DE3012014A1

DE3012014A1 - Istamycine und verfahren zur herstellung derselben

Info

Publication number: DE3012014A1
Application number: DE19803012014
Authority: DE
Inventors: Shinichi Kondo; Yoshiro Okami; Hamao Umezawa
Original assignee: Microbial Chemistry Research Foundation
Current assignee: Microbial Chemistry Research Foundation
Priority date: 1979-05-01
Filing date: 1980-03-28
Publication date: 1980-11-13
Also published as: ES491077A0; DE3012014C2; ES8105034A1; FR2455596B1; IT1153794B; CA1158999A; FR2455596A1; CH646712A5; US4296106A; IT8009394A0; NL8001842A; GB2048855A; GB2048855B

Description

.}. 301201-

Anmelder; ZAIDAN HOJIN BISEIBUTSU

KAGAKU KENKYU KAI, d 2βοο Bremen

14-23, Kami Osaki 3-chome, sievogutraee 21

Shinagawa-ku, Tokyo, Japan «^«^11*D.uu*i_and

Telefon 0421 - 34 2019 Telegramme: PATMEIS BREMEN it ». ι ^ \ ττ TnmniTn Telex: 246157 (melbo d)

Erfinder: 1) Hamao UMEZAWA,

23, Toyotamajtita 4 chome, _Datum 27.März 1980 Nerima-ku, Tokyo, Japan

Unser Zeichen 1511

2) Yoshiro OKAMI,

18-14, Denenchofu 4-chome, ""*>"*"" Ohta-ku, Tokyo, Japan

3) Shinichi KONDO,

1157-1, Ichigao-cho, Midori-ku, Yokohama-shi, Kanagawa-ken, Japan

Istamycine und Verfahren zur Herstellung derselben

Die Erfindung betrifft vier neue Antibiotika, die als Istamycin A, Istamycin B, Istamycin A und Istamycin B bezeichnet werden. Die Erfindung betrifft weiterhin die fermentative Herstellung dieser neuen Antibiotika unter Verwendung eines neuen Mikroorganismus sowie die Verwendung der neuen Antibiotika. Zum Gegenstand der Erfindung gehört schließlich auch der neue Mikroorganismus selbst, der für die fermentative Herstellung der Istamycine verwendet wird.

Eine große Zahl verschiedener pathogener Mikroorganismen wie Bakterien und Fungi ist die Ursache für das Auftreten von Krankheiten bei Menschen, bei Tieren und Pflanzen. Obwohl eine Anzahl von Antibiotika entwickelt worden ist, von denen einige eine hohe antimlkrobielle

Eingesandte Modelle werden nactt 2 Monaten, falls nicht zurückgefordert, vernichtet. Mündliche Abreden, Insbesondere durch Fernsprecher, bedürfen schriftlicher Bestätigung. — Die in Rechnung gestellten Kosten sind mit Redinungsdatum ohne Abzug fällig. — Bei verspäteter Zahlung werden Bankzinsen berechnet.

Bremer Bank, Bremen, Nr. 2 310 0*u

¹ O]JlJI Λ«O JW

Postscheckkonto: Hamburg 359 52-202

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-£. 27.03.80 30 Ί 20 U

Wirkung gegen die verschiedenen pathogenen Mikroorganismen aufweisen, besteht nach wie vor ein Bedarf an stärker wirksamen therapeutischen Mitteln, mit denen von pathogenen Mikroorganismen beim Menschen, bei Tieren und Pflanzen hervorgerufene Krankheiten bekämpft werden können.

Die Erfindung macht es sich zur Aufgabe, neue Antibiotika bereitzustellen, die als antibakterielle Mittel bei der therapeutischen Behandlung von bakteriellen Infektionen bei Menschen und Tieren und/oder zur Sterilisation chirurgischen Materiales und chirurgischer Instrumente verwendet werden können. Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht darin, ein Verfahren zur fermentativen Herstellung der neuen Antibiotika vorzuschlagen.

Im Zusammenhang mit der Gewinnung der neuen Antibiotika hat die Anmelderin umfangreiche Forschungen durchgeführt. Das Ergebnis dieser Forschungen besteht unter anderem in der Auffindung eines neuen Stammes der Gattung Streptomyces, welcher aus einer Bodenprobe isoliert werden konnte, die im Seeboden der Küste der Halbinsel Miura in Kanagawa Prefecture, Japan gefunden wurde. Diese Probe erhielt die Laboratoriumsbezeichnung Stamm-Nummer SS-939 und wurde in einem Kulturmedium unter aeroben Bedingungen gezüchtet. Bei der Züchtung wurden vier verschiedene Substanzen erzeugt, die eine antibakterielle Wirkung gegen eine große Zahl verschiedener Bakterien aufweisen. Diese antibakteriellen Substanzen konnten aus der Kulturbrühe isoliert und gereinigt werden. Aus den chemischen, physikalischen und mikrobiologischen Untersuchungen der isolierten Substanzen ergab sich, daß es sich bei jeder der isolierten Substanzen um ein neues Aminoglycosid-Antibiotikum handelt,

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welches sich durch eine geringe Toxizität auszeichnet und welches klar von den bekannten Antibiotika unterschieden ist. Die vier neuen Antibiotika sind als Istamycin A, Istamycin B, Istamycin A und Istamycin B bezeichnet worden.

(a) Istamycin A entspricht der Summenformal C^H^eNcOc. Die Verbindung enthält zwei N-Methylgruppen und eine O-Methy1gruppe im Molekül. Sie zeigt nur eine Endabsorption im Ultraviolett-Absorptionsspektrum in Wasser.

Die Verbindung ist löslich in Wasser und Methanol, kaum löslich oder unlöslich in Äthanol und anderen gewöhnlichen organischen Lösungsmitteln. Sie gibt eine positive Reaktion mit Ninhydrin- und Rydon-Smith-Reagenz und ihr Rf-Wert bei der Zellulose-Dünnschichtchromatographie beträgt 0,22, wenn zum Entwickeln n-Butanol-· Pyridin-Essigsäure-Wasser (Volumenverhältnis 6:4:2:4) verwendet wird. Das Istamycin-A-Hemicarbonat liegt in Form eines farblosen Pulvers vor, welches keinen definierten Schmelzpunkt besitzt und sich bei 102 bis 108⁰C

zersetzt. Die spezifische optische Drehung beträgt (ac)jp = + 155° ( c 0,4, Wasser).

(b) Istamycin B entspricht der Summenformel ^₁ γΗ,,-Ν,-Ο,-. Die Verbindung enthält zwei N-Methylgruppen und eine O-Methylgruppe im Molekül. Sie zeigt nur eine Endabsorption im Ultraviolett-Absorptionsspektrum in Wasser. Die Verbindung ist löslich in Wasser und Methanol, kaum oder unlöslich in Äthanol und anderen gebräuchlichen organischen Lösungsmitteln. Sie gibt eine positive Reaktion mit Ninhydrin- und Rydon-Smith-Reagenz. Der Rf-Wert bei der Zellulose-Dünnschichtchromatographie liegt bei 0,25, wenn zum Entwickeln ein Gemisch aus n-Butanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser (Volumenverhältnis 6:4:2:4) verwendet wird. Das Istamycin-B-Hemicarbonat

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stellt ein farbloses Pulver dar, welches keinen definierten Schmelzpunkt besitzt, sondern sich bei 112 bis 114⁰C zersetzt und eine spezifische optische Drehung von (a)jp = +165° (c 0,4, Wasser) aufweist.

(c) Istamycin A_Q entspricht der Summenformel C₁5^H32^4°4 Die Verbindung enthält zwei N-Methylgruppen und eine O-Methylgruppe im Molekül. Im Ultraviolett-Spektrum zeigt die Verbindung in Wasser nur eine Endabsorption. Istamycin A ist in Wasser und Methanol kaum löslich, in Äthanol und anderen gebräuchlichen organischen Lösungsmitteln unlöslich. Die Verbindung gibt eine positive Reaktion mit Ninhydrin und Rydon-Smith-Reagenz; ihr Rf-Wert bei der Dünnschichtchromatographie an Silikagel liegt bei 0,36, wenn zum Entwickeln die untere Phase einer Mischung aus Chloroform-Methanol-17#igem wässrigen Ammoniak (Volumenverhältnis 2:1:1) verwendet wird. Das Istamycin A₀-Hemicarbonat bildet ein farbloses kristallines Pulver, welches keinen definierten Schmelzpunkt besitzt, sondern sich bei 111 bis 114⁰C zersetzt und eine spezifische optische Drehung von (a)^² » +76° (c 0,56, Wasser) aufweist.

(d) Istamycin B_Q entspricht der Summenformel ^C-|5^H32^N4°4· Die Verbindung enthält zwei N-Methylgruppen und eine O-Methylgruppe im Molekül. Im Ultraviolett-Absorptions-Spektrum zeigt Istamycin B_Q in Wasser nur eine Endabsorption. Die Verbindung ist in Wasser und Methanol kaum löslich, in anderen gebräuchlichen organischen Lösungsmitteln und Äthanol unlöslich. Die Reaktion gegenüber Ninhydrin und Rydon-Smith-Reagenz ist positiv; bei der Dünnschichtchromatographie an Silikagel liegt der Rf-Wert der Verbindung bei 0,14, wenn zum Entwickeln die untere Phase einer Mischung aus Chloroform-Methanol- 17#igem wässrigem Ammoniak (Volumenverhältnis

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2:1:1) verwendet wird. Das Istamycin B_o-Hemicarbonat liegt in Form eines farblosen kristallinen Pulvers vor, welches keinen definierten Schmelzpunkt besitzt. Die spezifische optische Drehung liegt bei (a)ß⁶ = +160° (c 1,0 Wasser).

