DE2942194C2 - Aminoglycoside, Verfahren zu ihrer Herstellung und diese Verbindungen enthaltende antibiotische Mittel - Google Patents

Description

NH₂

in der R¹ und R², die gleich oder verschieden sein können, jeweils für ein Wasscrsioffstoin oder eine Methylgruppe stehen und R³ für ein Wasserstoffatom, eine ta 2-, 3- oder 4-Stellung durch eine Aminogruppe substituierte C₂- bis Q-Acylgruppe, eine in 2-, 3- oder 4-Stellung durch eine Aminogruppe substituierte C₂- bis Q-Alkylgruppe oder (S)-4-Amino-2-hydroxybutyl steht, mit der Maßgabe, daß, wenn R', R² und R³ Wasserstoffatome sind, die Methylaminogruppe in 4-Stellung nicht in transOrientierung zu den Hydroxylgruppen in 3- und 5-SteIlung steht, sowie deren pharmazeutisch annehmbare Säureadditionssalze.

2. Antibiotische Mittel, bestehend aus einer Verbindung nach Anspruch 1 und einem pharmazeutisch annehmbaren Verdünnungsmittel oder Träger.

3. Verfahren zur Herstellung der Verbindungen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Verbindung der allgemeinen Formel:

R¹

CH-NH-R²

NH₂

NH₂

in der R¹ und R² die in Anspruch 1 angegebenen Bedeutungen haben und R³' für Wasserstoff oder -COCH₂NH₂ steht, jeweils in an sich bekannter Weise

einem reaktiven Derivat davon acyliert und (D) aus der gemäß Verfahrensstufe (C) erhaltenen 4-N-Acylverbindung, gegebenenfalls nach Reduktion, die Schutzgruppen abspaltet

Die Erfindung betrifft neue Aminoglycoside, die als ίο Antibiotika geeignet sind, ein Verfahren zu ihrer Herstellung und diese Verbindungen enthaltende antibiotische Mittel.

Gegenstand der Erfindung sind Aminoglycoside der allgemeinen Formel:

NH,

in der R' und R², die gleich oder verschieden sein

Μ können, jeweils für ein Wasserstoffatom oder eine Methylgruppe stehen und R³ für ein Wasserstoffatom, eine in 2-, 3- oder 4-Stellung durch eine Aminogruppe substituierte Cr bis Ct-Acylgruppe, eine in 2-, 3- oder 4-Stellung durch eine Aminogruppe substituierte C₂- bis CVAlkylgruppe oder (S)-4-Amino-2-hydroxybutyl steht, mit der Maßgabe, daß, wenn R¹, R² und R³ Wasserstoffatome sind, die Methylaminogruppe in 4-Stellung nicht in trans-Orientierung zu den Hydroxylgruppen in 3- und 5-Stellung steht, sowie deren pharmazeutisch annehm bare Säureadditionssalze.

Es wurde gefunden, daß die erfindungsgemäßen Verbindungen der Formel (I), die in 5-Stellung eine Hydroxylgruppe haben, eine höhere antibiotische Aktivität haben als Verbindungen der Formel (I), die die Gruppe -OCH₃ in 5-Stellung aufweisen. Es wurde weiterhin festgestellt, daß die Verbindungen der Formel (I) vorteilhaft mit hohen Ausbeuten mit weniger Prozeßstufen hergestellt werden können, indem man die Verbindungen der Formel (I), die ein«: Methoxygmppe in 5-Stellung haben, mit starken Säuren behandelt und gegebenenfalls eine Acylierung anschließt.

Das zur Herstellung der Verbindungen der Formel (I) verwendete Ausgangs-Aminoglycosid wird durch die folgende Formel:

(A) entmethyliert und in den Fällen, in denen R³ eine andere Bedeutung als Wasserstoff oder Aminoacetyl haben soll,

(B) mit einem zur Einführung von Aminoschutzgruppen üblichen Reagenz umsetzt,

(C) die gemäß Verfahrensstufe (B) erhaltene, in 1-, 2'- und 6'-Stellung N-geschützte Verbindung mit einer an der Aminogruppe geschützten Aminocarbonsäure mit 2 bis 4 Kohlenstoffatomen, (S)-4-Amino-2-hydroxybuttersäure oder

OCH₃

NH₂

in der R¹ und R² die oben angegebenen Bedeutungen haben und R^v für Wasserstoff oder -COCH₂NH₂ steht, angegeben.

Einige der Verbindungen der Formel Π sind bereits bekannt

Unter den Ausgangsverbindungen der Formel (II) sind diejenigen der folgenden Formel:

CH

10

(A)

NH

15

20

in der R₃' für Wasserstoff oder -COCH₂NH₂ steht, und die Säureadditionssalze davon als Antibiotikum KA-6606 oder Sporaricin bekannt (vgL z.B. DE-OS 28 13 021).

Wie in dieser Druckschrift beschrieben wird, können die Verbindungen der Formel (A) durch ein Verfahren hergestellt werden, bei dem man einen das Antibiotikum KA-6606 erzeugenden Stamm der Gattung Saccharopolyspora kultiviert und das Antibiotikum KA-6606 aus der Kulturbrühe isoliert Ein typischer Stamm ist der Stamm Saccharopolyspora hirsuta KC-6606. Dieser Stamm wurde unter der Hinterlegungsnummer FERM-P Nr. 3912 beim Fermentation Research Instiute. Agency of Industrial Science & Technology, Japan, unter der Hinterlegungsnummer ATCC Nr. 20501 bei der American Type Culture Collection, und unter der Hinterlegungsnummer DSM 1238 bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen hinterlegt.

Wie in der DE-OS 28 13 021 beschrieben, kann das bekannte Antibiotikum KA-6606 in vier Antibiotika KA-6606 I, KA-6606 II, KA-6606 III und KA-6606 IV aufgetrennt werden. Die Antibiotika KA-6606 I, KA-6606 III und KA 6606 IV können leicht in KA-6606 II durch Behandlung mit Alkalien oder Säuren umgewandelt werden. Andere Antibiotika KA-6606 V und KA-6606 Vl können von dem Antibiotikum KA-6606 abgetrennt werden. Die Molekülformeln und die spezifischen Drehungen von KA-6606 1 bis VI werden nachstehend angegeben.

Antibiotika Molekularformel

spezifische Drehung

KA-6606 I
KA-6606 II
KA-6606 HI
KA-6606 IV
KA-6606 V
KA-6606 VI

C₁₇H₃₅O₅N₅ C₁₅H₃₂O₄N₄ C₁₈H₅₆O₆N₆ C₁₈H₃₅O₆N₅ C₁₅H₃₂O₄N₄ C₁₅Hj₂O₄N.

WYd ι- 104° (Cl, H₂O)
[aß⁷ + 1394° (Cl, H₂O)
Ia]³J + 103° (Cl, H₂O)
Ia)²J + 101° (Cl, H₂O)
[a]i^s + 103° (Q, H₂O)
[a]² _D ^s + 54° (Cl, H₂O)

Die Gruppen R₁, R₂ und R₃ von KA-6606 I bis Vl in der Formel (II) sind nachstehend tabellarisch zusammengefaßt:

	R«	R2	R3
KA-6606 I	CH3	H	COCH2NH2
KA-6606 II	CH3	H	H
KA-6606 Hl	CH3	H	COCHjNHCONH2
KA-6606 IV	CHj	H	COCH2NHCHO
KA-6606 V	CHj	H	H
KA-6606 VI	CH3	H	H

KA-6606 II, V und VI unterscheiden sich hinsichtlich dersterisehen Konfigurationen in 1- und4-Stellung.

