DE2553971A1

DE2553971A1 - Substanz mit einer antiviralen aktivitaet, verfahren zu ihrer herstellung und ihre therapeutische verwendung

Info

Publication number: DE2553971A1
Application number: DE19752553971
Authority: DE
Inventors: Albert Dr Med German; Jean-Louis Lamaison; Rolland-Yves Dr Mauvernay; Henri Pourrat
Original assignee: Centre Europeen de Recherches Mauvernay CERM
Current assignee: Centre Europeen de Recherches Mauvernay CERM
Priority date: 1974-12-02
Filing date: 1975-12-01
Publication date: 1976-08-12
Also published as: FR2293214A1; FR2293214B1; US4086216A; GB1508890A; JPS5191312A

Description

Anmelder: CENTRE EUROP^-IIT DE RECHERO¹:"^ MAUVIiRNAY "G.E.R.M." Route de Marsat, RIOM/Frankreich

Substanz mit einer antiviralen Aktivität, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre therapeutische Verwendung

Die Erfindung betrifft ein neues Glycoprotein, extrahiert aus dem Karpophor (Fruchtträger) eines Pilzes aus der Ordnung der Basidiomyceten, von Psalliota xanthoderma, und dessen Verwendung für die Behandlung von Viruserkrankungen; die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren, mit dessen Hilfe es möglich ist, dieses Glycoprotein aus dem frischen Pilz in einem hochreinen Zustand und in einer beträchtlichen Ausbeute zu gewinnen.

Nach der Entdeckung des-Penicillins aus einem Pilz, der zur Ordnung der Ascomyceten gehört, hat eine lebhafte Forschung innerhalb der Ordnung der Actinomyceten und insbesondere innerhalb des Genus Streptomyces dazu geführt, daß die größten Antibiotika entdeckt wurden (Streptomycin, Chloromycetin, Aureomycin, Terramycin und dgl.)·

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Diese systematische Untersuchung der Antibiotika hat auch dazu geführt, daß mit wäßrigen Extrakten von Pilzen, die zur Ordnung der Basidiomyceten gehören, große Reihenuntersuchungen durchgeführt wurden, bei denen der kleinste Index der bakteriostatischen Aktivität festgehalten wurde, ohne daß die derzeit verfügbaren Normen es erlaubten, das "Vorhandensein einer solchen Aktivität festzustellen_o Dies zeigt beispielsweise die in Großbritannien durchgeführte Arbeit von W.H. Wilkins, "Ann. App. Biol.", 51, 188 (194-6), die sich über 1000 Arten erstreckte, oder die Arbeit von N. Atkinson, "Austral. J. exp. Biol.", 24, Seite 169 (19^6)t die sich über 200 Arten erstreckte, darunter auch Psalliota xanthoderma_o

Bei einer sehr geringen Anzahl von Fallen ist es bei den Untersuchungen gelungen, einen Wirkstoff zu isolieren, der eine heute gerade noch anerkannte (feststellbare) bakteriostatische Aktivität aufweist« Dazu gehören z_oB. die Arbeiten von M. Willstaedt und B. Zetterberg, "Svensk. Kemisk. Tid.", 1966, _^8, 306, über Lactarius deliciosus, wobei es gelungen ist, das Lactarioviolin zu isolieren, sowie die Arbeiten von IT. Lofgren et al, "Svensk. Farm. Tidsk.", 194-9, S, 521, über Clitocybe nebularis, woraus das Nebularin isoliert wurde, Diese beiden Verbindungen sind aktiv gegenüber den Tuberkel*- bazillen.

