DE3400574C2 - - Google Patents

Description

Gegenstand der Erfindung ist ein durch den Patentanspruch gekennzeichnetes Verfahren zur Isolierung ei­ ner L-Aminosäure aus einer Reaktionsmischung, die während der Herstellung der L-Aminosäure unter Verwendung von Mikroorga­ nismen erhalten wird.

Bislang wurden zahlreiche Methoden zur Isolierung einer L-Amino­ säure durch ein Ionenaustauscherharz aus einer L-Aminosäure enthaltenden Reaktionsmischung, die unter Verwendung eines Mikroorganismus gebildet wurde, beschrieben. Beispielsweise war die Abtrennung von basischen Aminosäuren durch Kationen­ austauscherharze vom Carbonsäuretyp (US-PS 25 49 378), die Abtrennung von sauren Aminosäuren durch schwach basische Anionenaustauscherharze (D. T. Eaglis und H. A. Fiess: Ind. Eng. Chem., Bd. 36, 604, 1944; R. K. Cannan, J. Biol. Chem., Bd. 152, 401, 1944) und die Abtrennung von Aminosäuren unter Verwen­ dung stark saurer Kationenaustauscherharze vom H-Typ oder stark basischer Anionenaustauscherharze vom OH-Typ (S. M. Partridge und R. C. Blimley, Biochem. J., Bd. 51, 628, 1952) bekannt.

Für die industrielle Isolierung von Reaktionsprodukten durch Ionenaustauscherharze offenbart die japanische Patentpubli­ kation Nr. 5 050/1964 ein Verfahren, das die Zugabe eines polymeren Flockungsmittels vom Poylamidtyp zu einer ein Saccharid und eine Aminosäure enthaltenden Lösung, um Verun­ reinigungen auszuflocken und auszufällen, und deren Reinigung auf einem Ionenaustauscherharz umfaßt. Die japanische Patent­ publikation Nr. 21 105/1973 offenbart ein Verfahren zur Ge­ winnung einer gemischten Aminosäurelösung, die L-Tryptophan umfaßt durch ein Ionenaustauscherharz vom Sulfonsäuretyp mit einem Vernetzungsgrad, der durch einen DVB-Gehalt von nicht mehr als 6% veranschaulicht wird.

Diese früheren Methoden erwiesen sich jedoch für die industri­ elle Herstellung von Aminosäuren nicht als zufriedenstellend, da sie vor der Reinigung durch Ionenaustauscherharze die Ent­ fernung der verwendeten Mikroorganismen aus den Reaktions­ mischungen, beispielsweise durch Zentrifugalabtrennung, Flockulation und Ausfällung durch Zugabe von polymeren Flockungsmitteln, die Filtration an einer Ultrafiltrations­ membran etc. erfordern und ein großer Arbeitsaufwand in die Entfernung der Mikroorganismen investiert werden muß.

Ziel der Erfindung ist es, ein Verfahren zur wirksamen Ge­ winnung einer L-Aminosäure aus einer L-Aminosäure enthalten­ den Reaktionsmischung, die unter Verwendung von Mikroorganismen gebildet wurde, zu schaffen.

Das Ziel der Erfindung wird erreicht, indem man die die L-Amino­ säure enthaltende Reaktionsmischung direkt mit einem stark sauren Kationenaustauscherharz vom H-Typ behandelt. Das er­ findungsgemäße Verfahren macht es möglich, daß sowohl die Entfernung des bei der Reaktion verwendeten Mikroorganismus als auch die Isolierung der entstandenen L-Aminosäure gleich­ zeitig durchgeführt werden können.

Das Grundprinzip der vorliegenden Erfindung beruht darauf, daß beim Hindurchleiten einer L-Aminosäure enthaltenden Reaktions­ mischung, die einen Mikroorganismus enthält, durch eine Schicht eines stark sauren Kationenaustauscherharzes vom H-Typ, um die L-Aminosäure an der Harzschicht zu adsorbieren und sie zu isolieren und zu reinigen, der in der Reaktionsmischung gelöste oder suspendierte Mikroorganismus beim Kontakt mit dem Ionenaustauscherharz ausgeflockt wird und leicht durch Waschen des Harzes mit Wasser entfernt werden kann. Die Aus­ flockung des Mikroorganismus findet vermutlich deshalb statt, da beim Kontakt des in Wasser gelösten oder suspendierten Mikroorganismus mit dem stark sauren Kationenaustauscherharz vom H-Typ dieser durch die Sulfonsäuregruppe an der Ionen­ austauschergruppe modofiziert wird.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist auf eine einen Mikroorga­ nismus und eine L-Aminosäure enthaltende Reaktionsmischung (der Einfachheit halber zuweilen nachfolgend als "Aminosäure- Reaktionsmischung" bezeichnet) anwendbar, die während der Bildung der L-Aminosäure unter Verwendung des Mikroorganismus erhalten wird.

