basen.
- Jedes [Leu¹³]-Motilin-Polymer, das in großem Überfluß mit Hilfe der obigen Genetic Engineering-Techniken produziert wird, häuft sich in Form von Granula in den Bakterienzellen an. Die Zellen werden aufgeschlossen und anschließend einer Zentrifugation unterzogen, wodurch die Granula von den Membrankomponenten und löslichen Fraktionen leicht abgetrennt werden können. Das [Leu¹³]-Motilin-Polymer wird auf diese Weise in guter Ausbeute und hoher Reinheit erhalten. Behandelt man dieses granuläre [Leu¹³]- Motilin-Polymer mit Cyanogenbromid zum Zwecke des Abbaus, so erfolgt eine Spaltung an der Methionin-Stelle im Spacerpeptid, wobei man ein Peptid (Peptid 25) erhält, bestehend aus 26 Aminosäuren, nämlich monomeres [Leu¹³]-Motilin sowie Arg-Ile-Phe-Hse (Methionin wurde zu Homoserin (Hse) infolge des Abbaus umgewandelt) gebunden an das Carboxylende von [Leu¹³]-Motilin. Eine Verdauung dieses Peptids 25 mit Carboxypeptidase A führt zur hydrolytischen Eliminierung von Hse, Phe und Ile in der angegebenen Reihenfolge vom Carboxylende her. Auf diese Weise erhält man ein Peptid (Peptid 26) als einziges Produkt, bestehend aus [Leu¹³]-Motilin und Arg, gebunden an das Carboxylende.
- Die anschließende Verdauung von Peptid 26 mit Carboxypeptidase B eliminiert Arg, wobei man [Leu¹³]-Motilin (Formel 1) als einziges Produkt in hoher Ausbeute erhält. Peptid Formel
- Wie oben erwähnt, führt das erfindungsgemäße Herstellungsverfahren mit Hilfe der Genetic Engineering-Techniken zu [Leu¹³]- Motilin in hoher Ausbeute. Das Herstellungsverfahren gemäß vorliegender Erfindung besteht in der Konstruktion eines Gens, das für ein Peptidpolymer kodiert, bestehend aus einer Vielzahl von Molekülen des gewünschten Peptids, die mit einem Spacerpeptid seriell verbunden sind, das chemisch und enzymatisch eliminierbar ist, und zwischen zwei Molekülen des gewünschten Peptids insertiert ist; der Insertion des Gens in ein Plasmid, das einen wirksamen Promotor und einen Terminator aufweist; der Einführung des resultierenden Plasmids in einen Mikroorganismus, wodurch die Produktion des Peptidpolymers in signifikanter Menge bewirkt wird; der Umwandlung des auf diese Weise erhaltenen Peptidpolymers in das gewünschte monomere Peptid in hoher Ausbeute durch chemische und enzymatische Behandlung; und der Isolierung des gewünschten Peptids.
- Während die Verwendung von Cyanogenbromid, Carboxypeptidase A und Carboxypeptidase B zur Eliminierung des Spacerpeptids hierin konkret offenbart wurde, so sind andere Eliminierungsverfahren anwendbar, mit der Maßgabe, daß die verwendete Methode zu keiner Zersetzung des gewünschten Peptids führt. Beispielsweise führt die Verwendung von Ameisensäure beim chemischen Abbau zur Spaltung der Asp-Pro-Bindung, während Hydroxylamin die Asn-X (worin x für Gly, Leu oder Ala steht)-Bindung spaltet. Bezüglich der enzymatischen Spaltung sei die Verwendung von Enterokinase zur Spaltung der (Asp)n-Lys (n=2 bis 4)-Bindung, die Verwendung von Kollagenase zur Spaltung von Pro-X-Gly-Pro (worin X für einen beliebigen Aminosäurerest steht) und die Verwendung von Kallikrein zur Spaltung der Phe-Arg-Bindung unter anderem erwähnt.
- Das zur Durchführung der Erfindung verwendete Spacerpeptid kann jegliche Struktur aufweisen, die mit Hilfe eines Spaltungs- Verfahrens, das nicht zur Spaltung des gewünschten Peptids führt und unter den oben erwähnten Spaltungsmethoden ausgewählt ist, verwendet werden, mit der Maßgabe, daß das (die) resultierende(n) Spacerpeptidfragment(e) mit Hilfe eines oder mehrerer geeigneter Verfahren eliminiert werden kann (können). Bei Verfahren zur Herstellung von Peptidmonomeren, welche die Produktion von Polymeren, die seriell verbundene Peptidmonomere enthalten, und die Spaltung der Polymere umfassen, ist die Verwendung eines Spacerpeptids im allgemeinen von essentieller Bedeutung. Die Verwendung eines Spacerpeptids ist nur dann nicht erforderlich, wenn ein selektives Verfahren zur Spaltung der Bindung zwischen Aminoterminus und Carboxylterminus des herzustellenden Peptids zur Verfügung steht. In Fällen, wo beispielsweise der Aminoterminus von der Aminosäure Pro gebildet wird und der Carboxylterminus von der Aminosäure Asp gebildet wird, können die Peptidpolymere, in denen die Monomereinheiten über die Bindung Asp-Pro miteinander verbunden sind, durch Behandlung mit Ameisensäure in die monomere Form überführt werden. Peptide, welche eine derartige Struktur aufweisen, sind jedoch sehr selten. Demzufolge sind Spacerpeptide im allgemeinen von essentieller Bedeutung und sind so zu entwerfen, daß sie geschnitten und leicht und in hoher Ausbeute eliminiert werden können.
- Das hierin speziell offenbarte Spacerpeptid besitzt ein breites Anwendungsfeld, da es bei der Produktion sämtlicher Peptide verwendet werden kann, die frei von Methionin sind. Wenn die carboxyterminale Aminosäure des gewünschten Peptids keine basische Aminosäure ist, so kann man das erfindungsgemäße Spacerpeptid verwenden und es kann mit Hilfe des hierin spezifisch offenbarten Verfahrens geschnitten und eliminiert werden. Ist die carboxyterminale Aminosäure des gewünschten Peptids eine basische Aminosäure, wie Lys oder Arg, so ist die basische Aminosäure Arg im erfindungsgemäßen Spacerpeptid nicht erforderlich und die Reaktion zur Spacerpeptid-Eliminierung im Anschluß an die Spaltung mit Cyanogenbromid erfordert lediglich Carboxypeptidase A; Carboxypeptidase B ist demgegenüber nicht erforderlich.
- Das für das erfindungsgemäße Spacerpeptid kodierende Gen weist Erkennungsstellen für die Restriktionsenzyme BglII und BamHI auf und die Brauchbarkeit des Verfahrens, wobei man mit Hilfe dieses Gens eine Reihe von Genen verbindet, die mit Enzymen zur Produktion der gleichen Schnittstellen behandelt wurden, wurde im obigen Teil der Beschreibung bereits veranschaulicht. Indem man eine Anzahl von Genen seriell miteinander verbindet, kann eine Anzahl von Enzymen zusätzlich zu der erfindungsgemäß bevorzugten Kombination aus BglII und BamHI verwendet werden. Das einzige Erfordernis besteht darin- daß die verwendeten Restriktionsenzyme Schnittstellen in der für ein Spacerpeptid kodierenden Basensequenz ergeben, die in bezug auf Spaltung und Eliminierung obige Bedingungen erfüllen.
- Hierin wurde zwar ein Genherstellungsverfahren für Gene beschrieben, die 2n (n=1 bis 5) [Leu¹³]-Motilin-Gene, nämlich 1, 2, 4, 8, 16 und 32 [Leu¹³]-Motilin-Gene, seriell miteinander verbunden, enthalten. Es ist jedoch offensichtlich, daß jede beliebige Anzahl von Genen, die für das erfindungsgemäße Peptid kodieren, miteinander unter Anwendung des hierin beschriebenen Verfahrens ohne Schwierigkeiten verbunden werden können. Obwohl hierin die Produktion von [Leu¹³]-Motilin-Polymeren in Form von Fusionsproteinen beschrieben wurde, die aus der Verbindung der für die Polymere kodierenden Gene mit einem Teil des Gens für das aminoterminale Ende von Lachs-Wachstumshormon oder IFN-γ an einer stromabwärts gelegenen Position resultieren, ist verständlich, daß dieser Teil des Lachs-Wachstumshormon- oder IFN-γ-Gens kein essentielles Element für die Herstellung der gewünschten [Leu¹³]- Motilin-Polymere darstellt.
- Die Basensequenz in der Umgebung des Startkodons ATG eines Gens besitzt großen Einfluß auf die Proteinausbeute. Die Verwendung von Genen, die im Bereich des Startkodons ATG eine Basensequenz aus dem Lachs-Wachstumshormon-Gen aufweisen, von der bekannt ist, daß sie eine hohe Produktivität bewirkt, kann zur Expression der [Leu¹³]-Motilinpolymer-Gene in großer Menge führen. Dieses Verfahren erlaubt auch die starke Expression von Genen anderer Peptidpolymere als den [Leu¹³]-Motilin-Polymeren und besitzt somit in erkennbarer Weise beträchtliche allgemeine Anwendbarkeit über die spezielle Anwendung zur Herstellung von [Leu¹³]- Motilin hinaus.
