DE3111859C2

DE3111859C2 - Di-N↑6↑↑'↑,O↑3↑-desmethylistamycin A Verfahren zu dessen Herstellung und diese Verbindung enthaltende pharmazeutische Zubereitungen

Info

Publication number: DE3111859C2
Application number: DE3111859A
Authority: DE
Inventors: Daishiro Tokyo Ikeda; Shinichi Yokohama Kanagawa Kondo; Hamao Tokyo Umezawa
Original assignee: Microbial Chemistry Research Foundation
Current assignee: Microbial Chemistry Research Foundation
Priority date: 1980-03-28
Filing date: 1981-03-26
Publication date: 1983-03-03
Also published as: FR2482107A1; US4474946A; CA1175817A; IT8109369A1; DE3111859A1; IT1167854B; FR2482107B1; GB2073182A; JPS6362513B2; IT8109369A0; JPS56138180A; GB2073182B

Description

Die Erfindung betrifft ein neues Derivat des Istamycin A, welches als Di-N[hoch]6',O[hoch]3-desmethylistamycin A (d.i. 6'-N,3-O-Didesmethylamycin A) bezeichnet wird. Es handelt sich bei der Verbindung um ein synthetisches Aminoglycosid-Antibiotikum, welches als antibakterieller Wirkstoff verwendbar ist. Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung des neuen Derivates sowie pharmazeutische Zubereitungen, welche es enthalten.

Die Antibiotika Istamycin A und Istamycin B werden durch Züchtung einer neuen Streptomyces-Art, nämlich des Stammes Streptomyces tenjimariensis SS-939 (FERM-P 4932 oder ATCC 31603) gewonnen. Sie sind hoch aktiv gegen eine große Zahl gram-negativer und gram-positiver Bakterien (vgl. "Journal of Antibiotics" 32, 964 - 966, 1979). Es sind bereits intensive Untersuchungen über die Möglichkeit einer synthetischen Herstellung von Istamycin A aus 3',4'-Didesoxyneamin (vgl. "Journal of Antibiotics" 32, 1365 - 1366, 1979) durchgeführt worden. In Fortführung dieser Untersuchungen konnte jetzt ein neues Derivat von Istamycin A gefunden werden, und zwar das Di-N[hoch]6',O[hoch]3-desmethylistamycin A, welches sich durch eine hohe antibakterielle Wirkung gegen eine Vielzahl von gram-negativen und gram-positiven Bakterien auszeichnet und in einfacher Weise herstellbar ist. Insbesondere ist die Wirkung dieser Verbindung gegen Pseudomonas aeruginosa besser als die von Istamycin A selbst.

Aufgabe der Erfindung ist es, ein neues Derivat des Istamycin A und ein Verfahren zur Herstellung desselben sowie diese Verbindung enthaltende pharmazeutische Zubereitungen vorzuschlagen; die letzteren sollen zur Bekämpfung von bakteriellen Infektionen bei Menschen und Tieren sowie zur Sterilisation von chirurgischen Materialien und Instrumenten dienen.

Diese Aufgabe wird gelöst durch die im Anspruch 1 beschriebene und beanspruchte neue Verbindung, das Verfahren zur Herstellung derselben gemäß Anspruch 2 und die pharmazeutischen Zubereitungen gemäß Anspruch 3.

Istamycin A besitzt folgende Strukfurformel:

Die Verbindung der Formel I entspricht einem Derivat des Istamycin A, bei welchem aus der Methoxygruppe in 3-Stellung und der Methylaminogruppe in 6'-Stellung jeweils die Methylgruppe entfernt worden ist.

Die neue Verbindung I gemäß der Erfindung weist folgende physikalisch-chemische und biologische Eigenschaften auf:

Das Monocarbonat des Di-N[hoch]6',O[hoch]3-desmethylistamycin A liegt in Form eines farblosen Pulvers vor, welches keinen definierten Schmelzpunkt besitzt, sich vielmehr bei 138 bis 145°C zersetzt, eine spezifische optische Drehung von [kleines Alpha][hoch]22[tief]D + 136° (c 0,36 in Wasser) aufweist und bei der Gewichtsanalyse folgende Werte ergibt:

Gewichtsanalyse für C[tief]15H[tief]31N[tief]5O[tief]5 x H[tief]2CO[tief]3

Berechnet: C 45,38 %; H 7,85 %; N 16,54 %;

Gefunden: C 45,39 %; H 7,63 %; N 16,42 %.

In der Massenspektrometrie des Monocarbonates erkennt man eine Schulter bei (M + 1)[hoch]+ bei m/e = 362; bei der Dünnschichtchromatographie des Monocarbonates an Silikagel ergibt sich ein Einzelfleck (positiv gegen Ninhydrin-Reagenz) bei R[tief]f 0,06, wenn zum Entwickeln die untere Phase eines Lösungsmittelgemisches aus Chloroform, Methanol und 28%igem wäßrigem Ammoniak (Volumenverhältnis 2 : 1 : 1) verwendet wird, wird zum Entwickeln ein Lösungsmittelgemisch aus Butanol, Äthanol, Chloroform und 17%igem wäßrigem Ammoniak (Volumenverhältnis 4 : 5 : 2 : 5) verwendet, so ergibt sich ein Einzelfleck bei R[tief]f 0,46.

