DE3247786A1

DE3247786A1 - Verwendung von peptiden als medikamente

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Publication number: DE3247786A1
Application number: DE19823247786
Authority: DE
Inventors: Karin Damm 2950 Vedbaek Joergensen
Original assignee: Novo Industri AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 1981-12-23
Filing date: 1982-12-23
Publication date: 1983-07-21
Also published as: AU9188382A; IT1155438B; IT8224915A1; GR78411B; GB2112641A; EP0082731A1; LU84546A1; JPS58116421A; IT8224915A0; BE895432A; NZ202757A; ZA829408B

Description

Novo Industri A/S, Novo Alle, 2880 Bagsvaerd, Dänemark

Verwendung von Peptiden als Medikamente

Die Erfindung betrifft die Verwendung von Verbindungen der allgemeinen Formel

R¹ -R" (D

als Agens zum Freisetzen von Insulin, eine pharmazeutische Zusamrrensetzung mit einem wirksamen Gehalt an einer Verbindung der Formel I, ein Insulin freisetzendes Agens, sowie ein Verfahren zum Behandeln oder Verhindern von Hyperglykämie.

Glucagon, ein Polypeptid-Hormon,das aus 29 Aminosäuren besteht, besitzt bekanntlich verschiedene pharmakologische Wirkungen wie eine spasmolytische Wirkung auf glatte

813

Siiro Bremen /Bremen Office:

Ostfach / P. O. Box 107127
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Postfach / P. O. Box 22 0137 Schlotthauerstraße 3, D-8000 München 22 Telephon: (089) 223311
Telekop. / Telecop.: (089) 221569 CCITT 2

ι Muskulatur, eine Inhibitor-Effekt auf die Sekretion

} von Magensäure und metabolische Wirkungen, beispiels-

weise einen Insulin-Freisetzungs-Effekt.

Es ist bekannt, daß Glucagon Insulin aus isolierter perfundierter Rattenpankreas freisetzt. Die Insulinausschüttung ist bei Einwirkung von reinem Glucagon unabhängig von der Glukosekonzentration im Blut, so daß es auch bei Normo- und - Hypoglykäitiie

' Insulinausschüttende Wirkung hat. Die Aufgabe der Er

findung bestand also darin , eine Substanz zu schaffen, die lediglich bei Hyperglykämie Insulin-freisetzend wirkt.

Die Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch Verbindungen der Formel I , wobei R¹ His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-'Ser-Äsp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-, und R" Hydroxy, die Peptid-Kette -Phe-Val-Gln-Trp-Leu oder -Met-Asn-Thr oder eine entsprechende Peptid-Kette, oder Aminosäure die identisch mit einer der beiden letztgenannten Peptid-Ketten ist, außer daß eine oder mehrere der Aminosäure(n) fehlt(en), repräsentiert, oder Salze derselben.

Als Beispiel der'obengenannten "entsprechende Peptid-Kette oder Aminosäure, die identisch mit einer der beiden letztgenannten Peptid-Ketten ist, außer daß eine oder mehrere der Aminosäure(n) fehlt(en)" kann -Val-Trp und -Met-Asn genannt werden.

Ferner betrifft die Erfindung eine pharmazeutische Zusamnensetzung mit einem wirksamen Gehalt einer Verbindung der Formel I

BAD OBIGINAL

" . BOEHMERTT & BOEHM¹ERT 3 2 4 7 ? Ö 6

oder eines Salzes derselben in Assoziation mit einem geeigneten physiologisch verträglichen Träger, Verdünnungsmittel ·und/oder Corrigens, wenn sie als insulinfreisetzendes Medikament eingesetzt wird; ein Insulin-freisetzendes Agens, das eine Verbindung der Formel I wie in Anspruch 1 aufweist, bevorzugt der Verbindungen, die gemäß einem der Ansprüche 2-5 verwandt werden. Sowie ein Verfahren zum Behandeln oder Verhindern der Hyperglykämie, das durch die Gabe einer Verbindung der Formel I wie in Anspruch 1, bevorzugt der Verbindungen, die gemäß einem der Ansprüche 2-5 eingesetzt werden, zur Insulin-Freisetzung.