Beispiele für eine derartige Aminosäure-Reaktionsmischung umfassen eine L-Tryptophan enthaltende Reaktonsmischung, gebildet aus DL-Serien und Indol in Gegenwart von Escherichia coli und Pseudomonas putida; eine L-Tryptophan enthaltende Reaktionsmischung, gebildet aus L-Serin und Indol in Gegen­ wart von Escherichia coli; eine L-Tryptophan enthaltende Reaktionsmischung, gebildet in Gegenwart von Bacillus subtilis unter Verwendung von Anthranilsäure als Vorläufer; eine L-Tryptophan enthaltende Reaktionsmischung, gebildet aus Indol, Pyruvinsäure und Ammoniak in Gegenwart von Aerobacter aerogenes; eine L-Tryptophan enthaltende Reaktionsmischung, gebildet aus Indol, Serin und Glucose unter Verwendung eines Bakteriums der Gattung Aerobacterium; eine L-Serin enthaltende Reaktionsmischung, gebildet in einem Glyzin enthaltenden Kulturmedium, das Methanol als Kohlenstoffquelle enthält, unter Verwendung eines Methanol verwertenden Mikroorganismus der Gattung Aeromonas, Aerobacter oder Pseudomonas; und eine L-Serin enthaltende Reaktionsmischung, gebildet in einem Glyzin enthaltenden Kulturmedium in Gegenwart eines Mikro­ organismus der Gattung Nocardia. Diese sind lediglich bei­ spielshalber angegeben und das erfindungsgemäße Verfahren kann auf die Reinigung sämtlicher L-Aminosäure-Reaktions­ mischungen angewandt werden, die unter Verwendung von Mikro­ organismen erhalten werden.

Beispiele für das stark saure Kationenaustauscherharz vom H-Typ, das bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet wird, sind Lewatit sp-120 (Handelsbezeichnung), Lewatit sc-102 (Handelsbezeichnung) , Diaion pk-208 (Handelsbezeichnung), Diaion sk-102 (Handelsbezeichnung) und Amberlite XE-100 (Handelsbezeichnung).

Die Aminosäure-Reaktionsmischung wird entweder als solche oder, wenn die Aminosäure in Form von Kristallen in Wasser ausfällt, nach ihrer Verdünnung mit Wasser, bis die Kristalle sich bei Raum­ temperatur lösen, durch eine Schicht des in die H-Form re­ generierten Kationenaustauscherharzes vom Sulfonsäuretyp von seinem einen Ende aus geleitet, um die Aminosäure an dem Ionenaustauscherharz zu adsorbieren. Der Mikroorganismus in der Reaktionsmischung wird durch den Kontakt mit der Ionen­ austauscherharzschicht modifiziert und haftet an dem Ionen­ austauscherharz in ausgeflocktem Zustand. Hiernach wird Wasser mit einer festgelegten Fließgeschwindigkeit durch die Ionen­ austauscherharzschicht von dem anderen Ende der Harzschicht aus geleitet (dieses Verfahren wird als Rückwaschen bezeichnet), um den ausgeflockten Mikroorganismus aus der Ionenaustauscher­ harzschicht zu entfernen.

Die Adsorption der Aminosäure, das Ausflocken des Mikroorga­ nismus und die Entfernung des in der Ionenaustauscherharzschicht ausgeflockten Mikroorganismus werden gewöhnlich in einer mit dem Ionenaustauscherharz gefüllten Säule durchgeführt. Es ent­ steht jedoch selbst dann keine Schwierigkeit, wenn ein Ver­ fahren angewandt wird, bei dem nach der Adsorption der Amino­ säure an dem Ionenaustauscherharz das Ionenaustauscherharz in ein Reaktionsgefäß entnommen und einem Aufschlämmungs­ waschen mit Wasser unterzogen wird.