Die Verbindung der Formel I zeichnet sich durch eine starke antibakterielle Wirkung gegen eine Vielzahl von gram-negativen und gram-positiven Bakterien aus, was deutlich aus den in der folgenden Tabelle 1 zusammengestellten antibakteriellen Wirkungsspektren hervorgeht. Die Wirkung von Istamycin A ist zu Vergleichszwecken mit angegeben. Die Mindesthemmkonzentrationen (mcg/ml), die in der Tabelle angegeben sind, wurden nach der Standard-Methode der seriellen Verdünnung an Nähragarplatten, welche bei einer Temperatur von 37°C 17 Stunden bebrütet worden sind, bestimmt. Die in Tabelle 1 zusammengestellten Ergebnisse zeigen, daß Di-desmethylistamycin A gemäß vorliegender Erfindung eine erheblich stärkere Wirkung gegen Pseudomonas aeruginosa besitzt als Istamycin A selbst.

Tabelle 1

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Test Mikroorganismen Mindesthemm-Konzentrationen (mcg/ml)

Di-desmethyl- Istamycin A

istamycin A

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Staphylococcus aureus FDA 209P 1,56 0,78

Staphylococcus aureus Smith < 0,20 < 0,20

Staphylococcus aureus Ap01 1,56 0,78

Staphylococcus epidermidis 109 1,56 0,78

Micrococcus flavus FDA 16 3,13 3,13

Sarcina lutea PCI 1001 0,78 0,20

Bacillus anthracis 0,39 < 0,20

Bacillus subtilis PCI 219 < 0,20 < 0,20

Bacillus subtilis NRRL B-558 < 0,20 0,39

Bacillus cereus ATCC 10702 3,13 3,13

Corynebacterium bovis 1810 1,56 1,56

Mycobacterium smegmatis ATCC 607 0,39 1,56

Escherichia coli NIHJ 6,25 3,13

Escherichia coli K-12 6,25 1,56

Escherichia coli K-12 R5 100 3,13

Escherichia coli K-12 R388 1,56 0,78

Escherichia coli K-12 J5R11-2 3,13 3,13

Escherichia coli K-12 ML1629 3,13 3,13

Escherichia coli K-12 ML1630 12,5 3,13

Escherichia coli K-12 ML1410 6,25 3,13

Escherichia coli K-12 ML1410 R81 3,13 1,56

Escherichia coli K-12 LA290 R55 12,5 3,13

Escherichia coli K-12 LA290 R56 3,13 1,56

Escherichia coli K-12 LA290 R64 3,13 1,56

Escherichia coli W677 3,13 1,56

Escherichia coli JR66/W677 6,25 3,13

Escherichia coli K-12 C600 R135 > 100 > 100

Escherichia coli JR225 3,13 1,56

Klebsiella pneumoniae PCI602 3,13 1,56

Klebsiella pneumoniae 22 # 3038 12,5 3,13

Shigella dysenteriae JS11910 12,5 3,13

Shigella flexneri 4B JS11811 12,5 6,25

Shigella sonnei JS11756 6,25 6,25

Salmonella typhi T-63 3,13 0,78

Salmonella enteritidis 1891 6,25 3,13

Proteus vulgaris OX19 1,56 0,78

Proteus rettgeri GN311 50 25

Proteus rettgeri GN466 12,5 6,25

Serratia marcescens 12,5 6,25

Fortsetzung

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Test Mikroorganismen Mindesthemm-Konzentrationen (mcg/ml)

Di-desmethyl- Istamycin A

istamycin A

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Serratia sp. SOU > 100 > 100

Serratia sp. 4 50 50

Providencia sp. Pv16 12,5 6,25

Providencia sp. 2991 12,5 25

Pseudomonas aeruginosa A3 3,13 6,25

Pseudomonas aeruginosa No. 12 25 100

Pseudomonas aeruginosa H9 12,5 25

Pseudomonas aeruginosa H11 50 100

Pseudomonas aeruginosa TI-13 12,5 25

Pseudomonas aeruginosa GN 315 25 25

Pseudomonas aeruginosa 99 > 100 > 100

Pseudomonas aeruginosa B-13 > 100 > 100

Pseudomonas aeruginosa 21-75 > 100 > 100

Pseudomonas aeruginosa PST 1 50 100

Pseudomonas aeruginosa

ROS 134/PV 21 50 100

Pseudomonas aeruginosa K-Ps 102 12,5 50

Pseudomonas maltophilia GN 907 > 100 > 100

Das erfindungsgemäße Di-N[hoch]6',O[hoch]3-desmethylistamycin A wird im allgemeinen in Form der freien Base oder in Form seines Hydrates oder Carbonates erhalten, welches jeweils in ein beliebiges pharmazeutisch akzeptables, nicht-toxisches Säureanlagerungssalz umgewandelt werden kann, indem man es in üblicher bekannter Weise mit einer pharmazeutisch akzeptablen Säure umsetzt. Beispiele für pharmazeutisch akzeptable Säuren, die für diesen Zweck verwendet werden können, sind anorganische Säuren wie Chlorwasserstoffsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure und Salpetersäure, außerdem organische Säuren wie Essigsäure, Apfelsäure, Zitronensäure, Ascorbinsäure und Methansulfonsäure.

