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DE3421789A1 - Arzneimittel aus dem thymus und verfahren zu dessen herstellung - Google Patents

Arzneimittel aus dem thymus und verfahren zu dessen herstellung

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DE3421789A1
DE3421789A1 DE19843421789 DE3421789A DE3421789A1 DE 3421789 A1 DE3421789 A1 DE 3421789A1 DE 19843421789 DE19843421789 DE 19843421789 DE 3421789 A DE3421789 A DE 3421789A DE 3421789 A1 DE3421789 A1 DE 3421789A1
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DE
Germany
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thymus
polypeptides
acetic acid
tissue
extraction
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DE19843421789
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Vladimir Chatskelevič Leningrad Chavinson
Vjačeslav Grigor'evič Morozov
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LE G PED I IM A I GERCENA
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LE G PED I IM A I GERCENA
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Publication date
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Description

ARZNEIMITTEL AUS DEM THYMUS UND VERFAHREN 3 4 217 8 9 ZU DESSEN HERSTELLUNG
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf das Gebiet der Medizin, insbesondere auf ein Arzneimittel aus dem Thymus und auf ein Verfahren zu dessen Herstellung und kann zur Wiederherstellung der gestörten Prozesse der Immunogenese, Regenerierung, Hämopoese, Hämokoagulation und zur Normalisierung des Kohlenhydrat-, Fett- und Eiweißstoffwechsels beim Menschen verwendet werden.
Es ist bekannt, daß in den Extrakten aus dem Thymus (Thymusdrüse ) der Menschen und Tiere physiologisch wirksame Stoffe enthalten sind, die das Wachstum und die Entwicklung des Organismus sowie einige immunologische und metabolische Prozesse beeinflussen (Comsa T., Amer. J.Med. Sei. 250, 79, 1965; Goldstein A. et al., J.Immunol. 140, 559, 1970; SU-PS Nr. 459227, US-PS Nr. 4120951).
Nach den Literaturangaben wird der Extrakt aus dem Thymusgewebe von Kälbern (Thymozin) zum therapeutischen Ziel zur Wiederherstellung der Funktion des Immunitätssystems beim Menschen bei einigen onkologischen Erkrankungen und Erkrankungen mit angeborener Insuffizienz des immunologischen Systems verwendet (Goldstein A. et al., Transplant Proc. 7. 1 (suppl. I), 681, 1975» Sakai et al., Cancer 56, 5, 975, 1975).
Die Einführung von Thymozin den Kranken führte zur Wiederherstellung der gestörten immunologischen Reaktivität des Organismus. Nichtsdestoweniger sind bis heute die therapeutische Effektivität der physiologisch wirksamen Stoffe aus dem Thymusgewebe sowie die Indikationen zu deren Verwendung in der medizinischen Praxis nicht genügend untersucht norden.
Heutzutage ist ein Arzneimittel aus dem Thymusgewebe - Thymozin bekannt (Goldstein A. et al. Proo. Nat. Acad. Sei. USA, 69, 7, 1800, 1972), das einen Komplex (gegen 50 Komponenten) der sauren Polypeptide von 1000 bis 14000 Dalton Molekularmasse darstellt (Hooper et al., Ann. N.-Y. Acad. Sei., 249, 125, 1975). Thymozin wird folgenderweise hergestellt (Hooper et al., 1975). Man homogenisiert
Q/. 9 1 7 Q q _ 4 —
den Kalberthymus in einer 0,15 molaren NaCl-Lösung, zentrifugiert bei 14000 g, isoliert die Flüssigkeit über dem Niederschlag, erwärmt diese bei einer Temperatur von 80 0C, filtriert den ausgefallenen Niederschlag ab und gibt der zurückgebliebenen Lösung 5 Azetonvoluaiina hinzu. Man trocknet den erhaltenen Niederschlag auf dem Filter, löst dann wieder auf und salzt mit Ammoniumsulfat zuerst bei der 25%igen Sättigung und dann bei der 50%igen
Sättigung aus. Man filtriert das nach der Aussalzung erhaltene Präzipitat, entsalzt auf einer Kolonne mit SeI-fadex G-25 und lyophilisiert. In der gegebenen Reinigungsstufe besitzt der erhaltene Komplex der im Arzneimittel enthaltenen Polypeptide die am deutlichsten ausgeprägte biologische Wirksamkeit -die Fähigkeit, die Zellenimmunität anzuregen (Hooper et al., 1975)·
Eine weitere Präparatreinigung führt zur Herabsetzung der biologischen Wirksamkeit.