Wird eine mit einem Ionenaustauscherharz gefüllte Säule verwen­ det, läßt man die Aminosäure-Reaktionsmischung mit einer vor­ herbestimmten Fließgeschwindigkeit in die Harzsäule von deren oberem Ende fließen, um die Aminosäure an dem Ionenaustauscher­ harz zu adsorbieren. Hierbei wird fast der gesamte in der Aminosäure-Reaktionsmischung enthaltene Mikroorganismus modi­ fiziert und in der Harzsäule ausgeflockt und auf dem Harz physikalisch festgehalten. Ein Teil des Mikroorganismus fließt aus dem Boden der Harzsäule zusammen mit der entnommenen Flüssigkeit ab.

Wird nach dem vorstehenden Verfahren Wasser mit einer vorher­ bestimmten Fließgeschwindigkeit durch die Ionenaustauscher­ harzsäule von ihrem unteren Ende geleitet, um das Rückwaschen zu bewirken, wird der an dem Harz anhaftende ausgeflockte Mikroorganismus frei beweglich und fließt aus dem oberen Teil der Säule ab und kann somit wirksam entfernt werden.

Der Mikroorganismus in der in die Ionenaustauscherharzschicht zugeführten L-Aminosäure-Reaktionsmischung kann im wesentlichen vollständig entfernt werden, da während der Adsorption der L-Aminosäure an dem Ionenaustauscherharz ein Teil des Mikro­ organismus zusammen mit der abgeführten Flüssigkeit entfernt wird, und während des Rückwaschens der überwiegende Teil des Mikroorganismus in Form einer ausgeflockten Masse aus der Harzschicht entfernt wird.

Das die L-Aminosäure in adsorbierter Form enthaltende Ionen­ austauscherharz wird dann gewöhnlich mit wäßrigem Ammoniak behandelt, um die L-Aminosäure zu eluieren. Durch Einengen und Kirstallisation des Eluats kann die gewünschte L-Aminosäure einfach isoliert werden.

Die erhaltene L-Aminosäure besitzt aufgrund des Reinigungs­ effekts durch das Ionenaustauscherharz eine hohe Reinheit.

Durch Behandlung einer einen Mikroorganismus enthaltenden L-Aminosäure-Reaktionsmischung mit einem stark sauren Kationen­ austauscherharz vom H-Typ ermöglicht das erfindungsgemäße Ver­ fahren, gleichzeitig die L-Aminosäure zu isolieren und den Mikroorganismus, der mit Hilfe üblicher Methoden industriell sehr schwierig zu entfernen ist, zu entfernen. Daher ist das erfindungsgemäße Verfahren von großer industrieller Bedeutung als Verfahren zur Reinigung von Produkten, die durch Reaktionen erhalten wurden, die die Verwendung von Mikroorganismen ein­ schließen.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

Escherichia coli wurde bei einem pH von 7 und bei einer Temperatur von 30°C unter Rühren und Belüftung in Gegenwart von Monokaliumphosphat, Dikaliumphosphat, Ammoniumsulfat, Calciumchlorid, Eisensulfat, Hefeextrakt, Polypepton und anderen erforderlichen Materialien, unter Zugabe von Glucose und Indol kultiviert. Die Endkonzentration der Zellen betrug 30 bis 35 g pro Liter.

Auf die gleiche Weise wie vorstehend wurde Pseudomonas putida in dem gleichen Kulturmedium wie vorstehend, mit Ausnahme dessen, daß es kein Indol enthielt, kultiviert.

In beiden Fällen wurden die gewaschenen Zellen aus der Kultur­ brühe unter Verwendung eines üblichen Superzentrifugal­ separators gesammelt und in Form eines cremigen Kuchens mit einem Wassergehalt von 75 bis 85% erhalten.

Eine wäßrige aus 77,3 g DL-Serin, 10,5 g Ammoniumsulfat und 486 g Wasser bestehende Lösung wurde in einen Reaktor einge­ bracht und mit 29%igem wäßrigem Ammoniak auf pH 8,5 einge­ stellt. Hiernach wurden 51,2 g des vorstehend erhaltenen cremigen Kuchens der Escherichia coli-Zellen und 23,2 g des wie vorstehend erhaltenen cremigen Kuchens des Pseudomonas putida-Zellen zugegeben und die Mischung gut gerührt. Man gab weiterhin 392 g einer 78,4 g Indol enthaltenden Toluollösung zu und setzte 40 Stunden bei 35°C um.

Die Menge des in der Reaktionsmasse gebildeten L-Tryptophans wurde durch Flüssigkeits-Chromatographie analysiert und man fand 129,8 g (Ausbeute 95,0%, bezogen auf Indol).