Das Verfahren zur Herstellung der Verbindung der Formel I ist im Anspruch 2 beschrieben und beansprucht.

Die Ausgangsverbindung, die für das erfindungsgemäße Verfahren verwendet wird, kann als N[hoch]4-Desglycyl-di-N[hoch]6',O[hoch]3-desmethylistamycin A bezeichnet werden. Sie läßt sich ihrerseits aus 3',4'-Didesoxyneamin herstellen, welches wiederum nach der bekannten Methode gewonnen werden kann, die in "Journal of Antibiotics" 24, 711 - 712 (1971) oder "Bulletin of the Chemical Society of Japan" 46, 3507 - 3510 (1973) beschrieben ist.

Das N[hoch]4-Desglycyl-di-N[hoch]6',O[hoch]3-desmethylistamycin A weist folgende Eigenschaften auf:

Das Monocarbonat des N[hoch]4-Desglycyl-di-N[hoch]6',O[hoch]3-desmethylistamycin A ist ein farbloses Pulver, welches keinen definierten Schmelzpunkt besitzt, sondern sich bei 115 - 118°C zersetzt. Es weist eine spezifische optische Drehung [kleines Alpha][hoch]22[tief]D + 102° (c 0,65; Wasser) auf. Bei der Gewichtsanalyse wurden folgende Werte gefunden: C 46,15 %; H 7,97 %; N 15,37 %. Diese Werte stimmen mit den theoretischen Werten für die Summenformel C[tief]13H[tief]25N[tief]4O[tief]4 x H[tief]2CO[tief]3 (C: 45,89 %; H: 8,25 %; N: 15,29 %) überein. Bei der Massenspektrometrie zeigt das Monocarbonat eine M[hoch]+-Schulter bei m/e = 304; bei der Dünnschichtchromatographie an Silikagel ergibt sich ein Einzelfleck (positiv gegenüber Ninhydrin) bei R[tief]f 0,12, wenn zum Entwickeln die untere Phase eines Lösungsmittelgemisches aus Chloroform, Methanol und 28%igem wäßrigem Ammoniak (Volumenverhältnis 2 : 1 : 1) verwendet wird; verwendet man zum Entwickeln ein Lösungsmittelgemisch aus Butanol, Äthanol, Chloroform und 17%igem wäßrigem Ammoniak (Volumenverhältnis 4 : 5 : 2 : 5), so liegt der Einzelfleck bei R[tief]f 0,50.

Das Di-N[hoch]6',O[hoch]3-desmethylistamycin A der Formel I wird erfindungsgemäß aus dem N[hoch]4-Desglycyl-di-N[hoch]6',O[hoch]3-desmethylistamycin A durch Acylierung der Methylaminogruppe in der 4-Stellung mit Glycin (Glycylierung) hergestellt. Um eine selektive Glycylierung der 4-Methylaminogruppe in hoher Ausbeute zu erreichen, ist es notwendig, zuvor die anderen Aminogruppen in der 1-, 2'- und 6'-Stellung durch Aminogruppen zu blockieren. Dabei ist es günstig, daß in der Reaktivität zwischen diesen drei Aminogruppen und der 4-Methylaminogruppe ein erheblicher Unterschied besteht. Ein N-geschütztes Derivat, in welchem die drei Aminogruppen in der 1-, 2'- und 6'-Stellung blockiert sind, kann in bekannter Weise in hoher Ausbeute hergestellt werden, indem man die Ausgangsverbindung mit 3 - 3,5 Moläquivalent eines bekannten Reagenz zum Schützen von Aminogruppen, beispielsweise einem Säurehalogenid oder -azid, einem aktiven Ester oder einem Säureanhydrid umsetzt. Beispiele bekannter Aminoschutzgruppen sind folgende: Alkoxycarbonylgruppen wie tert.-Butoxycarbonyl und tert.-Amyloxycarbonyl, Cycloalkylcarbonylgruppen wie Cyclohexyloxycarbonyl; Aralkyloxycarbonylgruppen wie Benzyloxycarbonyl; Acylgruppen wie Trifluoracetyl und O-Nitrophenoxyacetyl; Phosphinothioylgruppen wie Diphenylphos- phinothioyl und Dimethylphosphinothioyl, Phosphinylgruppen wie Diphenylphosphinyl. Bekannte zweiwertige Aminoschutzgruppen können dazu verwendet werden, die Aminogruppen in Form von Schiff'schen Basen zu blockieren.