Es ist nun gefunden worden, daß Glucagon (1-21) keine derartige Wirksamkeit zeigt, wenn es bis zur gleichen Konzentration wie Glucagon als Infusion gegeben wird, vorausgesetzt, daß die Puffer-Glucose: konzentration 0,6 mg/ml ist, entsprechend Hypoglykämie. Es ist weiterhin gefunden worden, daß Glueagon-(1 -21) - im Gegensatz zum Glucagon - weder Hyperglykämie oder Freisetzung von Insulin in vivo in normal gefütterten •Ratten hervorruft. Nichtsdestoweniger ist überraschenderweise gefunden worden, daß Glucagon-(1-21) etwa 85% des IRI (immunreaktives Insulin) - Freisetzungseffektes von Glucagon in Modell perfundierter Rattenpankreas besitzt, wenn die Pufferglucosekonzentration 2,0mg/ml, entsprechend Hyperglykämie, ist, und etwa 60% des IRI-Freisetzungseffektes von Glucagon besitzt, wenn die Pufferglucosekonzentration 1,5 mg/ml, entsprechend schwacher Hyperglykämie,ist.

Untersuchungen an Glucose-behandelten Ratten und Schweinen haben nun gezeigt, daß intravenös infundiertes Glucagon-(1-21) die Glucose-Toleranz verbessert, siehe' die weiter- unten beschriebenen Experimente A-C. Da Glucagon-(1-21 ) den IRI-Freisetzungseffekt bei Vorliegen von Hyperglykämie besitzt, während ihm gleichzeitig die glykc'jenolytischen und glykoneogenetischen Effekte von Glucagon fehlen, kann Glucagon-(1-21)

BAD

!K)EHMEKT & ¹BDEHMERT 3 24 / ι C Ό

bei der Behandlung von Diabetikern mit vorhandener Rest-Beta-Zellenfunktion eingesetzt werden. Eine derartige Verwendung sollte besonders sicher sein, da während der Behandlung keine Hypoglykämie aufgrund des Fehlens der IRI-Freisetzungswirkung in Gegenwart von Hypoglykämie und Normoglykämie auftritt. Wenn Glucagon-(1-21) Ratten und Schweinen, die Plasmaglucose-Spiegel unterhalb 1,2mg/ml aufweisen, infundiert wird, wird Glucagon — (1 -21) weder IRI freisetzen, noch die Plasmaglucosewerte beeinflussen, siehe auch das weiter unten beschriebene Experiment D.

In Diabetes 2JL (1972), 843 ist zusammengefasst festgestellt worden, daß die für die insulinogene Wirkung notwendige Struktur innerhalb der 24-29 Aminosäuresequenz im Glucagon lokalisiert ist. Entgegengesetzt dieser Ansicht ist nun überraschenderweise gefunden worden, daß die für die insulinogene Wirkung verantwortliche Struktur sich in der 1-21 Aminosäuresequenz befindet, vorausgesetzt, daß Hyperglykämie vorliegt.

Ferner ist überraschenderweise gefunden worden, daß Glucagon-(1-26) und des-(22-26)-Glucagon einen Insulinfreisetzungseffekt in dem perfundierten Rattenpankreas-Modell besitzt, wenn die Pufferglucosekonzentration 2,0 mg/ml ist.

Es wird nun erwartet,daß alle Verbindungen der Formel I eine Insulinfreisetzende Wirkung bei Hyperglykämie besitzen, da Glucagon, Glucagon-(1-26), des(22-26)-Glucagon, und Glucagon-(1-21) diese Wirkung haben. Nichtsdestoweniger hat, im Gegensatz zu Glucagon-(1-21), Glucagon auch einen Insulinfreisetzungseffekt bei Vorliegen von Normoglykämie und Hypoglykämie.

In der dänischen Patentanmeldung Nr. 2885/81 ist beschrieben

BAD ORIGINAt

RQEHMERT&BOEHMERT 3 2Λ /7 86

worden, daß Verbindungen der Formel ΐ eine spasmolytische Wirkung und eine inhibitorische Wirkung auf die Sekretion von Magensäure besitzen.

Ferner ist darin festgestellt, daß Verbindungen der Formel I keine oder geringfügige, vernachlässigbare metabolische Wirkungen zeigen. Die Feststellung dieser dänischen Anmeldung, daß Glucagon (1-21) Insulin nicht aus der isolierten perfundierten Rattenpankreas freigesetzt, trifft zu, wenn die Pufferglucosekonzentration 1,Omg/ml ist, entsprechend Normoglykämie oder unterhalb dieser Konzentration. Vor diesen Hintergrund ist es überraschend, daß Verbindungen der Formel I. einen Insulin-Freisetzungseffekt in Tieren zeigen, die mit Glucose, entsprechend Eyperglykämie, behandelt worden sind.