Das nach dem genannten Verfahren erhaltene Thymozin besitzt einen Komplex der sauren Polypeptide mit einem isoelektrischen Punkt von 3,5 bis 6,7 and der Molekularmasse von 1000 bis 14000 Dalton unter bedeutendem Vorherrschen der Asparagin- und Glutaminsäure, die insgesamt 50 Masse%, bezogen auf die Thymozinmasse, betragen.
Bs muß gesagt werden, daß das Herstellungsverfahren von Thymozin kompliziert, mehrstufig (10 Stufen) ist. Die Verwendung dieses Verfahrens unter großtechnischen Bedingungen ist mit bestimmten Schwierigkeiten verbunden (solche Vorgänge, wie Ultrazentrifugieren, Verwendung von Sefadexen). Das Verfahren sichert keine genügend hohe Ausbeute an Arzneimittel Thymozin. Bei einer Reihe von Kranken ruft Thymozin Nebeneffekte und allergische Reaktionen hervor. Die therapeutische Effektivität von Thymozin und die Möglichkeit, dieses in der medizinischen Praxis zu verwenden, sind nicht vollständig untersucht worden.
yj Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, solch ein
Arzneimittel aus dem Thymusgewebe, das Polypeptide alkalischer Natur enthält, durch die Auswahl entsprechender technologischer Herstellungsvorgänge zu entwickeln, das
ein breiteres pharmakologisehes Wirkungsspektrum unter Ausbleiben der Nebeneffekte und allergischen Reaktionen bei dessen Anwendung besitzt.
Die Aufgabe wird dadurch gelöst, daß ein das PoIypeptide mit dem isoelektrischen Punkt von 3,5 bis 6,7 enthaltende Arzneimittel aus dem Thymus, vorgeschlagen wird, das erfindungsgemäß Polypeptide von 600 bis 6000 DaIton Molekularmasse enthält, von denen 10 bis 20 Masse% einen isoelektrischen Punkt von 7 bis 9 und eine Molekularmasse von 2000 bis 4000 Dalton haben.
Die Verwendung des erfindungsgemäßen Arzneimittels aus dem Thymus in der medizinischen Praxis gestattet, die herabgesetzte immunologische Reaktivität des Organismus anzuregen ,die Aktivität der Reparationsprozesse und der Hämopoese zu fördern sowie der Entwicklung der Infektions- und Destruktionsprozesse im Organismus vorzubeugen, was ermöglicht, eine Reihe der Ecke anklingen effektiver zu kurieren oder deren Entwicklung beim Menschen vorzubeugen. Die Verwendung des Arzneimittels aus eiern Thymus unter stationären Bedingungen gestattet, die Behandlungsdauer der Kranken mit chronischen Erkrankungen und gestörten Regenerierungsprozessen wesentlich herabzusetzen, was bei der Verwendung der Erfindung in der Medizin ausschlaggebend sein kann· Zum Unterschied von den bekannten Präparaten aus dem Thymus regt das erfindungsgemäße Arzneimittel aus dem Thymus dank dem Vorliegen von Polypeptiden alkalischer Natur darin die Prozesse der Regenerierung der verletzten Gewebe an, was sich in der Verminderung der Dauer der
JO Wunden- und Geschwüreheilung äußert. Das Arzneimittel regt auch die Blutbildungsprozesse an, was sich in der Erhöhung der Menge von Leukozyten, Thrombozyten und Erythrozyten im Falle deren erniedrigten Gehalts im peripheren Blut äußert. Das erf indungsgemäße Arzneimittel aus dem Thymus ruft keine Nebenerscheinungen und allergischen Reaktionen hervor, während es nach den Literatur angaben bekannt ist, daß die Verwendung von Thymozin bei 20 bis 30% der Kranken von allergischen Reaktionen begleitet wird.
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Es wird auch ein Verfahren zur Herstellung des Arzneimittels aus dem Thymus vorgeschlagen, das die Homogenisierung des Thymusgewebes, die Trennung des erhaltenen Homogenats in den Niederschlag und in die Flüssigkeit über dem Niederschlag, deren Behandlung mit einem organischen Lösungsmittel mit darauffolgender Isolierung des Endproduktes vorsieht, in welchem erfindungsgemäß das Homogenat des Thymusgewebes vor der Trennung mit einer 1 - 10%igen wäßrigen Essigsäurelösung in Gegenwart von Zinkchlorid mindestens während 24 Stunden extrahiert wird.
