CH659827A5 - Verfahren zur isolierung von l-aminosaeuren. - Google Patents

Description

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PATENTANSPRUCH Verfahren zur Isolierung einer L-Aminosäure aus einer Reaktionsmischung, die die L-Aminosäure und einen Mikroorganismus enthält, und welche durch die Herstellung der L-Aminosäure unter Verwendung des Mikroorganismus erhalten wurde, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktionsmischung mit einem stark sauren Kationenaustauscherharz des H-Types behandelt wird, wobei die L-Aminosäure in gelöstem Zustand bleibt.

Diese Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren der wirkungsvollen Isolierung einer T.-Aminosäure aus einer Reaktionsmischung, die die L-Aminosäure und einen Mikroorganismus enthält, die durch die Herstellung von L-Aminosäure durch die Verwendung des Mikroorganismus erhalten wurde.

Es sind schon viele Verfahren zur Isolierung von L-Aminosäure aus einer L-Aminosäure enthaltenden Reaktionsmischung, die durch Verwendung eines Mikroorganismus erzeugt wurde, bekannt, worin Ionenaustauscherharze zum Einsatz kommen. Beispielsweise sind die folgenden Verfahren bekannt: Die Trennung von basischen Aminosäuren durch Kationenaustauscherharze des Carbonsäuretypes (US-A- 2 549 378), die Trennung von sauren Aminosäuren durch schwach basische Anionenaustauscherharze (D.T. Eaglis and H.A. Fiess: Ind. Eng. Chem., Vol. 36, 604,1944; R.K. Cannan, J. Biol. Chem., Vol. 152, 401, 1944), und die Trennung von Aminosäuren unter Verwendung von stark basischen Kationenaustauscherharzen des H-Types oder stark basische Anionenaustauscherharze des OH-Types (S.M. Par-tridge and R.C. Blimeley, Biochem. J., Vol. 51, 628, 1952).

Für die industrielle Isolierung von Reaktionsprodukten durch Ionenaustauscherharze beschreibt die JP-A-5050/1964 ein Verfahren, das dadurch gekennzeichnet ist, dass ein polymères Ausflockungsmittel des Polyamidtypes zu einer Lösung, welche ein Saccharid und eine Aminosäure enthält, gegeben wird, um die Unreinheiten auszuflocken und auszufällen, und sie an einem Ionenaustauscherharz zu reinigen; und die JP-A-21105/1973 beschreibt ein Verfahren zur Gewinnung einer gemischten Aminosäurelösung, welche L-Trypto-phan enthält, durch ein Ionenaustauscherharz des Sulfon-säuretypes, welche einen Vernetzungsgrad, dargestellt durch den DVB-Gehalt, von nicht mehr als 6% aufweist.

Diese älteren Verfahren haben sich jedoch nicht als befriedigend für die industrielle Produktion von Aminosäuren erwiesen, da in diesen Methoden vor der Reinigung durch die Ionenaustauscherharze die Entfernung der verwendeten Mikroorganismen von der Reaktionsmischung erforderlich ist, beispielsweise durch Zentrifugation, Ausflockung und Ausfällung durch Zugabe eines polymeren Flockungsmittels, Filtration auf einer Ultrafiltrationsmembrane etc., und viel Arbeit musste in die Entfernung des Mikroorganismus gesteckt werden.

Aufgabe dieser Erfindung ist es, ein Verfahren zur wirkungsvollen Gewinnung einer L-Aminosäure aus einer L-aminosäurehaltigen Reaktionsmischung, die durch Verwendung eines Mikroorganismus erhalten wurde, zur Verfügung zu stellen.

Gegenstand der Erfindung ist das im Patentanspruch definierte Verfahren.

Das erfindungsgemässe Verfahren wird durchgeführt, indem die L-aminosäurehaltige Reaktionsmischung direkt mit einem stark sauren Kationenaustauscherharz des H-Types behandelt wird. Dieses Verfahren erlaubt die gleichzeitige

Entfernung des in der Reaktion verwendeten Mikroorganismus und die Isolierung der erhaltenen L-Aminosäure.