Die metabolisehen Wirkungen von Glukagon (1-2I)₇ Glukagon-(1-26), und des-(22-26)-Glucagon,wie verdeutlicht durch ihren lipolytischen Effekt auf freie Rattenfettzellen in vitro und ihre Wirkung auf die Aktivierung der Adenylat Zyklase in vitro sind, verglichen mit den metabolischen Wirkungen von Glucagon, vernachlässigbar. Nach Gabe an normal gefastete und gefütterte Ratten in vivo sind keine metabolischen Wirkungen gefunden worden.

Dementsprechend können Verbindungen der Formel I oder Salze derselben als i'nsulinfreisetzende Agentien verwandt werden. Verbindungen der Formel I oder Salze derselben eignen sich dann zur Behandlung von Diabetikern, beispielsweise von solchen mit verbleibender Beta-Zell-Funktion.Die Tatsche, daß Verbindungen der Formel I auch spasmolytische Effekte und einen inhibitorischen Effekt auf die Sekretion von Magensäure zeigen, werden in vielen, wenn nicht den meisten Fällen, die Verwendung der Verbindungen der Formel I als Insulin-

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BOE-HMERT&^:ßOEHMERT 3 24 7 7 fc 6

Freisetzendes Agens nicht von vomeherein ausschließen. Im Gegensatz dazu kann die Kombination dieser Wirkungen sich als Urteil, beispielsweise bei Diabetikern des Typs 2, erweisen.

Als Beispiele spezifischer, bekannter Verbindungen der Formel I können Glucagon(1-21), Glucagon-(1-23), Glucagon-(1-25), Glucagon-(1-26) und des(22-26)-Glucagon genannt werden. Die verbleibenden Verbindungen der Formel I und die Salze derselben können durch Verfahren hergestellt werden, welche allgemein in der Peptid-Synthese bekannt sind · in diesem Zusammenhang wird Bezug genommen auf beispielsweise die dänische Patentanmeldung Nr. 2885/81, Hoppe-Seyler's Zeitschrift für Physiol. Ghem. 362(1981) , 665-677; Methoden der Organischen Chemie (Houben-Weyl), Herausgeber: Müller, Vol. XV/1 und 2_;G.Thieme Verlag, Stuttgart, 1974; The Peptides, Herausgeber: Gross und Meienhofer, Vol. 1-4, Academic Press, 1981; und Appl. Biochem. Biotech. 2 (1982), 385 und weitere.

Verbindungen der Formel I werden in pharmazeutisch wirksame Präparationen umgewandelt und bevorzugt Menschen analog bekannten Verfahren gegeben.

Verbindungen der Formel I und Salze derselben können intravenös, intramuskulär oder subkutan in Dosierungen im Bereich von zwischen 1 bis 1000pg/kg Körpergewicht, bevorzugt von zwischen 10 bis 10 0ug/kg Körpergewicht, gegeben werden, obwohl eine niedrigere oder höhere Dosierung gegeben werden kann. Die benötigte Dosierung wird vom Zustand des Patienten und der Anzahl Gaben pro Tag abhängen. Ferner können Verbindungen der Formel I über den nasalen oder rektalen Weg gegeben werden.

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Verbindungen der Formel I können möglicherweise oral, beispielsweise durch die Verwendung spezieller Additive, gegeben werden.

Zum Zwecke der parenteralen Gabe können Verbindugen der Formel I in desilliertem Wasser gelöst werden und der pH-Wert, falls erwünscht,mit einem geeigneten Puffer derart eingestellt werden, daß er im Bereich zwischen etwa 6 bis 8 liegt. Ferner kann die Lösung auf Isotonie beispielsweise durch Zugabe von etwa 0,9% Natrium-Chlorid, eingestellt werden. Um das Lyophilisierungsverfahren, das zu einem geeigneten Produkt führt, zu erleichtern, kann beispielsweise Laktose zur Lösung gegeben werden. Anschließend kann die » .· Lösung steril gefiltert und in Ampullen abgefüllt werden. Anschließend können die Lösungen lyophilisiert und die Ampullen unter aseptischen Bedingungen versiegelt werden.