Das erfindungsganäße Verfahren ist durch eine einfache Technologie gekennzeichnet und unter Industriebedingungen leicht reproduzierbar. Das Verfahren gestattet, Proteine hoher Molekularmasse und andere hochmolekulare Verbindungen zu hydrolisieren, das Arzneimittel aus dem Thymus mit einer hohen Ausbeute und von einem hohen Heinheitsgrad zu erhalten, das bei der Einführung in den Organismus keine Nebenerscheinungen und keine allergischen Reaktionen hervorruft· Die Verwendung einer langwierigen Extraktion mit Essigsäure in Gegenwart katalytischer Mengen von Zinkchlorid trägt zum Entzug der Polypeptide von alkalischer Natur bei, deren Vorliegen im Arzneimittel die Erweiterung seines pharmakologischen Wirkungsspektrums bewirkt. Es ist zweckmäßig, zur maximalem Isolierung der Polypeptide mit dem isoelektrischen Punkt von 7 bis 9 und einer Molekülarmasse von 2000 bis 4000 DaIton, welche die höchste biologische Wirksamkeit besitzen, die Extraktion innerhalb von 48 bis 72 Stunden bei einem pH-Wert von 2,5 bis 4 und einer Temperatur von 5 bis 150C in Gegenwart von Zinkchlorid durchzuführen, das in einer Menge von 0,2 bis 2 g pro I 1 Essigsäure genommen wird.
Um die biologisch wirksamen Stoffe - Polypeptide alkalischer Natur vollständiger zu isolieren und die Rohstoffkonservierung zu bewirken, wird das Thymusgewebe vor der Homogenisierung vorzugsweise bei einer Temperatur von -3O0C bis -5O0C mindestens während 100 Stunden stehengelassen.
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Wir untersuchten die Eigenschaften dea Arzneimittels aus dem Thymus nach der Methode der Ionenaustauschchromatografie auf dem Karboxylkat ionenaustauscher "Biokarb" in der H+-Form (N.N.Xusnecova und andere, Hochmolekulare Verbindungen, 18a, 2, 555» 1976), der Gel-Filtration (Fish et al.,
J. Biol. Chem, 244, 4989, 1969), der zonalen Papierelektrophorese und der Elektrophorese im Polyacryl amid gel (nach üblichen Methoden) und der Aminosäurenanalyse (nach der Methode von Stein und Mur, J. Biol. Chem., 176, JO?, 1948). Mit Hilfe der Methode der Ionenaustauschohromatografie wurde festgestellt, daß die isolierten Stoffe 5 Fraktionen in einem bestimmten Prozent verhältnis enthalten, die sich durch elektrochemische Eigenschaften unterscheiden.
Nachstehend wird Tabelle 1 angeführt, in der physikai is ch-chem is ehe Charakteristiken der Fraktionen dargestellt werden, welche im erfindungsgemäßen Arzneimittel aus dem Thymus enthalten sind.
Tabelle
Komponente Gehalt, Molekular» isoelektrischer
Masae% masse, Punkt, Einh. des
DaIton pH-Wertes
Fraktion I 40-70 600-1000 3,5-5,0
Fraktion II 20-40 5000-6000 5,5-6,7
Fraktion III 10-20 2000-4000 7,0-9,0
Die Fraktionen I, II, III bestehen aus einer Reihe von Komponenten, die nach der Methode der zonalen Elektrophorese an den Tag gelegt werden. Die Molekül ar masse jBder Fraktion wurde mit Hilfe der Gel-Filtration auf Sefadex G-25 bestimmt.
Zur Festlegung des Aminosäurenbestands der Peptide der obengenannten Fraktionen wurde der automatische Aminosäurenanalysator "LKB-^lO" (Schweden) nach der Methode von Spackman D.H. et al. Anal. Chem., 1958, 30, 1190-1206 angewandt.
Nachstehend wird in Tabelle 2 der Aminosäurenbestand
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des erfindungsgemäßen Arzneimittels aus dem Thymus angeführt.