Das so gewonnene 1,2',6'-tri-N-geschützte Derivat des N[hoch]4-Desglycyl-di-N[hoch]6',O[hoch]3-desmethylistamycin A kann direkt, d.h. ohne Reinigung, für die nachfolgende Glycylierung der 4-Methylaminogruppe verwendet werden. Die 4-N-Glycylierung kann unter Verwendung von Glycin selbst oder einem funktionellen Äquivalent desselben in der aus der Synthese von Peptiden bekannten Weise durchgeführt werden. Zu den erfindungsgemäß verwendbaren funktionellen Äquivalenten des Glycins gehören Glycin plus Dicyclohexylcarbodiimide, gemischte Säureanhydride und -azide sowie aktive Ester des Glycins. Vorzugsweise wird die Aminogruppe des Glycins zuvor mit einer Aminoschutzgruppe blockiert; bei dieser Aminoschutzgruppe kann es sich um dieselbe Art oder um eine andere Art handeln, die zum Blockieren der Aminogruppen der Verbindung VIII verwendet worden ist. Beispiele für geeignete Aminoschutzgruppen sind die Benzyloxycarbonylgruppe, welche durch Hydrieren über einen Katalysator wie Palladium- oder Platinoxid leicht entfernbar ist, oder die tert.-Butoxycarbonylgruppe, die durch saure Hydrolyse, beispielsweise mit einer wäßrigen Lösung von Trifluoressigsäure oder Essigsäure oder mit verdünnter Salzsäure entfernbar ist.

Die 4-N-Glycylierung kann gegebenenfalls auch unter Verwendung eines aktiven Esters eines N-geschützten Glycins bei erhöhter Temperatur von 40 bis 60°C in einem geeigneten organischen Lösungsmittel wie Dioxan durchgeführt werden. Als aktiver Ester mit hoher Reaktivität eignet sich beispielsweise der N-Hydroxysuccinimidester von N-Benzyloxycarbonylglycin, der seinerseits in üblicher bekannter Weise hergestellt werden kann; diese Verbindung wird für die Glycylierung in einer Menge von 1 bis 1,5 Moläquivalent verwendet.

Nach Beendigung der Glycylierung werden alle in dem Reaktionsprodukt zurückgebliebenen Aminoschutzgruppen in bekannter Weise entfernt, beispielsweise durch Hydrieren oder durch saure Hydrolyse in der angegebenen Weise; man gewinnt so die erfindungsgemäße Verbindung der Formel I.

Die erfindungsgemäße neue Verbindung weist eine hohe antibakterielle Wirkung gegen eine große Zahl von Bakterien auf. Die Verbindung zeichnet sich durch eine geringe Toxizität für Tiere aus, was dadurch bewiesen wird, daß Mäuse eine intravenöse Verabreichung von 100 mg/kg vertrugen. Die Verbindung eignet sich infolgedessen als antibakterielles Mittel und kann zu diesem Zweck in die Form einer pharmazeutischen Zubereitung gebracht werden, die in an sich bekannter Weise Menschen und Tieren verabreicht werden kann.

Gegenstand der Erfindung sind infolgedessen auch die im Anspruch 3 gekennzeichneten und beanspruchten pharmazeutischen Zubereitungen. Diese Zubereitung kann zur Behandlung oder zur Vorbeugung bei bakteriellen Infekten verwendet werden. Die geeignete Menge an wirksamem Bestandteil in der verabreichten Zubereitung hängt dabei von der Art der Zubereitung, der Art der Verabreichung, den Bedingungen, unter denen die Behandlung erfolgt, und der Natur der zu bekämpfenden Bakterien ab. Ganz allgemein kann gesagt werden, daß der aktive Bestandteil dem Tier in einer Menge von 0,5 bis 5 mg/kg Körpergewicht verabreicht werden kann.

Die Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung.

Beispiel 1

Herstellung der Ausgangsverbindung für das erfindungsgemäße Verfahren

(a) Herstellung von 1,3,2',6'-tetra-N-Benzyloxycarbonyl-3',4'-didesoxyneamin

2,10 g (7,23 mMol) 3',4'-Didesoxyneamin wurden in 100 ml einer Mischung aus Wasser und Methanol (Volumenverhältnis 1 : 5) gelöst. Die Lösung wurde mit 11,9 g (4,3 mMol) Benzyl-4,6-dimethylpyrimidyl-2-thiolcarbonat und 2,3 ml Triäthylamin versetzt und bei Umgebungstemperatur 15 Stunden gerührt. Die entstandene Reaktionslösung wurde unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt und der verbliebene Rückstand wurde nacheinander mit 300 ml Wasser und 200 ml Äthyläther gewaschen. Man erhielt so 6,0 g (100 %) der Titelverbindung in Form eines schwach gelben Pulvers. Zersetzungspunkt 237 - 238°C. [kleines Alpha][hoch]20[tief]D + 45° (c 2; CHCl[tief]3).