Weitere pharmazeutische Verfahren können zur Steuerung der Wirkungsdauer eingesetzt werden. Präparationen mit gesteuerter Freisetzung können durch Verwendung von Polymeren zum Komplexieren oder Absorbieren von Verbindungen der Formel I eingesetzt werden. Die gesteuerte Abgabe kann durch Auswahl geeigneter Makromoleküle (beispielsweise Polyester, Polyaminosäuren, Polyvinylpyrrolidon, Ethylenvinylacetat, Methylcellulose, Carboxymethylcellulose, und Protaminsulfat)* der Konzentration der Makromoleküle als auch der Einbringverfahren durchgeführt werden, um die Drogenfreisetzung zu steuern. Außerdem ist es möglich_/eine längere Wirkungsdauer durch parenterale Gabe einer Suspension der Verbindungen in Form von Kristallen oder Aggregaten anstatt einer wässrigen Lösung zu erzielen, weil sich die Verbindungen kontinuierlich lösen, ein Verfahren, das durch wohlbekannte Faktoren gesteuert werden kann (beispielsweise Kristallformen, Aggregattypen,und Oberflächen). Eine weitere mögliche Methode, die Wirkungsdauer durch Präparationen mit

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BOBHMEBT&RQEHMEtRT -J ^.4/ v.·

gesteuerter Freisetzung zu steuern besteht darin, Verbindungen der Formel I in Partikeln eines polymeren Mate-.' rials in Form einer Matrix oder eines biologisch abbaubaren Sytems zu .inkorporieren/ beispielsweise, Glucagon (1-21) in Polyestern,Polyaminosäuren, Hydrogelen, Poly-(Milchsäure) oder Ethylenvinylacetat-Copolymere. Anstatt die Verbindungen in Polymerenpartikeln zu incorporieren ist es möglich/ Verbindungen der Formel I in vorgefertigten Mikrokapseln einzuschließen, beispielsweise durch Co-Acervationstechniken oder durch Grenzflächen-Polymerisation beispielsweise HydroxyethylZellulose oder Gelatine-Mikrokapseln und Poly (Methylmethacrylat) Mikrokapseln, oder in kolloidalen Drogenabgabesystemen, beispielsweise Liposomen , Albumin-Mikrokugeln, Mikroemulsionen, Nanopartikel, und Nanokapse^ln oder in Makroemulsionen. Ein weiterer Mechanismus, um Präparationen mit Verzögerung zu erzielen, ist die Verwendung von biologisch verträglichen Öl-Lösungen (beispielsweise Viscoleo- oder Erdnußöl) wobei das Freisetzen der Droge durch die Verteilung der Droge außerhalb des Öls in dem umgebenden wässrigen Milieu gesteuert ist. Außerdem ist es möglich, eine ölsuspension einzusetzen, die die Prinzipien, die bei wässrigen Suspensionen und öl-Lösungen beteiligt sind, kombiniert.

Zur nasalen Gabe wird eine Lösung in einer Nasal-Sprüheinrichtung oder Nebulisator verwandt. Die Verbindungen der Formel I werden in destilliertem Wasser gelöst und der pH-Wert derart eingestellt, daß er sich im Bereich von etwa 6-8 befindet, beispielsweise durch Zugabe von Natrium -Phosphat und Zitronensäure als Puffer. Natrium-Chlorid, Sorbitol und Glyzerin können dazu verwandt werden, eine isotone Lösung mit einer geeigneten Viskosität zu erhalten. Die Lösung kann unter Verwendung eines geeigneten Nebulisators oder Plastiksprays gegeben werden. Die Lösung kann

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BÖEHMERT & BOEFiMERT §' £> 4 η η g β

durch Verwendung bekannter Konservierungsmittel, beispielsweise Methyl oder Propyl p-Hydroxybenzoat,. konserviert werden. Um die Wirksamkeit zu verbessern, kann eine oberflächenaktive Substanz, beispielsweise Ester von Polyoxiethylen, Fettsäuren oder Enamin-Derivaten beispielsweise N-(l-methyl-2-ethoxycarbonylvinyl)-D-phenylglyciiie beispielsweise als Adsorbtionsbeschleuniger dienen. Zum Zwecke nasaler Gabe unter Verwendung eines Dosierungsaerosol-Sprays wird eine Verbindung der Formel I mit geeigneten Bestandteilen und einer Mischung von Halogenkohlenstoffen , beispielsweise Monofluortrichlormethan, Difluordichlormethan, und Tetrafluordichlorethan gemischt,um eine Mischung mit einem Dampfdruck zu erhalten, die eine wohlbestimmte Einzel-Dosis hervorbringt, wenn die Mischung unter Verwendung eines,Dosierungsaerosol-Sprays verabreicht wird.

Bei nasaler Gabe werden die Verbindungen der Formel I bevorzugt in einem Dosierungsbereich zwischen etwa o,1 bis 10C^g/kg Körpergewicht eingesetzt, bevorzugt zwischen 1 und 10ug/kg Körpergewicht pro Einzeldosis. Diese Dosis könnte mehrere Male pro Tag gegeben werden. ·

Für rektale Gabe werden Suppositorien durch Mischen einer Verbindung der Formel I mit einem inaktiven Bestandteil wie Kakaobutter oder mit einer Basis wie Polysorbat 85, Propylen-Glycolmonostearat und weißem Bienenwachs hergestellt. Oberflächenaktive Substanzen und/oder Enamind-Derivate können beispielsweise als Adsorptionsverbesserer dienen.