Wenn im Folgenden von Istamycin die Rede ist, so ist damit entweder Istamycin A, Istamycin B, Istamycin A_Q oder Istamycin B_Q oder aber eine Mischung dieser Substanzen gemeint, soweit im Einzelfall nicht etwas anderes angegeben ist. Unter dem Ausdruck Istamycin-Komplex wird eine Mischung aus zwei, drei oder allen Istamycinen A, B, A₀ und B verstanden, soweit nichts anderes angegeben ist. Die vorliegende Erfindung umfaßt also Istamycin A, Istamycin B, Istamycin A und Istamycin B_Qf entweder allein oder in Mischung von wenigstens zwei der genannten Substanzen, die in verdünnter Lösung, als Rohkonzentrat oder als feste Rohsubstanz, jedoch auch als gereinigte feste Substanz in Form der freien Base oder in Form von Säureanlagerungssalzen mit anorganischen oder organischen Säuren vorliegen können.

Die physiko-chemischen Eigenschaften von Istamycin, einschließlich der bereits erwähnten Eigenschaften werden im Folgenden im einzelnen beschrieben.

Istamycin A ist eine basische Verbindung; es läßt sich als Carbonat in Form eines farblosen Pulvers isolieren, welches keinen definierten Schmelzpunkt besitzt, eich vielmehr bei 102 bis 108°C zersetzt und eine spezifische optische Drehung von (a)|⁵ » +155° (c 0,4, Wasser) besitzt. Die Gewichtsanalyse stimmt mit den theoretischen Werten für die Summenformel C^yH^cNcOc. 1/2 H₂CO, (C 49,99 %; H 8,63 %; N 16,65 %; 0 24,73 %) überein.

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Die Sununenformel konnte durch die Massenspektrometrie (gefunden: m/e 389,2588; berechnet für ^C-|7^H35^N5°5^!

m/e 389,2635) bestätigt werden. Das Infrarot-Absorptionsspektrum von Istamycin-A-Hemicarbonat in Kaliumbromid-Tablette ist in Figur 1 der beigefügten Zeichnungen dargestellt. Das Ultraviolett-Absorptionsspektrum von Istamycin-A-Hemicarbonat in Wasser zeigt nur eine Endabsorption. Beim kernmagnetischen Resonanzabsorptionsspektrum - Proton ( H) - äußerer Standard: TMS, pD 5,4 - von Istamycin-A- Hemicarbonat in Deuterowasser finden sich charakteristische Signale bei e 3,20 (s, N-CH₅), 3,57 (s, N-CH₃), 3,89 (s, 0-CH₃), 4,50 (s, CH₂). und 5,80 (d, J=3,5 Hz,CH). Istamycin A ist löslich in Wasser und Methanol, schwach löslich oder unlöslich in Äthanol und anderen gebräuchlichen organischen Lösungsmitteln und seine Reaktion gegenüber Ninhydrin- und Rydon-Smith-Reagenz ist positiv. Istamycin A gibt einen Einzelfleck bei Rf 0,22 bei ^_n der Dünnschicht Chromatographie an Zellulose (Avicel^, ein Produkt der Firma Funakoshi Yakuhin Co.), wenn zum Entwickeln ein Lösungsmittelgemisch aus n-Butanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser (Volumenverhältnis 6:4:2:4) verwendet wird. Istamycin A unterscheidet sich so von Istamycin B, welches einen Einzelfleck bei derselben Dünnschichtchromatographie an Zellulose bei Rf 0,25 gibt. Bei der Hochspannungspapierelektrophorese (3300 Volt, 15 Minuten) unter Verwendung von Ameisensäure-Essigsäure-Wasser (Volumenverhältnis 25:75:900) ist die Mobilität von Istamycin A und Istamycin B gleich groß und liegt bei 2,15, wenn die Mobilität von Alanin als Standardsubstanz mit 1,0 angenommen wird. Durch Hochspannungspapierelektrophorese läßt sich Istamycin A folglich nicht von Istamycin B unterscheiden.

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Istamycin B ist in seinen Eigenschaften dem Istamycin A sehr ähnlich. Das Istamycin B ist ebenfalls eine basische Verbindung. Das als Carbonat in Form eines farblosen Pulvers isolierte Istamycin B besitzt keinen definierten Schmelzpunkt, zersetzt sich vielmehr bei 112 bis 124°C und zeigt eine spezifische optische Drehung von (α)²,⁵ = +165° (c 0,4, Wasser). Die Werte der Gewichtsanalyse stimmen mit den theoretischen Werten der Summenformel ^ci7^H35^N5⁰5· ¹/2 ^H2^C03 (C 49,99 %l H 8,63 %i N 16,65 %; 0 24,73 %) Uberein. Diese Summenformel konnte durch die Werte der Massenspektrometrie mit hohem Auflösungsvermögen (gefunden: m/e 389,2625; berechnet für C₁₇H₃₅N₅O₅: M/e 389,2635) bestätigt werden. Das Infrarot-Absorptionsspektrum von Istamycin B in Kaliumbromid-Tablette ist in Figur 2 der beigefügten Zeichnungen dargestellt. Das Ultraviolett-Absorptionsspektrum von Istamycin-B-Hemicarbonat in Wasser zeigt nur eine Endabsorption. Im kernmagnetischen Resonanz-Absorptionsspektrum - Proton ( H) - externer Standard: TMS, pD 5,4 - von Istamycin-B-Hemicarbonat in Deuterowasser finden sich charakteristische Signale bei<f 3,26 (s, H-CH₃), 3,59 (s, N-CH₃), 3,95 (s, 0-CH₃), 4,57 (s, CH₂) und 5,96 (d, J-3,5 Hz, CH). Ähnlich wie Istamycin A ist Istamycin B in Wasser und Methanol löslich, schwach löslich bis unlöslich in Äthanol und anderen gebräuchlichen organischen Lösungsmitteln, Eine Reaktion gegenüber Ninhydrin- und Rydon-Smith-Reagenz ist positiv. Wie bereits angegeben, ist Istamycin B vom Istamycin A durch die DünnschichtChromatographie Zellulose zu unterscheiden und zu trennen.

Istamycin A_Q ist ebenfalls eine basische Verbindung. Istamycin A_Q läßt sich als Hemicarbonat in Form eines farblosen kristallinen Pulvers isolieren; dieses Pulver besitzt keinen definierten Schmelzpunkt, zersetzt sich

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bei 111 bis 114⁰C und zeigt eine spezifische optische Drehung von (a)^ = + 76° (c 0,56, Wasser). Die Werte der Gewichtsanalyse stimmen mit den theoretischen Werten der Summenformel ^c-i5^H32^N4°4* ^^{2 H}2^⁰3 (C 51,22 %-, H 9,15 %,* N 15,42 %) überein. Die Summenformel konnte durch Massenspektrometrie mit hoher Auflösung (gefunden: m/e 332.2414; berechnet für ^C15^H32^N4°4^{: m}^^e 332,2420) bestätigt werden. Das Infrarot-Absorptionsspektrum von Istamycin-AQ-Hemicarbonat in Kaliumbromid-Tablette ist in Figur 3 der beigefügten Zeichnungen dargestellt. Das Ultraviolett-Absorptions- · Spektrum von Istamycin-AQ-Hemicarbonat in Wasser zeigt nur eine Endabsorption. Im kernmagnetischen Resonanzabsorptionsspektrum - Proton ( H) - externer Standard:

TMS, pD 5,0 - von Istamycin-A_Q-Hemicarbonat in Deuterowasser finden sich charakteristische Signale bei S3,23 (s, K-CH₃), 3,28 (s, H-CH₃), 3,94 (s, 0-CH₃), 5,86 (d_f J=4 Hz, CH). Istamycin A_Q ist löslich in Wasser und Methanol, kaum löslich oder unlöslich in Äthanol und anderen gebräuchlichen organischen Lösungsmitteln. Seine Reaktion gegenüber Ninhydrin- und Rydon-Smith-Reagenz ist positiv. Istamycin A_Q gibt einen Einzelfleck bei der DünnschichtChromatographie an Silikagel bei Rf 0,36, wenn zum Entwickeln die untere Phase einer Mischung aus Chloroform-Methanol-17#igem wässrigem Ammoniak (Volumenverhältnis 2:1:1) verwendet wird. Bei der Hochspannungspapierelektrophorese (3300 Volt, 15 Minuten) beträgt die relative Mobilität von Istamycin A_Q 2,35, wenn die Mobilität von Alanin mit 1,0 angenommen wird und als Laufmittel ein Gemisch aus Ameisensäure, Essigsäure und Wasser (Volumenverhältnis 1:3:36) verwendet wird.