In der DE-OS 28 13 021 wird im Detail die Trennung von KA-6606 I bis IV entsprechend der Formel (A) beschrieben. KA-6606 V und Vl können in ähnlicher Weise während der Trennung von KA-6606 1 bis IV aus rohem KA-6606, erhalten in der Weise gemäß der obengenannten Druckschrift, abgetrennt werden. So kann z. B. das rohe KA-6606 an einem Adsorbens, beispielsweise einem Kationenaustauscherharz vom schwachen Säuretyp, CM-Sephadex® oder CM-Cellulose, adsorbieren gelassen werden und durch eine Gradientenmethode oder eine stufenweise Methode unter Verwendung von wäßrigem Ammoniak, einer wäßrigen Lösung von Ammoniumcarbonat, einer wäßrigen Lösung von Ammoniumformiat etc. eluiert werden. Zunächst werden mehrere Spurenkomponenten eluiert und KA-6606 IV und hierauf KA-6606 111 werden als freie Basen eluiert. Bei der weiteren Elution werden die Substanzen KA-6606 I, VI und II nacheinander abgetrennt. Schließlich wird KA-6606 V abgetrennt. Diese erhaltenen Komponenten können gereinigt werden, indem man die Chromatographie auf Cellulose, Kieseigel etc. und die Chromatographie auf der Sephadex®-Reihe, z. B. LH 20, in geeigneter Weise kombiniert. So können sie beispielsweise durch Chromatographie mit Chloroform/Methanol/l7% Ammoniak-Lösung (1:8:3) auf einer Kieselgelsäule

gereinigt werden.

Die erhaltenen freien Basen werden sodann auf eine Säule eines stark basischen Anionenaustauscherharzes aufgegeben und beispielsweise mit Wasser eluiert Die aktiven Fraktionen werden gesammelt und lyophilisert, wodurch die reinen freien Basen erhalten werden. Diese freien Basen können in die entsprechenden Säureadditionssalze in herkömmlicher Weise umgewandelt werden, indem man anorganische Säuren, wie Salzsäure, Schwefelsäure, Bromwasserstoffsäure oder Kohlensäure, oder organische Säuren, wie Essigsäure oder Oxalsäure, zugibt.

Weitere Verbindungen der Formel (II), die bei der Erfindung als Ausgangsmaterial verwendet werden können, werden in der DE-OS 29 28 373 beschrieben.

Diese Verbindungen werden als Antibiotika KA-7038 oder Sannamycin bezeichnet Die Antibiotika KA-7038 können in der Weise hergestellt werden, daß man einen die antibiotische Substanz KA-7038 erzeugenden Stamm der Gattung Streptomyces kultiviert und die antibiotische Substanz KA-7038 aus der Kulturbrühe isoliert Ein tpyischer Stamm ist z. B. Streptomyces sp. KC-7038. Dieser Stamm KC-7038 wurde unter der Hinterlegungsnummer FERM-P Nr. 4388 beim Fermentation Research institute, Agency of Industrial Science & Technology, Japan, unter der Hinterlegungsnummer ATCC 31530 bei der American Type Culture Collection und unter der Hinterlegungsnummer DSM 1594 bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen hinterlegt.

Die Substanz KA-7038 kann in sieben Antibiotika KA-7038 I, KA-7038 II, KA-7038 III, KA-7038 IV, KA-7038 V, KA-7038 VI und KA-7038 VII weiter aufgetrennt werden. Diese können leicht durch Behandlung mit Säuren in die Säureadditionssalze umgewandelt werden.

Nachstehend werden die Formeln und die physikalischen und chemischen Eigenschaften der Ausgangssubstanzen KA-7038 I bis VII angegeben:

Molekularformel: spezifische Drehung: Schmelzpunkt:

Substanz KA-7038 III:

CH₂NHCH₃ -O

C₁₃H₂₈O₄N₄ [«1^ + 61° (c 1,H₂O) 85 bis 102⁰C

NH,

CH₃

NH₂

Molekularformel: spezifische Drehung: Schmelzpunkt:

Substanz KA-7038 IV:

C₁₅H₃₁O₄N₄

[aß + 78° (cO,5, H₂O) 74 bis 83°C

NH₂

OK

OCH₃

NH,

Molekularformel: spezifische Drehung: Schmelzpunkt:

OH

Substanz KA-7038 V:

Substanz KA-7038 I:

CH₂NHCH₃
O

NH₂

COCH₂NH₂

NH₂

Molekularformel:
spezifische Drehung:
Schmelzpunkt:

Substanz KA-7038 II:

OCHj

Ia]³J + 120,5° (el, H₂O)
83 bis 90"C

NH₂

Molekularformsl: spezifische Drehung:

NHCH₃

h₃₀₅ [a]l^! + 115° (cO,l, H₂O) 78 bis 82°C

NH,

OCH₃

NHCH₃

C₁₄H₃₀O₄N₄

[a]³ _D ^! + 98° (cO.5, H₂O)

Substanz KA-7038 VI:

NH₂

NHj

OCH₃

OH

NH₂

NHCH₃ NH₂

Molekularformel: spezifische Drehung:

CH,

C₁₅H₃AN₄

W?+ 58° (el, H₂O)

Substanz KA-7038 VII: CH,NHj -O

NH₂

OCH,

Molekularformel: spezifische Drehung:

Die Antibiotika KA-7038 können in der Weise erhalten werden, daß man einen KA-7038 erzeugenden Stamm, z.B. den Stamm FERM-P Nr.4388 oder den Stamm ATCC 31530, in einem Nährmedium, das eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle und Mineralien enthält, kultiviert und KA-7038 aus der Kulturbriihe abtrennt.

Geeignete Kulturmedien zur Verwendung bei der Fermentierung des die Substanz KA-7038 erzeugenden Stammes der Gattung Streptomyces enthalten Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und als fakultative Bestandteile anorganische Salze (Mineralien), sehr kleine Mengen von Schwermetallen etc.

Es können verschiedene Kohlenstoffquellen verwendet werden. Beispiele für bevorzugte Kohlenstoffquellen sind Glucose, Stärke, Saccharose, Fructose, Dextrin, Molassen und Glycerin, die entweder allein oder als geeignete Gemische verwendet werden können. Kohlenwasserstoffe, Alkohole, organische Säuren und Pflanzenöle können gleichfalls verwendet werden, wenn der eingesetzte Stamm sie als Kohlenstoffquelle verwerten kann.

Beispiele für geeignete Stickstoffquellen sind Sojabohnenmehi, Heieextrakt. getrocknete Hefe, Peptone, Fleischextrakt, Maisquellflüssigkeit, Casaminosäure, lösliches Distiller's Produkt, Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat. Ammoniumnitrat, Harnstoff und Natriumnitrat, die entweder allein oder als geeignete Gemische verwendet werden können. Beispiele für anorganische Salze sind Natriumchlorid. Nitrate, Calciumcarbonat, Kaliumchlorid, Kobalt(I)-chlorid und Eisen(II)-sulfat.

Anorganische Substanzen und organische Substanzen (z. B. Aminosäuren), die das Wachstum des Stammes unterstützen und die Erzeugung der Substanz KA-7038 fördern, können gleichfalls zu dem Kulturmedium, wie erforderlich, zugesetzt werden. Bei Verwendung einer Belüftungskultivierungsmethode kann auch ein Antischaummittel, z. B. ein Fettsäureöl, Siliconöle, Baumwollsamenöl oder Paraffin, zu dem Kulturmedium gegeben werden.

Die Kultivierung kann in einem festen Medium durchgeführt werden. Vorzugsweise wird aber, wie bei dem allgemeinen Herstellungsverfahren von Antibiotika, die Kultivierung in einer Flüssigkeit, insbesondere als Tauchkultivierung, durchgeführt. Die Kultivierung wird bei aeroben Bedingungen durchgeführt. Die Kultivierungstemperatur beträgt vorzugsweise etwa 20 bis etwa 35⁰C, mehr bevorzugt etwa 24 bis etwa 27° C Vorzugsweise wird während der Kultivierung der pH-Wert des Kulturmediums bei etwa 4 bis etwa 10 gehaltea Die Kultivierungszeit beträgt im allgemeinen etwa 2 Tage bis etwa i 0 Tage.