Dagegen wurden antivirale Eigenschaften nur bei drei Arten von Basidiomyceten und bei einem Ascomyceten, der zu den Makromyceten gehört, festgestellt: bei den Basidiomyceten Galvatia gigantea, dessen wäßriger Extrakt gegenüber verschiedenen Echo-Viren aktiv ist, Cortinellus shiitake, dessen wäßrige und phenolische Extrakte gegenüber einem Influenzavirus vom Typ A aktiv sind, und Amanita phalloides, dessen Wirkstoff, das a-Amanitin, gegenüber verschiedenen ARN-Viren aktiv ist, jedoch auf die Wirtszelle eine starke Toxizität ausübt; bei den Ascomyceten das Oordiceps militaris,

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dessen Wirkstoff, das Cordycepin, gegenüber dem Leucovirus aktiv ist ο Bis auf den heutigen Tag ist es nicht gelungen, "bei einer Ton Psalliota xanthoderma extrahierten Verbindung eine antivirale Aktivität nachzuweisen«, Die einzigen Arbeiten, die über diesen Pilz bekannt sind, sind australische Arbeiten über die Toxizität im Vergleich zwischen einem wäßrigen Extrakt dieses Pilzes und Kaliumchlorid (E.G. Pope, "Australian, J. Exptl. Biol. Med. Sei.", 1950, 28, 361-366).

Die vorliegende Erfindung basiert nun darauf, daß das Vorhandensein bestimmter antiviraler Eigenschaften bei einer Substanz gefunden wurde, die nach einem speziellen Extraktionsverfahren aus Psalliota xanthoderma erhalten wurde«

Die Erfindung betrifft in erster Linie ein Verfahren, mit dessen Hilfe es möglich ist, aus den Earpophoren (lyuchtträgern) dieses Pilzes eine Substanz zu extrahieren, die als ein Glyeoprotein identifiziert wurde, die insofern bemerkenswert ist, als sie eine sehr geringe Toxizität und eine hohe antivirale Aktivität insbesondere gegenüber dem Virus Sindbis, dem Virus Herpes und dem Kuhpocken (Vaccine)-Virus aufweist bei gleichzeitig fehlender bakteriostatischer Aktivität,,

Die Erfindung bezieht sich ferner auf die bei diesem Verfahren erhaltene Substanz, die insbesondere durch dieses Verfahren definiert werden kann_e

Die Erfindung "bezieht sich schließlich auf die Verwendung dieser Substanz in der Humantherapie, insbesondere für die Behandlung der verschiedenen Herpeserkrankungen.

Das Verfahren der Erfindung besteht im Prinzip aus drei aufeinanderfolgenden Stufen: einer wäßrigen Extraktion, einer Dialyse und einer Lyophilisierung, die unter spezifischen Bedingungen durchgeführt werden_e

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In der Extraktionsstufe beginnt man zunächst mit einer Lyophilisierung von frischen Pilzkarpophoren (Pilzfruchtträgern), danach wird zerkleinert (gemahlen) und gesiebt unter Bildung eines halbfeinen Pulvers_o Dieses Pulver wird in einen Extraktor eingeführt, der 10 bis 4-0 Teile Wasser enthält, bei einer Temperatur von 35 "bis 40⁰C gehalten und gerührt ο Die Extraktion erfolgt dann etwa eine halbe Stunde lang, dann werden die pflanzlichen Reste (Bruchstücke) durch Zentrifugieren entfernte Die überstehende Flüssigkeit wird zuerst einer ersten Filtrierung und dann einer zweiten FiI-trierung auf einem stärker zusammengepreßten Träger in Gegenwart eines Filtrierhilfsmittels, beispielsweise eines Diatomeenpulvers, unterworfene Am Ende dieser ersten Stufe erhält man ein klares Filtrat, das insbesondere die erfindungsgemäße Substanz enthalte

In der folgenden Stufe unterwirft man das Filtrat, dessen pH-Wert vorher auf 6,5 his 7 eingestellt worden ist, bei einer Temperatur zwischen 10 und 15°C einer Dialyse_o

In einer letzten Stufe wird die in der Stufe 2 erhaltene Lösung sofort bei -60 0 eingefroren, dann 60 bis 72 Stunden lang lyophilisiert; das dabei erhaltene trockene Produkt, das noch 4- Gew.-% des in der ersten Stufe verwendeten Pulvers darstellt, wird in einer solchen Menge entionisiertem Wasser, die dem 50-f^achen seines Gewichtes entspricht, aufgenommen und nach dem Filtrieren durch ein Filterpapier oder eine Asbestoder öellulosescheibe wird die Lösung unter den gleichen Bedingungen wie oben einer zweiten Lyophilisierung unterworfene Das dabei erhaltene Produkt stellt noch 2 Gew.-% des in der ersten Stufe verwendeten Pulvers dar; es hat das Aussehen eines bräunlichen Pulvers und ergibt in Wasser eine extrem feinteilige Pseudo-Lösung, die nicht ausflockt.