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-χ- /Ιζ 27.03.80

Istamycin B₀ ist ebenfalls eine basische Verbindung. In Form des Hemicarbonates kann die Verbindung als farbloses kristallines Pulver isoliert werden, welches keinen definierten Schmelzpunkt zeigt. Die spezifische 5 optische Drehung liegt bei (a)jj = +160° (c 1, Wasser). Die Werte der Gewichtsanalyse stimmen mit den theoretischen Werten für die Summenformel ^ci5^H32^N4°4· ¹^² H₂CO₃.1/2 H₂O (C 49,98 %; H 9,20 %; N 15,04 %) überein. Diese Summenformel konnte durch Massenspektrometrie mit hoher Auflösung (gefunden: m/e 332,2384; berechnet für ^c-j5^H32^N4°4^{: m}/^e 332,2421) bestätigt werden.Das Infrarot-Absorptionsspektrum von Istamycin B in Kaliumbromid-Tablette ist in Figur 4 der beigefügten Zeichnungen dargestellt. Das Ultraviolett-Absorptionsspektrum von Istamycin-B_o-Hemicarbonat in Wasser zeigt nur eine Endabsorption. Im kernmagnetischen Resonanz-Absorptionsspektrum - Proton ( H) - externer Standard: TMS, pD 5,2 - von Istamycin-B_Q-Hemicarbonat in Deuterowasser zeigen sich charakteristische Signale bei 6" 3,21 (s, N-CH₃); 3,28 (s, N-CH₃); 3,91 (s, 0-CH₃); 5,92 (d, J=3,5 Hz, CH). Istamycin B_Q ist löslich in Wasser und Methanol, jedoch kaum löslich oder unlöslich in Äthanol und anderen gebräuchlichen organischen Lösungsmitteln. Die Reaktion gegen Ninhydrin- und Rydon-Smith-Reagenz ist positiv. Istamycin B_Q ergibt einen Einzelfleck bei der bereits beschriebenen Dünnschichtchromatographie an Silikagel bei Rf 0,14, wenn zum Entwickeln die untere Phase einer Mischung aus Chloroform-Methanol-1596igem wässrigen Ammoniak (Volumenverhältnis 2:1:1) verwendet wird. Bei der Hochspannungspapierelektrophorese - durchgeführt wie für Istamycin A beschrieben - ist Istamycin B nicht vom Istamycin A_Q zu unterscheiden, weil die Mobilitäten beider Verbindungen in gleicher Weise bei 2,35 liegen.

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Aufgrund der im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung durchgeführten Untersuchungen können die folgenden Strukturformeln für die erfindungsgemäßen Istamycine als gesichert gelten:

Istamycin A

(D

Istamycin B

NH,

H₂NCH₂C

OCH,

(II)

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Istamycin A

CH₂NHCH₃

HO—-

OCH,

oder

CH^NHCH,

(IV)

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Bei den Untersuchungen zur chemischen Struktur des Istamycins A hat sich gezeigt, daß diese Verbindung in wässriger Lösung bei höheren pH-Werten als dem Neutralwert eine Konfiguration annimmt, die der Formel III entspricht, während sie in wässriger Lösung bei pH-Werten niedriger als der Neutralwert (protonenhaltige Form) der Formel IV entspricht.

Istamycin B

CH₂NHCH₃

(V)

OCH,

Istamycin A, Istamycin B, Istamycin A und Istamycin B lassen sich jeweils in Form der freien Base oder als Hydrat oder Carbonat derselben erhalten; die Verbindungen können in pharmazeutisch akzeptable Säureanlagerungssalze umgewandelt werden, indem man sie in bekannter Weise mit einer pharmazeutisch akzeptablen Säure umsetzt. Die pharmazeutisch akzeptablen Säureanlagerungssalze des Istamycins lassen sich so beispielsweise durch Umsetzen mit einer anorganischen Säure wie Chlorwasserstoffsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Salpetersäure, SuIfonsäure u.a. oder mit einer organischen Säure wie

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Essigsäure, Apfelsäure, Zitronensäure, Ascorbinsäure, Methaneulfonsäure u.a. gewinnen.

In den beigefügten Zeichnungen entsprechen die dargestellten Kurven den Infrarot-Absorptionsspektren von Proben der Hemicarbonate - in Kaliumbromid-Tablettevon

Figur 1 Istamycin A,

Figur 2 Istamycin B, Figur 3 Istamycin A_Q und Figur 4 Istamycin B_Q.

Istamycin A und Istamycin B gemäß vorliegender Erfindung zeigen eine starke antibakterielle Wirkung gegen eine große Zahl gram-äegativer und gram-positiver Bakterien, was deutlich aus den Wirkungsspektren der Substanzen in der folgenden Tabelle 1 hervorgeht. Istamycin A und Istamycin B inhibieren sowohl das Wachstum von gram-negativen als auch gram-positiven Bakterien. Die Mindesihemmkonzentrationen (mcg/ml) von Istamycin A und Istamycin B gegen verschiedene Bakterien wurden nach der seriellen Standard-Verdünnungsmethode an Nähragarplatten bestimmt, die bei einer Temperatur von 37°C 17 Stunden bebrütet wurden.

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Test-Mikroorganismus

Mindesthemmkonzentration (mcg/ml)

Istamycin A Istamycin B

Staphylococcus aureus 209P	1,56	0,78
" " Smith	0,39	< 0/10
" " ApOl	1,56	1,56
Staphylococcus epidermidis 109	1,56	1,56 .
Micrococcus flavus FDA 16	25	6,25
Sarcina lutea PCI 1001	1,56	3,13
Bacillus anthracis	0,78	< 0,10
Bacillu subtilis PCI 219	0,39	< 0,10
" » NRRLB-558	1,56	< 0,10
Bacillus cereus ATCC 10702	6,25	3,13
Corynebacterium bovis 1810	3,13	1,56
Mycobacterium smeRmatis ATCC 607	1,56	0,78
Escherichia coli NIHJ	3,13	1,56
« it κ-12	3,13	1,56
¹¹ " K-12 R5	6,25	6,25
" " K-12 R388	3,13	1,56
" " K-12 J5R11-2	3,13	1,56
" " K-12 ML1629	3,13	3,13
¹¹ " K-12 ML163O	6,25	3,13
» " K-12 ML1410	12,5	3,13
« » K-12 ML1410 R81	6,25	3,13
» « K-12 LA290 R55	6,25	3,13
" " K-12 LA290 R56	3,13	1,56

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. _9A 30120U

- W- Z" 27.03.80

Fortsetzung Tabelle 1

Escherichia coil K-12 LA29O R64 " " W677

" ^N JR66/W677 " " K-12 C600 R135

» " JR225 Klebsiella pneumoniae PCI602

« » 22#3038 Shigella dysenteriae JS1191O Shigella flexneri 4B JS11811 Shigella sonnei JS11756 Salmonella typhi T-63
Salmonella enteritidis 1891 Proteus vulgaris 0X19
Proteus rettgeri GN311 " " GN466 Serratia marcescens Serratia SOU '

Serratia 4
Providenciä Pvl6
Provldencia 2991
Pseudomonas aeruginosa A3 ' » " No. 12 ;

3,13	1,56
3,13	1,56
6,25	6,25
50	25
3,13	1,56
6,25	3,13
12,5	12,5
12,5	6,25
12,5	12,5
12,5	12,5
1,56	12,5
3,13	3,13
1,56	0,78
25	12,5
6,25	6,25
25	12,5
50	>25
50	>25
50	12,5
50	25
50	12,5
50	>25

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- Λβί- 4/· 27.03.80

Die antibakterielle Wirkung von Istamycin A und Istamycin B_Q wurde in derselben Weise nach derselben Standard-Verdünnungsmethode an Nähragarplatten wie für Istamycin A und Istamycin B angegeben bestimmt. Istamycin A_Q und Istamycin B_Q zeigen nur eine geringe Wirkung. Es hat sich gezeigt, daß die antibakterielle Wirkung von Istamycin A₀ nur etwa i/200stel von Istamycin A und die antibakterielle Wirkung von Istamycin B_Q nur etwa i/200stel der Wirkung von Istamycin B betragen, wenn man als Test-Mikroorganismus Bacillus subtilis verwendet.

Mäuse vertrugen die intravenöse Verabreichung von 100 mg//Ug Istamycin A, Istamycin B, Istamycin A_Q oder Istamycin B .

Im Hinblick auf die vorstehend genannten Eigenschaften von Istamycin A und Istamycin B kann gesagt werden, daß Istamycin A und Istamycin B in einigen Punkten dem Fortimicin A (R.Okachi et al, Journal of Antibiotics Bd. 30, Seite 541 (1977) und Sporaricin (T.Deushi et al, Journal of Antibiotics, Bd. 32, Seite 173 (1979)) ähnlich sind. Unzweifelhaft unterscheiden sich Istamycin A und Istamycin B aber von den bekannten Antibiotika durch die Tatsache, daß sie keine C-Methylgruppe, sondern vielmehr zwei N-Methylgruppen im Molekül enthalten; die Istamycine A und B und ebenso die Istamycine A_Q und B_Q müssen daher als neue Antibiotika angesehen werden.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist, wie eingangs bereits gesagt, ein Verfahren zur Herstellung des Istamycin-Komplexes, welches darin besteht, daß man einen Istamycin erzeugenden Stamm von Streptomyces unter aeroben Bedingungen in einem Kulturmedium züchtet,

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welches Kohlenstoff- und Stickstoffquellen enthält. Die Züchtung wird solange fortgesetzt, bis sich in dem Kulturmedium eine ausreichende Menge an Istamycin gebildet und angesammelt hat. Der so gebildete Istamycin-Komplex wird dann aus der Kulturbrühe abgetrennt. Als Istamycin-Komplex wird, worauf ebenfalls eingangs bereits hingewiesen wurde, eine Mischung aus zwei, drei oder vier der Istamycine A, B, A und B verstanden.

In einer bevorzugten Ausführungsform dient das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von Istamycin A, wobei ein Istamycin A erzeugender Stamm von Streptomyces unter aeroben Bedingungen in einem Kohlenstoff- und Stickstofffluellen enthaltenden Kulturmedium gezüchtet wird. Weitere bevorzugte Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens dienen zur Erzeugung von Istamycin B, Istamycin A_Q und Istamycin B_Q jeweils unter Verwendung entsprechender Istamycin B, Istamycin A_Q bzw. Istamycin B₀ erzeugender Stämme von Streptomyces. Die Züchtungsbedingungen entsprechen jeweils den angegebenen. Nach Ansammlung einer entsprechenden Menge des jeweiligen Mikroorganismus in der Kulturbrühe kann derselbe aus der Kulturbrühe isoliert und gegebenenfalls gereinigt werden. Die jeweiligen Istamyeine lassen sich aber auch als Rohprodukte in Lösung oder als feste Substanzen allein oder in Mischung untereinander gewinnen.