(b) Herstellung von 3,2',6'-Tri-N-benzyloxycarbonyl-3',4'-didesoxyneamin-1,6-carbamat

1,34 g (1,62 mMol) des gemäß Stufe (a) erhaltenen Produktes wurden in 13 ml wasserfreiem Dimethylformamid gelöst. Zu der Lösung wurden danach bei 135 mg (4,9 mMol) Natriumhydrid (50%ige Suspension in Öl) unter Eiskühlung und unter einer Atmosphäre aus Argongas gegeben. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur 4 Stunden gerührt, danach durch Zugabe von Essigsäure neutralisiert und anschließend in 500 ml Eiswasser gegossen, wobei sich ein Niederschlag abschied. Der Niederschlag wurde abfiltriert und durch Säulenchromatographie an Silikagel (50 g Wako-gel C-200[hoch]R im Kreis) gereinigt, wobei zum Entwickeln der Kolonne ein Lösungsmittelgemisch aus Chloroform und Aceton (Volumenverhältnis 2 : 1 bis 1 : 1) verwendet wurde. Die Ausbeute an der Titelverbindung betrug 683 mg (62 %). [kleines Alpha][hoch]28[tief]D + 58° (c 2; CHCl[tief]3). R[tief]f 0,25 bei der Dünnschichtchromatographie (TLC) an Silikagel unter Verwendung von Chloroform-Äthanol (20 : 1) als Laufmittel.

(c) Herstellung von 3,2',6'-Tri-N-bezyloxycarbonyl-3',4'-didesoxy-5-O-tetrahydropyranylneamin-1,6-carbamat

3,7 (5,15 mMol) des gemäß Stufe (b) erhaltenen Produktes wurden in 50 ml Dimethylformamid gelöst. Zu der Lösung wurden 1,3 g (15,5 mMol) 3,4-Dihydro-2H-pyran und 196 mg (1,14 mMol) wasserfreie para-Toluolsulfonsäure gegeben. Man ließ die Mischung bei Umgebungstemperatur 72 Stunden stehen, versetzte das Gemisch mit 1 ml Triäthylamin und engte anschließend unter vermindertem Druck ein, wobei ein Rückstand verblieb. Dieser letztere wurde über Silikagel (300 g Wako-gel C-200[hoch]R im Kreis) chromatographiert, wobei Chloroform-Äthanol (100 : 1) als Laufmittel verwendet wurde. Die Ausbeute an der Titelverbindung betrug 2,4 g (57 %). Zersetzungspunkt 79 - 83°C. [kleines Alpha][hoch]22[tief]D + 33° (c 0,5; CHCl[tief]3). R[tief]f 0,51 bei der Dünnschichtchromatographie an Silikagel mit Chloroform-Äthanol (15 : 1) als Laufmittel.

(d) Herstellung von 3,2',6'-Tri-N-benzyloxycarbonyl-1-N-tert.-butoxycarbonyl-3',4'-didesoxy-6-O-mesyl-5-O-tetrahydropyranylneamin

2,3 g (2,86 mMol) des gemäß Verfahrensstufe (c) gewonnenen Produktes wurden in 80 ml Dioxan gelöst. Diese Lösung wurde mit 25 ml 0,05 m Bariumhydroxid versetzt. Die Mischung wurde 30 Minuten bei 60°C gerührt und dann mit weiteren 30 ml 0,05 m Bariumhydroxid in Wasser versetzt und danach eine Stunde gerührt. Danach wurden nochmals 30 ml 0,05 m Bariumhydroxid zugefügt und die Gesamtmischung wurde eine weitere Stunde gerührt, um die Öffnung des Ringes bei dem 1,6-Cyclocarbamat zu erreichen. Nach Beendigung der Umsetzung wurde gasförmiges Kohlendioxid durch die Reaktionslösung geleitet, wobei sich ein Niederschlag abschied, der abfiltriert wurde. Das Filtrat wurde unter vermindertem Druck eingeengt und der verbliebene Rückstand wurde mit 200 ml Chloroform extrahiert. Der Extrakt wurde unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt, wobei man 2,24 g eines schwach gelben Pulvers erhielt, welches aus 3,2',6'-Tri-N-benzyloxycarbonyl-3',4'-didesoxy-5-O-tetrahydropyranylneamin bestand.

Dieses Pulver wurde in 50 ml Methanol gelöst, zu der Lösung wurden 0,4 ml Triäthylamin und 1,35 g (5,7 mMol) tert.-Butyl-4,6-dimethylpyrimidyl-2-thiolcarbonat gegeben. Die Mischung wurde bei Umgebungstemperatur über Nacht gerührt und anschließend unter vermindertem Druck eingeengt. Der verbliebene Rückstand wurde in 20 ml Toluol aufgenommen, die entstandene Lösung wurde mit n-Hexan versetzt, worauf sich ein Niederschlag abschied. Dieser Niederschlag wurde abfiltriert und mit Wasser gewaschen. Man erhielt auf diese Weise 2,24 g pulverförmiges 3,2',6'-Tri-N-benzyloxycarbonyl-1-N-tert.-butoxycarbonyl-3',4'-didesoxy-5-O-tetrahydropyranylneamin.