In dem nachfolgenden Beispiel v/ird eine Ausführungsform der Erfindung näher beschrieben, es sei jedoch darauf hingewiesen,

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daß die Erfindung keineswegs auf die darin "beschriebenen einzelnen Arbeitsgänge und Arbeitsmittel beschränkt ist.

Beispiel

250 g halbfeines Pulver (Sieb 24-/28) der lyophilisierten Karpophoren von Psalliota xanthoderma, die etwa 15 Gew.-% der frischen Karpophoren darstellten, wurden bei einer Temperatur von 37 bis 38°C mit 5 1 Wasser extrahiert. Die Extraktion wurde etwa 1/2 Stunde lang unter Rühren mit I50 UpM fortgesetzt. Die Pflanzengewebe wurden durch Zentrifugieren und anschließendes Filtrieren entfernt.

Durch 10-minütiges Zentrifugieren mit 2000 UpM wurden die dichteren !Teile entfernt. Die überstehende Lösung enthielt suspendierte Teilchen einer geringen Dichte, die durch Filtrieren durch eine Glasfritte Nr₀ 0 entfernt wurden. Die dabei erhaltene Lösung wurde mit 50 g Diatomeenpulver versetzte

Es wurde erneut unter den gleichen Bedingungen wie oben filtriert, diesmal jedoch unter Verwendung von engeren (dichter gepackten) Membranen, wie z_oB. einer Glasfritte Nr. 1. Der durch das Piltrierhilfsmittel und die Verunreinigungen gebildete Kuchen wurde in etwa dem gleichen Volumen Wasser wieder suspendiert, dann erneut durch eine Glasfritte Nr. 1 filtriert. Das letzte Filtrat wurde mit dem vorhergehenden Piltrat vereinigt.

Der pH-Wert der dabei erhaltenen klaren Lösung wurde auf 7 eingestellt, dann wurde sie in Dialyseschläuche (-därme) eingeführte Es wurde ein konstanter Wasserzulauf in dem Dialysegefäß aufrechterhalten und man ließ den Vorgang 65 Stunden lang bei einer Temperatur in der Größenordnung von 10⁰C ablaufen_o Der Kaliumchloridgehalt, der vor der Dialyse 65»5 mg/g betrug, wurde auf 2 mg/g gebracht; der zuletzt genannte Wert erlaubte es, davon auszugehen, daß die Dialyse

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eine quantitative Entfernung des Kaliumchlorids ermöglicht hatteο

Die dialysierte Lösung wurde anschließend schnell bei etwa -60⁰C eingefroren, dann wurde sie ziemlich langsam in der Weise lyophilisiert, daß der Vorgang innerhalb von etwa 65 Stunden beendet war_o Es wurden 10,2 g lyophilisiertes Pulver gewonnen, die etwa 4 % des ursprünglich eingesetzten Pulvers darstellten,,

Dieses Lyophilisat wurde in einer solchen Menge entionisiertem Wasser aufgenommen, die dem 50-fachen seines Gewichtes entsprach· Ein Teil blieb in dem Wasser unlöslich und dieser wurde durch Filtrieren durch ein Blatt Filterpapier leicht entfernt. Die filtrierte Lösung, die danach einen pH-Wert in der Größenordnung von 8,4 hatte, wurde durch Zugabe einer Mineralsäure auf pH 6,5 eingestellte Diese Lösung wurde eingefroren und dann lyophilisiert, wobei diese beiden Arbeitsgänge nach dem vorstehend beschriebenen Verfahren durchgeführt wurde_e Dabei erhielt man 5 S eines bräunlichen Pulvers, dessen physikalisch-chemische Eigenschaften nachfolgend angegeben sind:

die Spektralanalyse dieses Pulvers, nachfolgend mit PX bezeichnet, in ultraviolettem und infrarotem Licht ergab die charakteristischen Protein-Banden:
UV: Absorptionsmaximum bei 277-278 mn, IR: Spitzenwerte bei 3300, 2950, 1645, 1540, 1450 und 1410 cm"¹,