Ein Beispiel für einen Istamycin erzeugenden Stamm ist der bereits erwähnte Stamm von Actinomycetes, der von den Erfindern aus einer Bodenprobe isoliert worden ist, die vom Seeboden der Küste der Halbinsel Miura in Kanagawa Prefecture, Japan im August 1978 entnommen worden ist; der Stamm hat die Bezeichnung SS-939 erhalten.

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Dieser Stamm SS-939 weist folgende mikrobiologische Eigenschaften auf.

(a) Mikroskopische Morphologie

Bei gutem Wachstum in Agarmedium erzeugt das Mycel von SS-939 monopodiale Verzweigungen. Gerade oder wenig gebogene Lufthyphen entwickeln sich vom Bodenmycel. Die reifen Lufthyphen tragen an den Spitzen eine Kette mit 10 bis 50 Sporen. Die Gestalt der Sporen ist zylindrisch (1 Mikron breit und 4 bis 5 Mikron lang). Spiralige oder quirlförmige Verzweigungen wurden nicht beobachtet. Unter dem Elektronenmikroskop erkennt man, daß die Oberfläche der Sporen glatt ist und keine flusige oder haarige Struktur aufweist. Geißeln und Sporangien wurden nicht beobachtet. Der Stamm SS-939 ist folglich ein typischer Stamm von Streptomyces.

(b) ZUchtungseigenschaften auf verschiedenen Kulturmedien

(1) Auf Saccharose-Nitrat-Agar-Medium (bebrütet bei 27°C): schwaches farbloses Wachstum mit Lufthyphen, welches zunächst weiß ist und sich allmählich in grau mit Blaustich verändert (17 ec, wasserblau, gemäß den Farbangaben in dem "Color Harmony Manual", veröffentlicht von der Container Corporation of America; soweit nichts anderes angegeben ist, beziehen sich die im Folgenden benutzten Farbbezeichnungen ebenfalls auf dieses Standardwerk). Diffundierendes Pigment wird in dem Inkubations-Medium nicht in merklicher Menge gebildet.

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(2) Auf Glycerin-Asparagin-Agar-Medium (bebrütet bei 27°C): die Ergebnisse sind im wesentlichen die gleichen wie bei Sacoharose-Nitrat-Agar-Medium unter (1) angegeben, Jedoch werden kaum Lufthyphen erzeugt.

(3) Auf Stärke-Agar-Medium (bebrütet bei 27°C): im wesentlichen die gleichen Ergebnisse wie bei Saccharose-Nitrat-Agar-Medium unter (1); Lufthyphen werden erzeugt. Die Stärke am Rand des Wachstums wird durchsichtig.

(4) Auf Tyrosin-Agar-Medium (bebrütet bei 37⁰C): die Kultureigenschaften sind im wesentlichen dieselben wie auf den Medien gemäß (1) und (2), jedoch wird ein Melanoidpigment erzeugt.

(5) Auf Nähr-Agar-Medium (bebrütet bei 27⁰C): farbloses Wachstum, auf dem sich weißfarbene Lufthyphen bilden. Das Inkubationsmedium hat einen dunkelbraunen Farbton.

(6) Auf Hefeextrakt-Ma lzextrakt-Medium (bebrütet bei 27°C): farbloses Wachstum mit Lufthyphen. Die Lufthyphen sind weiß und bekommen allmählich eine graue Farbe mit blaugrünem Stich (19 de, wassergrün). Das Medium wird dunkelbraun.

(7) Auf Hafermehl-Agar-Medium (bebrütet bei 27°C): farbloses Wachstum mit Lufthyphen, die eine weiße bis blaugraue Farbe aufweisen (17 ec, wasserblau).

(c) Physiologische Eigenschaften

(1) Temperatur für das Wachstum: Wachstum bei 20 bis 41⁰C.

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(2) Hydrolyse von Stärke: Stärke wird in Stärke-Agar-Medium hydrolysiert.

(3) Koagulierung und Peptonisierung von Magermilch: im wesentlichen negativ.

(4) Bildung von Melanoid-Pigment: positiv auf Tyrosin-Agar-Medium und auf Pepton-Hefeextrakt-Eisen-Agar-Medium.

(d) Ausnutzung von Kohlenstoffquellen für das Wachstum (bestimmt in Pridham-Gottlieb-Medium)

Glukose und Inosit werden verwendet.

Arabinose, D-Xylose, Saccharose, Rhamnose, Raffinose und D-Mannitol werden nicht ausgenutzt. Die Verwendung von D-Fructose ist zweifelhaft.

Faßt man die vorstehend angegebenen Charakteristika des Stammes SS-939 zusammen, so erkennt man, daß dieser Stamm zur Gattung Streptomyces gehört und durch das Fehlen von Spiralen an den Lufthyphen und durch seine Chromogenizität charakterisiert ist. Auf der Basis der vorstehend genannten Eigenschaften kann der Stamm SS-939 mit bekannten Streptomycesarten verglichen werden, wobei Bezug genommen wird auf die Beschreibungen in "International Streptomyces Project (ISP) und Bergey^fs Determinative Bacteriology", 1974. Die charakteristischen Eigenschaften des Stammes SS-939 erinnern stark an Streptomyces viridochromogenes. Der Stamm SS-939 unterscheidet sich jedoch von S. viridochromogenes insoweit, daß SS-939 weder Spiralen produziert, noch Xylose, Arabinose, Rhamnose, Fructose, Raffinose noch Mannitol ausnutzt. Weitere Unterschiede bestehen in der Richtung, daß die Oberfläche der von dem Stamm SS-939 produzierten

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Sporen nicht flusig ist. Als nächstes hat Streptomyces viridifaciens keine Chromogenizität und erzeugt Lufthyphen in einer Farbe, die der des Stammes SS-939 ähnlich ist. Sie sind jedoch voneinander dadurch unterscheidbar, daß der Stamm SS-939 weder Spiralen an den Lufthyphen produziert noch Fructose und Saccharose als Kohlenstoffquellen für das Wachstum ausnutzt. Im übrigen gibt es keine bekannten Streptomycesarten, die die Eigenschaft der Ausnutzung von Kohlenstoffquellen aufweisen, wie sie dem Stamm SS-939 eigen ist. Der Stamm SS-939 unterscheidet sich folglich von den bekannten Stämmen soweit, daß er als eine neue Art zu bezeichnen ist und folglich als Streptomyces tenjimariensis bezeichnet worden ist.

Der Stamm Streptomyces tenjimariensis SS-939 wurde bei der öffentlichen japanischen Hinterlegungsstelle "Fermentation Research Institute", Agency of Industrial Science and Technology, Tsukuba-gun, Ibaragi Prefecture, Japan unter der Hinterlegungs-Nummer FERM-P 4932 am 21.April 1979 und ebenso bei der American Type Culture Collection, Washington, D.C, U.S.A. unter der ATCC-Nummer 31603 hinterlegt.

Mutationen treten bei Actinomyceten häufig sowohl spontan als auch durch künstliche Beeinflussung auf. Die vorliegende Erfindung betrifft folglich die Verwendung des Stammes SS-939 auch in all dessen Varianten und Mutanten, so lange diese Istamycin erzeugen.

Istamycin kann durch aerobe Züchtung von Sporen oder Mycel von Istamycin erzeugenden Stämmen von Streptomyces, beispielsweise Streptomyces tenjimariensis SS-939 (FERM-P 4932 oder ATCC Nummer 31 603) gewonnen werden. Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens

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zur Erzeugung von Istamycin wird folglich eine bestimmte Menge an Sporen oder Mycel eines Istamycin erzeugenden Stammes in ein geeignetes Kulturmedium eingeimpft. Dieses Kulturmedium muß entsprechende Nährstoffquellen enthalten, die für den Stamm assimilierbar sind. Das geimpfte Nährmedium wird dann unter aeroben Bedingungen bebrütet, bis sich in der Kulturbrühe Istamycin, d.h. wenigstens eine der Substanzen Istamycin A, B, A_Q oder B_Q angesammelt hat. Nährstoffe in dem Kulturmedium können alle üblicherweise für die Züchtung von Actinomyceten verwendeten Substanzen sein. Geeignet sind beispielsweise im Handel erhältliches Sojabohnenmehl, Erdnußpulver, Baumwollsamenmehl, getrocknete Hefe, Pepton, Fleischextrakt, Casein, Maisweichwasser, Natriumnitrat, Ammoniumsulfat u.a. als Stickstoffquellen. Die im Handel erhältlichen Kohlehydrate wie Saccharose, Stärke, Glycerin, Maltose, Dextrin, Glukose, Lactose u.a. sowie Sojabohnenöl und Fette sind als Kohlenstoffquellen geeignet. Gegebenenfalls können der Kulturbrühe anorganische Salze wie Natriumchlorid, Calciumcarbonat, Magnesiumsulfat, Manganchlorid und Phosphate sowie verschiedene Aminosäuren zugesetzt werden. Alle Nährstoffe, die für die Züchtung von Actinomyceten bekannt sind, können für das erfindungsgemäße Verfahren verwendet werden, solange sie von dem Istamycin erzeugenden Stamm assimiliert werden können.