Als Ergebnis der Kultivierung wird die Substanz KA-7038 erzeugt und sie sammelt sich in der Kulturbrühe an. Wenn die in der Kulturbrühe erzeugte

NHCH₃

C₁₄H₃₀O₄N₄

IaJi'+ 59° (el, H₂O)

Menge der Substanz KA-7038 ein Maximum erreicht hat, dann wird die Kultivierung abgebrochen. Die Substanz KA-7038 kann aus der Kulturbrühe gesammelt werden.

Da die Substanz KA-7038 eine wasserlösliche basische Substanz ist, jedoch in üblichen organischen Lösungsmitteln schwer löslich ist. kann sie aus der Kulturbrühe in der Weise abgetrennt werden, daß man die Verfahrensweisen anwendet, die üblicherweise zum . Isolieren und Reinigen von wasserlöslichen basischen Antibiotika angewendet werden. So kann z. B. eine Adsorptionsdesorptionsmethode unter Verwendung eines Ionenaustauscherharze*, von Aktivkohle etc.. eine säulenchromatographische Methode unter Verwendung von Cellulose, Kieselgcl, Aluminiumoxid etc., und eine Extraktionsmethode mit Butanol. Amylalkohol etc.

unter Verwendung einer höheren Fettsäure als Hilfsmittel angewendet werden.

Wenn beispielsweise das Filtrat der Kulturbrühe auf eine Säule eines schwach sauren Kationenaustauscherharzes aufgegeben wird, dann wird darauf die Substanz KA-7038 adsorbiert. Die Substanz KA-7038 wird dann durch Elution mit 0,1 bis 3.0 N-Alkali oder Säure isoliert. Das resiinterendc aktive EIüs* kann lycphshssrt werde."., wodurch ein rohres Pulver der Substanz KA-7038 erhalten wird.

Beispiele für Alkalien, die zur Elution verwendet werden können, sind eine Ammoniumhydroxidlösung und eine wäßrige Lösung von Natriumhydroxid. Beispiele für geeignete Säuren sind Ameisensäure. Salzsäure und Schwefelsäure. Bei einem weiteren

•»5 Beispiel einer Gewinnungsmethode geht man so vor, daß man den pH-Wert des Filtrats der Kulturbrühe auf 7 bis 9 einstellt, das Filtrat mit Aktivkohle kontaktiert, damit die Substanz KA-7038 an der Aktivkohle adsorbiert wird, und die Substanz mit saurem Wasser

so eluieru Die Substanz KA-7038, die nach den oben beschriebenen Methoden isoliert werden kann, kann in KA-7038 I, II, III, IV, V, Vl und VII aufgetrennt werden, indem man sie in Wasser auflöst, auf eine Säule eines Adsorbens,

z. B. eines schwach sauren lonenaustauscherharzes des oben beschriebenen Typs oder eines schwach sauren Ionenaustauschers, wie z. B. CM-Cellulose, aufbringt, um die Substanz an dem Adsorbens adsorbieren zu lassen, und sodann mit einer wäßrigen alkalischen Lösung, z. B. verdünnter Ammoniumhydroxidlösung oder einer wäßrigen Lösung von Ammoniumcarbonat oder Ammoniumformiat, nach einer Gradientenmethode oder einer stufenweisen Methode eluiert. Entsprechend diesem Trennverfahren werden die Substanz

&5 KA-7038 IV, die Substanz KA-7038 VH, die Substanz KA-70381, die Substanz KA-7038 II, die Substanz KA-7038 VI, die Substanz KA-7038 III und die Substanz KA-7038 V nacheinander als freie Basen abgetrennt

Die resultierenden Substanzen KA-7038 I, II, III, IV, V, VI und VII, die abgetrennt worden sind, können in Pulverform erhalten werden, indem man das Eluat konzentriert und das Kondensat lyophilisiert. Sie können durch Säulenchromatographie, beispielsweise auf Cellulose oder einem stark basischen Anionenaustauscherharz, gereinigt werden. So kann man z. B. das Silver in Wasser auflösen, die Substanz an einer Säule eines stark basischen Anionenaustauscherharzes adsorbieren lassen, sie mit entionisiertem Wasser eluieren, Aktivfraktionen sammeln und die gesf.mmelten Fraktionen lyophilisieren. Die als freie Base erhaltene Substanz KA-7038 kann in ihre Säureadditionssalze durch Behandlung mit pharmazeutisch annehmbaren anorganischen oder organischen Säuren umgewandelt werden. Beispiele für solche Säuren sind anorganische Säuren, wie Schwefelsäure, Salzsäure, Jodwasserstoffsäure, Phosphorsäure, Kohlensäure, Salpetersäure, und organische Säuren, wie Essigsäure, Fumarsäure, Maleinsäure, Zitronensäure, Mandelsäure und Bernsteinsäure.

Die Substanz KA-7038 III hat die Strukturformel der Substanz KA-70381, bei der die Glycylgruppe — COCH2NH2 abgespalten ist. Daher kann die Substanz KA-7038 III auch in der Weise erhalten werden, daß man die Substanz KA-7038 I mit Alkalien oder Säuren behandelt, um die Substanz KA-7038 I zu zersetzen und sie in die Substanz KA-7038 III umzuwandeln. Diese Umwandlung kann in der Weise durchgeführt werden, daß man die Substanz KA-7038 I mit einer wäßrigen 0,1 bis 4 N-Lösung eines alkalischen Reagenses, z. B. von Natriumhydroxid oder Bariumhydroxid, oder mit einer wäßrigen 0,1 bis 1 N-Lösung eines sauren Reagenses, z. B. von Salzsäure oder Schwefelsäure, behandelt.

Bei Verwendung eines alkalischen Reagenses kann ein stark basisches Anionenaustauscherharz (OH⁹-Form) zugesetzt werden, und die Reaktion kann im suspendierten Zustand durchgeführt werden. Gleichermaßen kann bei Verwendung des sauren Reagenses ein stark saures Kationenaustauscherharz zugesetzt werden, und die Reaktion kann im suspendierten Zustand durchgeführt werden. Die Reaktion kann gewöhnlich bei etwa 30 bis 100⁰C über einen Zeitraum von etwa 0,5 bis 3 h durchgeführt werden.

Durch die Erfindung wird weiterhin ein Verfahren zur Herstellung der Verbindungen der allgemeinen Formel (I) zur Verfügung gestellt, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man eine Verbindung der allgemeinen Formel II gemäß Anspruch 3 jeweils in an sich bekannter Weise

(A) entmethyliert und in den Fällen, in denen R³ eine andere Bedeutung als Wasserstoff oder Aminoacetyl haben soll,

(B) mit einem zur Einführung von Aminoschutzgruppen üblichen Reagenz umsetzt,

(C) die gemäß Verfahrensstufe (B) erhaltene, in 1-, 2'- und 6'-SteIlung N-geschützte Verbindung mit einer an der Aminogruppe geschützten Aminocarbonsäuren mit 2 bis 4 Kohlenstoffatomen, (S)-4-Amino-2-hydroxybultersäure oder einem reaktiven Derivat davon acyliert und

(D) aus der gemäß Verfahrensstufe (C) erhaltenen 4-N-AcyIverbindung, gegebenenfalls nach Reduktion, die Schutzgruppen abspaltet

Die Verbindungen der Formel (I)-I oder die Säureadditionssalze davon sind neue Antibiotika.

Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Verbindung der Formel (II) oder ihr geschütztes Produkt an der Amino- oder Methylaminogruppe in 1-, 2'- und 6'-Stellung mit einer starken Säure in Gegenwart oder Abwesenheit eines Lösungsmittels behandelt. Diese Reaktion induziert die Spaltung des Methyläthers in 5-Stellung und die Abspaltung der Gruppe R₃', die an die Methylaminogruppe in 4-Stellung gebunden ist, wenn sie eine Acylgruppe ist. Auf diese Weise kann eine Verbindung der Formel (I)-I, bei der R³ für ein Wasserstoffatom steht, erhalten werden.

Beispiele für starke Säuren sind starke Mineralsäuren, wie Bromwasserstoffsäure, Salzsäure, Jodwasserstoffsäure, Fluorwasserstoffsäure, Schwefelsäure und Phosphorsäure, stark saure organische Säuren, wie pToluolsulfonsäure und Trifluormethansulfonsäure, und Lewis-Säuren, wie Bortrichlorid und Bortrifluorid. Wenn eine Lewis-Säure verwendet wird, wird die Reaktion vorzugsweise unter wasserfreien Bedingungen durchgeführt. In anderen Fällen wird die Reaktion vorzugsweise in wäßriger l-ösung durchgeführt. So kann beispielsweise Dichlormethan als wasserfreies Lösungsmittel verwendet werden.

Die Reaktion kann beispielsweise bei Raumtemperatur bis etwa 200⁰C durchgeführt werden. Gewöhnlich ist die Reaktion in etwa 1 h bis etwa 30 Tagen beendet. Das Produkt kann durch eine gewöhnliche säulenchromatographische Methode, beispielsweise unter Verwendung eines Kationenaustauscherharzes, abgetrennt und gereinigt werden. Die Acylierung der Methylaminogruppe in 4-Stellung der resultierenden Verbindung der Formel (I)-I, bei der R³ ein Wasserstoffatom ist, liefert letzlich eine Verbindung der Formel (I)-I, bei der R³ eine der in Anspruch 1 definierten Acylgruppen ist.

Bei der Durchführung der Acylierung werden die Amino- oder Methylaminogruppen in 1-, 2'- und 6'-Stellungen der Verbindung der Formel (I), bei der R^J ein Wasserstoffatom ist und eine — OH-Gruppe in 5-Stellung vorliegt, geschützt. Hierauf wird eine der in Anspruch 3 definierten Aminosäuren (die vorzugsweise geschützt ist) oder ein reaktives Derivat davon zur Bildung der gewünschten Acylgruppe auf die geschützte Verbindung einwirken gelassen, um die Methylannnogruppe in 4-Stellung zu acylieren. Die nachfolgende Abspaltung der Schutzgruppe kann sodann die Verbindung der Formel (I) als freie Base liefern. Gewünschtenfalls wird das Produkt mit einer Säure behandelt, um es in ein Säureadditionsprodukt umzuwandeln.

Schutzgruppen für eine Amino- oder Methylaminogruppe können diejenigen sein, die üblicherweise bei Peptidsynthesen verwendet werden. Wenn beispielsweise ein aktiver Ester, z. B. ein substituierter Phenylester (z. B. Monobenzylcarbonat), ein N-Oxysuccinimidester oder ein N-Hydroxyphthalimidester verwendet wird, dann werden nur die Amino- oder Methylamiriogruppen in 1-, 2'- und 6'-Stellungen durch eine Benzyloxycarbonylgruppe geschützt. Die Anwesenheit einer Metallverbindung, z. B. von Nickelacetat. Kobalt(I)-acetat und Kupferacetat, während der Schutzreaktion ist bevorzugt. Substituierte Benzyloxycarbonylgruppen und tertiäre Butoxycarbonylgruppen können gleichfalls als Schutzgruppen verwendet werden. Wenn die Methylaminogruppe in 4-Stellung gleichzeitig geschützt ist, dann kann sie freigesetzt werden, indem man das Produkt mit einem Alkali umsetzt, um ein cyclisches Carbamat, bei dem die Hydroxylgruppe an die Methylaminogruppe in 4-Stellung angrenzt, zu bilden, und anschließend hydrolysiert.

Die oben beschriebene Einführung einer Schutzgruppe in die Amino- oder Methylaminogruppen kann

beispielsweise bewirkt werden, indem man den aktiven Ester auf die Verbindung der Formel (1), bei der R³ für Wasserstoff steht, bei einer Temperatur von etwa 0 bis etwa 100°C, vorzugsweise in Gegenwart einer Metallverbindung, einwirken läßt, wobei die Menge des aktiven Esters etwa 3 bis etwa 10 Mol pro Mol Verbindung der Formel (I) beträgt. Die Reaktion kann gewöhnlich in etwa 0,1· bis etwa 20 h abgeschlossen sein.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird eine Acylgruppe gewünschtenfalls in die Methylaminogruppe in 4-Stellung der Verbindung der formel (I). bei der R^J für Wasserstoff steht, und die Amino- oder Methylaminogruppen in 1-, 2'- und ö'-Stellungen geschützt sind, eingeführt. Die Acylierung kann nach herkömmlichen Peptidsynthesetechniken erfolgen. Die Acylierung wird unter Verwendung einer aminogeschützten Aminosäure gemäß Anspruch 3, Verfahrensstufe (C) oder eines reaktiven Derivats davon durchgeführt. Beispiele für reaktive Derivate sind Säurehalogenide, aktive Ester, z. B. ein Phenylester, Cyanomethylester, N-Oxysuccinimidester oder N-Oxyphthalimidester, Säureazide, Säureanhydride, gemischte Säureanhydride und andere Verbindungen, die bei der Synthese von Peptiden verwendet werden. Schutzgruppen für die Aminogruppe der Aminosäure können die gleichen sein, wie sie oben beispielhaft für die Amino- oder Methylaminogruppen der Verbindung der Formel (I), bei der R^J die Bedeutung Wasserstoff hat, angegeben wurden. Vorzugsweise sollten genau die gleichen Schutzgruppen verwendet werden.

Die Acylierungsreaktion kann beispielsweise bei einer Temperatur von etwa 0 bis etwa 100⁰C in einem Lösungsmittel, wie Methanol, Dioxan, Acetonitril und Dichlormethan. unter Verwendung von etwa 1 bis etwa 10 Mol Acylierungsmittel pro Mol der zu acylierenden Verbindung durchgeführt werden. Gewöhnlich kann die Reaktion innerhalb von etwa 0,5 bis etwa 20 h abgeschlossen sein.

Vorzugsweise werden die Schutzgruppen für die Aminogruppen von der geschützten Verbindung der Formel (1) vorzugsweise durch eine katalytische Reduktion abgespalten. Geeignete Katalysatoren für diesen Zweck sind z. B. Palladium, Platin, Raney-Nickel, Rhodium, Ruthenium und Nickel.

Die Abspaltung der Schutzgruppen durch katalytisehe Reduktion kann beispielsweise dadurch geschehen, daß man die geschützte Verbindung in einem Lösungsmittel, wie Essigsäure, in Gegenwart eines Katalysators bei einer Temperatur von etwa 0 bis etwa 80° C etwa 1 bis etwa 50 h lang zur Umsetzung bringt. Der Wasserstoffdruck zu dieser Zeit kann Normaldruck, Atmosphärendruck oder Überdruck sein.

Um eine Verbindung herzustellen, bei der R³ eine gemäß Anspruch 1 substituierte Alkylgruppe ist, kann die Acylgruppe des acylierten Produkts reduziert werden. Vorzugsweise erfolgt die Reduktion, bevor die Schutzgruppen für die Aminogruppen abgespalten werden. Reduktionsmethoden unter Verwendung von Reduktionsmitteln, wie Lithiumaluminiumhydrid, Natriumborhydrid und Diboran, können angewendet werden.