Eine Lösung dieses Pulvers in 50 ml Pyridin wurde mit 574 mg (5,7 mMol) Methansulfonylchlorid vermischt und die Mischung wurde über Nacht bei Umgebungstemperatur gerührt. Die danach vorliegende Reaktionslösung wurde zur Trockne eingeengt. Der verbleibende Rückstand wurde durch Säulenchromatographie an Silikagel (150 g Wako-gel C-200[hoch]R im Kreis) gereinigt, wobei als Laufmittel Toluol-Aceton (5 : 1) verwendet wurde. Die Ausbeute an der Titelverbindung betrug 1,65 g (60 %). Zersetzungspunkt 101 - 105°C. [kleines Alpha][hoch]22[tief]D + 29° (c 0,44; CHCl[tief]3).

(e) Herstellung von 3-O-Benzoyl-1,2',6'-tri-N-benzyloxycarbonyl-4-N-tert.-butoxycarbonyl-5-O-tetrahydropyranyl-N[hoch]4-desglycyl-tri-N[hoch]4,N[hoch]6',O[hoch]3-desmethylistamycin A

1,37 g (1,43 mMol) des Produktes aus der Verfahrensstufe (d) wurden in 55 ml trockenem Tetrahydrofuran gelöst. Die Lösung wurde mit 194 mg (3,6 mMol) Natriummethylat versetzt, und zwar unter einer Atmosphäre aus Argongas bei 0°C. Die erhaltene Mischung wurde 30 Minuten gerührt und dann bei 10°C 15 Stunden stehengelassen. Die entstandene Reaktionslösung wurde im Überschuß mit Ammoniumchlorid und Wasser versetzt und anschließend mit Chloroform extrahiert. Der Extrakt wurde zur Trockne eingeengt, wobei man 1,23 g pulverförmiges Aziridinderivat erhielt. [kleines Alpha][hoch]22[tief]D + 10° (c 0,5; CHCl[tief]3). R[tief]f 0,41 bei der Dünnschichtchromatographie an Silikagel unter Verwendung von Benzol-Äthylacetat (1 : 1) als Laufmittel.

1,12 g des so gewonnenen Pulvers wurden in 50 ml Dimethylformamid gelöst. Die Lösung wurde mit 1,3 g Natriumbenzoat versetzt. Die Mischung blieb bei Raumtemperatur 10 Stunden stehen, damit die Spaltung des Aziridinringes eintreten konnte. Die Reaktionslösung wurde danach mit 300 ml Chloroform vermischt und zweimal mit gesättigter wäßriger Natriumchloridlösung gewaschen. Die Chloroformschicht wurde abgetrennt, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und zur Trockne eingeengt. Der Rückstand wurde durch Säulenchromatographie an Silikagel (180 g Wako-gel C-200[hoch]R im Kreis) gereinigt, wobei Toluol-Äthylacetat (5 : 2) als Laufmittel verwendet wurde. Die Ausbeute an der Titelverbindung betrug 878 mg (76 %). Zersetzungspunkt 84 - 86°C. [kleines Alpha][hoch]22[tief]D + 61° (c 0,49; CHCl[tief]3). R[tief]f 0,54 bei der Dünnschichtchromatographie an Silikagel unter Verwendung von Benzol-Äthylacetat (1 : 1) als Laufmittel.

(f) Herstellung von Tri-N[hoch]1,N[hoch]2',N[hoch]6'-benzyloxycarbonyl-N[hoch]4-tert.-butoxycarbonyl-O[hoch]5-tetrahydropyranyl-N[hoch]4-desglycyl-tri-N[hoch]4,N[hoch]6',O[hoch]3-desmethylistamycin A

860 mg (0,88 mMol) des Produktes, welches in Stufe (e) erhalten worden ist, wurden in 20 ml 12%igem methanolischem Ammoniak gelöst. Die Lösung blieb 40 Stunden bei Umgebungstemperatur stehen, damit die Entfernung der 3-O-Benzoylgruppe eintreten konnte. Die danach vorliegende Reaktionslösung wurde zur Trockne eingeengt. Der verbleibende Rückstand wurde über Silikagel (70 g Wako-gel C-200[hoch]R im Kreis) chromatographiert, wobei Benzol-Äthylacetat (1 : 1) als Laufmittel verwendet wurde. Die Titelverbindung wurde in einer Menge von 693 mg (90 %) gewonnen. Zersetzungspunkt 88 bis 90°C. [kleines Alpha][hoch]22[tief]D + 44° (c 0,5; CHCl[tief]3). R[tief]f 0,18 bei der Dünnschichtchromatographie an Silikagel unter Verwendung von Benzoläthylacetat (1 : 1) als Laufmittel.