- Die Reaktionsbedingungen, die bei obigen rekombinanten DNA- Techniken angewendet werden, stimmen mit den herkömmlichen Techniken überein und werden im allgemeinen wie folgt gewählt:
- Die DNA-Verdauungsreaktion mit einem oder mehreren Restriktionsenzymen wird im allgemeinen in einem Reaktionsgemisch durchgeführt, das aus 0,1-20 ug DNA und einem Medium besteht, das 2- 200 mM (vorzugsweise 10-40 mM) Tris-HCl (pH 6,0-9,5, vorzugsweise ph 7,0-8,0), 0-200 mM NaCl oder KCl, 2-30 mM (vorzugsweise 5-10 mM) MgCl&sub2; und 0-20 mM Mercaptoethanol enthält, dem 0,1-100 Einheiten (vorzugsweise 1-3 Einheiten pro Mikrogramm DNA) eines oder mehrerer Restriktionsenzyine zugesetzt sind. Die Reaktion wird bei 20-70ºC (die optimale Temperatur kann in Abhängigkeit von dem oder den verwendeten Restriktionsenzymen variieren) über einen Zeitraum von 15 Minuten bis 24 Stunden durchgeführt.
- Das durch Restriktionsenzymverdau gebildete DNA-Fragment wird beispielsweise unter Anwendung des LGT-Verfahrens oder durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese gereinigt.
- Die Reaktion zur Ligation der DNA-Fragmente wird in einem Reaktionsmedium durchgeführt, das 2-200 mM (vorzugsweise 10-40 mM) Tris-HCl (pH 6,1-9,5, vorzugsweise pH 7,0-8,0), 2-20 mM (vorzugsweise 5-10 mM), MgCI&sub2;, 0,1-10 mM (vorzugsweise 0,5-2,0 mM) ATP und 1-50 mM (vorzugsweise 5-10 mM) Dithiothreitol enthält, wobei 0,3-10 Einheiten T4 DNA-Ligase bei 1-37ºC (vorzugsweise 3-20ºC) über einen Zeitraum von 15 Minuten bis 72 Stunden (vorzugsweise 2-20 Stunden) verwendet werden.
- Die durch die Ligationsreaktion gebildete rekombinante Plasmid-DNA wird in Escherichia coli eingeführt, erforderlichenfalls unter Verwendung der Transformationsmethode von Cohen et al. (S.N. Cohen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)).
- Die DNA-Isolation aus dem Escherichia coli-Stamm, der die rekombinante Plasmid-DNA enthält, wird beispielsweise unter Verwendung der Cäsiumchlorid-Ethidiumbromid-Dichtegradienten Ultrazentrifugationsmethode (D. B. Clewell et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 62, 1159 (1969)) oder mit Hilfe des Verfahrens von Birnboim et al. (H. C. Birnboim et al., Nucleic Acids Res., 7, 1513 (1979)) durchgeführt.
- Die Plasmid-DNA wird mit einem oder mehreren geeigneten Restriktionsenzymen verdaut und auf das Vorliegen eines oder mehrerer Schnittstellen durch Agarose-Gelelektrophorese oder Polyacrylamid-Gelelektrophorese überprüft. Falls erforderlich, wird die Basensequenz der DNA mit Hilfe der Maxam-Gilbert-Methode (Proc. Natl. Acad. Sci., USA 74, 560 (1977)) oder mit Hilfe der Methode von Sanger unter Verwendung des M13 Phagen (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 74, 5463 (1977); Amersham M13 Klonierungs- und Sequenzierungshandbuch) durchgeführt.
- Das erfindungsgemäße Peptid kann in folgender Weise hergestellt werden:
- Man transformiert beispielsweise Escherichia coli K-12 C600 oder HBIOI mit dem Plasmid und selektiert Plasmid-tragende Escherichia coli-Transformanden aus Ampicillin-resistenten Kolonien. Durch Kultivierung der Plasmid-tragenden Escherichia coli-Stämme in einem Medium kann das Peptid in Kultur produziert werden.
- Jedes Medium, entweder synthetisch oder natürlich, kann als Wachstumsmedium verwendet werden, unter der Voraussetzung, daß es für das Wachstum von Escherichia coli und für die Produktion des Peptids geeignet ist.
- Geeignete Kohlenstoffquellen sind unter anderem Fructose, Lactose, Glycerol, Mannitol und Sorbitol. Geeignete Stickstoffquellen sind beispielsweise NH&sub4;Cl, (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;, Casaminosäuren, Hefeextrakt, Polypepton, Fleischextrakt, Bactotrypton und Maisquellwasser. K&sub2;HPO&sub4;, KH&sub2;PO&sub4;, NaCl, MgSO&sub4;, Vitamin B&sub1;, MgCl&sub2; und dergleichen können als weitere Nährstoffquellen verwendet werden. Die Kultivierung erfolgt unter Belüftung und Rühren bei einem ph von 5,5 bis 8,5 und bei einer Temperatur von 18-40ºC.
- Nach 5-90-stündiger Kultivierung wird das in den kultivierten Zellen angehäufte Peptid gewonnen, indem man die Zellen aus der Kultur erntet, diese mit Lysozym behandelt, sie durch wiederholte Gefrier-Auftau-Zyklen aufschließt und das Peptid aus dem durch Zentrifugation hergestellten Überstand mit Hilfe herkömmlicher Peptidextraktionsmethoden extrahiert.
- Das Peptid kann nachgewiesen werden, indem man die kultivierten Zellen direkt in Laemmli's Probenpuffer (Laemmli, Nature, 227, 680 (1970)) unter Erwärmen auflöst und eine SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (Verfahren von Laemmli; vgl. oben), gefolgt von einer Färbung mit dem Farbstoff Coomassie-Brilliantblau (Bio- Rad) durchführt.
- Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Veranschaulichung der Erfindung.
- Die DNAs 3-6, 13 und 14 werden mit Hilfe der Phosphoramidit- Methode durch Festphasensynthese (S. L. Beaucage et al., Tetrahedron Letters, 22, 1859 (1981); L.J. McBrie et al., ibid., 24, 245 (1983)) unter Verwendung eines DNA-Syntheseautomaten, Modell 380A Applied Biosystems, wie folgt hergestellt:
- Silikagel wurde als Festphasenträger verwendet.
- (1) Ein Nukleotid wurde mit der 5'-Hydroxylgruppe eines -Nucleotids kondensiert, das an den Festphasenträger über die 3'-Hydroxylgruppe gebunden war. Dabei wurde die Phosphoramidit- Methode verwendet. (2) Das am kondensierten Nucleotid gebundene Phosphit wurde mit Jod zu einem gebundenen Phosphat oxidiert. (3) Die Schutzgruppe der 5'-Hydroxylgruppe des kondensierten Nucleotids wurde mit Trifluoressigsäure entfernt. Anschließend wurde Schritt (1) für die Kondensation des nächsten Nucleotids wiederholt. Auf diese Weise wurden die Schritte (1)- (3) wiederholt und eine DNA wurde am Träger synthetisiert. Nach Beendigung der Synthese läßt man den Täger mit daran gebundener DNA 1 Stunde bei Zimmertemperatur in einer Thiophenollösung stehen, wodurch die Eliminierung der Schutzgruppe vom Phosphorsäurerest bewirkt wird. Anschließend läßt man in konzentriertem, wäßrigem Ammoniak 1 Stunde bei Zimmertemperatur stehen, wodurch die DNA vom Träger freigesetzt wird. Der DNA-enthaltende, konzentrierte, wäßrige Ammoniak wird auf 60ºC in einem verschlossenen Gefäß 12 Stunden erhitzt, um die Schutzgruppen auf den Basen zu eliminieren.
- Im Falle von DNA 3 wird beispielsweise die Synthese unter Verwendung von 1 uM Start-Nucleotid, das am Träger gebunden ist, durchgeführt. Nach Beendigung der letzten Kondensationsreaktion in einer Gesamtausbeute von 81 % und anschließender Deprotektion und Freisetzung von der Festphase erhält man DNA 3 als Rohprodukt in einer Ausbeute von 242 O.D.-Einheiten (gemessen bei 260 nm). Zur Reinigung elektrophoretisiert man 22 O.D.-Einheiten dieses Rohprodukts auf einem 10%igen Polyacrylamidgel (Dicke 2 mm, 13 x 13 cm) unter Verwendung von Tris-Boratpuffer (pH 8), der 7 M Harnstoff enthält. Derjenige Teil des Gels, der die DNA 3 enthält wird isoliert und mit 1 ml 0,2 M Triethylamincarbonatpuffer (ph 8) (im folgenden TEAB) 18 Stunden extrahiert. Den Extrakt trägt man auf eine Sephadex DE52 (Pharmacia Fine Chemicals)- Säule (Durchmesser 6 mm, Länge 5 mm) auf, um DNA 3 daran zu adsorbieren. Durch Elution mit 2 ml 2 M TEAB erhält man 3,9 O.D.Einheiten reine DNA 3.
- Andere DNAs als DNA 3 werden bei annähernd gleichen Ausbeuten synthetisiert.
- Diese DNAS werden durch Phosphorylierung an der 55'-Hydroxylgruppe mit Hilfe herkömmlicher Verfahren (A. M. Maxam et al., Methods in Enzymology, Bd. 65, Teil I, S. 499, Academic Press (1980)) unter Verwendung der Nucleotidkinase aus dem Phagen T4 und [γ-³²P]ATP radiomarkiert. Die markierten DNAs werden einer Gelelektrophorese aus 20%igem Polyacrylamid unter Verwendung von Tris-Boratpuffer, enthaltend 7 M Harnstoff, unterzogen. Auf diese Weise können Reinheit und Kettenlänge jeder DNA bestätigt werden. Darüber hinaus wurde die Basensequenz einer jeden markierten DNA mit Hilfe der Maxam-Gilbert-Methode (siehe oben) bestimmt und es wurde bestätigt, daß jede DNA die jeweilige gewünschte Basensequenz aufwies.