Die Reaktionsmischung wurde zur Entfernung des Toluols destil­ liert. Hiernach wurde die Reaktionsmischung mit Wasser derart verdünnt, daß sich die L-Tryptophankristalle vollständig bei einer Konzentration von 1,0 Gew.-% auflösten.

Andererseits wurden 4,86 l Lewatit sp-120 (stark saures Kationenaustauscherharz), das durch Chlorwasserstoffsäure in die H-Form regeneriert war, in eine Säule gefüllt. Die vor­ stehende L-Tryptophanlösung (125 g) wurde durch die Säule von deren oberem Ende aus mit einer vorherbestimmten Fließ­ geschwindigkeit geleitet, um L-Tryptophan an dem Ionenaus­ tauscherharz zu adsorbieren.

Hiernach wurde die Säule mit 24,9 g Wasser rückgewaschen, um die flotierende ausgeflockte Masse der mikrobischen Zellen wegzuwaschen. Anschließend wurde L-Tryptophan aus der Harz­ säule unter Verwendung von wäßrigem Ammoniak in einer Menge entsprechend dem Zweifachen der Austauschkapazität des Ionenaustauscherharzes eluiert. Das Eluat wurde zur Entfernung und Rückgewinnung von Ammoniak auf 100°C erhitzt. Der Rück­ stand wurde auf Raumtemperatur abgekühlt. Die ausgefällten L-Tryptophankristalle wurden durch Filtration abgetrennt und getrocknet. Man erhielt L-Tryptophan mit einer Reinheit von 99,8% in einer Menge von 1,0 g.

Das Zellengleichgewicht durch die Ionenaustauscherharz-Behand­ lung war derart, daß 3% der Zellen in der Ablauge vorlagen, die während der Adsorption des L-Tryptophans durch die Säule gelangte und 97% der Zellen in dem Abfluß während des Rück­ waschens vorlagen (das Zellengleichgewicht wurde aus dem Ge­ wicht der Zelle bestimmt, die zur Trockne eingeengt waren und dem Kohlenstoffgleichgewicht, das durch Elementaranalyse erhalten wurde).

Beispiel 2

L-Tryptophan wurde aus L-Serin und Indol in Wasser, unter Ver­ wendung eines cremigen Kuchens von Escherichia coli-Zellen, die in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 kultiviert worden waren, hergestellt. Um eine Verminderung der Aktivität des Enzyms durch Indol zu vermeiden, wurde die Umsetzung unter allmählicher Zugabe von Indol durchgeführt, wobei kontinuier­ lich seine Konzentration analysiert wurde, derart, daß die Indolkonzentration in Wasser bei 200 ppm oder niedriger ge­ halten wurde. Die Ausbeute an gebildetem L-Tryptophan betrug 100%, bezogen auf Indol, und 85%, bezogen auf L-Serin. Die Endkonzentration des L-Tryptophans belief sich auf 120 g/l. Die L-Tryptophan-Reaktionsmischung wurde durch Zentrifugieren entwässert, um einen cremigen Reaktionskuchen, der L-Tryptophan und die mikrobischen Zellen enthielt, zu erhalten.

Der cremige Reaktionskuchen wurde mit Wasser verdünnt, derart, daß sich die L-Tryptophan-Kristalle vollständig mit einer Kon­ zentration von 1,0 Gew.-% lösten. Die verdünnte Lösung wurde mit Lewatit SC-102 (H-Form) als Ionenaustauscherharz nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 1 behandelt, um die Zellen zu entfernen und L-Tryptophan zu isolieren.

Die Menge des isolierten L-Tryptophans betrug 1,1 g und seine Reinheit 99,9%. Die Zellen in der L-Tryptophan-Reaktions­ mischung wurden in einer Menge von 2,5% während der Adsorption an dem Ionenaustauscherharz und von 97,5% während des Rück­ waschens der Ionenaustauscherharzsäule entfernt.

Claims (1)

1. Verfahren zur Isolierung einer L-Aminosäure aus einer ge­ löste L-Aminosäure und einen Mikroorganismus enthaltenden Reaktionsmischung, die während der Herstellung der L-Amino­ säure unter Verwendung von Mikroorganismen erhalten wird, dadurch gekennzeichnet, daß man die Reaktionsmischung mit einem stark sauren Kationenaustauscherharz vom H-Typ be­ handelt, dann den am Ionenaustauscherharz adsorbierten Mikroorganismus durch Waschen des Ionenaustauscherharzes entfernt und die adsorbierte L-Aminosäure aus dem Ionenaus­ tauscherharz eluiert und reinigt.