(g) Herstellung von N[hoch]4-Desglycyl-di-N[hoch]6',O[hoch]3-desmethylistamycin A

680 mg (0,78 mMol) des Produktes der Verfahrensstufe (f) wurden in 10 ml 90%iger wäßriger Trifluoressigsäure bei 0°C gelöst. Man ließ die Lösung zwei Stunden stehen, damit die hydrolytische Entfernung der Tetrahydropyranylgruppe und ggf. auch die Entfernung der tert.-Butoxycarbonylgruppe erreicht wurde. Die Reaktionslösung wurde zur Trockne eingeengt. Der verbliebene Rückstand wurde in 50 ml Chloroform aufgenommen und nacheinander mit 1 n wäßrigem Natriumhydroxid und Wasser gewaschen. Die Chloroformschicht wurde abgetrennt, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und zur Trockne eingeengt. Der Rückstand wurde durch Säulenchromatographie an Silikagel (50 g Wako-gel C-200[hoch]R im Kreis) gereinigt, wobei als Laufmittel ein Gemisch aus Chloroform, Methanol und 17%igem wäßrigem Ammoniak (80 : 10 : 1) verwendet wurde. Man erhielt 350 mg (65 %) pulverförmiges N[hoch]1,N[hoch]2',N[hoch]6'-Benzyloxycarbonyl-N[hoch]4-desglycyl-tri-N[hoch]4,N[hoch]6',O[hoch]3-desmethylistamycin A.

Zu einer Lösung aus 293 mg (0,42 mMol) des wie vorstehend beschrieben erhaltenen Pulvers in 5 ml Methanol wurde eine weitere Lösung aus 27 mg Natriumcarbonat in 0,5 ml Wasser gegeben. Anschließend wurden noch 55 mg (0,5 mMol) Äthylchloroformiat bei 0°C zugesetzt. Die entstandene Mischung wurde zwei Stunden bei Raumtemperatur gerührt, um die Einführung der Äthoxycarbonylgruppe zu erreichen. Danach wurde die Reaktionslösung zur Trockne eingeengt. Der Rückstand wurde in 30 ml Chloroform aufgenommen und mit Wasser gewaschen. Die Chloroformschicht wurde über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und wiederum zur Trockne eingeengt. Man erhielt so 318 mg (98 %) pulverförmiges Tri-N[hoch]1,N[hoch]2',N[hoch]6',O[hoch]3-desmethylistamycin A. R[tief]f 0,62 bei der Dünnschichtchromatographie an Silikagel unter Verwendung von Chloroform-Methanol-17%igem wäßrigem Ammoniak (80 : 10 : 1) als Laufmittel.

Das gewonnene Pulver wurde in 8 ml einer Mischung aus Methanol, Wasser und Essigsäure (2 : 1 : 1) gelöst. Die Lösung wurde mit 100 mg 5%igem Palladium-auf-Kohle als Hydrierungskatalysator versetzt. Man ließ die Mischung unter einem Wasserstoffstrom zwei Stunden stehen; dabei wurden die Benzyloxycarbonylgruppen entfernt. Anschließend wurde der Katalysator aus der Reaktionsmischung entfernt und die letztere wurde zur Trockne eingeengt. Der verbleibende Rückstand wurde in Wasser gelöst und über eine Kolonne geleitet, die eine einem Volumen von 11 ml entsprechende Menge an Amberlite CG-50[hoch]R im Kreis (NH[tief]4-Form) enthielt. Die Kolonne wurde nacheinander mit Wasser und 0,1 m wäßrigem Ammoniak gewaschen und dann mit 0,2 m wäßrigem Ammoniak eluiert. Das Eluat wurde zur Trockne eingeengt. Man erhielt so 143 mg (95 %) pulverförmiges N[hoch]4-Äthoxycarbonyl-N[hoch]4-desglycyl-tri-N[hoch]4,N[hoch]6',O[hoch]3-desmethylistamycin A. R[tief]f 0,55 bei der Dünnschichtchromatographie an Silikagel unter Verwendung von Chloroform-Methanol-17%igem wäßrigem Ammoniak (3 : 3 : 1) als Laufmittel.

130 mg (0,36 mMol) des auf diese Weise gewonnenen Pulvers wurden in 6 ml wasserfreier Trifluoressigsäure bei 0°C gelöst. Die Lösung wurde zur Trockne eingeengt und der verbleibende Rückstand wurde in 3 ml trockenem Tetrahydrofuran aufgenommen. Zu der entstandenen Lösung gab man 15 ml 1 m Borhydrid-Tetrahydrofuran-Komplex. Die Mischung wurde bei 50°C 18 Stunden gerührt, damit die reduktive Umwandlung der Äthoxycarbonylaminogruppe in eine Methylaminogruppe eintreten konnte. Die Reaktionslösung wurde mit Wasser versetzt und anschließend zur Trockne eingeengt. Der verbleibende Rückstand wurde in 10 ml Wasser aufgenommen. Die wäßrige Lösung wurde durch Zugabe von wäßrigem Ammoniak auf pH 8 eingestellt und über eine Kolonne geleitet, die eine einem Volumen von 30 ml entsprechende Menge Amberlite CG-50[hoch]R im Kreis (NH[tief]4-Form) enthielt. Die Kolonne wurde nacheinander mit Wasser, 0,2 m, 0,3 m und 0,4 m wäßrigen Ammoniaklösungen gewaschen und mit 0,5 m wäßrigem Ammoniak eluiert. Das Eluat wurde aufgefangen und zur Trockne eingeengt. Man erhielt auf diese Weise 45 mg (40 %) des Monocarbonates der Titelverbindung in Form eines Pulvers. Zersetzungspunkt 115 - 118°C. [kleines Alpha][hoch]22[tief]D + 102° (c 0,65; H[tief]2O). Massenspektrometrie: m/e 304 (M[hoch]+). Bei der Dünnschichtchromatographie an Silikagel wurden folgende Werte erhalten: R[tief]f 0,12 bei Verwendung der unteren Schicht eines Gemisches aus Chloroform-Methanol-28%igem wäßrigem Ammoniak (2 : 1 : 1) als Laufmittel und R[tief]f 0,50 bei Verwendung eines Gemisches aus Butanol-Äthanol-Chloroform-17%igem wäßrigem Ammoniak (4 : 5 : 2 : 5) als Laufmittel.