Das Grundprinzip der vorliegenden Erfindung besteht darin, dass wenn ein L-aminosäurehaltiges Reaktionsge-5 misch, das einen Mikroorganismus enthält, durch eine Schicht eines stark sauren Kationenaustauschers des H-Types fliesst, um die L-Aminosäure an der Harzschicht zu adsorbieren, sie zu isolieren und zu reinigen, der in der Reaktionsmischung gelöste oder suspendierte Mikroorganismus io durch den Kontakt mit dem Ionenaustauscherharz ausgeflockt wird und leicht durch Waschen des Harzes mit Wasser entfernt werden kann. Die Ausflockung des Mikroorganismus findet vermutlich statt, weil der im Wasser gelöste oder suspendierte Mikroorganismus, der mit dem stark sauren 15 Kationenaustauscherharz des H-Types in Kontakt kommt, durch die Sulfonsäuregruppen am Ionenaustauscherharz modifiziert wird.

Das Verfahren dieser Erfindung findet Anwendung auf eine Reaktionsmischung, die einen Mikroorganismus und ei-20 ne L-Aminosäure enthält, die durch die Herstellung der L-Aminosäure unter Verwendung des Mikroorganismus erhalten wurde (wird zur Vereinfachung nachstehend auch als «Aminosäurereaktionsgemisch» bezeichnet).

Beispiele einer solchen Aminosäurereaktionsmischung 25 umfassen eine L-Tryptophan enthaltende Reaktionsmischung, hergestellt aus DL-Serin und Indol in Gegenwart von Escherichia coli Pseudomonas putida; eine L-Trypto-phan enthaltende Reaktionsmischung, hergestellt aus L-Se-rin und Indol in Gegenwart von Escherichia coli; eine L-3o Tryptophan enthaltende Reaktionsmischung, erhalten unter Verwendung von Anthralinsäure als Vorläufer in Gegenwart von Bacillus subtilis; eine L-Tryptophan enthaltende Reaktionsmischung, hergestellt aus Indol. Brenz-Traubensäure und Ammoniak in Gegenwart von Aerobacter aerogenes; ei-35 ne L-Tryptophan enthaltende Reaktionsmischung, hergestellt aus Indol. Serin und Glukose unter Verwendung eines Bakteriums des Genus Aerobacterium; eine L-Serin enthaltende Reaktionsmischung, hergestellt in einem Glycin enthaltenden Kulturmedium, das Methanol als Kohlenstoff-40 quelle enthält, unter Verwendung eines Methanol verwendenden Mikroorganismus des Genus Aeromonas, Aerobacter oder Pseudomonas; und eine L-Serin enthaltende Reaktionsmischung, hergestellt in einem Glycin enthaltenden Kulturmedium in Gegenwart des Mikroorganismus des Ge-45 nus Nocardia. Dies sind nur Erläuterungen, und das erfindungsgemässe Verfahren kann breit auf die Reinigung von allen L-Aminosäurereaktionsmischungen, die durch die Verwendung von Mikroorganismen erhalten wurden, angewendet werden.

so Beispiele der stark sauren Kationenaustauscherharze des H-Types, welche im erfindungsgemässen Verfahren verwendet werden, sind Lewatit sp-120 (Warenname der Bayer AG), Lewatit sc-102 (Warenname der Bayer AG), Diaion pk-208 (Warenname von Mitsubishi Chemical Co., Ltd.), 55 Diaion sk-102 (Warenname von Mitsubishi Chemical Co., Ltd.), und Amberlite XE-100 (Warenname von Rohm & Haas Co.).

Die Aminosäurereaktionsmischung, entweder als solche oder wenn die Aminosäure in Form von Kristallen ausge-6o schieden wird, nach Verdünnen mit Wasser bei Zimmertemperatur bis zur vollständigen Auflösung wird in der Regel durch eine Schicht eines zur H-Form regenerierten Kationenaustauscherharzes des Sulfonsäure-Types fliessen gelassen, um die Aminosäure am Ionenaustauscherharz zu adsor-65 bieren. Der Mikroorganismus der Reaktionsmischung wird dabei durch den Kontakt mit dem Ionenaustauscherharz modifiziert und wird im ausgeflockten Zustand angelagert. Dann kann Wasser mit einer bestimmten Fliessrate in entge

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gengesetzter Richtung durch die Ionenaustauscherharzschicht fliessen gelassen werden (dieses Verfahren wird «back washing» genannt), um die ausgeflockten Mikroorganismen von der Harzschicht auszuwaschen.

Die Adsorption der Aminosäure, die Ausflockung des Mikroorganismus und die Entfernung des ausgeflockten Mikroorganismus vom Ionenaustauscherharz werden üblicherweise in einer Säule, die mit dem Ionenaustauscherharz gefüllt ist, durchgeführt. Es ergeben sich keine Probleme, sogar wenn ein Verfahren verwendet wird, in welchem nach der Adsorption der Aminosäure am Ionenaustauscherharz das Ionenaustauscherharz in ein Reaktionsgefäss gegossen wird und unter Aufschlämmung mit Wasser gewaschen wird.