Tabelle 2
Aminosäure
Aminosäurengehalt im erfindungsgemäßen Arzneimittel, Mol.%
Gehalt in Fraktionen, Mol%
Prak- Fr ak- Fraktion tion tion I II III
Asparaginsäure 5,8
Threonin 5,7
Serin 5,7
Glutaminsäure 6,2
Prolin 10,1
GIyζin 8,6
Alanin 10,7
Cyst in 3,4
Valin 8,8
Methionin Spuren
Isoleucin 3,9
Leucin 6,7
Tyrosin 2,4
Phenylalanin 3,2
Histidin 2,9
Lysin 7,0
Arginin 8,5
Tryptophan Spuren
6,3 6,3 6,5 8,6
10,8 10,4 12,6 2,6 5,2
Spuren 2,3 6,2 1,2 1,7 2,9 8,5 7,a
Spuren
0,6
6,4
7,5
14,1
13,2
11,7
8,7
1,0
6,5
5,8
2,4
3,3 2,2
7,1
4,6
4,2
5,8
10,4
6,2
9,5
10,1
18,6
0,9
3,9
1,3 3,2 0,8 0,9 0,5 21,6
2,1
Spuren Spuren
Die biologische Wirksamkeit und ein breites pharmakologisches Wirkungsspektrum des erfindungsgemäßen Arzneimittels aus dem Thymus von 600 bis 6000 Dal ton Molekularmasse sind auf das Vorliegen von 10 bis 20 Masse % Polypeptide mit einem isoelektrischen Punkt von 7 bis 9 und einer Molekülarmasse von 2000 bis 4000 Dal ton zurückzuführen, die durch den Gehalt an Hauptaminosäurenreste, beispielsweise Lysin,gekennzeichnet werden. Den physikalisch-chemischen Eigenschaften und dem
3 1 τ ι non
Aminosäurenbestand nach unterscheidet sich das Arzneimittel aus dem Thymus wesentlich von Thymozin, das aus einem Komplex der sauren Polypeptide (der isoelektrische Punkt von 3,5 bis 6,7) von 1000 bis 14000 Dalton Molekülarmasse unter bedeutendem Vorherrschen der Asparagin- und Glutaminsäure besteht, die insgesamt gegen 50 Masse% des Präparats betragen. (Hooper et al., Ann. N.-Y. Acad. Sei., 249, 125, 1975).
Das erfindungsgemäße Arzneimittel aus dem Thymus wird folgenderweise hergestellt.
Das Thymusgewebe wird von Gefäßen, Blutkuchen, vom Fettzellgewebe gereinigt, mit Wasser gewaschen und der Homogenisierung unterzogen.
Um den Rohstoff zu konservieren und die Ausbeute an biologisch wirksamen Stoffen, Polypeptiden mit isoelektrischen Punkten von 3,5 bis 6,7 und von 7 bis 9 zu erhöhen, empfiehlt es sich, das Thymusgewebe vor der Homogenisierung bei einer Temperatur von -500C bis -300C stehenzulassen oder dieses mit einem organischen Lösungsmittel wie Aceton, Chloroform, Äthylalkohol bei einer Temperatur von -200C bis -I0C zu behandeln.
Das Homogenat des Thymiisgewebes wird der Extraktion mit einer 1 - 10%igen wäßrigen Essigsäurelösung in Gegenwart von Zinkchlorid mindestens während 24 Stunden unterzogen. Die Durchführung der Extraktion unter solchen Bedingungen trägt zur vollständigsten Isolierung der Polypeptide von 2000 bis 4000 Dalton Molekül ar masse mit einem isoelektrischen Punkt von 7 bis 9 bei und sichert die Entfernung der Proteine und der hochmolekularen Verbindüngen, die allergische Reaktionen bei der Einführung des Arzneimittels aus dem Thymus den Kranken hervorrufen. Die optimale Verhältnisse der Extrakt ions durchführung ist ein pH-Wert von 2,5 bis 4., eine Temperatur von 5 bis 150C und eine Dauer von 48 bis 72 Stunden bei einem Gehalt an Zinkchlorid von 0,2 bis 2 g pro I 1 Essigsäure.
Nach der Beendigung der Extraktion wird das erhaltene Substrat in den niederschlag und in die Flüssigkeit über dem Niederschlag getrennt, die mit einem organischen
Lösungsmittel wie Aceton, Chloroform, Äthylalkohol mit darauffolgender Isolierung des sich gebildeten Niederschlags behandelt wird. Der Niederschlag wird zum FuIver getrocknet, das biologisch wirksame Stoffe, Polypeptide, enthält.
Das Pulver wird in Essigsäure gelöst, die Lösung wird durch nitration sterilisiert und in sterile Flaschen je zu I ml abgefüllt, dann lyophilisiert und mit sterilen Gummipfropfen verschlossen. Eine Flasche enthält IO mg der aus dem Thymus isolierten Stoffe.