Erfindungsgemäß kann die Verbindung der Formel (I)-I, die auf die obige Weise aus der Verbindung der Formel (II) erhalten wird, in üblicher Weise isoliert und gereinigt werden. Eine Säulenchromatographie wird bevorzugt. Bevorzugte Adsorbentien für diesen Zweck sind z. B. Kationenaustauscherharze, wie Carboxyme-' thylcellulose. Die Entwicklung kann durch eine Gradientenmethode oder eine stufenweise Methode durchgeführt werden, wobei eine alkalische wäßrige Lösung, z. B. eine wäßrige Ammoniaklösung oder eine wäßrige Lösung von Ammoniumformiat, als Entwicklungsmittel verwendet wird. Die Aktivfraktionen werden aus den Eluaten gesammelt und lyophilisert, wodurch die Verbindung der Formel (I)-I in reiner Form erhalten wird.

Je nach dem Reinigungsvorgang kann das gewünschte Produkt (I)-I auch in Form eines Säureadditionssalzes erhalten werden. Die Verbindung (I)-I als freie Base kann in ein Säureadditionssalz, vorzugsweise ein pharmazeutisch annehmbares Säureadditionssalz, in üblicher Weise umgewandelt werden. Hierfür geeignete Säuren sind z. B. anorganische Säuren, wie Schwefelsäure, Salzsäure, Bromwasserstoffsäure, Jodwasserstoffsäure. Phosphorsäure, Kohlensäure und Salpetersäure, und organische Säuren, wie Essigsäure. Fumarsäure, Apfelsäure, Zitronensäure, Mandelsäure und Bernsteinsäure.

F.rfindungsgemäß können die eewünschten Verbindungen der Formel (I)-I mit antibakterieller Aktivität leicht und in guter Ausbeute aus Fortimicinen oder KA-6606- und K.A-7038-Substanzen mit ähnlicher Struktur wie ciie Fortimicine erhalten werden.

Die Verbindungen der Formel (I)-I zeigen eine überlegene antibiotische Aktivität und sie sind in der Human- und Veterinärmedizin geeignet.

Durch die Erfindung werden daher auch antibiotische MiUeI zur Verfügung gestellt, die aus einer Verbindung der oben beschriebenen Art und einem pharmazeutisch annehmbaren Verdünnungsmittel oder Träger bestehen.

Der Anteil der Verbindung (I)-I beträgt beispielsweise etwa 0,01 bis etwa 99,5 Gew.-%, bezogen auf das Gewicht des Mittels.

Das erfindungsgemäße antibiotische Mittel kann in allen üblicherweise verwendeten Dosierungsformen vorliegen, wobei jedoch injizierbare Zubereitungen und Kapseln besonders bevorzugt werden.

Vorzugsweise wird ähnlich wie bei bekannten wasserlöslichen basischen Antibiotika eine injizierbare Zubereitung hergestellt, indem ein lyophilisiertes Pulver des Antibiotikums in ein Gläschen, vorzugsweise zusammen mit einem Stabilisator, abgefüllt wird und beim Gebrauch der Inhalt des Gläschens in einer auflösenden Flüssigkeit zur Verabreichung aufgelöst wird.

Beispiele für Verdünnungsmittel oder Träger sind flüssige Verdünnungsmittel, wie destilliertes Wasser zur Injektion und eine physiologisch isotonische Lösung, und feste Träger, wie Lactose, Stärke, weißer Zucker, Glucose, kristalline Cellulose, Calciumcarbonat, Kaolin, D-Mannit, Magnesiummetasilicataluminat, Calciumsulfat, Calciumphosphat und BentoniL Die Zugabe von Stabilisatoren, beispielsweise von saurem Natriumbisulfit, wird gleichfalls bevorzugt.

Die Dosierung der erfindungsgemäßen antibiotischen Substanz kann in geeigneter Weise ausgewählt werden und beträgt beispielsweise etwa 0,01 bis etwa 100 mg/ kg/Tag.

Erfindungsgemäß werden daher antibiotische Mittel für den Menschen und für Tiere, wie z. B. Geflügel, Haustiere und Zuchtfische, zur Verfügung gestellt Diese Mittel sind als antibakterielle Mittel mit einem breiten antibakteriellen Spektrum geeignet

In Tabelle I sind die antibakteriellen Spektren von mehreren Beispielen der Verbindungen der Formel (I) und von Ausgangsmaterialien hierfür zusammengestellt

Tabelle I

KA-6606 I

Des-O-

methyl KA-6606 1 4-N-glycyl KA-6606 Vl

Des-O-methyl-4-N-glycyl KA-6606 Vl

KA-7038 I

Des-O-methyl KA-7038 I

Staphylococcus aureus 209 P 0,2 0,2 0,39

Bacillus subtilis ATCC 6633 0,2 <0,l 0,20

Bacillus cereus 1,56 0,78 0,78

Bacillus anthracis 0,2 <0,l 0,20

Streptococcus faecalis 25 25 25

Escherichia coli NIHJ 1,56 1,56 1,56

Escherichia coli ML1410 1,56 1,56 3,13

Escherichia coli ML 1410 R-81 3,13 1,56 6,25

(gegenüber Kanamycin, Streptomycin und Lividomycin
resistent)

Escherichia coli ML 1410 R-82 3,13 3,13 6.25

(gegenüber Kanamycin, Streptomycin und Butirosin
resistent)

Escherichia coli 1,56 1.56 3,13

ML 1410 R-101 (gegenüber
Gentamydin, Tobramycin
und Kanamycin resistent)

Proteus vulgaris OX-19 0,78 0,78 1,56

Klebsiella pneumoniae 0,78 0,78 0,78

PCI 602

Pseudomonas aeruginosa 3,13 0.78 6,25

Shibata

Pseudomonas aeruginosa A₃ 3,13 0,78 6,25

Pseudomonas aeruginosa 0,39 0,39 0,78

Pseudomonas aeruginosa 3,13 0,78 3,13

Pseudomonas aeruginosa K-11 6,25 1.56 6,25

(gegenüber Kanamycin

resistent)

Pseudomonas aeruginosa 6,25 1,56 3,13

Nr. 157

Pseudomonas aeruginosa 6,25 3.13 12,5

Nr. 315 (gegenüber Gentamycin, Tobramycin und
Amikacin resistent)

Proteus inconstans 1,56 1,56 1,56

Serratia marcescens 3,13 1,56 0,78

0,39
0,20
0,78
0,20
25
1,56
3,13
3,13

6,25

3,13

1,56
0,78

1,56

0,39
0,20
1,56
0,20
50
3,13
1,56
6,25

12,5

6,25

3,13
1,56

6.25

3,13	12,5
0,78	1,56
3,13	6,25
6,25	12,5
1,56	6,25
6,25	25
1,56	6,25
1,56	1,56

0,39 <0,l

0,39 <0,l 100 3,13 1,56 3,13

6,25 3,13

3,13 0,78

1,56

3.13

0,78

1.56 3.13

1,56 6,25

6,25 0.78

Die Erfindung wird in den Beispielen erläutert. Diese zeigen die Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen und die Herstellung des bekannten Des-O-methylfortimicins nach dem erfindungsgemäßen Verfahren.

Beispiel 1
Des-O-methyl-KA-6606 II

KA-6606 II als freie Base (100 mg) wurde in 5 ml Dichlormethan suspendiert und mit 5 g Bortrichlorid bei -80⁰C versetzt. Das Gemisch wurde bei der gleichen Temperatur 1 h lang stehen gelassen. Sodann wurde es bei Raumtemperatur über Nacht stehen gelassen. Das Reaktionsgemisch wurde zur Trockene eingeengt und der Rückstand wurde mit Methanol versetzt. Das Gemisch wurde erneut zur Trockene eingeengt. Dieser Vorgang wurde dreimal wiederholt.