- Das Plasmid pTrs20 (2 ug) wurde in 30 ul einer Lösung (10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 7 mM MgCl&sub2;, 6 mM 2-Mercaptoethanol), enthaltend 10 Einheiten des Restriktionsenzyms ClaI (Boehringer Mannheim) und 15 Einheiten des Restriktionsenzyms SacI (Takara Shuzo) gelöst und die Verdauugsreaktion wurde 2 Stunden bei 37ºC durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde auf einem Ethidiumbromidenthaltenden Agarosegel elektrophoretisiert. Unter Detektion mit Hilfe von UV-Strahlen bei einer Wellenlänge von 302 nm werden Gelstücke, die DNA 7 mit einer Größe von etwa 3,8 kb enthalten, herausgeschnitten. Den Gelstücken wurden 0,5 ml Phenol zugesetzt, das Gemisch wurde eingefroren und aufgetaut, die wäßrige Schicht wurde mit Chloroform gewaschen und die DNA wurde durch Ausfällung mit Ethanol isoliert.
- Die DNAS 3-6 (jeweils 10 Picomol) wurden in 30 ul eines Puffers für die T4-Polynucleotidkinase-Reaktion (50 mM Tris-HCl (ph 7,5), 10 mM MgCl&sub2;, 5 mM Dithiothreitol (im folgenden DTT), 1 mM ATP, 0,1 mM Spermidin, 0,1 mM EDTA) gelöst. Nach Zugabe von 3 Einheiten T4 Polynucleotidkinase (Takara Shuzo) wurde die Phosphorylierungsreaktion 40 Minuten bei 37ºC durchgeführt. Anschließend wurde das Enzym durch 15-minütiges Erhitzen auf 65ºC inaktiviert. Eine 4 ul-Portion wurde aus jedem der so erhaltenen Reaktionsgemische entnommen. Die 4 ul-Portionen aus den vier Reaktionsgemischen wurden vereinigt, und 0,08 Picomol DNA 7 (erhalten in obiger Weise) wurde zugesetzt. Das Volumen des Gemisches wurde auf 50 ul erhöht, wobei 2 Einheiten T4 DNA-Ligase (Takara Shuzo) zugesetzt wurden, während die Gemischzusammensetzung eingestellt wurde auf: 28 mM Tris-HCl (pH 7,5), 9 mM MgCl&sub2;, 10 mM DTT, 0,03 mM EDTA, 0,7 mM ATP und 0,03 mM Spermidin. Die Ligationsreaktion wurde 16 Stunden bei 4ºC durchgeführt.
- Das Reaktionsgemisch wurde verwendet, um den Escherichia coli Stamm HB101 (Bolivar et al., Gene, 2, 75 (1977)) mit Hilfe des Verfahrens von Cohen et al. (S.N. Cohen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69 2110 (1972)) zu transformieren. Es wurden Ampicillin-resistente (Apr) Kolonien erhalten. Die Plasmid-DNA wurde aus einer der Kolonien mit Hilfe eines alkalischen Behandlungsverfahrens (Maniatis et al., (Hrsg.), Molecular Cloning, S. 368, Cold String Harbor Laboratory) isoliert. Auf diese Weise erhielt man pMTA1. Die Struktur von pMTA1 wurde durch Schneiden mit BglII, PstI, SacI und BamHI und anschließender Agarose-Gelelektrophorese bestätigt. Für jede Spaltungsreaktion in Gegenwart des betreffenden Enzyms wurde ein Reaktionsmedium hergestellt, indem man NaCl oder KCl in optimaler Konzentration für das Enzym im Bereich von 0-200 mM zu einer Lösung zugab, die 10 mM Tris-HCl (ph 7,5), 7 mM MgCl&sub2; und 6 mM 2-Mercaptoethanol (im folgenden bezeichnet als Restriktionsenzym-Reaktionsmedium; im folgenden wird lediglich die NaCl oder KCL-Konzentration angegeben) enthielt.
- Darüber hinaus wurde das gewünschte [Leu¹³]-Motilin-Gen dadurch identifiziert, daß man die 115 Basen umfassende Sequenz mit Hilfe des in der Literatur beschriebenen Verfahrens (A.J.H. Smith, Methods in Enzymology, herausgegeben von L. Grossmen und K. Moldave, Bd. 65, S. 560 (1980), Academic Press) bestimmte, welche den von den DNAS 3-6 abgeleiteten Abschnitten entsprach.
- Eine 0,2 ug-Portion des Plasmids pMTA1, hergestellt gemäß Beispiel 2, wurde in 15 ul des Restriktionsenzym-Reaktionsmediums (100 mm NaCl), definiert gemäß Beispiel 2, gelöst. 6 Einheiten PstI (Takara Shuzo) und 6 Einheiten BglII (Toyo Boseki) wurden zugesetzt und die Verdauungsreaktion wurde 2 Stunden bei 37ºC durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde mit Hilfe der gemäß Beispiel 2 beschriebenen Agarose-Gelelektrophorese fraktioniert. Auf diese Weise erhielt man ein DNA-Fragment (DNA 8) mit einer Größe von etwa 2,8 kb.
- Getrennt davon wurden 0,2 g pMTA1 in 15 ul Restriktions- Enzym-Reaktionsmedium (100 mm KCl) gelöst. 6 Einheiten PstI und 6 Einheiten BamHI (Takara Shuzo) wurden zugesetzt und die Verdauungsreaktion wurde zwei Stunden bei 37ºC durchgeführt. Eine Fraktionierung des Reaktionsgemisches durch Agarose-Gelelektrophorese ergab ein DNA-Fragment (DNA 9) mit einer Länge von etwa 1,2 kb.
- Die auf diese Weise erhaltene DNA 8 (50 ng) und DNA 9 (50 ng) wurden vereinigt und in 30 ul eines Mediums für T4 DNA-Ligase-Reaktion (20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl&sub2;, 10 mM DTT, 0,3 mM ATP) gelöst. 1 Einheit T4 DNA-Ligase (Takara Shuzo) wurde zugesetzt und die Ligationsreaktion wurde 18 Stunden bei 4ºC durchgführt. Das Reaktionsgemisch wurde zur Transformation des Escherichia coli-Stamms HB101 verwendet und Apr-Kolonien wurden isoliert. Die Plasmid DNA wurde aus einer dieser Kolonien gewonnen. Auf diese Weise erhielt man pMTA2. Die Struktur dieses Plasmids wurde durch Spaltung mit PstI, BamHI und BglII und anschließende Agarose-Gelelektrophorese bestätigt.
- Eine 0,2 ug-Portion des Plasmids pMTA2, hergestellt gemäß Beispiel 3, wurde in 15 ul Restriktionsenzym-Reaktionsmedium (100 mm NaCl) gemäß Beispiel 2 gelöst. 6 Einheiten PstI und 6 Einheiten BglII wurden zugesetzt und das Plasmid wurde 2 Stunden bei 37ºC verdaut. Nach Fraktionierung durch Agarose-Gelelektrophorese erhielt man ein etwa 2,8 kb langes DNA-Fragment. Getrennt davon wurden 0,2 ug pMTA2 in 15 ul Restriktionsenzym-Reaktionsmedium (100 mm KCl) gelöst. 6 Einheiten PstI und 6 Einheiten BamHI wurden zugesetzt und die Verdauung erfolgte 2 Stunden bei 37ºC. Nach Fraktionierung durch Agarose-Gelelektrophorese erhielt man ein etwa 1,3 kb langes DNA-Fragment.
- Die beiden obigen DNA-Fragmente (jeweils 0,2 Picomol) wurden vereinigt und in 30 ul T4 DNA-Ligase-Reaktionsmedium gelöst. 1 Einheit T4 DNA-Ligase wurde zugesetzt und die Ligationsreaktion wurde 18 Stunden bei 4ºC durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde dazu verwendet, um den Escherichia coli-Stamm HB101 zu transformieren. Apr-Kolonien wurden isoliert und die Plasmid-DNA wurde gewonnen. Die Struktur des auf diese Weise erhaltenen Plasmid pMTA4 wurde durch Spaltung mit PstI, BamHI und BglII und anschließende Agarose-Gelelektrophorese bestätigt.
- Eine 1 ug-Portion des Plasmids psGHIM1 wurde in 30 ul Restriktionsenzym-Reaktionsmedium (100 mM KCl) gelöst. 6 Einheiten PstI und 6 Einheiten BamHI wurden zugesetzt, die Verdauungsreaktion wurde 2 Stunden bei 37ºC durchgeführt. Man isolierte ein DNA-Fragment von etwa 2,1 kb durch Agarose-Gelelektrophorese.
- Das Plasmid pGHD7 (1 ug) wurde mit PstI und BamHI in gleicher Weise wie psGHIM1 verdaut und ein DNA-Fragment von etwa 1,7 kb wurde gewonnen.
- Diese DNA-Fragmente (jeweils 0,03 Picomol) wurden vereinigt und in 30 ul T4 DNA-Ligase-Reaktionsmedium gelöst. Eine Einheit T4 DNA-Ligase wurde zugesetzt und die Ligationsreaktion wurde 18 Stunden bei 4ºC durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde verwendet, um den Escherichia coli Stamm HB101 zu transformieren. Apr- Kolonien wurden isoliert und die Plasmid-DNA wurde gewonnen. Auf diese Weise erhielt man psGHIME1.