Das erhaltene Arzneimittel aus dem Thymus enthält biologisch wirksame Stoffe, Polypeptide von 600 bis 6000 Dalton Molekülarmasse, bei deren folgendem Verhältnis (Masse%):
Polypeptide mit einem isoelektrischen Punkt
von 5»5 bis 6,7 9O-8O
Polypeptide mit einem isoelektrischen Punkt
von 7 bis 9 10-20
Das Arzneimittel aus dem Thymus stellt ein amorphes weisses Pulver oder ein weisses Pulver mit gelblicher Schattierung dar, ist in 5%iger Essigsäurelösung, in Wasser löslich, ist im Alkohol praktisch unlöslich, enthält kein Protein· der pH-Wert der I^igen wässrigen Lösung beträgt 5 bis 5,8. Das Arzneimittel aus dem Thymus wird an trockener, lichtgeschützter Stelle bei einer Temperatur von höchstens +200O innerhalb von 2 Jahren aufbewahrt·
Das Arzneimittel aus dem Thymus wird intramuskulär eingeführt. Der Flascheninhalt wird vor der Injektion in 1 bis 2 ml physiologischer Lösung oder Novokainlösung aufgelöst. Die Behandlungskur mit dem Arzneimittel aus dem !Hhymus beträgt 5> bis 20 Tage zu IO bis 30 mg täglich. Es wurden breite klinische Untersuchungen des erfindungsgemässen Arzneimittels aus dem Thymus bei einer Reihe menschlicher Erkrankungen . unternommen, die gezeigt haben, dass es ein breiteres pharmakologisches Wirkungsspektrum besitzt, als das nach den Literaturangaben bekannte Präparat aus dem Thymus, ohne Nebenerscheinungen und allergische Reaktionen hervorzurufen.
Das erfindungsgemäße Arzneimittel aus dem Thymus wird empfohlen zur Behandlung von akuten und chronischen ei-
-ii_ 3 4 2 1 7 8 G
trigen Ent ζ ündungs erkrankungen der Knochen und der Weich" gewebe, von der chronischen posttraumatischen und hä'matogenen Osteomyelitis, von Knochenbrüchen, von Brandwunden, von trophischen Geschwüren, Wundliegen, Strahlennekrο-se der Gewebe, von Atherosklerosis obliterans, von chronischen Pneumonien, von peptischen Geschwüren· von den Zuständen, die mit der Hypofunktion des Thymus, mit der Immunitäts- und Blutbildungshemmung nach der durchgeführten Strahlentherapie oder Chemotherapie bei onkologischen Kranken verbunden sind. Es wird empfohlen, das Arzneimittel aus dem Thymus zwecks Prophylaxe der Infektionskomplikationen, Hemmung der Immunität, Blutbildung,
Regenerationsprozesse in der posttraumatischen und postoperativen Periode, während der Durchführung der Strahlentherapie oder Chemotherapie, beim Gebrauch massiver Antibiotikadosen zu verwenden. Es empfiehlt sich, das Arzneimittel bei Unverträglichkeit der antibakteriellen Therapie oder beim Ausbleiben des Effekts sowie als Normalisierungsmittel bei funktionellen Störungen des Kohlenhydrat-, Fett- und EiweiJBstoffwechsels im Organismus zu verwenden.
Bei der Herstellung des erfindungsgeinässen Arzneimittels aus dem Thymus wird von uns eine einfache, billige Technologie benutzt, die unter grosstechnischen Bedingungen leicht reproduzierbar ist und gestattet, ein Präparat von hoher Qualität, in einer hohen Ausbeute zu erhalten, die die Ausbeute, beispielsweise von Thymozin um das 5-fache übersteigt.
Unten werden konkrete Beispiele zur Herstellung des erfindungsgema'ssen Arzneimittels aus dem Thymus angeführt. Beispiel 1.
5OO g Thymusgewebe, das von Gefässen, Blutkuchen, IFettzellgewebe gereinigt wurde, werden mit Wasser, Aceton gewaschen und dann in Aceton, das in einem Gewichtsverhältnis zum Thymusgewebe von 4:1 genommen wird, bei einer Temperatur von t-1°C innerhalb von 24 Stunden stehengelassen und danach der Homogenisierung unterzogen. Das erhaltene Homogenat des Thymusgewebes wird in eine 3%ige wässrige
_ 12 _
Essigsäurelösung bei deren Gewichtsverhältis von 1 bzw. zu 6 eingebracht. Die Extraktion wird bei einem pH-Wert von 3»2, einer Temperatur von 1O0C während 72 Stunden in Gegenwart von Zinkchlorid durchgeführt, das in einer Menge von 1 g pro I 1 der genannten Essigsäure genommen wird.