Eine bevorzugte Unterklasse der Verbindungen der Formel I sind Verbindungen, in denen die Aminosäuresequenz identisch mit einem kontinuierlichen Teil der Aminosäuresequenz von

BAD

boehmert'& boehmert 3 2 4 Ί 716

Glucagon ist. Als Beispiele spezieller Verbindungen der Formel I können Verbindungen genannt werden, in denen R" Phe,Val, GIn, Trp, Leu, Met, Asn oder Thr ist. Eine bevorzugte Verbindung der Formel I ist Glucagon-(1-21), da es überlegene pharmakologische Eigeaschaften zeigt und leicht - beispielsweise aus natürlichem Glucagon - erhältlich ist.

Als Beispiele für Salze der Verbindungen der Formel I können Natrium,Kalium , Magnesium, Calcium und Zinksalze und Säureadditionssalze mit organischen oder anorganischen Säuren wie Ameisensäure,genannt werden. Beworzugte Salze der Verbindungen der Formel I sind physiologisch und pharmazeutisch verträgliche Salze.

Die Erfindung betrifft auch eine pharmazeutische Zusammensetzung, welche eine Verbindung der Formel I oder ein Salz derselben, sowie ein oder mehreie pharmazeutisch

verträgliche Träger, Verdünnungsmittel,bevorzugt Wasser, und/oder Corrigens, aufweist, wenn sie als Insulin—Freisetzendes Medikament verwandt wird. Beispielhaft für derartige Träger können konventionelle Konservierungsmittel, beispielsweise Methyl oder Propyl p-Hydroxibenzonat und Natrium-Chlorid_/genannt werden.

Weiterhin wird jegliches neues Merkmal oder Merkmalkombination, die hierin beschrieben wird, als erfindungswesentlich betrachtet.

Die Buchstaben-Triplett-Abkürzungen für Aminosäuren, die hier verwandt werden,sind in J₄BiOl.Chem. 243 (1968) , 3558, angegeben. Aus Gründen der Kürze wurde Glucagon-(1-21)-Heneicosapeptid hier als Glucagon-(1-21) bezeichnet und analog trifft dieses auch für Glucagon-(1-23), Glucagon-(1-25), und Glucagon-(1-26)zu. Ferner wurde des-Penta-

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ßÖEBMEFJT &feOEBMERT 3 2 4 7 7 I 6

-χ-

pepdid-(22-26)-Glucagon als des(22-26)Glucagon bezeichnet.

Das nachfolgende Beispiel, welches keineswegs als Begrenzung betrachtet werden soll, wird zur Verdeutlichung der Erfindung gegeben.

Beispiel:

Eine Präparation zur parenteralen Gabe,welche 1mg Glucagon-(1-21) pro ml enthält, kann wie folgt hergestellt werden:

1 g Glucagon-(1-21) und 99g Laktose werden in einem Liter destilliertem Wasser gelöst und der pH-Wert auf 7,0 eingestellt. Die Lösung wird anschließend steril gefiltert. Die sterile Lösung wird in 10 ml Ampullen derart eingefüllt, daß jede Ampulle 1,0 ml der Lösung enthält. Anschließend werden die Lösungen lyophilisiert und die Ampullen unter aseptischen Bedingungen versiegelt.

Die in jeder der Ampullen enthaltene Präparation soll in 1,0ml sterilen Wassers vor Verabreichung gelöst werden.

Weitere Beispiele der Herstellung von Präparationen,die Glucagon-(1-21) enthalten, werden in der dänischen Patentanmeldung Nr. 2885/81 beschrieben. Praparationen, die andere Verbindungen der Formel I enthalten, werden analog hergestellt.

Experiment A:

Wirkung auf IRI-Freisetzung in Ratten in vivo

10 männliche Ratten des WistarStammes, 150g (+/- 5g) wurden mit Pentobarbital betäubt. Polyethylen-Katheder

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BdEHMERT "& BOEHMERT l· / / ^ υ

wurden in die rechte Karotis Arterie zur Blutentnahme und in die linke Jugulare Vene für Infusionen eingeführt. Die Ratten wurden in zwei Gruppen mit jeweils 5 Tieren in jeder Gruppe aufgeteilt. Eine Gruppe wurde mit Glucose (1,5mg/min.) zwischen 0 bis 60 Minuten (Plazebo) infudiert und eine andere Gruppe mit Glucose (1 ,5mg/min.) + Glucagon-(1-21) {10(^g/kg/Std.) zwischen 0 bis 60 Minuten infudiert. Blut wurde in auf Eis gelagerte Glaser, die Heparin (250IU/ml) und Aprotinin (6 00 KIU/ml) enthielten zu den Zeiten 0, 1, 10, 20, 30, 40, 50 und 60 Minuten in Proben genommen. Insulin wurde durch Radioimmunessay (RIA) vom Plasma bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle I unten aufgeführt.