Der resultierende Rückstand wurde in 10 ml Wasser aufgelöst und die Lösung wurde auf eine Säule aufgegeben, die mit 40 ml CM-Sephadex® C-25 (NH₄ ⁰-Form) bepackt war. Unter Anwendung der Konzentrationsgradientenmethode unter Verwendung von wäßrigem Ammoniak mit einer Konzentration, die allmählich von 0,05 N bis 0,5 N variierte, wurde eluiert. Fraktionen. die Des-O-methyl-KA-6606 II enthielten, wurden ge-

sammelt und in üblicher Weiese fertigbearbeitet, wodurch 15 mg einer farblosen Substanz init der Formel:

NH₂

erhalten wurden.

spezifische Drehung:[<xH⁵+140° IcI. H₂O) NMRiOD₂OpPm

U3(3H,d,J = 63 Hz,C-CH₃)

Z88(3H, S₁N-CH₃)

5,46 (1H, d, J =3,4 Hz, anomerer H) Elementaranalyse für C14H30N4O4 ■ H₂O:

berechnet (%): C 4938 H 959 N 16,65

gefunden (%): C 49.69 H 9,73 N 16,48.

30

(b) Des-O-methyl-KA-6606 I

Das Tetrakis-N-benzyloxycarbonyl-des-O-methyl-KA-66061 (60 mg), welches unter (a) oben erhalten wurde, wurde in 12 ml Essigsäure aufgelöst und in Gegenwart von 30 mg Palladiumschwarz bei Raumtemperatur und Atmosphärendruck hydriert

Der Katalysator wurde abfiltriert und das Fdtrat wurde mit 100 ml Wasser verdünnt und mit konzentrier-

!0 tem wäßrigen Ammoniak neutralisiert Die Lösung wurde auf eine Säule aufgegeben, die mit 10 ml CM-Sephadex* C-25 (NHt®-Fonn) bepackt war, und nach der Gradientenmethode unter Verwendung von wäßrigem Ammoniak mit einer Konzentration, die allmählich von 0,05 N bis 0,5 N variierte, eluiert Fraktionen, die die gewünschte Verbindung enthielten, wurden gesammelt und lyophilisert, wodurch 21 mg Des-O-methyl-KA-66061 als farbloser Feststoff mit einem Schmelzpunkt von 172 bis 175° C (Zers.) und der

20 Formel:

Beispiel 2

(a)Tetrakis-N-benzyloxycarbonyldes-O-methyl-KA-6606 I

Des-O-methyl-KA-6606 Il als freie Base (60 mg) wurde in 5 ml Methanol aufgelöst und bei —10" C mit 75 mg N-Benzyloxycarbonyloxysuccinimid versetzt. Das Gemisch wurde gerührt Am Ende von 1 h bzw. von 2 h wurden 30 mg und 20 mg der obengenannten aktiven Ester zugesetzt. Das Gemisch wurde bei der gleichen Temperatur 2 weitere h gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde bei vermindertem Druck eingeengt. Der Rückstand wurde in 10 ml Chloroform aufgelöst, mit Wasser gewaschen und getrocknet. Danach wurde das Lösungsmittel abdestilliert

Der Rückstand wurde in 3,5 ml Dioxan aufgelöst und das Gemisch wurde mit 0,2 ml Triäthylamin und 100 mg

N-Hydroxysuccinimidyl-N-benzyloxycarbonylglycin versetzt. Das Gemisch wurde über Nacht auf 6O⁰C erhitzt. Das Reaktionsgemisch wurde zur Trockene eingeengt. Der Rückstand wurde in 10 ml Chloroform aufgelöst, mit Wasser gewaschen und getrocknet, und danach wurde das Lösungsmittel abdestilliert. Der Rückstand wurde auf einer Silicagelsäule unter Verwendung von Chloroform/Methanol (50 :1) als Elutionsmit- tel chromatographiert und in üblicher Weise fertigbehandeit, wodurch 62 mgTetrakis-N-benzyloxycarbonyldes-O-methyl-KA-6606 I als farbloser Feststoff erhalten wurden.

spezifische Drehung:[«]i' + 37^a (c2, CHCl₃) NMR: OCDCl₃, ppm

1,01 (3H,d, J-63 Hz, C-CH₃)

2,91 (3H, s, N-CH₃) IR:v™,^C1· cm-¹ 1640(Amid I) Elementaranalyse für C48H57N5O13:

berechnet (%): C 63,22 H 6,30 N 7,68

gefunden (%): C 63,28 H 635 N 7,55.

60

NHj

erhalten wurden.

Elementaranalyse für Ci₆H₃₃NsO₅ · H₂CO₃ berechnet (%): C 44,83 H 8,19 N 1538 gefunden (%): C 44,47 H 838 N 15,05.

H₂O:

Das nach einer herkömmlichen Methode erhaltene Hydrochlorid dieses Produkts hatte die folgenden Eigenschaften:

spezifische Drehung: [<x]i' + 110° (c2, H₂O) NMR:<5D₂Oppm

1,83(3H,d,J= 6,6 Hz₁C-CH₃)

3.63(3H₁S₁N-CH₃)

6,03(lH,d, J = 3,6 Hz,anomerer H).

Beispiel 3 Des-O-methyl-KA-6606 VI

KA-6606 Vl (100 mg) wurde in 5 ml 48%iger Bromwasserstoff säure aufgelöst, und die Lösung wurde 10 Tage lang bei 37° C stehen gelassen. Das Reaktionsgemisch wurde zur Trockene bei unterhalb 37° C eingeengt. Der Rückstand wurde in 50 ml Wasser aufgelöst und mit wäßrigem Ammoniak neutralisiert Die Lösung wurde auf eine Säule von CM-Sephadex C-25 (NH4⁺-Form) aufgegeben und nach der Konzentrationsgradientenmethode unter Verwendung von wäßrigem Ammoniak mit einer Konzentration, die allmählich von 0,05 N bis 03 N variierte, eluiert, wodurch 19 mg Des-O-methyl-KA-6606 VI mit der Formel;

enthielten, wurden gesammelt und lyophilisert, wodurch 105 mg Des-O-methyl-4-N-glycyl-KA-6606 VI als farbloser Feststoff mit der Formel:

CH

NH₂

erhalten wurden.

Elementaranalyse für C14H30N4O4 - H₂O:
berechnet (%): C 49,98 H 939 N 16,65
gefunden (%): C 49,65 H 9,44 N 16,61

spezifische Drehung: [α] £+87° (c 1, H₂O)

₂pP

l,54(3H,ci, J =6,5 Hz₁C-CH₃)
2Λ5 (3H. s. N-CH₃)
5,56(1H,d, J =33 Hz, anomerer H).