Nach der Beendigung der Extraktion wird das Substrat bei 3000 U/min während 20 min zentrifugiert, die Flüssigkeit über dem Niederschlag wird isoliert und dazu wird A eton bei deren Gewichts verhältnis von 1 bzw. zu 5 zugegossen.
Der sich bildende Niederschlag wird abfiltriert, mit Azeton gewaschenund auf dem Filter getrocknet. Man erhält 5 S weißes Pulver, das biologisch wirksame Stoffe, Polypeptide von 600 bis 6000 DaIton Molekularmasse bei deren folgendem Verhältnis (Massel) enthält:
Polypeptide mit einem isoelektrischen Punkt
von 3,5 bis 6,7 80
Polypeptide mit einem isoelektrischen Punk*
von 7 bis 9 20.
Das erhaltene Arzneimittel aus dem Thymus stellt ein weißes Pulver dar, das in 5%igez Essigsäure, in Wasser löslich ist; der pH-Wert der l%igen wäßrigen Lösung beträgt 5,5.
Zur Herstellung der Arzneiform des Arzneimittels aus dem Thymus wird das erhaltene Pulver in 5OO ml l%iger Essigsäure gelöst. Die Präparatlösung wird durch Filtration sterilisiert und in sterile Flaschen je zu 1 ml abgefüllt, dann lyophilisiert und mit Gummipfropfen verschlossen. Im Ergebnis enthält eine Flasche 10 mg Stoffe, die aus dem Thymusgewebe isoliert worden sind. Beispiel 2.
50Og Thymusgewebe, das von Gefäßen, Blutkuchen, Fettzellgewebe gereinigt wurde, werden mit Wasser, Chloroform gewaschen und dann in Chloroform, das in einem Gewichtsverhältnis zum Thymusgewebe von 8:1 genommen wird, bei einer Temperatur von -1O0C innerhalb von 48 Stunden stehengelassen und danach der Homogenisierung unterzogen. Das erhaltene Homogenat des Thymusgewebes wird in eine l%ige wäßrige Essigsäurelösung bei einem Gewichtsverhältnis von
1 bzw. zu lO eingebracht. Die Extraktion wird bei einem pH-Wert von 4, einer Temperatur von 15°C während 48 Stunden in Gegenwart von Zinkchlorid durchgeführt, das in einer Menge von 2 g pro I 1 der genannten Essigsäure genommen wird. Nach der Beendigung der Extraktion wird das Substrat während 24 Stunden filtriert, die Flüssigkeit über dem Niederschlag wird isoliert und dazu wird Chloroform bei deren Gewichtsverhältnis von 1 bzw. zu 8 zugegossen. Der sich bildende Niederschlag wird abfiltriert, mit Chloroform, gewaschen und auf dem Filter getrocknet. Man erhält 3 g weißes Pulver, das biologisch wirksame Stoffe, Polypeptide von 600 bis 6000 Dalton Molekularmasse bei deren folgendem Verhältnis (Masse%) enthält: Polypeptide mit einem isoelektrischen Punkt von 3,5 bis 6,7 3D
Polypeptide mit einem isoelektrischen Punkt von 7 bis 9 10.
Das erhaltene Arzneimittel aus dem Thymus stellt ein weißes Pulver dar, das in 5%iger Essigsäure, in Wasaer löslich ist; der pH-Wert der l%igen wäßrigen Lösung beträgt 5,8.
Zur Herstellung der Arzneiform des Arzneimittels aus dem Thymus wird das erhaltene Pulver in 300 ml ^%lger Essigsäure gelöst. Die Präparatlösung wird durch Filtration sterilisiert und in sterile Flaschen je zu 1 ml abgefüllt, dann lyophilisiert und mit Gummipfropfen verschlossen. Im Ergebnis enthält eine Flasche 10 mg Stoffe, die aus dem Thymusgewebe isoliert worden sind.
Beispiel 3.
500 g Thymusgewebe, das von Gefäßen, Blutkuchen, Fettzellgewebe gereinigt wurde, werden mit Wasser gewaschen und der Homogenisierung unterzogen. Das erhaltene Homogenat des Thymusgewebes wird in eine 10%ige wäßrige Essigsäurelösung bei einem Gewichtsverhältnis von 1 bzw. zu 4 eingebracht. Die Extraktion wird bei einem pH-Wert von 2,5, einer Temperatur von 5°C innerhalb von 24 Stunden in Gegenwart von Zinkchlorid durchgeführt, das in einer Menge von 0,2 g zu I 1 der genannten Essigsäure genommen wird.