Wenn eine mit einem Ionenaustauscherharz gefüllte Säule verwendet wird, lässt man die Aminosäurereaktionsmischung mit einer festen Fliessgeschwindigkeit oben in die Säule einfliessen, um die Aminosäure am Ionenaustauscherharz zu adsorbieren. Zu diesem Zeitpunkt sind beinahe alle in der Aminosäurereaktionsmischung enthaltenen Mikroorganismen modifiziert und in der Harzsäule ausgeflockt und werden physikalisch am Harz festgehalten. Ein Teil der Mikroorganismen fliesst aus dem unteren Ende der Harzsäule weg, zusammen mit der zu verwertenden Flüssigkeit.

Wenn nach obiger Operation Wasser mit einer bestimmten Fliessgeschwindigkeit von unten durch die Ionenaustauscherharzsäule geschickt wird, um das «back washing» durchzuführen, wird der ausgeflockte Mikroorganismus, der am Harz angelagert ist, weggeschwemmt und fliesst vom oberen Teil der Säule weg und kann somit wirkungsvoll entfernt werden.

Der Mikroorganismus in der L-Aminosäurereaktionsmi-schung, welcher in die Ionenaustauscherharzschicht gegeben wird, kann wirkungsvoll vollständig entfernt werden, da zur Zeit der Adsorption der L-Aminosäure am Ionenaustauscherharz, ein Teil des Mikroorganismus zusammen mit der verworfenen Flüssigkeit entfernt wird und zur Zeit des «back washing» die meisten der Mikroorganismen eine ausgeflockte Masse bilden, die von der Harzschicht entfernt wird.

Das Ionenaustauscherharz, welches die L-Aminosäure an sich adsorbiert hat, wird dann wie üblich mit wässrigem Ammoniak behandelt, um die L-Aminosäure zu entfernen. Durch Konzentrierung und Kristallisation des Eluates, wird die gewünschte L-Aminosäure leicht isoliert.

Die erhaltene L-Aminosäure hat eine hohe Reinheit gegen den Reinigungseffekt durch das Ionenaustauscherharz.

Durch die Behandlung der L-Aminosäurereaktionsmi-schung, die einen Mikroorganismus enthält, mit einem stark sauren Kationenaustauscherharz des H-Types, macht es das erfmdungsgemässe Verfahren möglich, die L-Aminosäure zu isolieren und den Mikroorganismus, durch welchen sie produziert wurde, zu entfernen, was in industriellem Massstab durch übliche Methoden sehr schwierig ist. Das erfmdungsgemässe Verfahren hat somit eine grosse industrielle Bedeutung, als Methode zur Reinigung von Erzeugnissen, welche durch Reaktionen unter Verwendung von Mikroorganismen erhalten werden.

Die folgenden Beispiele erläutern das erfmdungsgemässe Verfahren im einzelnen.

Beispiel 1

Zellen, welche Escherichia coli enthalten, wurden bei einem pH-Wert 7 und bei einer Temperatur von 30 °C unter Schütteln und Belüftung in Gegenwart von Monokalium-phosphat, Dikaliumphosphat, Ammoniumsulfat, Calci-umchlorid, Eisensulfat, Hefeextrakt, Polypepton und anderen erforderlichen Materialien unter Zugabe von Glukose und Indol kultiviert. Die Endkonzentration der Zellen war 30-35 g/1.

In der gleichen Weise wie oben wurden Zellen, welche Pseudomonas putida enthielten, im gleichen Kulturmedium 5 wie oben kultiviert, mit der Ausnahme dass es kein Indol enthielt.

In beiden Fällen wurden die gewachsenen Zellen aus der Kulturbrühe gewonnen unter Verwendung eines gewöhnlichen Superzentrifugalseparators, und es wurde ein Creme-io kuchen, der einen Wassergehalt von 75-85% enthielt, erhalten.

Eine wässrige Lösung, die sich aus 77,3 g von DL-Serin, 10,5 g Ammoniumsulfat und 486 g Wasser zusammensetzte, wurde in einen Reaktor gegeben und mit 29% wässrigem 15 Ammoniak auf einen pH-Wert 8,5 eingestellt. Dann wurden 51,2 g des oben erhaltenen Cremekuchens von Escherichia coli-Zellen und 23,2 g des oben erhaltenen Cremekuchens von Pseudomonas putida-Zellen zugegeben und die Mischung wurde gut gerührt. Anschliessend wurden 392 g einer 20 Toluol-Lösung, welche 78,4 g Indol enthielt, zugegeben und dann bei 35 °C während 40 h umgesetzt.