- Eine 0,5 ug-Portion des auf diese Weise erhaltenen Plasmids psghlmel wurde in 30 ul Restriktionsenzym-Reaktionsmedium (weder NaCl noch KCl wurde zugesetzt) gelöst. 50 Einheiten SacI (Takara Shuzo) wurde zugesetzt und die Verdauungsreaktion wurde 2 Stunden bei 37ºC durchgeführt. Anschließend wurden 2 ul 2 M NaCl zugesetzt und weitere 15 Einheiten BglII wurden zugegeben. Danach wurde die Verdauungsreaktion weitere 2 Stunden bei 37ºC fortgesetzt. Ein DNA-Fragment von etwa 3,2 kb wurde nach Fraktionierung durch Agarose-Gelelektrophorese gewonnen.
- Eine 0,5 ug-Portion von pMTA4 (hergestellt gemäß Beispiel 4) wurde in gleicher Weise wie oben beschrieben mit SacI und anschließend mit BglII verdaut und ein DNA-Fragment von etwa 0,3 kb wurde durch Agarose-Gelelektrophorese gewonnen.
- Diese DNA-Fragmente (jeweils 0,03 Picomol) wurden vereinigt und in 30 ul T4 DNA-Ligase Reaktionsmedium gelöst. 1 Einheit T4 DNA-Ligase wurde zugesetzt und die Ligationsreaktion wurde 15 Stunden bei 4ºC durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde verwendet, um den Escherichia coli Stamm HB101 zu transformieren. Apr- Kolonien wurden isoliert und die Plasmid-DNA wurde gewonnen. Auf diese Weise erhielt man pMTL4.
- Eine 1,5 ug-Portion des Plasmids pMTL4, hergestellt gemäß Beispiel 5, wurde in 20 ul Restriktionsenzym-Reaktionsmedium (100 mm NaCl) gelöst. 8 Einheiten PstI und 7 Einheiten BglII wurden zugesetzt und die Verdauungsreaktion wurde 2 Stunden bei 37ºC durchgeführt. Ein DNA-Fragment von etwa 2,2 kb (DNA 15) wurde durch Agarose-Gelelektrophorese isoliert. Getrennt davon wurde pMTL4 in 20 ul Restriktionsenzym-Reaktionsmedium (100 mM NaCl) gelöst. 8 Einheiten PstI und 6 Einheiten HindIII (Takara Shuzo) wurden zugesetzt und die Verdauungsreaktion wurde 2 Stunden bei 37ºC durchgeführt. Nach Agarose-Gelelektrophorese wurde ein DNA- Fragment von etwa 1,0 kb (DNA 16) isoliert.
- DNA 13 (21 Picomol) und DNA 14 (21 Picomol) wurden jeweils in 50 ul T4 Polynucleotidkinase-Reaktionspuffer gemäß Beispiel 2 gelöst. 4 Einheiten T4 Polynucleotidkinase wurden zugesetzt und die Phosphorylierungsreaktion wurde 40 Minuten bei 37ºC durchgeführt. Das Enzym wurde durch Erwärmen auf 65ºC innerhalb von 15 Minuten inaktiviert. Die Reaktionsgemische (jeweils 2 ul) wurden vereinigt, DNA 15 und DNA 16 wurden zugesetzt, das Gemisch wurde auf 40 ul aufgefüllt, wobei das Gemisch unter Zugabe von 2 Einheiten T4 DNA-Ligase wie folgt eingestellt wurde: 28 mM Tris-HCl, 9 mM MgCl&sub2;, 10 mM DTT, 0,03 mM EDTA, 0,7 mM ATP, 0,03 mM Spermidin. Die Ligationsreaktion wurde 16 Stunden bei 4ºC durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde verwendet, um den Escherichia coli Stamm HB101 zu transformieren. Apr-Kolonien wurden isoliert und die Plasmid-DNA wurde gewonnen. Auf diese Weise erhielt man pMTN4.
- Eine 2,5 ug-Portion des Plasmids pMTN4 wurde in 40 ul Restriktionsenzym-Reaktionsmedium (weder NaCl noch KCl wurden zugesetzt), enthaltend 0,01 % Triton X, gelöst. 12 Einheiten SacI wurden zugesetzt und die Verdauungsreaktion wurde 2 Stunden bei 37ºC durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde mit Phenol-Chloroform extrahiert und das mit SacI-geschnittene pMTN4 wurde durch Ausfällung mit Ethanol gewonnen und in 40 pl einer Lösung folgender Zusammensetzung gelöst: 20 mM Tris-HCl (pH 7,8), 7 mM MgCl&sub2;, 6 mM 2-Mercaptoethanol, je 0,25 mM dNTP (dATP, dTTP, dCTP, dGTP). Zur Lösung gab man 4 Einheiten Escherichia coli DNA-Polymerase I, Klenow-Fragment (Takara Shuzo) und führte die Reaktion 1 Stunde bei 20ºC durch. Das Reaktionsgemisch wurde mit Phenol-Chloroform extrahiert und ein Polymerase-behandeltes pMTN4-Fragment wurde durch Ausfällung mit Ethanol gewonnen. Dieses wurde in 30 ul Restriktionsenzym-Reaktionsmedium (100 mm NaCl) gelöst. 5 Einheiten PstI wurden zugesetzt und die Verdauungreaktion wurde 2 Stunden durchgeführt. Nach Fraktionierung durch Agarose-Gelelektrophorese erhielt man ein DNA-Fragment von etwa 1,3 kb (DNA 20).
- Eine 2 ug-Portion des Plasmids pArgE1 wurde in 20 ul Restriktionsenzym-Reaktionsmedium (150 mM NaCl) gelöst. 10 Einheiten PstI und 10 Einheiten EcoRV (Takara Shuzo) wurden zugesetzt und die Verdauungsreaktion wurde 2 Stunden bei 37ºC durchgeführt. Nach Fraktionierung durch Agarose-Gelelektrophorese erhielt man ein DNA-Fragment von etwa 1,7 kb (DNA 19).
- Diese DNA 19 (0,06 Picomol) und DNA 20 (0,06 Picomol) wurden vereinigt und in 25 ul T4 DNA-Ligase-Reaktionsmedium gelöst. 3 Einheiten T4 DNA-Ligase wurden zugesetzt und die Ligationsreaktion wurde 20 Stunden bei 4ºC durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde verwendet, um den Escherichia coli Stamm HB101 zu transformieren. Apr-Kolonien wurden isoliert und die Plasmid-DNA wurde aus einer der Kolonien gewonnen. Auf diese Weise erhielt man pMTO4. Die Struktur von pMTO4 wurde durch Spaltung mit PstI, EcoRI, HindIII, SalI, BglII und MluI bestätigt.
- Das Plasmid pMTO4 (2 ug) wurde in 30 ul Restriktionsenzym- Reaktionsmedium (100 mm NaCl) gelöst. 6 Einheiten HindIII und 6 Einheiten PstI wurden zugesetzt und die Verdauungsreaktion wurde 2 Stunden bei 37ºC durchgeführt. Ein [Leu¹³]-Motilin-Polymergenenthaltendes DNA-Fragment von etwa 3,0 kb (DNA 21) wurde durch Fraktionierung mittels Agarose-Gelelektrophorese isoliert. Getrennt davon wurden 3 ug Plasmid pKYP10 (Europäische Patentanmeldung Publikationsnr. 83069A) in 30 ul Restriktionsenzym-Reaktionsmedium (100 mm NaCl) gelöst. 9 Einheiten HindIII und 9 Einheiten PstI wurden zugesetzt und die Verdauungsreaktion wurde 2 Stunden bei 37ºC durchgeführt. Ein Promotor-enthaltendes DNA- Fragment von etwa 1,1 kb (DNA 22) wurde durch Fraktionierung mittels Agarose-Gelelektrophorese gewonnen. Diese DNA-Fragmente (jeweils 0,1 ug) wurden in 30 ul T4 DNA-Ligase-Reaktionsmedium gelöst. 1 Einheit T4 DNA-Ligase wurde zugesetzt und die Ligationsreaktion wurde 18 Stunden bei 4ºC durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde verwendet, um den Escherichia coli Stamm HBIOI zu transformieren. Die Plasmid-DNA wurde aus einer der Apr-Kolonien gewonnen. Auf diese Weise erhielt man das [Leu¹³]-Motilin- polymer-Expressionsplasmid pMTOI4, das einen Tryptophanpromotor enthielt. Die Struktur von pMTOI4 wurde durch Schneiden mit PstI, BanIII, HindIII und MluI (vgl. Fig. 9) bestätigt.