Für die Produktion von Istamycin in großem Maßstab eignet sich insbesondere die Züchtung in flüssigem Medium. Die Züchtung kann bei beliebigen Temperaturen, bei welchen der Istamycin erzeugende Stamm zu wachsen und Istamycin zu produzieren vermag, durchgeführt werden, vorzugsweise arbeitet man bei einer Temperatur im Bereich von 25 bis 30°C. Die Züchtung wird im allgemeinen solange fortgesetzt, bis sich eine ausreichende Menge Istamycin in

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dem Kulturmedium angesammelt hat; dies erfordert im allgemeinen 2 bis 7 Tage.

Die Prüfung von Istamycin A und Istamycin B kann unter Verwendung von Bazillus subtilis PCI 219 als Test-Organismus durchgeführt werden. Man arbeitet nach der Standard-Deckelplattenmethode, die au<5h üblicherweise zur Prüfung bekannter Antibiotika angewendet wird. Eine reine Probe von Istamycin A, welches gemäß dem im Folgenden beschriebenen Beispiel 3 erhalten worden ist, kann als authentisches Produkt verwendet werden, welches eine Potenz von 1000 meg (Einheiten) pro mg aufweist. Eine reine Probe von Istamycin B, die ebenfalls gemäß folgendem Beispiel 3 erhalten worden ist, zeigt eine Potenz von 3170 meg (Einheiten)/mg.

Die Prüfung von Istamycin A₀ und Istamycin B kann ebenfalls mit Bacillus subtilis PCI 219 als Test-Organismus unter Verwendung der Standard-Deckelplattenmethode durchgeführt werden. Eine reine Probe von Istamycin A , welche gemäß der Erfindung erhalten worden ist, weist eine Potenz von 5 meg (Einheiten)/mg und eine reine Probe von Istamycin B eine Potenz von 10 meg (Einheiten)/mg auf, wobei als Vergleich angesetzt ist, daß die reine authentische Probe von Istamycin A eine Potenz von 1000 meg (Einheiten)/mg aufweist.

Istamycin A, Istamycin B, Istamycin A_Q und Istamycin B sowie ihre Säureanlagerungssalze sind leicht löslich in Wasser. Der Istamycin-Komplex ist in der Kulturbrühe im wesentlichen in der flüssigen Phase der Lösung enthalten. Istamycine A und B sowie die Istamycine A_Q und B lassen sich aus wässriger Lösung mit organischen Lösungsmitteln wie Butanol, Butylacetat, Chloroform oder

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anderen mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmitteln praktisch nicht extrahieren, so daß diese organischen Lösungsmittel gut dazu verwendet werden können, um erforderlichenfalls Verunreinigungen aus der Kulturbrühe zu extrahieren. Für die Abtrennung des Istamycin-Komplexes aus der Kulturbrühe oder aus einer wässrigen Lösung kann die Kulturbrühe oder die wässrige Lösung mit verschiedenen Adsorbentien behandelt werden, an denen sich das Istamycin anlagert. Verwendet man Aktivkohle als Adsorbenz, so kann das von dieser adsorbierte Istamycin durch Behandlung mit schwach angesäuertem Wasser, schwach angesäuertem wässrigen Methanol, schwach angesäuertem wässrigen Propanol, schwach angesäuertem wässrigen Aceton u.a. wieder extrahiert werden.

Istamycin wird infolge seiner Basizität in wirksamer Weise von Kationenaustauscherharzen adsorbiert, von welchen es mittels geeigneter Lösungsmittel wieder eluiert werden kann. Die Adsorption an einem Kationenaustauscherharz ist der gangbarste und geeignetste Weg zur Abtrennung von Istamycin aus einer großen Menge Kulturbrühe. Die Kationenaustauscher, die für diesen Zweck geeignet und erhältlich sind, können beispielsweise die folgenden sein: Kationenaustauscherharze mit Carboxylfunktionen wie Amberlite IRC-50 ^ und Amber-

lite CG-50® (Produkte der Firma Rohm & Haas Co., USA), Lewatit CNP © (ein Produkt der Firma Bayer, West-Deutschland), CM-Sephadex^ (ein Produkt der Firma Pharmacia Co., Schweden), und zwar sowohl in ihren Η-Formen, Na-Formen und/oder NH^-Formen. Das Istamycin, welches an dem Kationenaustauscherharz adsorbiert ist, kann wieder eluiert werden, indem man mit angesäuertem Wasser, verdünntem wässrigem Ammoniak oder einer wässrigen Lösung eines anorganischen Salzes behandelt. Für die genannte Eluierung eignen sich am

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besten 0,2n bis 1n Chlorwasserstoffsäure und 0,2n bis 1n wässriges Ammoniak. Da Istamycin A und Istamycin B ebenso wie Istamycin A₀ und Istamycin B₀ an Anionenaustauscherharzen praktisch nicht adsorbiert werden, können Anionenaustauscherharze zum Neutralisieren der wässrigen sauren Lösung von Istamycin oder zur Entfernung von sauren Verunreinigungen aus der Istamycinlösung verwendet werden.

Um Istamycin A, Istamycin B, Istamycin A_Q oder Istamyein B getrennt aus dem so gewonnenen Istamycin-Komplex zu erhalten, wird der Istamycin-Komplex einer Säulenchromatographie an Silikagel unterworfen, wobei zum Entwickeln die untere Phase eines Lösungsmittelgemisches aus Chloroform-Methanol-17%igem wässrigen Ammoniak (Volumenverhältnis 2:1:1) oder andere analoge Lösungsmittelgemische verwendet werden. Die Trennung ist möglich aufgrund der Tatsache, daß die vier Istamycine bei der Dünnschichtchromatographie an Silikagel bei der Entwicklung mit der unteren Phase des Lösungsmittelgemisches aus Chloroform-Methanol-17%igem wässrigen Ammoniak (2:1:1) Einzelflecken ergeben,und zwar das Istamycin A einen Einzelfleck bei Rf 0,17, das Istamycin B einen Einzelfleck bei Rf 0,11, das Istamycin A einen Einzelfleck bei Rf 0,36 und das Istamycin B_Q einen Einzelfleck bei Rf 0,14. Auf diese Weise sind die vier Istamycine voneinander trennbar. Um Istamycin A von Istamycin B zu trennen kann eine Mischung dieser beiden Istamycine der chromatographischen Trennung an einer Cellulosekolonne unterworfen werden, die mit einem Lösungsmittelgemisch aus n-Butanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser (Volumenverhältnis 6:4:2:4) oder einem analogen Lösungsmittelgemisch entwickelt wird. Dies ist möglich aufgrund der Tatsache, daß bei der Dünnschichtchromatographie an Cellulose bei Entwicklung mit dem genannten Lösungsmittelgemisch aus

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n-Butanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser (6:4:2:4) Istamycin A einen Einzelfleck bei Rf 0,22, Istamycin dagegen einen Einzelfleck bei Rf 0,25 ergibt. Die Prozeduren der chromatographischen Trennung lassen sich infolgedessen für die Gewinnung der Istamycine ebenso wie für die Reinigung von isoliertem Istamycin verwenden. Istamycin A, B, A_Q oder B_Q läßt sich in gereinigtem Zustand isolieren, wenn man sowohl die beschriebenen Extraktionsmethoden als auch die chromatographische Isolierung in kombinierter Form gegebenenfalls mehrfach wiederholt anwendet.

Für die Abtrennung des Istamycin-Komplexes und für die Isolierung und Reinigung der einzelnen Istamycine wird die folgende Prozedur bevorzugt:

Die Kulturbrühe des Istamycin erzeugenden Stammes wird durch Zugabe von Chlorwasserstoffsäure auf einen pH-Wert von 2,0 eingestellt und anschließend filtriert. Man erhält so ein Brühenfiltrat, welches anschließend über eine Kolonne mit einem Kationenaustauscherharz, z.B. Amber-

lite IRC-50<S)(NH^-Zyklus)geleitet, so daß das Istamycin von dem Harz adsorbiert wird. Das Harz wird dann mit Wasser gewaschen und mit 1n wässrigem Ammoniak eluiert. Die aktiven Fraktionen des Eluates werden vereinigt und unter vermindertem Druck eingeengt, so daß man eine konzentrierte Lösung erhält, die dann über eine Kolonnemit einem Kationenaustauscherharz, z.B. Amberlite CG-50^ geleitet wird. Das Istamycin wird an dem genannten Harz adsorbiert. Das Harz wird mit Wasser gewaschen und mit 0,2n wässrigem Ammoniak und danach mit 0,4n wässrigem Ammoniak eluiert.

Mehrere aktive Fraktionen, die eine nennenswerte Menge an Istamycin B enthalten, werden vereinigt und im Vakuum zur Trockne eingeengt. Man erhält so ein pulverförmiges

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Rohprodukt, welches Istamycin B darstellt. Dieses Rohprodukt wird mehrfach der Säulenchromatographie an Silikagel unterworfen, wodurch man Istamycin B in gereinigter Form als farbloses Pulver gewinnt.

Mehrere aktive Fraktionen, die eine nennenswerte Menge an Istamycin A sowie Mengen an Istamycin A_Q und B_Q enthalten, werden vereinigt und im Vakuum zur Trockne eingeengt. Man erhält so ein pulverförmiges Rohprodukt, welches aus den Istamycinen A, A und B besteht. Dieses pulverförmige Rohprodukt wird der Säulenchromatographie an Silikagel unterworfen; die Kolonne wird mit der unteren Phase eines Lösungsmittelgemisches aus Chloroform-Methanol-8,5%igem wässrigen Ammoniak (Volumenverhältnis 2:1:1) entwickelt.