Tabelle I

I IRI, μυ/ml.

Placebo	t 7	20	32	40	40	40	34	36
GlucaqonJl-21)	I I 18	43	48	62	56	56	60	55
Zeit, Min.	I I o	1	10	20	30	40	50	60

Experiment B:

Wirkung auf Plasma-Glucosespiegel in Ratten in vivo.

1. Intravenöse Gabe

Männliche Wistar Ratten wurden wie in Experiment A beschrieben, vorbereitet. Eine Gruppe von 5 Ratten bekam zwischen 0 bis 3 0 Minuten eine intravenöse Infusion von Glucose (2 mg/min), gefolgt durch Infusion einer 0,9%igen Salzlösung mit 0,1% HSA (menschliches Serum Albumin). Eine Gruppe von 5 Ratten bekam eine intravenöse Infusion

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BÖEHMERT & BOEIiMERT 3 2 4 7 7 (T' 6

von Glucose (2 mg/min) zwischen 0 bis 3 0 Minuten, gefolgt durch eine Infusion von 1mg Glucagon (1-21) in Salzlösung mit HSA zwischen 30 bis 60 Minuten. Blutproben wurden aus der Karotisarterie zu den Zeiten 0, 2, 5, 10,20, 25, 30, 40, 50, und 60 Minuten gezogen und die Blutglucosewerte

nach dem Hexokinase-Verfahren auf einem Autoanalyser bestimmt. Die Blutglucosewerte sind in der Tabelle II unten aufgeführt.

Tabelle II Γ	Elutalucose	1.	1.	3	mg/ml	.7	1.8	1	.8	1	.5	1	.3	1	.2
I Placebo \|	0.	1.	1.	4	1.4 1	.7	1.9	1	.9	1	.3	1	.0	0	.8
I Glucagon-\| (1-21) I	1.			5	1.5 1	20	25		30		40		50		60
Zeit, Min.)		.1		10
.9	.2
.0	2
0

2. Orale Gabe von Glucose.

Die Wirkung von Glucagon-(1-21)in Ratten wurde während einem oralen Glucosetoleranztest untersucht. 20 männliche Wistar Ratten wurden in 2 Gruppen je 10 Ratten aufgeteilt und wie folgt dosiert: Beide Gruppen wurden mit Glucose (5g/kg, Peroral) bei 0 und 60 Minuten dosiert. Die Plazebo Gruppe wurde mit 1ml einer 0,9%igen Salzlösung mit 0,1 HSA intraperitoneal zu den Zeiten 0, 30, 6 0 und 90 Minuten behandelt. Die andere Gruppe wurde mit Glucagon-(1-21) (1mg/kg) in 0,9%iger Salzlösung mit HSA zu den Zeiten 0, 30, 60 und 90 Minuten behandelt. Blutproben wurden aus den Schwänzen zu den Zeiten -5, 0, 15, 30, 45, 60, 90, und 120 Minuten zur Blutglucosebestimmung genommen. Die Blutglucosewerte sind in Tabelle III unten aufgeführt.

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RöEHMERT & BOE-HJViERT 3 2 4 / / t 6

Tabelle III I	0	Blutglucose	0.98 1	rng/ml	52	1	.46	1	.45	1.	60	1	.54
I Placebo \|	0	.88	0.96 1	.60 1.	35	1	.23	1	.36	1.	37	1	.37
I Glucagon- \| (1-21) I		.89	0	.32 1.	30		45		60		90		12 0
I .Zeit, Min. j	-5	15

Experiment C:

Wirkung auf den Blutglucosespiegel in Schweinen in vivo

1. Intravenöse Gabe

Die Wirkung von Glucagon-(1-21) auf Plasmaglucosespiegel wurde während einer intravenösen Glucoseinfusion untersucht. 4 weibliche Schweine (Dänische Rasse/Yorkshire), mit einem Gewicht von 3 0kg (+/- 3kg) wurden mit Glucose (O,7g/kg/Std.) als intravenöse Infusion dosiert und mit der gleichen Glucoseinfusion + Infusion von Glucagon-(1-21)(1ΟΟμ g/kg/Std.)zwischen 0 bis 120 Minuten behandelt. Das Experiment wurde als crossover Experiment durchgeführt. Die Schweine wurden durch intravenöse Ohrkatheder infundiert und Blutproben . vom anderen Ohr zu den Zeiten 0, 15, 30, 45, 60, 75, 90, 105, und 120 Minuten genommen. Glucose wurde nach dem Hexokinaseverfahren bestimmt; die Blutglucosewerte sind in Tabelle IV unten aufgeführt.