Dabei handelte es sich im einzelnen um ein Glycoprotein, das zu etwa 40 % aus Proteinen und zu 10 bis 20 % aus Zuckern bestand, der Rest bestand aus adsorbierten Harzen. Die Bestimmung des Zuckergehaltes wurde nach demAnthronschwefelsäureverfahren durchgeführt, wobei die Glucose als Bezugssubstanz verwendet wurde«

Die Proteinmenge wurde nach dem Verfahren von Folin ermittelt

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und ausgedrückt, wobei Serumalbumin als Yergleichssubstanz verwendet wurde_o

Bei den in diesem Glycoprotein enthaltenen Zuckern handelte es sich tun. miteinander verbundene Zucker oder Polysaccharide; sie bestanden hauptsächlich aus Galactose_o Ebenfalls identifiziert wurden Mannose, etwas Glucose sowie Spuren Rhamnose.

Die Bestimmung der in der Proteinfraktion dieses Glycoproteins enthaltenen Aminosäuren wurde unter Verwendung eines Technicon-Autoanalysators durchgeführte Die dabei erhaltenen Ergebnisse sind nachfolgend als "Aminosäurereste auf 1000 Reste" ausgedrückt: ASP 155,28 - THR 64,41 - SER 80,75 - GLU 118,54 PRO 46,57 - GlY 114,62 - ALA 80,69 - GYS/2 16,95 - VAL 60,96 MET 15,51 - ILEU 42,82 - LEU 62,05 - TYR 29,57 - PHE 55,07 LYS 44,75 - HIS 17,74 - ARG 56,55o

Die oben angegebenen Eigenschaften wurden unter Berücksichtigung der experimentellen Fehler bei verschiedenen Fraktionen (Mengen) sowohl was die Sammeldauer von Psalliota xanthoderma anlangt als auch was die Orte anlangt, an denen sie gewonnen (gesammelt) wurden.

Die Verbindung PX wurde gegenüber verschiedenen Viren untersucht und nachfolgend sind die interessantesten Ergebnisse, die gegenüber dem Virus Sindbis sowie gegenüber anderen ADN- oder ARN-Viren, wie z.B„ gegenüber dem Herpes-Virus und gegenüber dem Kuhpoeken (Vaccine)-Virus, erhalt en wurden, angegeben.

Die Untersuchung gegenüber dem Virus Sindbis wurde, nach dem Konzentrationsgradientenverfahren durchgeführte Dieses Verfahren besteht darin, daß man in einer Petri-Schale auf eine monozelluläre Fibroplastenschicht eines Hühnerembryos eine Suspension des Virus Sindbis aufbringt unter Bildung von etwa 100 Flecken (plages) pro Schale, daß man nach 1-stündiger Absorption eine erste Schicht Agarmedium (milieu gelose)

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aufbringt, wobei die Schale entsprechend einem bevorzugten Durchmesser so geneigt ist, daß eine Dicke erhalten wird, die zwischen 0 und 5 m& "variiert, und daß man schließlich nach dem Erstarren der ersten Schicht eine mit der ersten Schicht identische zweite Schicht aufbringt, die jedoch die zu untersuchende Verbindung PX enthalte

Im Verlaufe der Inkubation,die man 48 Stunden lang bei 37°G und im Gleichgewicht ablaufen ließ, konnte festgestellt werden, daß die Konzentration in der ursprünglichen ETeigungs achse von 0 bis zu der gefundenen maximalen Konzentration regelmäßig zunahmo Am Ende des Experiments wurde zuerst die Toxizität des Produkts gegenüber den Zellen ermittelt. Diese äußerte sich darin, daß das Milieu alkalisch wurde_o Es handelte sich dabei um eine grobe makroskopische Abschätzung der Toxizität, die sich in dem Absterben der Zellen äußerte,, Das völlige Fehlen eines Flecks (Hofes) ohne Zellzerstörung zeigte die Aktivitätszone an. Eine Verminderung der Schärfe der Flecken (Höfe) zeigte eine schlechte Diffusion des Virus und damit einen bestimmten Inhibierungseffekt_o