Die aktiven Fraktionen des Eluates, die allein Istamycin A enthalten, werden vereinigt und im Vakuum eingeengt. Die so gewonnene konzentrierte Lösung wird über eine Kolonne mit einem Kationenaustauscherharz, z.B. Amberlite CG-50® (NH^-Zyklus) geleitet; die Kolonne wird mit 0,5n wässrigem Ammoniak eluiert. Die so eluierten aktiven Fraktionen, die nur Istamycin A enthalten, werden vereinigt und im Vakuum zur Trockne eingeengt. Man erhält auf diese Weise reines Istamycin A als farbloses kristallines Pulver.

Die aktiven Fraktionen des Eluates der durchgeführten Säulenchromatographie, die Istamycin A enthalten, werden ebenfalls vereinigt und im Vakuum eingeengt. Die so gewonnene konzentrierte Lösung wird wiederum der Säulenchromatographie an Silikagel unterworfen, wobei die aktiven Fraktionen, die ausschließlich Istamycin A enthalten, vereinigt und im Vakuum zur Trockne eingeengt werden. Man erhält so reines Istamycin A als farbloses Pulver. Die aktiven Fraktionen der beschriebenen Säulen-

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Chromatographie an Silikagel schließlich, die nur Istamycin B_Q enthalten, werden vereinigt und im Vakuum eingeengt. Die entstandene konzentrierte Lösung wird wiederum der Säulenchromatographie an einem Kationenaustauscherharz wie Amberlite CG-50^(NH^-Zyklus) unterworfen, wobei zum Entwickeln 0,5n wässriges Ammoniak verwendet wird. Die Fraktionen des Eluates, die allein Istamycin B₀ enthalten, werden vereinigt und im Vakuum zur Trockne eingeengt. Man erhält auf diese Weise gereinigtes Istamycin B_Q in Form eines farblosen kristallinen Pulvers.

Aus den Strukturuntersuchungen an Istamycin A, B, A_Q. und B_Q konnte geschlossen werden, daß Istamycin A_Q ein Deglycylderivat des Istamycin A und das Istamycin B_Q ein Deglycylderivat des Istamycin B ist (vergleiche die Formeln I und II mit den Formeln III, IV und V). Istamycin A_Q und Istamycin B_Q können infolgedessen in Istamycin A bzw. Istamycin B umgewandelt werden, indem man in an sich bekannter Weise ein Glycinmolekül mit der Iminogruppe, die in der Methylaminogruppe in 4-Stellung des Istamycin A_Q bzw. Istamycin B_Q vorhanden ist, kondensiert. Diese Umwandlung stellt eine wertvolle Reaktion dar, weil Istamycin A und Istamycin B eine höhere antibakterielle Aktivität aufweisen und stärker wirksame chemotherapeutische Mittel sind als Istamycin A₀ und Istamycin B_Q.

Weiterhin konnte gefunden werden, daß Istamycin A und Istamycin B_Q gebildet werden, wenn man Istamycin A bzw. Istamycin B unter alkalischen Bedingungen hydrolysiert. Zum Gegenstand der Erfindung gehört infolgedessen auch ein Verfahren zur Herstellung von Istamycin A aus Istamycin A bzw. Istamycin B aus Istamycin B, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß man Istamycin A oder

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Istamycin B in wässriger Lösung unter alkalischen Bedingungen zu Istamycin A bzw. Istamycin B hydrolyliert. Diese alkalische Hydrolyse von Istamycin A oder Istamycin B kann bei Temperaturen von 50 bis 110⁰C in wässriger Lösung in Gegenwart von Alkalien wie Alkalimetall- oder Erdalkalimetallhydroxiden oder -carbonaten, beispielsweise Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid oder Bariumhydroxid u.a. durchgeführt werden. Das Alkalimetallhydroxid oder die andere alkalische Verbindung kann in einer Konzentration von 0,1 bis 4m vorhanden sein. Die Hydrolyse ist im allgemeinen in 1 bis 3 Stunden abgeschlossen. Die Hydrolyse von Istamycin A oder Istamycin B kann vorzugsweise so durchgeführt werden, daß man die Verbindungen in Wasser, welches 4m Natriumhydroxid enthält, eine Stunde auf 100°C erhitzt, Die Umsetzung kann auch in Wasser durchgeführt werden, welches 0,5m Bariumhydroxid enthält; man erhitzt dann drei Stunden auf 100⁰C. Unter diesen Reaktionsbedingungen kommt es nicht zu einem Aufbrechen der Glycosidbindungen des Istamycin A₀ oder Istamycin B . Die alkalische Hydrolyse kann auch in der Kulturbrühe oder dem Brühenfiltrat, welches Istamycin A oder Istamycin B enthält, durchgeführt werden.

Das Istamycin A und Istamycin B gemäß vorliegender Erfindung zeichnen sich durch hohe bakterielle Wirkung und eine niedrige Toxizität für Tiere aus. Istamycin A und B sind infolgedessen ebenso wie die bekannten Antibiotika wertvolle antibakterielle Mittel und können in entsprechenden pharmazeutischen Verabreichungsformen als solche Verwendung finden. Die Erfindung umfaßt daher auch pharmazeutische Mittel bzw. Arzneimittel, die eine ausreichende Menge an wenigstens einer der Substanzen Istamycin A, Istamycin B und/oder einem Säureanlagerungssalz dieser Verbindungen in Kombination mit einem phar-

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mazeutisch akzeptablen Trägermaterial enthalten.

Die Erfindung betrifft auch die Verwendung der erfindungsgemäßen Substanzen Istamycin A, Istamycin B und/oder der Säureanlagerungssalze dieser Verbindungen in ausreichender Menge zur Unterdrückung und Bekämpfung von Bakterienwachstum bei Tieren. Dabei muß in Betracht gezogen werden, daß die im Einzelfall zu verwendenden Mengen an Istamycin je nach Art der Anwendung und dem betroffenen Organismus schwanken können. Viele Faktoren können dabei eine Rolle spielen und die zu verwendende Menge des Arzneimittels beeinflussen. Solche Faktoren sind beispielsweise das Alter, das Körpergewicht, das Geschlecht, mögliche Diäten, die Zeit der Verabreichung, das Ausmaß der Ausscheidung, Kombinationen mit anderen Arzneimitteln, mögliche Sensibilitäten sowie die Schwere des Falles. Optimale Mengen müssen von Fall zu Fall vom Fachmann festgesetzt werden.

Streptomyces tenjimariensis SS-939 (FERM-P 4932, ATCC Nummer 31603) ist, wie weiter vorn bereits ausgeführt, ein neuer Mikroorganismus, der ein neues Antibiotikum, nämlich Istamycin, erzeugt und die weiter vorn aufgeführten mikrobiologischen Eigenschaften aufweist. Zum Gegenstand der Erfindung gehört schließlich dieser neue Mikroorganismus Streptomyces tenjimariensis SS-939 in reiner · isolierter Form, der bei öffentlichen Hinterlegungsstellen als FERM-P 4932 bzw. ATCC 31603 hinterlegt ist und durch folgende charakteristische Merkmale gekennzeichnet ist:
Produktion von Lufthyphen mit weißer Farbe, die sich allmählich ingrau mit blaugrünem Stich ändert, das Fehlen von Spiralen an den Lufthyphen, glatte Oberfläche der Sporen, Chromogenizität, Ausnutzung von Glucose und Inosit, jedoch Nicht-Verwendung von Arabinose, D-Xylose,

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Saccharose, Rhamnose, Raffinose und D-Mannitol als Kohlenstoffquellen sowie Fähigkeit zur Bildung der Istamycine A, B, A₀ und B_Q. Der Stamm SS-939 wurde isoliert durch Bebrüten einer Bodenprobe, die vom Seeboden der Küste der Halbinsel Miura in Kanagawa Prefecture, Japan, entnommen worden ist auf einem MY-Kulturmedium, welches 1 % Maltose, 0,4 % Hefeextrakt, 1,5 % Agar (pH 7,2) sowie zusätzlich 10 mcg/ml Kanamycin A enthielt. Die Isolierung erfolgte nach der Bebrütung auf dem vorstehend genannten Agarmedium bei 27⁰C. während 3 Tagen durch Entnahme des Mycels und der Sporen einer Kolonie, die sich auf dem genannten MY-Medium gebildet hatte. Das Mycel und die Sporen wurden auf Platten mit Pridham-Gottlieb-Kulturmedium eingeimpft (das Testmedium diente zur Bestimmung der Assimilierbarkeit verschiedener Kohlehydrate), von denen jede 1 % Glucose, Xylose, Arabinose, Rhamnose, Raffinose oder Inosit enthielt. In einem Pridham-Gottlieb-Medium, welches Inosit enthielt, konnte ein Stamm von S.tenjimariensis gewonnen werden, der die Fähigkeit zum Assimilieren von Inosit besaß.

Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung.

Beispiel 1

Eine Schrägbodenkultur von Streptomyces tenjimariensis SS-939 (FERM-P 4932 bzw. ATCC Nummer 31603) wurde in ein flüssiges Kulturmedium ( je T10 ml in Erlenmeyer-Kolben mit einem Fassungsvermögen von 500 ml) eingeimpft; das Kulturmedium enthielt 1,0 % Stärke, 0,2 % Glukose, 1,0 % Sojabohnenmehl, 0,3 % Natriumchlorid, 0,1 % Dikaliumhydrogenphosphat und 0,1 % Magnesiumsulfat . 7 H₂O. Die Züchtung und Bebrütung erfolgte unter Drehung und Schütteln bei 27⁰C im Verlauf

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von 48 Stunden. Die nach dieser Zeit vorliegende Saatkultur (220 ml) wurde in einen 30 1-Gärbehälter eingeimpft, der 15 Liter eines flüssigen Produktionskulturmediums enthielt, welches 2,0 % Stärke, 0,2 % Glukose, 2,0 % Sojabohnenmehl, 0,3 % Natriumchlorid, 0,1 % Dikaliumhydrogenphosphat und 0,1 % Magnesiumsulfat . 7 HpO aufwies. Die Gärung lief bei 27°C in 72 Stunden unter Belüftung (15 1 Luft pro Minute) und Rühren (300 Umdrehungen pro Minute) ab.