Nach der Beendigung der Extraktion wird das Substrat bei 5000 U/min während 10 min zentrifugiert, die Flüssigkeit über dem BTiederschlag wird isoliert und dazu wird Äthylalkohol bei deren Gewichtsverhältnis von 1 bzw. zu 10 zugegossen. Der sich bildende Niederschlag wird abfiltriert, mit Äthylalkohol gewaschen, auf dem Filter getrocknet. Man erhält 4 g weißes Pulver, das biologisch wirksame Stoffe, Polypeptide von 600 bis 6000 Dalton Molekülarmasse bei deren folgendem Verhältnis (Masse%)enthält:
Polypeptide mit einem isoelektrischen Punkt
von 3,5 bis 6,7 87
Polypeptide mit einem isoelektrischen Punkt von 7 bis 9 IJ.
Das erhaltene Arzneimittel aus dem Thymus stellt ein weißes Pulver dar, das in-5%iger Essigsäure löslich ist; der pH-Wert der l%igen wäßrigen Lösung beträgt 5»3·
Zur Herstellung der Arzneiform des Arzneimittels aus dem Thymus wird das erhaltene Pulver in 400 ml 3%iger Essigsäure gelöst. Die Präparatlösung wird durch Filtration sterilisiert und in sterile Flaschen je zu I ml abgefüllt, dann lyophilisiert und mit Gummipfropfen verschlossen. Im Ergebnis enthält eine Flasche 10 mg Stoffe, die aus dem Thymusgewebe isoliert worden sind. Beispiel 4.
500 g Thymusgewebe, das von Gefäßen, Blutkuchen, FettZellgewebe gereinigt wurde, werden mit Wasser gewaschen, bei einer Temperatur von -300C während 200 Stunden stehengelassen land danach der ' Homogenisierung unterzogen. Das erhaltene Homogenat des Thymusgewebes wird in eine 5%ige wä&r.
rige Essigsäurelösung bei einem Gewichtsverhältnis von 1 bzw. zu 5 eingebracht. Die Extraktion wird bei einem pH-Wert von 4, einer Temperatur von 120C innerhalb von 56 Stunden in Gegenwart von Zinkohlorid durchgeführt, das in einer Menge von 0,5 g pro I 1 der genannten Essigsäure genommen wird. Nach der Beendigung der Extraktion wird das Substrat bei 4000 U/min während 20 min zentrifugiert, die Flüssigkeit über dem Niederschlag wird isoliert und dazu wird Aceton bei deren Gewichtsverhältnis von 1 bzw.
zu 6 zugegossen. Der sich bildende Niederschlag wird durch Zentrifugieren isoliert, mit Aceton gewaschen und auf dem Filter getrocknet. Man erhält 5»5 g weißes Pulver, das biologisch wirksame Stoffe, Polypeptide von 600 bis 6000 Dalton Molekularmasse bei folgendem Verhältnis (Masf·· BQ%) enthält:
Polypeptide mit einem isoelektrischen Punkt von 3,5 bis 6,7 82
Polypeptide mit einem isoelektrisohen Punkt
von 7 bis 9 ia
Das erhaltene Arzneimittel aus dem Thymus stellt ein weißes Pulver mit gelblicher Schattierung dar, das in 5%iger Essigsäure löslich ist; der pH-Wert der i%igen wäßrigen Lösung beträgt 5,2.
Zur Herstellung der Arzneiform des Arzneimittels aus
dem Thymus wird das erhaltene Pulver in 550 ml 4%iger
Essigsäure gelöst. Die Präparatlösung wird durch PiItration sterilisiert und in sterile Flaschen je zu I ml abgefüllt, dann lyophilisiert und mit Gummipfropfen verschlossen. Im Ergebnis enthält eine Flasche 10 mg Stoffe, die aus dem Thymusgewebe isoliert worden sind. Beispiel 5.