Der Anteil von L-Tryptophan, welcher in der Reaktionsmasse gebildet wurde, wurde durch Flüssigchromatographie analysiert, wobei 129,8 g gefunden wurden (Ausbeute 25 95,0%, auf Basis von Indol).

Die Reaktionsmischung wurde destilliert, um das Toluol zu entfernen. Dann wurde die Reaktionsmischung mit Wasser verdünnt, sodass die L-Tryptophan-Kristalle vollständig aufgelöst wurden und die Konzentration 1,0 Gew.-% be-30 trug.

Andererseits wurden 4,86 1 Lewatit sp-120 (starksaures Kationenaustauscherharz) durch Salzsäure zur H-Form regeneriert und in die Säule gefüllt. Die obengenannte L-Tryp-tophan-Lösung (125 g) wurde durch die Säule von ihrem 35 oberen Ende her mit einer festen Fliessgeschwindigkeit fliessen gelassen, um das L-Tryptophan am Ionenaustauscherharz zu adsorbieren.

Dann wurde die Säule mit 24,9 g Wasser rückgewaschen, um die schwimmende ausgeflockte Masse der mikrobischen 40 Zellen auszuwaschen. Anschliessend wurde das L-Trypto-phan aus der Harzsäule unter Verwendung von wässrigem Ammoniak eluiert, mit einem Anteil der zweimal der Austauschkapazität des Ionenaustauscherharzes entsprach. Das Eluat wurde auf 100 °C erwärmt, um den Ammoniak zu ent-45 fernen und wieder zu gewinnen. Der Rückstand wurde auf Zimmertemperatur gekühlt. Die ausgefällten L-Tryptophan-Kristalle wurden durch Filtration abgetrennt und getrocknet. Das L-Tryptophan hatte eine Reinheit von 99,8% und wurde in einer Menge von 1,0 g erhalten.

so Das Zellgleichgewicht stellte sich bei der Ionenaustauscherbehandlung so ein, dass 3% der Zellen in der ausfliessenden Flüssigkeit, die während der Zeit der Adsorption des L-Tryptophans durch die Säule floss, vorhanden waren und 97% der Zellen, in der während der Rückwaschung ausge-55 waschenen Flüssigkeit vorhanden waren (das Zellgleichgewicht wurde aus dem Gewicht der Zellen, die zur Trockenheit konzentriert wurden, und aus der Kohlenstoffbilanz, die durch die Elementaranalyse erhalten wurde, bestimmt).

so Beispiel 2

L-Tryptophan wurde aus L-Serin und Indol in Wasser hergestellt, unter Verwendung eines Cremekuchens von Escherichia coli-Zellen, die in gleicher Weise wie in Beispiel 1 kultiviert wurden. Zur Vermeidung einer Verminderung 65 der Enzymaktivität durch Indol wurde die Reaktion durchgeführt, indem man das Indol graduell zuführte, wobei seine Konzentration kontinuierlich ermittelt wurde, sodass die In-dolkonzentration im Wasser bei 200 ppm oder niedriger ge

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halten wurde. Die Ausbeute des erhaltenen L-Tryptophans war 100% auf Basis des Indols und 85% auf Basis von L-Se-rin. Die Schlusskonzentration des akkumulierten L-Tryptophans war 120 g/1. Die L-Tryptophan-Reaktionsmischung wurde durch Zentrifugation entwässert, wobei ein Reak-tions-Cremekuchen erhalten wurde, der L-Tryptophan und die mikrobischen Zellen enthielt.

Der Reaktions-Cremekuchen wurde mit Lewatit sc-102 (H-Form) als Ionenaustauscherharz behandelt, durch das gleiche Verfahren wie in Beispiel 1 beschrieben, um die Zellen zu entfernen und das L-Tryptophan zu isolieren.

Der Anteil des isolierten L-Tryptophans war 1,1g und seine Reinheit betrug 99,9%. Die Zellen in der L-Trypto-5 phan-Reaktionsmischung wurden in einem Anteil von 2,5% während der Zeit der Adsorption an das Ionenaustauscherharz entfernt und 97,5% während der Zeit der Rückwa-schung der Ionenaustauscherharzsäule.

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