Die Kulturbrühen aus sechs Gärbehältern wurden vereinigt, durch Zugabe von Chlorwasserstoffsäure auf einen pH-Wert von 2,0 eingestellt und anschließend filtiert. Man erhielt auf diese Weise 90 1 Brühenfiltrat (Potenz 2,5 mcg/ml). Das Brühenfiltrat wurde durch eine Kolonne geleitet, welche 12 1 des Kationenaustauscherharzes

Amberlite IRC-50^ (NH^-Form) enthielt. Das Istamycin wurde an dem Harz adsorbiert. Das Harz wurde anschliessend mit 24 1 Wasser gewaschen und danach mit 1n wässrigem Ammoniak eluiert. Die aktiven Fraktionen des Eluates wurden vereinigt (3 1) und im Vakuum zur Trockne eingeengt. Man erhielt auf diese Weise 3,51 g eines pulverförmigen Rohproduktes (Potenz 61 mcg/mg).

Dieses pulverförmige Rohprodukt wurde in 100 ml Wasser gelöst. Die entstandene Lösung wurde durch eine Kolonne mit einem Durchmesser von 40 mm geleitet, welche eine einem Volumen von 300 ml entsprechende Menge des Anionenaustauscherharzes Dowex 1-X4^(OH-Form) enthielt; anschließend wurde die Kolonne mit Wasser entwickelt. Die zunächst ablaufenden Mengen (200 ml) des Eluates wurden verworfen; die dann ablaufende Menge (880 ml) wurde aufgefangen und über eine andere Kolonne mit einem Durchmesser von 25 mm geleitet, die eine einem Volumen von 150 ml entsprechende Menge des Kationenaustauscherharzes Amberlite CG-50^ (NH^-Form) enthielt, an welchem

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das Istamycin adsorbiert wurde. Die Kolonne mit dem Kationenaustauscherharz wurde mit 300 ml Wasser gewaschen und anschließend zunächst mit 900 ml 0,2n wässrigem Ammoniak und dann mit 900 ml 0,4n wässrigem Ammoniak eluiert. Das Eluat wurde in 18 ml-Fraktionen aufgefangen. Die aktiven Fraktionen Nr. 66 bis 80 wurden vereinigt und unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft. Man erhielt auf diese Weise 210 mg eines weißen Pulvers (Potenz 460 mcg/mg), welches aus den Istamycinen A und B bestand. Die Fraktionen Nr.

28 bis 65 wurden in entsprechender Weise aufgearbeitet, wobei man ein pulverförmiges Rohprodukt erhielt, welches aus einigen nicht idenfizierten Antibiotika, bei denen es sich um andere als die Istamycine A, B, A_Q und B_Q handelt, bestand.

Beispiel 2

Das Brühenfiltrat (150 Liter, gesammelt aus 10 Gärbehältern) , welches bei der Fermentierung von Streptomyces tenjimariensis in derselben Weise wie in Beispiel 1 beschrieben gewonnen worden war, wurde durch eine Kolonne geleitet, die 20 Liter des Kationenaustauscherharzes Amberlite IRC-50*·—) (NHL-Form) enthielt, an dem das Istamycin adsorbiert werden konnte. Nach dem Waschen mit Wasser (40 Liter) wurde die Kolonne mit 1n wässrigem Ammoniak eluiert. Die aktiven Fraktionen des Eluates wurden vereinigt und unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt. Man erhielt auf diese Weise 4,1 g eines pulverförmigen Rohproduktes (Potenz 240 mcg/mg).

Dieses pulverförmige Rohprodukt wurde in 20 ml Wasser gelöst. Die so gewonnene wässrige Lösung wurde auf eine Kolonne mit einem Durchmesser von 30 mm gegeben, die eine einem Volumen von 200 ml entsprechende Menge des Anionenaustauscherharzes Dowex 1-X4^ (OH-Form)

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enthielt. Die Kolonne wurde mit Wasser entwickelt. Die zunächst ablaufende Flüssigkeit (270 ml) wurde verworfen. Die danach ablaufende Flüssigkeit (270 ml) wurde aufgefangen und über eine weitere Kolonne mit einem Durchmesser von 25 mm geleitet, die eine einem Volumen von 150 ml entsprechende Menge des Kationenaustauscherharzes Amberlite CG-50 v-' (NH^-Form) zur Adsorption des Istamycins enthielt. Die Kolonne wurde mit 150 ml Wasser gewaschen und dann zunächst mit 900 ml 0,2n wässrigem Ammoniak und dann mit 900 ml 0,4n wässrigem Ammoniak eluiert. Das Eluat wurde in 18 ml-Fraktionen aufgefangen. Die Fraktionen Nr. 55 bis 90 wurden vereinigt und unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt. Man erhielt auf diese Weise 980 mg eines weißen Pulvers (Potenz 940 mcg/mg), welches aus den Istamycinen A und B bestand.

Beispiel 3

Das gemäß Beispiel 2 erhaltene weiße Pulver (980 mg, Potenz 940 mcg/mg), welches aus den Istamycinen A und B bestand, wurde in 15 ml einer Mischung aus n-Butanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser (Volumenverhältnis 6:4:2:2) aufgenommen. Die erhaltene Lösung wurde auf eine Kolonne mit einem Durchmesser von 25 mm gegeben, welche 60 g Cellulosepulver (Avicel^—'von der Firma Funakoshi Yakuhin Co., Japan) zur Adsorption des Istamcins enthielt. Die Cellulosekolonne wurde zunächst mit 1200 ml des vorstehend angegebenen Lösungsmittelgemisches (Volumenverhältnis 6:4:2:2) und anschließend noch mit 600 ml des Lösungsgemisches aus n-Butanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser (jedoch im Volumenverhältnis von 6:4:2:4) entwickelt. Das Eluat wurde in 10 ml-Fraktionen aufgefangen. Die Fraktionen Nr. 45 bis 74 enthielten nur Istamycin B, die Fraktionen Nr. 114 bis 154 enthielten nur Istamycin A und die Fraktionen Nr. 75 bis

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113 enthielten ein Gemisch aus den Istamycinen A und B.

Die Fraktionen Nr. 45 bis 74 wurden vereinigt und unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt. Man erhielt ein Pulver, welches in 5 ml Wasser gelöst wurde. Die so gewonnene wässrige Lösung von Istamycin B wurde über eine Kolonne geleitet, die eine einem Volumen von 25 ml entsprechende Menge des Kationenaustauscherharzes Amberlite CG-50^ (NH^-Form) zur Adsorption des Istamycin B enthielt. Nach dem Waschen mit 25 ml Wasser wurde die Harzkolonne mit 0,4n wässrigem Ammoniak eluiert. Die aktiven Fraktionen (insgesamt 40 ml) des Eluates wurden unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt; man erhielt so 15,3 mg reines pulverförmiges Istamycin B (Potenz 3170 mcg/mg).

Die Fraktionen Nr. 114 bis 154 wurden ebenfalls vereinigt und unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft. Man erhielt auf diese Weise ein Pulver, welches in 5 ml Wasser gelöst wurde. Die Lösung von Istamycin A in Wasser, die so erhalten worden war, wurde durch eine Kolonne geleitet, die eine einem Volumen von 25 ml entsprechende Menge des Kationenaustauscherharzes Amberlite CG-50^--' (NH^-Form) zur Adsorption von Istamycin A enthielt. Nach dem Waschen mit 25 ml Wasser wurde die Kolonne mit 0,4n wässrigem Ammoniak eluiert. Die aktiven Fraktionen (insgesamt 45 ml) des Eluates wurden unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt. Man erhielt auf diese Weise 50 mg reines pulverförmiges Istamycin A (Potenz 1000 mcg/mg).

Beispiel 4

Eine Agar-Schrägbodenkultur von Streptomyces tenjimariensis SS-939 (FERM-P 4932; ATCC Nr. 31603) wurde in je 110 ml eines flüssigen Kulturmediums eingeimpft,

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welches sich in Erlenmeyer-Kolben mit einen Fassungsvermögen von 500 ml befand und welches 1,0 % Stärke, 0,2 % Glukose, 1,0 % Sojabohnenmehl, 0,3 % Natriumchlorid, 0,1 % Dikaliumhydrogenphosphat und 0,1 % Magnesiumsulfat . 7 H₂O enthielt. Die Züchtung erfolgte während 48 Stunden bei 27⁰C unter Schütteln und Drehung. Die so gewonnene Saatkultur (220 ml) wurde in 30 1-Gärbehälter eingeimpft, die jeweils 15 1 eines flüssigen Produktionskulturmediums enthielten. Das Produktionskulturmedium hatte einen Gehalt an 2,0 % Stärke, 0,2 % Glukose, 2,0 % Sojabohnenmehl, 0,2 % Natriumpalmitat, 0,3 % Natriumchlorid, 0,1 % Dikaliumhydrogenphosphat und 0,1 % Magnesiumsulfat . 7 H₂O. Die Fermentierung wurde 72 Stunden lang bei 27°C unter Belüftung (15 1 Luft pro Minute) und Bewegung (300 Umdrehungen pro Minute) durchgeführt.