Tabelle IV

I Plasma Glucose, mg/ml

Placebo	1	.0	1	.7	2	.1	2.	2	2	.3	2	.3	2.3	2.2	2.3
Glucagon- (1-21) + Glucose	0	.9	1	.5	1	.7	1.	8	1	.9	1	.8	2.0	1.9	1.9
•Zeit,.· Min.		0		15		30	4	5		60		75	90	105	120

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BÖEHMERT& BOEIiMERT 3 2 4 7 7 t'6

2. Orale Gabe von Glucose,

Die Wirkung von Glucagon-(1-21) auf die Plasma-Glucosespiegel wurde während eines oralen Glucosetoleranztests bei Schweinen untersucht. 4 Schweine wurden in einem cross-over Experiment mit Glucose (5g/kg) peroral bei 0 und 60 Minuten + Placebo (Salzlösung mit HSA) oder Glucagon-(1-21) (1mg/kg/Std.) zwischen 0 bis 120 Minuten intravenös, dosiert. Blutproben wurden von einer Ohrvene zu den Zeiten -5, 10, 20, 30, 45, 60, 75, 90, 105 und Minuten genommen und die Plasmaglucose nach dem Hexokinase-Verfahren bestimmt. Die Plasmaglucosewerte sind in Tabelle V unten aufgeführt:

Tabelle V

	Plasma	Glucose,	1.8	mg/ml	•	2	.5	2.7	2	.8	2.7	2.4
Placebo	0.8 1	.3	1.4	2.2	2.5	1	.9	1.8	1	.7	1.7	2.1
Glucagon- (1-21)	0.8 1	.0	20 ·	1.7	1.8		60	75		90	105	120
Zeit, Min.		10	30	45

Experiment D:

Untersuchungen der Wirkung von Glucagon und Glucagon-(1-21) auf Plasmaglucose und Plasma IRI-Spiegel in Normoglykämisehen Ratten.

Glucagon (1mg/kg) und eineaeguimolare Dosis Glucagon-(1-21}, nämlich 0,77mg/kg,wurden intravenös zur Startzeit (Zeit: 0 Minuten) normal gefütterten männlichen Wistar Ratten, die 150g (+/- 5g) wogen, injiziert. Blutproben wurden aus dem orbitalen Plexus zu den Zeiten -5, 2, 5, 10, 15, 30 und 6 0 Minuten entnommen. Blutglucose wurde nach der Hexokinase-

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BOEHMEKT -& 3OEHMEKT

324771 ο

Methode bestimmt und Plasmainsulin durch RIA. Glucagon besaß eine signifikant steigernde Wirkung auf Blutglucose und Plasma IRI. Glucagon besaß eine signifikant Blutglucose- und Plasma-IRI steigernde Wirkung. Im Gegensatz zu Glucagon besaß Glucagon(1-21 keine Wirkung auf diese Parameter. Mittlere Blutglucosewerte (N = 10) sind in Tabelle VI unten aufgeführt, und mittlere Plasma IRI-Werte (N = 10) sind in Tabelle VII unten aufgeführt.

Tabelle VI	Blutglucose	1.2	1.3	mg/ml	1.4	1.5	1.1	I I experiment
Glucagon	0.9	1.1	1.1	1.3	1.2	1.1	1.3	T I T.acr 1
Placebo	0.9	1.1	1.1	1.2	1.3	1.3	■1.3	I I experiment
Glucagon(l-21)	1.0	1.2	1.2	1.2	1.3	1.3	1.3	Ί I Jag 2.
- Placebo	1.0	2	5	1.3	15	30	60	I I.
Zeit, Min.'	-5	1:0

Tabelle VII	I Plasma	95	IRI μϋ/ml	82	67	53	17	experiment«
Glucagon	I ! 19	' 25	98	23	20	22	25	Taa ' 1
Placebo	I 17	30	28	35	43	38	30	experiments
Glucagon(1-21)	I I 32	20	33	22	24	22	16	Tag 2
Placebo	I ! 13	2	2 0	10	15	30	60
-Zeit, Min.	I "5	. 5

Experiment E:

Studie der akuten Toxizität

10mg Glucagon-(1-21), die intravenös als Bolus NMRI Mäusen mit einem Gewicht von etwa 20g (d.h. in einer Dosis von etwa 500mg/kg Körpergewicht) gegeben wurden, besaßen keine ungünstige Wirkung. Es traten keine Todesfälle auf.