Beispiel 2

Herstellung von Di-N[hoch]6',O[hoch]3-desmethylistamycin A

45 mg (0,123 mMol) N[hoch]4-Desglycyl-di-N[hoch]6',O[hoch]3-desmethylistamycin A-Monocarbonat, welches gemäß Beispiel 1 erhalten worden ist, wurden in 3 ml Methanol gelöst. Zu dieser Lösung wurden 0,017 ml (0,123 mMol) Triäthylamin und 94,9 mg (0,38 mMol) N-Benzyloxycarbonyloxysuccinimid gegeben.

Die entstandene Mischung ließ man bei Raumtemperatur 6,5 Stunden stehen, wodurch die Einführung der Benzyloxycarbonylgruppen als Aminoschutzgruppen erreicht wurde. Die so gewonnene Reaktionslösung, die aus Tri-N[hoch]1,N[hoch]2',N[hoch]6'-benzyloxycarbonyl-N[hoch]4-desglycyl-di-N[hoch]6',O[hoch]3-desmethylistamycin A bestand, wurde zur Trockne eingeengt. Der verbliebene Rückstand wurde in 3 ml Dioxan aufgenommen. Die Lösung wurde mit 67,9 mg (0,18 mMol) N-Hydroxysuccinimidester von N-Benzyloxycarbonylglycin versetzt. Die so gewonnene Lösung ließ man bei 60°C 6 Stunden stehen. Danach wurde die aus Tetra-N[hoch]1,N[hoch]2',N[hoch]6',N[hoch]2''-benzyloxycarbonyl-di-N[hoch]6',O[hoch]3-desmethylistamycin A bestehende Reaktionslösung zur Trockne eingeengt. Der Rückstand wurde in 4 ml eines Lösungsmittelgemisches aus Essigsäure, Methanol und Wasser (2 : 1 : 1) aufgenommen.

Zu dieser Lösung wurden 50 mg eines 5%igem Palladium-auf-Kohle-Hydrierungskatalysators gegeben. Die Entfernung der Benzyloxycarbonylgruppen erfolgte im Wasserstoffstrom in vier Stunden. Der Katalysator wurde aus dem Reaktionsgemisch abfiltriert; das Filtrat wurde zur Trockne eingeengt; der Rückstand wurde in Wasser aufgenommen. Die gewonnene wäßrige Lösung wurde über eine Kolonne geleitet, die eine einem Volumen von 6 ml entsprechende Menge Amberlite CG-50[hoch]R im Kreis (NH[tief]4-Form) enthielt. Die Kolonne wurde nacheinander mit Wasser, 0,1 m wäßrigem Ammoniak und 0,3 m wäßrigem Ammoniak gewaschen und dann mit 0,4 m wäßrigem Ammoniak eluiert. Das Eluat wurde in 1 ml-Fraktionen aufgefangen. Die aktiven Fraktionen Nr. 4 bis 10 wurden vereinigt und zur Trockene eingeengt. Man erhielt auf diese Weise 15 mg (29 %) Di-N[hoch]6',O[hoch]3-desmethylistamycin A-Monocarbonat in Form eines Pulvers. F. 138 - 145°C (unter Zersetzung); [kleines Alpha][hoch]22[tief]D + 136° (c 0,36; Wasser).

Claims

1. Di-N[hoch]6',O[hoch]3-desmethylistamycin A der Formel (I)

und dessen Säureanlagerungssalze.

2. Verfahren zur Herstellung der Verbindungen gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man jeweils in an sich bekannter Weise

A) N[hoch]4-Desglycyl-di-N[hoch]6',O[hoch]3-desmethylistamycin A mit 3 bis 3,5 Moläquivalenten eines üblichen Aminoschutzgruppenreagenz umsetzt,

B) die gemäß Verfahrensstufe A) erhaltene Tri-N[hoch]1,N[hoch]2',N[hoch]6'-geschützte Verbindung mit Glycin oder einem eine übliche N-Schutzgruppe aufweisenden Glycin oder mit einem funktionellen Glycin-Äquivalent acyliert,

C) aus der gemäß Verfahrensstufe B) erhaltenen N[hoch]4-Glycylverbindung die Schutzgruppen abspaltet und das erhaltene Di-N[hoch]6',O[hoch]3-desmethylistamycin A gegebenenfalls in ein Säureadditionssalz überführt.

3. Pharmazeutische Zubereitungen, bestehend aus mindestens einer Verbindung gemäß Anspruch 1 und üblichen Träger- und Hilfsstoffen.