Beispiel 4

(a) 1 ^'.ö'-Tris-N-benzyloxycarbonyM-N-benzyloxycarbonylglycyl-des-O-methyl-KA-eeOöVl

Des-O-methyl-KA-6606 VI (19 mg) wurde in 0,8 ml Methanol aufgelöst und mit 90 mg Benzyl-p-nitrophenylcarbonat versetzt Das Gemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Zu dem Reaktionsgemisch wurden 0,1 ml einer 30%igen äthanolischen "Lösung von Methylamin gegeben und das Gemisch wurde eine weitere h gerührt. Hierauf wurde das Reaktionsgemisch zur Trockene eingeengt. Der Rückstand wurde in Chloroform aufgelöst, mit Wasser gewaschen und getrocknet. Das Produkt wurde in 1 ml Dioxan aufgelöst und mit 0,05 ml Triäthylamin und 35 mg N-Hydroxysuccinimidyl-N-benzyloxycarbonylglycin versetzt. Das Gemisch wurde 5 h lang auf 80° C erhitzt. Das Reaktionsgemisch wurde zur Trockene eingeengt. Der Rückstand wurde in Chloroform aufgelöst und unlösliche Stoffe wurden abfiltriert. Die Chloroformschicht wurde mit Wasser gewaschen und getrocknet, wonach das Lösungsmittel abdestilliert wurde. Der Rückstand wurde abgetrennt und durch präparative Silicagelchromatographie (Chloroform/ Methanol im Verhältnis von 15 :1) gereinigt, wodurch 23 mg l^'.ö'-Tris-N-benzyloxycarbonyM-N-benzyloxycarbonylglycyl-des-O-methyl-KA-ööOe Vl als farbloser Feststoff erhalten wurden.

(b) Des-O-methyl^-N-glycyl-KA-eoOO Vl

Das l^'.ö'-Tris-N-benzyloxycarbonyM N-benzyloxycarbonylglycyl-des-O-methyl-KA-6606 VI (288 mg), das oben unter (a) erhalten worden war, wurde in 4 ml Essigsäure aufgelöst und mit 50 mg Palladiumschwarz versetzt. Die obengenannte Verbindung wurde sodann katalytisch bei Raumtemperatur reduziert. Das Reaktionsgemisch wurde filtriert. Das Filtrat wurde mit 400 ml Wasser verdünnt und mit wäßrigem Ammoniak neutralisiert. Die Lösung wurde auf eine Säule von CM-Sephadex C-25 (NH4 ⁺ -Form) aufgegeben und nach der Konzentrationsgradientenmethode unter Verwendung von wäßrigem Ammoniak mit einer Konzentration, die allmählich von 0,05 N bis 0,35 N variierte, eluiert. Fraktionen, die das gewünschte Produkt erhalten wurden.

Elementaranalyse für Ci₆H₃₃N₅Os · H₂O: berechnet (%): C 48,84 H 837 N 17,80 gefunden (%): C 48,55 H 8,83 N 17,48 spezifische Drehung:[α]? +115°C(c I, H₂O) NMR:<5D2Oppm

1,52 (3H, d, J = 63 Hz, C - CH₃)
3,62(3H,s,N-CH₃)

5,40 (1 H.d, J =3 Hz, anomerer H).

Beispiel 5 Des-O-Methyl-KA-703& III

KA-7038 111 als freie Base (302 mg) wurde in der gleichen Weise wie im Beispiel 3 umgesetzt. Durch Reinigung wurden 220 mg Des-O-methyl-KA-7038 III als farbloses Pulver mit der Formel:

NH₃

NH₂

erhalten.

Elementaranalyse für CmH₃₀N₄O₄ · H₂O: berechnet (%): C 49,98 H 939 ti 16,65 gefunden (%): C 49,71 H 9,73 N 1633

spezifische Drehung:[«]i'+40^o (cO3, H2O)

NMR:<5D₂Oppm
2,80(3H₁S₁N-CH₃)
2,84(3H₁S₁N-CH^)
533(lH,d,J=33 Hz, anomerer H).

Beispiel 6

(a)Tetrakis-N-benzyloxycarbonyldes-O-methyi-KA-7038 I

Des-O-methyl-KA-7038 III (190 mg) wurde wie im

Beispiel 4(a) umgesetzt. Nach der Reinigung wurden 350 mg l^'.e'-Tris-N-benzyloxycarbonyl^-N-benzyloxycarbonylglycyl-des-O-methyl-KA-7038 III, d.h. Tetrakis-N-benzyloxycarbonyl-des-O-methyl-KA^OSe I.

als farbloser Feststoff erhalten.

Elementaranalyse für C48H57N5O13:

berechnet (%): C 63,22 H 630 N 7,68

gefunden (%): C 63,01 H 6,49 N 7,42 spezifische Drehung: [α]?+55° (c 1, CHa₃) NMR-OCDCl₃ ppm

232(6H,s, 2 χ N-CH₃).

(b) Des-O-methyl-KA-7038 I

Tetrakis-N-benzyloxycarbonyl-des-O-methyl-KA-7038 1 (320 mg) wurde in der gleichen Weise wie im Beispiel 4(b) behandelt, wodurch 112 mg Des-O-methyl-KA-7038 I als farbloser Feststoff mit der Formel:

CH₂NHCH₃
-O

NH₂

Tetrahydrofuran aufgelöst und 2 h bei Raumtemperatur in einem Stickstoffstrom umgesetzt Wasser (0,2 ml) wurde zu dem Reaktionsgemisch gegeben und das Gemisch wurde zur Trockene eingeengt Der Rückstand wurde in 3 ml 0,2 N-methanoüscher HCl-Lösung aufgelöst und die Lösung wurde über Nacht bei Raumtemperatur stehen gelassen. Das Reaktionsgemisch wurde zur Trockene eingeengt Der Rückstand wurde in 15 ml Chloroform aufgelöst, mit einer gesättigten wäßrigen

ίο Natriumbicarbonatlösung und sodann mit Wasser gewaschen und getrocknet Das Lösungsmittel wurde abdestilliert Der Rückstand wurde mit Chloroform/ Methanol (20:1) durch Silicagelsäulenchromatographie eluiert und in üblicher Weise fertigbehandelt wodurch 85 mg des gewünschten Produkts als farbloser Feststoff erhalten wurden.

COCH₂NH₂ OH

25

30

35

NH₂
erhalten wurden.

Elementaranalyse für CieHjjNsOs · H₂O:

berechnet (%): C 48,84 H 837 N 17,flO

gefunden (%): C 4834 H 8,69 N 1738 spezifische Drehung:[a]i?+126° (c 1, H₂O) NMR:öD₂Oppm

2,83 (3H, s, 6'-N-CHj)

3.63 (3H.S.4-N-CKJ

5,42 (IH, d, J = 3 Hz, anomerer H).

Beispiel 7

(a) 1,2',6'-THs- N-benzyloxycarbonyl-4- N -[(S)-4-benzyloxycarbonylamino-2-hydroxybutylyl]-

5-des-O-methyl-KA-6606 Il

138 mg !^',ö'-Tris-N-benzyloxycarbonyl-S-des-O-methyl-KA-6606 II (1) wurden in 4 ml Dioxan aufgelöst und mit 130 mg N-Hydroxysuccinimidester von (S)-4-N-Benzyloxycarbonylamino-2-hydroxybuttersäure und 0,1 ml Triethylamin versetzt. Das Gemisch wurde 3 h lang auf 55° C erhitzt. Das Reaktionsgemisch wurde zur Trockene eingeengt. Der Rückstand wurde in 20 ml Chloroform aufgelöst, mit Wasser gewaschen und getrocknet, wonach das Lösungsmittel abdestilliert wurde. Der Rückstand wurde mit Chloroform/Methanol (30:1) durch Silicagelsäulenchromatographie eluiert und in üblicher Weise fertigbehandelt, wodurch 160 mg des gewünschten Produkts als farbloser Feststoff erhalten wurden.

NMR: OCDCl₃, ppm

2,40 (3H, s, N -CH₃)

1,03 (3H,d, J =7,0 Hz₁C-CH₃)
IR: Die Absorption bei 1625 cm-'
Eiemeniarznalyse für CsoHwNsOu:

berechnet (¹Zo): C 63,75 H 6,74 N 7,43

gefunden (%): C 63,88 H 6,48 N 731.