- Das Plasmid pMTO4 (2 ug) wurde in 30 ul Restriktionsenzym- Reaktionsmedium (100 mm NaCl) gelöst. 6 Einheiten HindIII und 6 Einheiten PstI wurden zugesetzt und die Verdauungsreaktion wurde 2 Stunden bei 37ºC durchgeführt. Ein [Leu¹³]-Motilin-Polymergenenthaltendes DNA-Fragment von etwa 3,0 kb (DNA 21) wurde durch Fraktionierung mittels Agarose-Gelelektrophorese gewonnen. Getrennt davon wurden 3 ug des Plasmids pGEL1 (Europäische Patentanmeldung, Publikationsnr. 166444a) in 30 ul Restriktionsenzym- Reaktionsmedium (100 mm NaCl) gelöst. 9 Einheiten HindIII und 9 Einheiten PstI wurden zugesetzt und die Verdauungsreaktion wurde 2 Stunden bei 37ºC durchgeführt. Ein Promotor-enthaltendes DNA- Fragment von etwa 1,1 kb (DNA 23) wurde durch Fraktionierung mittels Agarose-Gelelektrophorese gewonnen. Diese DNA-Fragmente (jeweils etwa 0,1 ug) wurden in 30 ul T4 DNA-Ligase-Reaktionsmedium gelöst. 1 Einheit T4 DNA-Ligase wurde zugesetzt und die Ligationsreaktion wurde 18 Stunden bei 4ºC durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde verwendet, um den Escherichia coli Stamm HB101 zu transformieren und die Plasmid-DNA wurde aus einer der Apr-Kolonien gewonnen. Auf diese Weise erhielt man das Plasmid pMTOII4 für die [Leu¹³]-Motilinpolymer-Expression. Das Plasmid enthielt zwei Tryptophan-Promotoren, die seriell gekoppelt waren und die SD-Sequenz in dem Plasmid war 14 Basen vom Startkodon ATG entfernt. Die Struktur von pMTOII4 wurde durch Schneiden mit PstI, BanIII, HindIII und MluI (vgl. Fig. 10) bestätigt.
- Das Plasmid pMTO4 (2 ug) wurde in 30 ul Restriktionsenzym- Reaktionsmedium (100 mm NaCl) gelöst. 6 Einheiten HindIII und 6 Einheiten PstI wurden zugesetzt und die Verdauungsreaktion wurde 2 Stunden bei 37ºC durchgeführt. Nach Fraktionierung durch Agarose-Gelelektrophorese erhielt man ein [Leu¹³]-Motilin-Polymergenenthaltendes DNA-Fragment von etwa 3,0 kb. Getrennt davon wurden 3 ug des Plasmids pGHA2 (Europäische Patentanmeldung, Veröffentlichungsnr. 152613A) in 30 ul Restriktionsenzym-Reaktionsmedium (100 mm NaCl) gelöst. 9 Einheiten HindIII und 9 Einheiten PstI wurden zugesetzt und die Verdauungsreaktion wurde 2 Stunden bei 37ºC durchgeführt. Nach Fraktionierung mittels Agarose-Gelelektrophorese wurde ein Promotor-enthaltendes DNA-Fragment von etwa 0,9 kb gewonnen. Diese DNA-Fragmente (jeweils etwa 0,1 ug) wurden in 30 ul T4 DNA-Ligase-Reaktionsmedium gelöst. 1 Einheit T4 DNA- Ligase wurde zugesetzt und die Ligationsreaktion wurde 18 Stunden bei 4ºC durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde verwendet, um den Escherichia coli-Stamm HB101 zu transformieren. Die Plasmid- DNA wurde aus einer der Apr-Kolonien gewonnen. Auf diese Weise erhielt man das Plasmid pMTOIII4 für die [Leu¹³]-Motilinpolymer- Expression. Dieses Plasmid enthielt einen let-Promotor. Die Struktur von pMTOIII4 wurde durch Spaltung mit PstI, BanIII, HindIII, MluI und BglII (vgl. Fig. 11) bestätigt.
- Der Escherichia coli-Stamm W3110 strA (FERM BP-732) wurde mit pMTO4 (hergestellt gemäß Beispiel 7) transformiert. Eine auf diese Weise erhaltene Apr-Kolonie wurde in 8 ml LG-Medium (1 % Bacto-Trypton, 0,5 % Hefeextrakt, 0,5 % NaCl, 0,1 % Glucose, 50 ug/ml Tryptophan, 50 ug/ml Ampicillin, pH 7,5) inokuliert und 16 Stunden bei 30ºC kultiviert. Eine 400 ul-Portion der Kultur wurde in 10 ml MCG-Medium (0,6 % Na&sub2;HPO&sub4;, 0,3 % KH&sub2;PO&sub4;, 0,5 % NaCl, 0,1 % NH&sub4;Cl, 0,5 % Glucose, 0,5 % Casaminosäuren, 1 mM MgSO&sub4;, 4 ug/ml Vitamin B&sub1;, pH 7,2), ergänzt mit 50 ug/ml Tryptophan und 50 ug/ml Ampicillin, inokuliert und bei 30ºC kultiviert. Sobald die Trübung (OD&sub5;&sub5;&sub0;) der Kultur einen Wert von 0,9 (nach etwa 4 Stunden) erreicht hatte, wurden 200 ug Indolacrylsäure zugesetzt. Die Kultivierung wurde weitere 4 Stunden fortgesetzt. Anschließend wurden die Zellen aus der Kultur durch 5-minütige Zentrifugation bei 7 000 Upm abzentrifugiert. Die Zellen wurden in dem Probenpuffer gemäß Laemmli et al. (Nature, 227, 680 (1970)) gelöst, die Lösung wurde erhitzt und einer SDS-Polyacrylamid- Gelelektrophorese gemäß dem Verfahren von Laemmli et al. unterzogen. Nach Färbung mit Coomassie Brilliant-Blau wurde eine Polypeptidbande in einer Position detektiert, die einem Molekulargewicht von etwa 15 000 entsprach. Ein Escherichia coli W3110 strA-Stamm frei von pMTO4 ergab keine entsprechende Bande. Damit wurde bestätigt, daß der pMTO4-tragende Transformand von Escherichia coli W3110 strA ein [Leu¹³]-Motilin-Polymerprotein, fusioniert mit einem Teil des Lachs-Wachstumshormons produzierte.
- Der Escherichia coli-Stamm W3110 strA wurde mit dem Plasmid pMTOI4 aus Beispiel 8 transformiert. Eine erhaltene Apr-Kolonien wurde in gleicher Weise wie in Beispiel 11 beschrieben kultiviert und die Zellen wurden durch 5-minütige Zentrifugation der Kultur bei 7 000 Upm gewonnen. Die Zellen wurden in Probenpuffer gemäß Laemmli et al. gelöst, die Lösung wurde erhitzt und einer SDS- Polyacrylamid-Gelelektrophorese gemäß dem Verfahren von Laemmli et al. unterzogen, gefolgt von einer Färbung mit Coomassie-Brilliant-Blau. Als Ergebnis wurde eine Polypeptidbande in einer Position detektiert, die einem Molekulargewicht von etwa 15 000 entsprach. Da der pMTOI4-freie Escherichia coli W3110 strA-Stamm keine entsprechende Bande ergab, war offensichtlich, daß der pMTOI4-tragende Transformand von Escherichia coli ein [Leu¹³]-Motilin-Polymerprotein, fusioniert mit einem Teil des Lachs-Wachstumshormons, produzierte.
- Das gemäß Beispiel 9 erhaltende Plasmid pMTOII4 wurde zur Transformation des Escherichia coli-Stamms W3110 strA verwendet. Eine erhaltene Apr-Kolonie wurde in gleicher Weise wie in Beispiel 11 kultiviert und Zellen wurden durch 5-minütige Zentrifugation der Kultur bei 7 000 Upm gewonnen. Die Zellen wurden in Probenpuffer gemäß Laemmli et al. gelöst, die Lösung wurde erhitzt und einer SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese gemäß dem Verfahren von Laemmli et al., gefolgt von einer Coomassie-Brilliant-Blau-Färbung, unterzogen. Als Ergebnis wurde eine Polypeptidbande in einer Position detektiert, die einem Molekulargewicht von etwa 15 000 entsprach. Da der pMTOII4-freie Escherichia coli W3110 strA- Stamm keine entsprechende Bande ergab, war evident, daß der pMTOII4-tragende Transformand von Escherichia coli W3110 strA ein [Leu¹³]-Motilin-Polymerprotein, fusioniert mit einem Teil des Lachs-Wachstumshormons, produzierte.
- Das Plasmid pmtolll4, hergestellt gemäß Beispiel 10, wurde verwendet, um den Escherichia coli-Stamm W3110 strA zu transformieren. Eine gewonnene Apr-Kolonien wurde in gleicher Weise wie in Beispiel 11 beschrieben kultiviert und die Zellen wurden durch 5-minütige Zentrifugation der Kultur bei 7 000 Upm gewonnen. Die Zellen wurden in Probenpuffer gemäß Laemmli et al gelöst, die Lösung wurde erhitzt und einer SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese gemäß dem Verfahren von Laemmli et al., gefolgt von einer Coomassie-Brilliant-Blau-Färbung, unterzogen. Als Ergebnis wurde eine Polypeptidbande in einer Position detektiert, die einem Molekulargewicht von etwa 15 000 entsprach. Da der pMTOIII4-freie Escherichia coli-Stamm W3110 strA keine entsprechende Bande ergab, war offensichtlich, daß der pMTOIII4-tragende Transformand des Escherichia coli-Stammes W3310 strA ein [Leu¹³]-Motilin-Polymerprotein produzierte, fusioniert mit einem Teil des Lachs- Wachstumshormons.
- Das Plasmid pMTN4, hergestellt gemäß Beispiel 6, wurde zur Transformation des Escherichia coli-Stamms W3110strA verwendet. Eine isolierte Apr-Kolonie wurde in 8 ml LG-Medium überführt und anschließend 8 Stunden bei 30ºC kultiviert. Ein Teil der Kultur wurde in 10 ml LG-Medium inokuliert. Nach 16-stündiger Kultivierung bei 30ºC wurde die Kultur in 1 Liter MCG-Medium, ergänzt mit 100 ug/ml Tryptophan und 50 ug/ml Ampicillin, inokuliert und die Kultivierung wurde in einem Schüttelfermenter 48 Stunden bei 30ºC durchgeführt.