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Claims

NXM 812 Ansprüche

1. Verwendung von Verbindungen der allgemeinen Formel

R'-R" (I)

als Agens zum Freisetzen von Insulin, wobei R' His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-, und R" Hydroxy, die Peptid-Kette Phe-Val-Gln-Trp-Leu oder -Met-Asn-Thr oder eine entsprechende Peptid-Kette oder Aminosäure, die identisch mit einer der beiden letzt-genannten Peptid-Ketten ist, außer daß eine oder mehrere der Aminosäure(n) fehlt(en) repräsentiert, oder Salze derselben.

2. Verwendung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Aminosäuresequenz^ in der Verbindung der Formel I identisch mit der Sequenz in einem Glucagon-Fragment ist.

3. Verwendung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß R" Phe, VaI, Gin, Trp, Leu, Met, Asn oder Thr repräsentiert.

4. Verwendung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß

R" Hydroxy₍-Phe-Val-Gln-Trp-Leu oder -Met-Asn-Thr repräsentiert.

5. Verwendung nach einem der Ansprüche 1, 2 und

4, dadurch gekennzeichnet, daß R" Hydroxy repräsentiert.

6. Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindung der Formel I für die Behandlung von Diabetikern verwandt wird.

7. Verwendung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindung der Formel I zur Behandlung von Diabetikern mit einer noch bestehenden Beta-Zellen-Funktion eingesetzt wird.

8. Verwendung gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindung der Formel I in wirksamer Menge eingesetzt wird.

9. Pharmazeutische Zusammensetzung mit einem wirksamen Gehalt einer Verbindung der Formel I gemäß Anspruch 1 oder eines Salzes derselben, in Assoziation mit einem geeigneten physiologisch verträglichen Träger, Verdünnungsmittel und/oder Corrigens, wenn sie als insulinfreisetzendes Medikament eingesetzt wird.

10. Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß sie zwischen 7,5 und 75.00C^g, bevorzugt zwischen 7 5 und 7500 μg einer Verbindung der Formel I oder eines Salzes derselben pro Dosiseinheit aufweist.

11. Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Verbindung der Formel I aufweist, wobei die Aminosäuresequenz identisch mit der Sequenz eines Glukagon-Fragments ist.

E&MERT 324/786

12. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Verbindung der Formel I aufweist, wobei R" Phe, VaI, Gin, Trp, Leu, Met, Asn oder Thr repräsentiert.

13. Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Verbindung der Formel I aufweist, wobei R" Hydroxy, -Phe-Val-Gln-Trp-Leu oder -Met-Asn-Thr repräsentiert.

14. Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 9, 10 oder 13, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Verbindung der Formel I aufweist, wobei R" Hydroxy ist.

15. Verwendung von Verbindungen der Formel I in Anspruch1, bevorzugt der Verbindungen, die nach einem der Ansprüche 2-5 eingesetzt werden, oder eines Salzes derselben zur Herstellung vom Medikamenten mit Insulin freisetzender Wirkung.

16. Verwendung der Formel I wie in Anspruch 1, bevorzugt der Verbindungen, die nach irgendeinem'- der Ansprüche 2-5 eingesetzt werden, zur Verwendung als Insulin freisetzendes Agens.

17. Insulin freisetzendes Agens , dadurch gekennzeichnet, daß es eine Verbindung der Formel I wie in Anspruch 1 aufweist, bevorzugt der Verbindungen, die gemäß einem der Ansprüche 2-5 verwandt werden.

18. Verwendung einer Verbindung der Formel I wie in Anspruch 1, bevorzugt der Verbindungen _J die gemäß irgendeinem der Ansprüche 2-5 eingesetzt werden, zur Behandlung von Personen, die normalerweise eine zu niedrige Insulin Produktion besitzen,

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-BOEHMERT &' BOEHMERT

7 7 86 - 4 -

19. Verfahren zum Behandeln oder Verhindern von Hyper-Glykämie gekennzeichnet durch Gabe einer Verbindung der Formel I wie in Anspruch 1, bevorzugt der Verbindungen, die gemäß einem der Ansprüche 2-5 eingesetzt werden, zur Insulin-Freisetzung.

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