(c)4-N-[(S)-4-Amino-2-hydroxybutyI]-5-des-O-methyi-KA-6606 II

80 mg des oben unter (b) erhaltenen Produkts wurden in 2 ml Essigsäure aufgelöst und mit 20 mg 5% Palladium auf Kohlenstoff versetzt. Die Verbindung wurde bei Raumtemperatur katalytisch reduziert Das Reaktionsgemisch wurde filtriert und das Filtrat wurde mit 300 ml Wasser verdünnt und anschließend wurde mit wäßrigen Ammoniak neutralisiert Das Gemisch wurde sodann auf eine Säule von CM-Sephadex* C-25 (NH₄ ⁰-Form) aufgegeben und nach der Gradientenmethode mit wäßrigem Ammoniak, dessen Konzentration allmählich von 0,25 N zu 0,60 N variierte, entwickelt Fraktionen, die das gewünschte Produkt enthielten, wurden gesammelt und lyophilisiert, wodurch 21 mg des gewünschten Produkts als farbloses Pulver erhalten vurden.

50

NM R: d CDCl, ppm 3,04 (3H, s, N-CHj)

1,03 (3H₁ d, J= 7,0 Hz, C - CH₃)
IR:v 1625 cm-'(Amid I)
Elementaranalyse für C50H61N5O14:

berechnet (%): C 62,81 H 6,43 N 732 gefunden (%): €62,55 H 6,19 N 7,48=

(b)l,2',6'-Tris-N-benzyloxycarbonyl-4-N-[(S)-

4-benzyloxycarbonylamino-2-hydroxybutyl]-

5-des-O-methyl-KA-6606 II

160 mg des oben unter (a) erhaltenen Produkts wurden in 3,2ml einer IM-Lösung von Diboran in 1,60(3H,d,J = 7,0 HzX-CH₃)
3,00(3H₁S₁N-CH₃)
5,46 (1H₁ d, J =34 Hz, anomerer H)
Elementaranalyse für CisHwNsOs · H₂O:
berechnet (%): C 51,04 H 9,76 N 16,54
gefunden (%): C 50,87 H 9.92 N 16,40.

Beispiel 8

(a) l,2',6'-Tris-N-benzyloxycarbonyl-

4-N-(2-benzyloxycarbonylaminoäthyl)-

5-des-O-methyl-KA-6606 II

500 mg Tetrakis-N-benzyloxycarbonyl-5-des-O-methyl-KA-6606 I, erhalten im Beispiel 2 (a), wurden wie im Beispiel 7 (b) behandelt, wodurch 220 mg des genannten Produkts erhalten wurden.

NMR:<5COCljppm

1,03 (3H,d, J = 7,0 Hz, C-CH₃)
2,43(3H₁S₁N-CH₃)

Elementaranalyse für ΟβΗ₅9Ν5θι₂:
berechnet (%): C 64,20 H 6,62 N 7,80
gefunden (%): C 64,13 H 6,73 N 7,61.

(b) 4-N-(2-Aminoäthyl)-5-des-O-meihyI-KA-6606 II

240mg des oben unter (a) erhaltenen Produkts wurden wie im Beispiel 7 (c) behandelt wodurch 62 mg des genannten Produkts erhalten wurden.

NMR: OD₂O ppm

l,53(3H,cU=7,0 Hz₁C-CH₃)

236(3Rs₁N-CH₃)

5,44 (1H, d, J=3,5 Hz, anomerer H). Elementaranalyse für C16H35NSO4 · H2O:

berechnet (%): C 50,64 H 9,83 N 18,45
gefunden (%): C 50,29 H 9,71 N 18,18.

Versuchsbericht

Tabelle II zeigt einen Vergleich der Verbindungen Des-O-methyl-KA-6606 II (Verbindung des Beispiels 1), Des-O-methyl-KA-6606 VI (Verbindung des Beispiels ?) und Des-O-methyl-KA-7038 III (Verbindung des Beispiels 5) mit KA-6606 II, KA-6606 VI und KA-7038 III hinsichtlich der antimikrobiellen Aktivität, gemessen nach einer Papierscheibenmethode.

Tabelle Π

Test-Mikroorganismus	Hemmscheibe (Durchmesser: mm)	Des-O-	KA-6606 VI	Des-O-	KA-7038 III	Des-O-
	KA-6606 Π	methyl-		methyl-		methyl-
		KA-6606 II		KA-6606 VI		KA-7038 IH
		19,0	17,3	17,7	15,9	17,2
Bacillus subtilis ATCC 6633	18,1	16,4	14,8	15,0	13,0	16,0
Staphylococcus aureus 209 P	15,0	20,1	17,9	18,7	15,4	18,4
Escherichia coli NIHJ	19,1	22,6	21,5	21,9	18,8	20,2
Proteus vulgaris OX-19	23,6	17,1	11,5	15,6	10,0	16,0
Klebsieila pneumoniae	16,4
PCI 602		16,1	14,5	14,4	12,1	14,1
Pseudomonas aeruginosa	15,6
No. 12		18,8	14,0	12,8	10,9	9,7
Proteus inconstans	16,3	19,7	16,9	18,9	16,7	16,8
Serratia marcessens	19,5

Kulturmedium: Mycinversuchsagar (Eiken Chem. Co.). Scheibe: Durchmesser 8 mm, dünne Papierscheibe.

Dosis: 1 mg/ml.

Tabelle HI zeigt einen Vergleich von 4-N-Aminoäthyl-5-des-O-methyl-KA-6606 II [A] (Verbindung des Beispiels 7) und 4-N-(4-Amino-2-hydroxybutyl)-5-des-

O-methyl-KA-6606 [B] (Verbindung des Beispiels 8) hinsichtlich der minimalen Hemmkonzentration gegenüber verschiedenen Mikroorganismen.

Tabelle III	Minimale Hemmkonzen tration (mcg/ml)	[A]	[B]
Testmikroorganismus	KA-6606 II	0,2	0,78
	0,2	0,2	0,39
Staphylococcus aureus 209 P	0,2	1,56	6,29
Bacillus subtilis ATCC 6633	1,56	0,2	0,39
Bacillus anthracis	1,2	50	100
Bacillus cereus	25	3,13	12,5
Streptococcus faecalis	1,56	6,25	25
Escherichia coli NIHJ	1,56	6,25	25
Escherichia coli K-12 ML-1410	3,13
Escherichia coli K-12 ML-1410 R-81

29 42	Fortsetzung	194	Hemmkonzen-	(AJ	[BI
Testmikroorganismus		!ration (mcg/ml)	6,25	50
	Minimale	KA-6606 Il
		3,13	1,56	12,5
Escherichia coli K-12
ML-1410 R-82		1.56	1,56	1,56
Escherichia coli K-12			1,56	6,25
ML-1410 R-IOl	0,78
Proteus vulgaris OX-19	0,78	3,13	12,5
Klebsiella pneumonia
PCI 602	3,13	3.13	2 S
Pseudomonas aeruginosa
Shibata	3,13	1,56	3,13
Pssudcmcriäs asruginosa
A3	0,39	1,56	12,5
Pseudomonas aeruginosa
No. 12	3,13	3,13	50
Pseudomonas aeruginosa
TI-13	6,25	3.Ί	12,5
Pseudomonas aeruginosa
K-Il	6,25	3,13	25
Pseudomonas aeruginosa
TK-157	6.25	3,13	12,5
Pseudomonas aeruginosa
GN-315	1,56	3,13	25
Proteus inconstans
GN-154	3,13
Seratia marcessens

Tabelle IV zeigt die Stabilität der Verbindungen jAj, [B] und KA-6606 ! in wäßriger, basischer Lösung. Tabelle IV Verbindung Restaktivität, %

KA-6606 I	30%
[A]	95%
[B]	98%

Bedingungen: pH 6,0; 70°C; 50 Std.

Claims (1)

Patentansprüche:

1. Aminiglycoside der aligemeinen Formel R¹

NH,

OH

(D