- Eine 100 ml-Portion der Kultur wurde bei 7 000 Upm zentrifugiert. Die auf diese Weise erhaltenen Zellen wurden mit PBS (97 mM Dinatriumphosphat, 1,5 mM Kaliumdihydrogenphosphat, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl) gewaschen, in 60 ml PBS suspendiert und 30 Minuten beschallt. Das durch 40-minütige Zentrifugation bei 10 000 Upm erhaltene Sediment wurde in 3,48 ml 20 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7,0) gelöst, gefolgt von einer Zugabe von 3 ml destillierten Wassers, 3,6 ml 1,5 M NaCl und 25 ml Percol (Pharmacia Fine Chemicals). Anschließend wurde 15 Minuten bei 17 000 Upm zentrifugiert. Das Sediment wurde mit Hilfe des Percol-Dichtegradienten in zwei Fraktionen aufgetrennt und die Fraktion mit höherer Dichte wurde isoliert. Zu dieser Fraktion gab man 5 Volumina destillierten Wassers. 7-minütige Zentrifugation bei 11 000 Upm ergab ein Sediment, das mit destilliertem Wasser gewaschen wurde, wobei man 47 mg Granulat erhielt. Die Proteinquantifizierung wurde unter Verwendung eines Proteintestkits (Bio-Rad) durchgeführt.
- Das gemäß Beispiel 15 hergestellte granuläre Motilin-Polymer (etwa 5 mg) wurde in 2,0 ml 70%iger Ameisensäure gelöst. Eine Lösung von 42 mg Cyanogenbromid in 0,4 ml 70%iger Ameisensäure wurde zugesetzt und das Gemisch ließ man 1 Tag bei 37ºC stehen. Dann wurden erneut 0,4 ml einer Lösung von 42 mg Cyanogenbromid in 70%iger Ameisensäure zugesetzt und das gesamte Gemisch ließ man über Nacht bei 37ºC stehen. Das Produkt bestand aus [Leu¹³]- Motilin-Monomer und dem daran gebundenen Spacerpeptid-Rest (Peptid 25) und wurde mit Hilfe der hochauflösenden Flüssigkeitschromatographie (HPLC) isoliert. Eine Portion von etwa 100 ug des isolierten Peptids wurde in 0,4 ml 0,2 M N-Ethylmorpholinacetat-Puffer (ph 8,0) gelöst und die Lösung ließ man 21 Stunden bei 37ºC stehen, wodurch der von Homoserin abgeleitete Lactonring am Carboxylende von Peptid 25 gespalten wurde. Anschließend wurden 2 ug Carboxypeptidase A (Sigma) zugesetzt und das Gemisch ließ man 30 Minuten bei 37ºC stehen, wobei man Peptid 26, bestehend aus [Leu¹³]-Motilin und Arginin, gebunden an das Carboxylende von [Leu¹³]-Motilin' erhielt. Eine 22 ug-Portion dieses Peptids 26 wurde in 0,2 ml 0,2 M N-Ethylmorpholinacetat- Puffer (ph 8,0) gelöst, mit 1 ug Carboxypeptidase B (Sigma) versetzt und das Gemisch ließ man 10 Minuten bei 37ºC stehen. Anschließend gab man 0,2 ml einer 0,1%igen Trifluoressigsäurelösung hinzu, um die Reaktion abzustoppen. Auf diese Weise erhielt man [Leu¹³]-Motilin in quantitativer Ausbeute. Die Struktur dieses [Leu¹³]-Motilins wurde durch Aminosäuresequenzanalyse und Massenanalyse bestätigt.
- Männliche Kaninchen mit einem Gewicht von 2,3-2,8 kg wurden durch Ausbluten getötet und eine Duodenumprobe mit einer Länge von etwa 1,5 cm wurde entnommen. Jede Duodenumprobe wurde in einem 30 ml-Magnusbad suspendiert, das untere Ende wurde mit einem isotonischen Transducer (Nihon Kohden Modell TD-112S) verbunden und die Kontraktionsreaktion des Duodenums wurde auf einem Rekorder (Yokogawa Hokushin Electric Typ 3066) aufgezeichnet. Das Duodenum wurde mit einem Zug von 1 g belastet.
- Das Experiment wurde bei einer Temperatur von 28 ± 1ºC in einer Mischgasatmosphäre, bestehend aus 95 % O&sub2; und 5 % CO&sub2; unter Verwendung der Tyrode-Nährlösung (8,0 g/l NaCl, 0,2 g/l KCl, 0,2 g/l CaCl&sub2;, 0,1 g/l MgCl&sub2;, 0,05 g/l NaH&sub2;PO&sub4;, 1,0 g/l NaHCO&sub3;, 1,0 g/l Glucose) durchgeführt.
- Zur Bewertung der Kontraktionsaktivität von [Met¹³]-Motilin und von [Leu¹³]-Motilin wurde die Kontraktionsspannung, nach kumulativer Zugabe der Substanzen zur Tyrode-Lösung in Konzentrationen von 1 x 10&supmin;&sup9; bis 3 x 10&supmin;&sup7; g/ml gemessen und die gemessenen Werte wurden mit der Kontraktionsspannung verglichen, die man nach Zugabe von 10&supmin;&sup5; g/ml Acetylcholin gemessen hatte und wurden ausgedrückt als Prozentwerte, wobei der für Acetylcholin ermittelte Wert als 100 % gesetzt wurde. Aus den ermittelten Resultaten, die in Fig. 17 gezeigt werden, ergibt sich, daß [Leu¹³]- Motilin in bezug auf seine Intestinum-kontrahierende Aktivität mit natürlichem porcinem Motilin vergleichbar ist.
- Der ATG-Vektor pTrs20 wurde gemäß dem in Fig. 12 gezeigten Schema konstruiert. In diesen Vektor ist die SD-Sequenz 14 Basen vom Startkodon ATG entfernt und der Vektor enthält eine SacI- Schnittstelle unmittelbar hinter dem ATG-Kodon.
- Zunächst wurden 3 ug von pKYP10, hergestellt mit Hilfe des in der Europäischen Patentanmeldung, Veröffentlichungsnr. 83069A beschriebenen Verfahrens, in 30 ul Y-100 Puffer gelöst. Jeweils 6 Einheiten der Restriktionsenzyme BanIII und NruI (New England Biolabs) wurden zugesetzt und die Spaltungsreaktion wurde 3 Stunden bei 37ºC durchgeführt. Aus dem Reaktionsgemisch erhielt man mit Hilfe der LGT-Methode etwa 0,5 ug eines Ptrp-enthaltenden DNA-Fragments von etwa 3,8 kb (BanIII-NruI-Fragment).
- Getrennt davon wurde zur Bereitstellung des Startkodons ATG stromabwärts von Ptrp der folgende DNA-Linker mit Hilfe der Phosphotriestermethode synthetisiert:
- Die synthetischen 19-mer und 17-mer DNAs (jeweils 10 Picomol) wurden in einem Gesamtvolumen von 20 ul einer Lösung, enthaltend 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl&sub2;, 5 mM Dithiothreitol, 0,1 mM EDTA und 1mM ATP, gelöst. Anschließend erfolgte eine Zugabe von 3 Einheiten T4 Polynucleotidkinase (Takara Shuzo). Die Phosphorylierungsreaktion wurde 60 Minuten bei 37ºC durchgeführt.
- Anschließend wurden 0,1 ug des oben erwähnten, von pKYP10- abgeleiteten BanIII-NruI-Fragments (etwa 3,8 kb) und etwa 0,5 Picomol des oben erwähnten DNA-Linkers in 20 ul T4 Ligasepuffer gelöst und außerdem wurden 2 Einheiten T4 DNA-Ligase zugesetzt. Dann wurde die Ligationsreaktion 18 Stunden bei 4ºC durchgeführt.
- Das auf diese Weise erhaltene rekombinante Plasmidgemisch wurde verwendet, um den Escherichia coli-Stamm HB101 (Boliver et al., Gene, 2, 75 (1977)) zutransformieren. Es wurden Apr-Kolonien isoliert. Die Plasmid-DNA wurde aus kultivierten Zellen, abgeleitet aus einer dieser Kolonien, isoliert. Die Struktur des erhaltenen Plasmids wurde durch Agarose-Gelelektrophorese und anschließender Spaltung mit den Restriktionsenzymen EcoRI, BanIII, HindIII, SacI und NruI bestätigt. Dieses Plasmid wurde als pTrS20 bezeichnet. pTrS20 weist in der Nachbarschaft der BanIII und HindIII-Stellen die im folgenden angegebene Basensequenz auf. Dies wurde mit Hilfe der Dideoxysequenzierungsmethode unter Verwendung des M13-Phagen bestätigt.