Die nachfolgend angegebenen Schemata stellen die für drei verschiedene Dosen einerseits mit Amantadinhydrochlorid und andererseits mit der Verbindung PX erhaltenen Ergebnisse dar,

500 ^ /:

ml

Φ /% f\ f\ f\ f\ Q V.

MO V- /ml

1 mg/ml
Amantadin

ΛΛΛΛΛΛ- : oOoOo '

100y/ml 100 7·/ml

Verbindung PX

Zelltoxizität

normale Höfe (plages)
kleine und große

antivirale Aktivität
Fehlen von Höfen (plages) 609823/ S4^l%

γ /ml

Es wurde festgestellt, daß die Aktivität der Verbindung PX bis zu 5 y-/ml ausgeprägt war, ohne daß sich bei Konzentrationen unterhalb 10Oy-/ml eine Toxizität zeigte₀ Bei Amantadin, einem üblicherweise als Vergleichssubstanz verwendeten klassischen antiviralen Mittel^zeigte sich eine Zellentoxizität bei 500|*/elL» dies entspricht der doppelten antiviralen Schwellenaktivität, die bei 250Y"/ml liegt,,

Die Aktivität der Verbindung PX gegenüber Herpes-Virus und gegenüber dem Kuhpocken (Vaccine)-Virus wurde in vitro untersucht durch Nachweis einer Abnahme des cytopathogenen Effektes, der durch diesen Virus auf die Zellen KB hervorgerufen wurde: dabei wurde festgestellt, daß die Verbindung PX bei einer Konzentration von 100/ug/ml den durch den Herpesvirus oder den Kuhpocken (Vaccine)-Virus hervorgerufenen cytopathogenen Effekt um 50 % verminderte_o Die Wirkung der Verbindung PX auf den Herpes-Virus wurde "in ovo" bestätigt:

In die Chario-Allantoidin-Membran von 11 Tage lang inkubierten Embryoeiern wurde die Verbindung PX inokuliert, dann wurde 24 Stunden später der Herpesvirus inokuliert und dann wurden nach 72-stündiger Inkubation bei 37 0 die Ghario-Allantoidin-Membranen entfernt und es vmrde die Anzahl der gebildeten Pusteln unter Bezugnahme auf Vergleichseier, die nicht mit der Verbindung PX versetzt worden waren und im Durchschnitt etwa 50 Pusteln aufwiesen, gezählt.

Mit 50/Ug der Verbindung PX pro Ei wurde die Anzahl der Pusteln auf 3 vermindert, mit 25/Ug wurde die Anzahl auf 6 verminderte Diese antivirale Aktivität war insofern bemerkenswert, als es sich dabei um eine echte antivirale Aktivität handelte. Ergänzende Versuche haben nämlich gezeigt, daß die Verbindung PX keinlnterferon-Induktor war.

Eventuelle bakteriostatische Eigenschaften wurden gegenüber drei Mikroorganismenstammen untersucht: Staphylococcus

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- ίο -

aureus Oxford, Escherichia coli IP 54-8 und Candida albicans I.P. Die Untersuchung wurde nach der Verdünnungsmethode in einem flüssigen Milieu durchgeführt (Trypticase-Sojabouillon für die Staphylokokken und Golibakterien und flüssiges Sabouraud-Milieu für Gandida) _o Das Inokulum wurde aus einer Stunden alten Kultur gewonnen, wobei die Endverdünnungen

10 ^J für Staphylococcus, 5·10 für Escherichia coli und

10 für Gandida albicans betrugen. Die minimalen Hemmkonzentrationen. (Inhibierungskonzenttationen) der Verbindung PX nach 24-stündigem Aufenthalt in einem Trockenschrank von 37°O (Staphylococcus und Escherichia coli) oder von 30 G (Gandida albicans) lagen oberhalb 5000/ug/ml. Ein solches Ergebnis erlaubt die Schlußfolgerung, daß die Verbindung PX bakteriostatisch inaktiv ist_o