500 g Thymusgewebe, das von Gefäßen, Blutkuchen, Fettzellgetiebe gereinigt wurde, werden mit Wasser gewascher bei einer Temperatur von -500C während 100 Stunden stehenge lassen und danach der Homogenisierung unterzogen. Des erhaltene Homogenat des Thymusgewebes wird in eine 2%ige wäßrige Essigsäurelösung bei deren Gewichtsverhältnis von 1 bzw. zu 7 eingebracht. Die Extraktion wird bei einem pH-Wert von 3,0 einer Temperatur von 80C während 60 Stunden in Gegenwart von Zinkchlorid durchgeführt, das in eine] Menge von 1,5 g pro I 1 der genannten Essigsäure genommen wird. Nach Beendigung der Extraktion wird das Substrat
bei 6000 U/min während 10 min zentrifugiert, die Flüssigkeit über dem Niederschlag wird isoliert und dazu wird Äthylalkohol bei einem Gewichtsverhältnis von 1 bzw. zu 10 zugegossen. Der sich bildende Niederschlag wird abfiltriert, mit Äthylalkohol gewaschen, auf dem Filter
getrocknet. Man erhält 5,6 g weißes Pulver, das biologisch wirksame Stoffe, Polypeptide von 600 bis 6000 Dalton Molekularmasse bei folgendem Verhältnis (Masse%) enthält:
Polypeptide mit einem isoelektrischen Punkt
von 5i5 bis 6,7 80
Polypeptide mit einem isoelektrischen Punkt
von 7 bis 9 20.
Das erhaltene weiße Pulver ist in 5%iger Essigsäure, in Wasser löslich; der pH-Wert der l%igen wäßrigen Lösung beträgt 5f4.
Zur Herstellung der Arzneiform des Arzneimittels aus dem Thymus wird das erhaltene Pulver in 570 ml 2%iger Essigsäure gelöst. Die Präparatlösung wird durch Filtration sterilisiert und in sterile Flaschen je zu I ml abgefüllt, darm lyophilisiert und mit Gummipfropfen verschlossen. Im Ergebnis enthält eine Flasche 10mg Stoffe, die aus dem Thymusgewebe isoliert worden sind.

Claims (1)

  1. v.FüNER EBBINGHAUS FINCK
    PATENTANWÄLTE EUROPEAN PATENT ATTORNEYS
    MARIAHILFPLATZ 2 & 3, MÜNCHEN 9O POSTADRESSE: POSTFACH 95 O1 6O, D-8OOO MÖNCHEN 95
    3421739
    Leningradskij Gosudarstvennyj DEAA-31944.8
    Pedagogi2eskij Institut imeni
    A.I. Gercena 12.. Juni 1984
    ARZNEIMITTEL AUS DEM THYMJS UND ZU DESSEN HERSTELLUNG PATENTANSPRÜCHE
    1. Arzneimittel aus dem Thymus, das Polypeptide mit einem isoelektrischen Punkt von 3»5 bis 6,7 enthält, d adurch gekennzeichnet, daß es Polypeptide von 600 bis 6000 Dalton Molekülarmasse enthält, von welchen 10 bis 20 Masse% einen isoelektrischen Punkt von 7 bis 9 und eine Molekül ar masse von 2000 bis 4000 Dalton haben.
    2. Verfahren zur Herstellung des Arzneimittels aus dem Thymus nach Anspruch 1, das
    - die Homogenisierung des Thymusgewebes,
    - die Trennung des erhaltenen Homogenats in den NIederschlag und die Flüssigkeit über dem Niederschlag;
    - die Behandlung der Flüssigkeit über dem Niederschlag mit einem organischen Lösungsmittel; und
    - die Isolierung des Endproduktes
    vorsieht, dadurch gekennzeichnet, daß man das Homogenat des Tnymusgewebes vor der Trennung mit einer 1 - 10%igen wäßrigen Essigsäurelösung in Gegenwart von Zinkchlorid mindestens während 24 Stunden extrahiert. 5. Verfahren nach Anspruch 2,dadurch gekennzeichnet, daß man die Extraktion im Verlaufe von 48 bis 72 Stunden durchführt.
    4. Verfahren nach Ansprucn 2, 3» dadurch g ekennze iohne t, daß man für die Extraktion Zinkchlorid in einer Menge von 0,2 bis 2 g nimmt, berechnet auf I 1 Essigsäure.
    5. Verfahren nach Anspruch 2 bis 4, dad urch gekennze lohnet, daß man die Extraktion bei einem pH-Wert von 2,5 bis 4 und einer Temperatur von 5 bis 150C durchführt.
    6. Verfahren nach Anspruch 2bis 5» dadurch gekennze lehnet, daß man das Thymusgewebe vor der Homogenisierung bei einer Temperatur von -5O0C bis -JO0C mindestens während 100 Stunden stehenläßt.
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