- In 40 ul einer Lösung (im folgenden "Y-100-Puffer"), enthaltend 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl&sub2; und 100 mM NaCl, wurden 3 ug pGEL1 (etwa 3,4 kb) gelöst. Anschließend gab man 5 Einheiten BanIII (Toyobo) hinzu. Dann wurde die Verdauungsreaktion 3 Stunden bei 37ºC durchgeführt. Die Extraktion des Reaktionsgemisches mit Phenol und Ausfällung mit Ethanol ergab etwa 2,4 ug pGEL1, dem Spaltungsprodukt an einer BanIII-Stelle. Dieses DNA-Fragment (etwa 2,4 ug) wurde in 50 ug einer Lösung (im folgenden "DNA- Polymerasepuffer") gelöst, enthaltend 50 mM Tris-HCl (pH 7,8), 7 mM MgCl&sub2; und 6 mM Mercaptoethanol. dATP und dTTP wurde jeweils in einer Konzentration von 1 mM zugesetzt. Außerdem erfolgte die Zugabe von 5 Einheiten DNA-Polymerase I (New England Bio-Labs) und die Reaktion wurde 30 Minuten bei 37ºC durchgeführt, um die vorstehenden Enden zu entfernen. Etwa 2,0 ug eines DNA-Fragments erhielt man durch Extraktion mit Phenol und Ausfällung mit Ethanol. Eine 1 ug-Portion dieses DNA-Fragments wurde in 30 ul eines Puffers (im folgenden "T4-Ligasepuffer I"), enthaltend 20 mM Tris-HCl (pH 7,6), 10 mM MgCl&sub2;, 10 mM Dithiothreitol, gelöst. 1 mM ATP, 2 Einheiten T4 DNA-Ligase (Takara Shuzo: ebenso wie im folgenden) wurde zugesetzt und die Ligationsreaktion wurde 18 Stunden bei 4ºC durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde zur Transformation des Escherichia coli-Stamms HB101 (Boliver et al. (Gene, 2, 75 (1977)) mit Hilfe des Verfahrens von Cohen et al. (S. N. Cohen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)) verwendet, wobei Apr-Kolonien isoliert wurden. Die Plasmid-DNA wurde aus einem der Transformandenstämme mit Hilfe eines bekannten Verfahrens (H. C. Birnboim et al., Nucleic Acids Res., 7, 1513 (1979)) abgetrennt. Auf diese Weise erhielt man pGEL10 (etwa 3,4 kb). Die Struktur von pGEL10 wurde durch Agarose-Gelelektrophorese und anschließende Spaltung mit EcoRI, PstI, HindIII und BamHI bestätigt. Die Basensequenz von der SD-Sequenz, stromabwärts vom trp-Promotor zum Translationsstartkodon ATG für das Interferon-γ-Gen wurde mit Hilfe der Maxam-Gilbert-Methode (Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 74, 560 (1977)) bestimmt. Man stellte fest, daß es die folgenden 10 Basenpaare umfaßte.
- Das Plasmid pGEL10 (5 ug), das in obiger Weise erhalten wurde, wurde in 40 ul Y-100-Puffer gelöst, jeweils 10 Einheiten HindIII und BamHI wurden zugesetzt und die Spaltungsreaktion wurde 3 Stunden bei 37ºC durchgeführt. Aus dem Reaktionsgemisch isolierte man etwa 2 ug eines DNA-Fragments (etwa 2,7 kb), das die trp-Promotor-Region, den Ursprung der Replikation und den Lipoproteinterminator enthielt. Es wurde die Gefrier-Auftaumethode verwendet.
- Getrennt davon wurden 5 ug psGHIB2 (etwa 3,8 kb) (hergestellt gemäß dem Verfahren von Referenzbeispiel 3) in 40 ul Y-100 Puffer gelöst. 10 Einheiten BamHI wurden zugesetzt und die Reaktion wurde 3 Stunden bei 37ºC zur vollständigen Spaltung durchgeführt. Anschließend wurde 1 Einheit HindIII zugesetzt und die Reaktion wurde 30 Minuten bei 37ºC durchgeführt, um eine partielle Spaltung zu bewirken. Aus dem Reaktionsgemisch isolierte man mit Hilfe der Gefrier-Auftaumethode etwa 0,7 ug eines DNA-Fragments (etwa 1,1 kb), das für die reife Form des Lachs-Wachstumshormons kodierte.
- Etwa 0,1 ug des DNA-Fragments von pGEL10 und etwa 0,2 ug des DNA-Fragments von pSGHIB2, die man jeweils in obiger Weise erzeugte, wurden in 30 ul T4-DNA-Ligasepuffer I gelöst. 2 Einheiten T4 DNA-Ligase wurden zugesetzt und die Ligationsreaktion wurde 18 Stunden bei 4ºC durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde verwendet, um den Escherichia coli-Stamm HB101 zu transformieren. Plasmid-DNA wurde aus einer der Kolonien isoliert. Auf diese Weise erhielt man psghlml. Die Struktur von psGHIM1 wurde durch Agarose-Gelelektrophorese und anschließende Spaltung mit ECORI, HindIII, BamHI und PstI bestätigt.
- 5 ug des Plasmids psGH1 (hergestellt mit Hilfe des in der Europäischen Patentanmeldung, Veröffentlichungsnr. 166444A beschriebenen Verfahrens), das eine DNA enthielt, die für Lachs- Wachstumshormon kodiert, wurden in 40 ul einer Lösung (im folgenden "Y-10-Puffer"), enthaltend 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl&sub2;, und 10 mM NaCl, gelöst. 10 Einheiten des Restriktionsenzyms MboII (New England BioLabs) wurden zugesetzt und die Verdauungsreaktion wurde 3 Stunden bei 37ºC durchgeführt. Anschließend wurde die NaCl-Konzentration in der resultierenden Lösung auf 175 mm eingestellt. 10 Einheiten SalI wurden zugesetzt und die Verdauungsreaktion wurde 3 Stunden bei 37ºC durchgeführt. Aus dem Reaktionsgemisch erhielt man mit Hilfe der LGT-Methode etwa 0,2 ug eines 163 bp DNA-Fragments, das dem N-Terminus und seiner Nachbarschaft entsprach.
- Anschließend wurden 5 ug psGH1 in 40 ul Y-100-Puffer gelöst. 10 Einheiten BamHI wurden zugesetzt und die Verdauungsreaktion wurde 3 Stunden bei 37ºC durchgeführt. Die NaCl-Konzentration des Reaktionsgemisches wurde auf 175 mm eingestellt. 10 Einheiten SalI wurden zugesetzt und die Verdauungsreaktion wurde 3 Stunden bei 37ºC durchgeführt. Aus dem Reaktionsgemisch erhielt man mit Hilfe der LGT-Methode etwa 0,5 ug eines DNA-Fragments (etwa 900 bp), das das C-terminale Ende und die 3'-nichttranslatierte Region enthielt.
- Getrennt davon wurden 5 ug pGELI in 40 ul Y-100 Puffer gelöst. Jeweils 10 Einheiten von BamHI und HindIII wurden zugesetzt und die Verdauungsreaktion wurde 3 Stunden bei 30ºC durchgeführt. Aus dem Reaktionsgemisch erhielt man etwa 1 ug eines Tryptophan-Promotor-enthaltenden DNA-Fragments (etwa 2,7 kb).
- Getrennt davon wurde ein DNA-Linker der im folgenden angegebenen Sequenz synthetisiert, um das Translationsstartkodon einzuführen, das für die Expression der für die reife Form des Lachs-Wachstumshormons kodierenden DNA und für die Verknüpfung der Vektor-DNA und obiger DNA benötigt wurde.
- Zunächst wurden die einzelsträngigen 17-mer und 12-mer DNAs mit Hilfe der herkömmlichen Phosphotriestermethode (R. Crea et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 75, 5765 (1978)) hergestellt. Die einzelsträngigen 17-mer und 12-mer DNAs (jeweils 12 Picomol) wurden in 20 ul einer Lösung, enthaltend 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl&sub2;, 10 mM Dithiothreitol und 1 mM ATP, gelöst. 6 Einheiten T4 Polynucleotidkinase (Takara Shuzo) wurden zugesetzt und die Phosphorylierungsreaktion wurde 60 Minuten bei 37ºC durchgeführt.
- Das von psGH1 abgeleitete MboII-SalI-Fragment (163 bp) (0,1 Picomol), 0,06 Picomol des SalI-BamHI-Fragments (etwa 900 bp) und 20 0,02 Picomol des von pGEL1 abgeleiteten HindIII-BamHI-Fragments (etwa 2,7 kb), die jeweils wie oben beschrieben hergestellt wurden, wurden in 30 ul einer Lösung gelöst, die 50 mM Tris-HCl (ph 7,5), 10 mM MgCl&sub2;, 10 mM Dithiothreitol und 1 mM ATP enthielt. Zu der Lösung gab man 5 ul des oben erwähnten Reaktionsgemisches, das die phosphorylierte synthetische DNA enthielt. Zu dem resultierenden Gemisch gab man 6 Einheiten T4 Ligase (Takara Shuzo) und führte die Ligationsreaktion 18 Stunden bei 4ºC durch.
- Das Reaktionsgemisch wurde dazu verwendet, um den Escherichia coli-Stamm HB101 zu transformieren. Apr-Kolonien wurden isoliert und die Plasmid-DNA wurde aus einer der Kolonien gewonnen. Auf diese Weise erhielt man das in Fig. 16 gezeigte psGHIB2. Die Struktur von pSGHIB2 wurde durch Agarose-Gelelektrophorese und anschließender Verdauung mit ECORI, HindIII, ClaI, BglII, SalI und BamHI bestätigt. Die Sequenz in Nachbarschaft zum N- Terminus der für das Lachs-Wachstumshormon in psGHIB2 kodierenden DNA wurde mit Hilfe der Methode von Sanger unter Verwendung des M13 Phagen wie folgt bestimmt:
- Als Ergebnis wurde festgestellt, daß psGHIB2 eine DNA enthielt, die für die reife Form des Lachs-Wachstumshormon-Polypeptids kodierte. Ein Stamm von Escherichia coli, der das Plasmid pSGHIB2 trägt, nämlich Escherichia coli ESGHIB2, wurde am 20. September 1984 beim Fermentation Research Institut, Agency of Industrial Science and Technology unter der Hinterlegungsnummer FERM BP-612 hinterlegt.