Schließlich sei noch darauf hingewiesen, daß die bemerkenswerte Uicht-Toxizität der Verbindung PX, die sich in dem Konzentrationsgradientenverfahren gezeigt hat, durch die akute Toxizität bestätigt wurde, die bei der Maus bei intravenöser Verabreichung bestimmt wurde:

Dieses Experiment wurde mit Gruppen von 18 Tieren durchgeführt und die DL^_n wurde nach der Methode errechnet, welche die beste linearisierung der Ergebnisse ergab_o Der für die DL₁-Q erhaltene Wert betrug 318 mg/kg, wobei das 5 %-Toleranzintervall 268 bis 369 mg/kg betrug.

Die vorstehend angegebenen Ergebnisse erlauben die Verwendung der Verbindung PX in der Humantherapie, insbesondere für die Behandlung des Herpes oder jeder anderen Erkrankung mit Herpesmanifestation.

Die Verbindung¹ PX kann auf oralem oder generellem Wege in Verbindung mit üblichen pharmazeutischen Träger- oder Hilfsstoffen in einer Form verabreicht werden, die für die zu behandelnde Erkrankung geeignet ist: man kann sie beispiels-

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weise in Form eines in situ hergestellten Augenmittels (collyre) mit 10/ug/ml oder in einer injizierbaren oder oral -Verabreicfrbaren Form in täglichen Dosen zwischen 10 und 300 mg verwenden«,

Patentansprüche:

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Claims

Patentansprüche

1. Verfahren zur Herstellung einer Substanz mit antiviralen Eigenschaften für die Behandlung von Herpes-Viruserkrankungen, dadurch gekennzeichnet, daß man Karpophoren des Pilzes Psalliota xanthoderma zuerst einer wäßrigen Extraktion, dann einer Dialyse und schließlich einer Lyophilisierung unterwirft_o

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die wäßrige Extraktion in der Weise durchführt, daß man den frischen, vorher lyophilisierten, zerkleinerten (gemahlenen) und gesiebten Pilz-Karpophoren 10 bis 40 Teile Wasser zugibt, dann die Suspension etwa 30 Minuten lang bei 35 bis 40⁰G rührt und die Extraktionsflüssigkeit durch Filtrieren abtrennt,

3· Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Dialyse mit dem aus der wäßrigen Extraktionsstufe stammenden Filtrat, das vorher auf einen pH-Wert von 6,5 bis 7 eingestellt worden ist, etwa 60 bis etwa 70 Stunden lang bei einer (Temperatur von etwa 10 bis etwa 15°0 durchführt.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Lyophilisierung in der Weise durchführt, daß man die dialysierte Lösung bei -60⁰O einfriert und sie dann langsam 60 bis 70 Stunden lang lyophilisierto

5_# Verfahren nach Anspruch 4,dadurch gekennzeichnet, daß man das dabei erhaltene lyophilisat in entionisiertem Wasser aufnimmt und nach dem Filtrieren und Ansäuern auf pH 6,5 einer zweiten Lyophilisierung unt erwirft₀

6ο Substanz mit einer antiviralen Aktivität, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus den Karpophoren von Psalliota

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xanthoderma nach dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 "bis 5 gewonnen worden ist*

Substanz mit einer antiviral en Aktivität, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus den Karpophoreri von Psalliota xanthoderma extrahiert worden ist und aus einem Glycoprotein bestehtj welches das folgende Aminogramnij ausgedruckt durch die Aminosäurereste auf 1000 Reste, aufweist: ASP 135*28 - THR 64,4-1 - SER 80,75 - GLU 118,34- - PRO 46,37 GLX 114,62 - ALA 80,69 - CTS/2 16,95 - VAL. 60,96 - MET 13,31 ILEU 42_f82 - LEU 62,05 - TYR 29,37 - PHE 35,07 - LYS 44,73 HIS 17,74 - ARG 36,55.

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