- Etwa 2 ug des Plasmids pGHB3 (Europäische Patentanmeldung, Publikationsnr. 152613A; IGHB3, FERM BP-403), das den lecI-Promotor (vgl. Europäische Patentanmeldung, Publikationsnr. 152613A), enthielt, der Escherichia coli Lipoprotein-Gen (1pp) Terminator und menschliche Interferon-γ-cDNA wurden in 30 ul Y-50 Puffer (ein Puffer der 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 50 mM NaCl, 7 mM MgCl&sub2; und 6 mM 2-Mercaptoethanol enthielt), gelöst. 8 Einheiten PvuII wurden zugesetzt und die Verdauungsreaktion wurde 2 Stunden bei 3 7ºC durchgeführt.
- Dann wurde NaCl zugesetzt, um eine Konzentration von 150 mM einzustellen. 8 Einheiten SalI wurden zugesetzt und die Verdauungsreaktion wurde 2 Stunden bei 37ºC durchgeführt. Das durch Extraktion des aus der Verdauungsreaktion resultierenden Gemisches mit Phenol und Chloroform und Präzipitation mit Ethanol erhaltene DNA-Fragment wurde in einem Gesamtvolumen von 30 ul eines Puffers gelöst, der 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 7 mM MgCl&sub2;, 6 mM 2-Mercaptoethanol, 0,25 mM dATP, 0,25 mM dcTP, 0,25 mM dGTP und 0,25 mM dTTP enthielt. 4 Einheiten der von Escherichia coli abgeleiteten DNA Polymerase I, Klenow Fragment (Takara Shuzo) wurden zugesetzt und die Verdauungsreaktion wurde 2 Stunden bei 15ºC durchgeführt, um die vorstehenden Enden, die aus der Verdauung resultieren, zu begradigen. Nach 10-minütiger Hitzebehandlung bei 65ºC wurde das größere DNA-Fragment (3,6 kb) durch 5 Elektrophorese auf niedrigschmelzendem Agarosegel gereinigt.
- Das auf diese Weise erhaltene DNA-Fragment (etwa 0,1 ug) wurde der Ligation unterworfen. Die Ligationsreaktion wurde in 20 ul eines Puffers durchgeführt, der 20 mM Tris-HCl (pH 7,6), 10 mM MgCl&sub2;, 10 mM Dithiothreitol und 0,5 mM ATP enthielt (im folgenden "T4 DNA-Ligase-Puffer 11"). Die Reaktion erfolgte in Gegenwart von 2 Einheiten T4 DNA-Ligase über einen Zeitraum von 18 Stunden bei 4ºC.
- Die auf diese Weise erhaltene rekombinante Plasmid-DNA wurde verwendet, um den Escherichia coli-Stamm HB101 zu transformieren, wobei Ampicillin-resistente Stämme isoliert wurden. Die Plasmid- DNA wurde aus einem der Transformanden-Stämme isoliert und dessen Struktur wurde analysiert. Als Ergebnis wurde bestätigt, daß das Plasmid pGHD7 die gewünschte Struktur aufwies.
- Etwa 3 ug des trp Promotor-enthaltenden Plasmids pKYP100 (T. Nishi et al., Agric. Biol. Chem, 48, 669-675 (1984)) wurden in 30 ul eines Puffers, enthaltend 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 50 mM NaCl, 7 mM MgCl&sub2; und 6 mM 2-Mercaptoethanol gelöst. 10 Einheiten PstI und 10 Einheiten HindIII wurden zugesetzt und die Verdauungsreaktion wurde 2 Stunden bei 37ºC durchgeführt. Nach 10 minütigem Erwärmen auf 65ºC wurde das kleinere DNA-Fragment (0,88 kb) durch Gelelektrophorese auf niedrigschmelzender Agarose gereinigt.
- Darüber hinaus wurden etwa 3 ug des Human-γ-Interferon- Expressionsplasmids pGEL1 (FERM BP-612); Europäische Patentanmeldung, Publikationsnr. 16644A) in 30 ul Y-100-Puffer gelöst. 10 Einheiten PstI und 10 Einheiten NcoI wurden zugesetzt und die Verdauungsreaktion wurde 2 Stunden bei 37ºC durchgeführt. Nach 10-minütigem Erwärmen auf 65ºC wurde das größere DNA-Fragment (1,7 kb) durch Gelelektrophorese auf niedrigschmelzender Agarose gereinigt.
- Eine Linker-DNA (die eine EcoRV-Schnittstelle und eine Sali- Schnittstelle aufwies) wurde zur Kopplung der beiden oben erwähnten gereinigten DNA-Fragmente verwendet:
- Die beiden einzelsträngigen DNAs (jeweils 36-mer), die oben gezeigt sind, wurden mit Hilfe der herkömmlichen Phosphotriestermethode (R. Crea et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 75, 5765 (1978)) synthetisiert. Jede DNA (20 Picomol) wurde in einem Gesamtvolumen von 20 ul einer Lösung gelöst, die 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl&sub2;, 5 mM Dithiothreitol, 0,1 mM EDTA und 1 mM ATP enthielt. 4 Einheiten T4 Polynucleotidkinase wurden zugesetzt und die Phosphorylierungsreaktion wurde 30 Minuten bei 37ºC durchgeführt. Gleiche Mengen dieser einzelsträngigen DNAS wurden vermischt, 5 Minuten auf 65ºC erwärmt und dann allmählich auf Zimmertemperatur abgekühlt, wodurch man einen Linker mit obiger Struktur erhielt.
- Dieser DNA-Linker (1 Picomol) und die beiden oben erwähnten gereinigten DNA-Fragmente (jeweils 0,1 ug) wurden miteinander in 20 ul des oben erwähnten T4 DNA-Ligase-Puffers 11 in Gegenwart von 2 Einheiten T4 DNA-Ligase bei 4ºC ligiert. Die Ligationsreaktion wurde 18 Stunden durchgeführt.
- Die auf diese Weise erhaltene rekombinante Plasmid-DNA wurde verwendet, um den Escherichia coli-Stamm HB101 zu transformieren, wobei Ampicillin-resistente Stämme erhalten wurden. Die Plasmid-DNA wurde aus einem dieser Transformandenstämme isoliert und dessen Struktur wurde analysiert. Es wurde bestätigt, daß das konstruierte Plasmid pArg4 die gewünschte Struktur aufwies.
Claims (14)
1. Peptid mit der Aminosäuresequenz:
Formel
2. DNA, welche für ein Peptid mit der folgenden
Aminosäuresequenz kodiert:
Formel
3. DNA mit der folgenden Nucleotidsequenz:
Formel
worin die auf die Symbole ClaI, BglII, BamHI und SacI
gerichteten Linien die Schnittstellen für die jeweiligen
durch die Symbole angegebenen Restriktionsenzyme angeben,
und worin A, T, G und C für die Basen Adenin, Thymin,
Guanin bzw. Cytosin in dem Nucleotid stehen.
4. DNA mit der Nucleotidsequenz:
Formel
5. DNA mit der Nucleotidsequenz:
Formel
6. DNA mit der Nucleotidsequenz:
Formel
7. DNA mit der Nucleotidsequenz:
Formel
8. Rekombinante DNA, in welche eine DNA insertiert ist, die
fur ein Peptid mit der in Anspruch 1 angegebenen
Aminosäuresequenz kodiert.
9. Verfahren zur Herstellung eines Peptids mit der in
Anspruch 1 angegebenen Aminosäuresequenz, wobei man
(a) in einem Wachstums-Nährmedium einen Mikroorganismus
kultiviert, der eine rekombinante DNA enthält, in
welche eine DNA insertiert ist, die für ein Peptid
mit der in Anspruch 1 angegebenen Aminosäuresequenz
kodiert, und man das Peptid mit der in Anspruch 1
angegebenen Aminosäuresequenz in der Kultur anhäuft,
und
(b) das Peptid aus der Kultur isoliert.
10. Peptid mit folgender Aminosäuresequenz:
11. Verfahren zur Herstellung eines Peptids mit folgender
Aminosäuresequenz:
wobei man ein Peptid mit der in Anspruch 10 angegebenen
Aminosäuresequenz mit Carboxypeptidase A und
Carboxypeptidase B abbaut.
12. Polymeres Peptid mit der Aminosäuresequenz:
worin
n für einen Wert von 2 bis 32 steht.
13. Spacerpeptid mit der Aminosäuresequenz:
X-Arg-Ile-Phe-Met-X
worin X ein Nachbar-Peptid mit der folgenden
Aminosäuresequenz ist:
und Met für Methionin steht, wobei das Spacerpeptid
entfernbar ist, indem man nacheinander mit Cyanogenbromid,
Carboxypeptidase A und Carboxypeptidase B unter Bildung
von monomerem X behandelt.
14. Pharmazeutisches Mittel, enthaltend eine therapeutisch
wirksame Menge des Peptids gemäß Anspruch 1 zusammen mit
einem pharmazeutisch akzeptablen Träger oder
Verdünnungsmittel.
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