Die entstandene Kulturbrühe wurde aus den Gärbehältern entnommen, durch Zugabe von Chlorwasserstoffsäure auf pH 2,0 eingestellt und filtriert. Man erhielt 150 1 eines Brühenfiltrates mit einer Potenz von 6 mcg/mg. Dieses Brühenfiltrat wurde durch eine Kolonne geleitet, welche eine einem"Volumen von 12 1 entsprechende Menge des Kationenaustauscherharzes IRC-50^ (NH^-Form) zur Adsorption von Istamycin enthielt. Nach dem Waschen mit 24 1 Wasser wurde die Harzkolonne mit 1n wässrigem Ammoniak eluiert. Die aktiven Fraktionen (ingesamt 5,6 1) des Eluates wurden vereinigt und unter vermindertem Druck eingeengt. Die so gewonnene konzentrierte Lösung wurde auf eine Kolonne gegeben, die eine einem Volumen von 200 ml entsprechende Menge des Kationenaustauscherharzes Amber lite CG-50^—' (ML.- Form) enthielt. Nach dem Waschen mit 200 ml Wasser wurde die Harzkolonne noch mit 1200 ml 0,2n wässrigem Ammoniak gewaschen und dann mit 1200 ml 0,4n wässrigem Ammoniak eluiert.

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- 3//-fe. - - - 3012QH

27.03.80 Das Eluat wurde in 18 ml-Fraktionen aufgefangen.

Die Fraktionen Nummer 80 bis 106 wurden vereinigt und unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt. Man erhielt auf diese Weise 240 mg rohes pulverförmiges Istamycin B (Potenz 380 mcg/mg). Dieses pulverförmige Rohprodukt wurde mehrfach der Säulenchromatographie an Silikagel unterworfen, wobei zur Entwicklung die untere Phase einer Mischung aus Chloroform-Methanol-8,5!#igem wässrigen Ammoniak (2:1:1) verwendet wurde, bis reines weißes pulverförmiges Istamycin B mit einer Potenz von 1350 mcg/mg vorlag. Ausbeute 25 mg.

Die Fraktionen Nummer 107 bis 124 wurden ebenfalls vereinigt und unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt. Man erhielt auf diese Weise 380 mg eines pulver-

.15 förmigen Rohproduktes (Potenz 180 mcg/mg), welches aus den Istamycinen A, A und B bestand. Dieses pulverförmige Rohprodukt wurde der Säulenchromatographie unterworfen, wobei man eine Kolonne mit 38 g Silikagel (60^; ein Handelsprodukt der Firma E.Merck Co., Deutschland) verwendete. Die Kolonne wurde mit der unteren Phase eines Lösungsmittelgemisches aus Chloroform-Methanol-8,5^igem wässrigen Ammoniak (Volumenverhältnis 2:1:1) entwickelt. Das Eluat von der Silikagelkolonne wurde in 5 ml-Fraktionen aufgefangen.

Die Fraktionen Nr. 54 bis 61 wurden vereinigt und unter vermindertem Druck eingeengt. Die konzentrierte Lösung wurde auf eine Kolonne gegeben, die eine einem Volumen von 3 ml entsprechende Menge des Kationenaustauscherharzes Amberlite CG-50 ^(NH^-Form) zur Adsorption des Istamycins A_Q enthielt. Die Kolonne mit dem Kationenaustauscherharz wurde mit 0,5n wässrigem Ammoniak eluiert und die aktiven Fraktionen der ablaufenden Flüssigkeit wurden unter vermindertem Druck zur Trockne einge-

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27.03.80

engt. Man erhielt auf diese Weise reines Istamycin A (Potenz 5 mcg/m
Ausbeute 25 mg.

ο (Potenz 5 mcg/mg) als farbloses kristallines Pulver.

Die Fraktionen Nr. 65 bis 76 wurden ebenfalls vereinigt und unter vermindertem Druck eingeengt. Die konzentrierte Lösung wurde der Säulenchromatographie unterworfen, wobei man eine Kolonne mit 10 g Silikagel verwendete. Zum Entwickeln wurde die untere Phase des Lösungsmittelgemisches aus Chloroform-Methanol-8,5%igem wässrigen Ammoniak (2:1:1) verwendet. Der Vorgang diente der Reinigung von Istamycin A. Auf diese Weise konnte reines Istamycin A mit einer Potenz von 1000 mcg/mg als farbloses pulverförmiges Produkt in einer Menge von 23 mg erhalten werden.

Die Fraktionen Nr. 77 bis 90 wurden auch vereinigt und unter vermindertem Druck eingeengt. Die konzentrierte Lösung wurde über eine Kolonne gegeben, die eine einem Volumen von 3 ml entsprechende Menge des Kationenaustauscherharzes Amberlite CG-50^ (NH/-Form) zur Adsorption von Istamycin B_Q enthielt. Diese Kolonne wurde mit 0,5n wässrigem Ammoniak eluiert. Die aktiven Fraktionen des Eluates wurden unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt. Man erhielt auf diese Weise reines Istamycin B mit einer Potenz von 10 mcg/mg als farbloses kristallines Pulver. Ausbeute 18 mg.

Beispiel 5

Dieses Beispiel und die folgenden Beispiele dienen der Erläuterung der Herstellung von Istamycin A_Q oder B aus Istamycin A oder Istamycin B durch alkalische Hydrolyse.

G30CU6/OS37

30120H

27.03.80

Eine Lösung von 20 mg Istamycin A in zwei ml Wasser wurde mit 300 mg Bariumhydroxid (Ba(OH)₂.8H₂O) vermischt. Die Mischung wurde 3 Stunden in einem verschlossenen Rohr auf 100⁰C erhitzt, um die alkalische Hydrolyse des Istamycins A durchzuführen. Das Reaktionsgemisch wurde anschließend durch Zugabe von festem Kohlendioxid neutralisiert und anschließend filtriert. Das Filtrat wurde durch eine Kolonne geleitet, die eine einem Volumen von 3ml entsprechende Menge des Kationenaustauscherharzes Amberlite CG-50^ (NH^-Form) enthielt. Die Kolonne wurde mit 0,5n wässrigem Ammoniak eluiert. Die aktiven Fraktionen des Eluates wurden unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt. Man erhielt auf diese Weise 16 mg reines Istamycin A als farbloses kristallines Pulver.

Istamycin B (20 mg) wurde in der eben beschriebenen Weise ebenfalls der alkalischen Hydrolyse unterworfen. Man erhielt farbloses kristallines pulverförmiges reines Istamycin B_Q in einer Menge von 15 mg.

Beispiel 6

Eine Agar-Schrägbodenkultur von Streptomyces ten^imariensis SS-939 (FERM-P 4932) wurde in ein flüssiges Kulturmedium (50 1) eingeimpft, welches 1,0 % Stärke, 0,2 % Glukose, 1,0 % Sojabohnenmehl., 0,3 % Natrium-Chlorid, 0,1 % Dikaliumhydrοgenphosphat und 0,1 % Magnesiumsulfat . 7 H₂O (pH 7,0) enthielt. Das beschriebene flüssige Kulturmedium wurde in einem Gärbehälter aus rostfreiem Stahl mit einem Fassungsvermögen von 100 1 gegeben, in dem die Fermentierung dann bei 28⁰C in 24 Stunden unter Belüftung (50 1 Luft pro Minute) und Bewegung (200 Umdrehungen pro Minute) durchgeführt wurde. Ein Teil (20 1) der so gewonnenen Saatkultur wurde in einen Gärbehälter aus rostfreiem Stahl mit einem Fassungs-

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27.03.80

vermögen von 2 t eingeimpft, welcher 1000 1 eines flüssigen Kulturmediums enthielt, das einen Gehalt von 4,0 % Stärke, 0,4 % Glukose, 5,0 % Weizenkeime, 0,6 % Calciumcarbonat und 0,3 % Natriumchlorid (pH 7,0) aufwies. Die Fermentierung wurde bei 28°C in 108 Stunden unter Belüftung (800 1 Luft pro Minute) und Rühren (280 Umdrehungen pro Minute) durchgeführt.

Die so gewonnene Gärbrühe (pH 7,3) wurde durch Zugabe von Chlorwasserstoffsäure auf pH 2,0 eingestellt und dann filtriert. Das Filtrat wurde durch Zugabe von wässrigem Natriumhydroxid neutralisiert. Man erhielt auf diese Weise 850 1 Brühenfiltrat (pH 6,2; Potenz 105 mcg/ml). Dieses Brühenfiltrat wurde über eine Kolonne geleitet, welche eine einem Volumen von 55 entsprechende Menge eines Kationenaustauscherharzes, und zwar Amberlite IRC-50^-' (NH^-Form), zur Adsorption von Istamycin enthielt. Nach dem Waschen mit 300 1 Wasser wurde die Kolonne mit 1,1η wässrigem Ammoniak eluiert. Die zunächst ablaufende Flüssigkeit (38 l) wurde verworfen. Die danach ablaufende Menge (188 l) wurde aufgefangen und auf ein Volumen von 2,8 1 unter vermindertem Druck eingeengt.

Die so gewonnene konzentrierte Lösung wurde mit 475,2 g Bariumhydroxid (Ba(OHJg.8HgO) vermischt; die Mischung wurde 3 Stunden bei 110⁰C zum Rückfluß erhitzt, um so die alkalische Hydrolyse der Istamycine A und B durchzuführen. Das Reaktionsgemisch wurde neutralisiert (auf pH 7,2), und zwar durch Zugabe von 1960 ml 2n Schwefelsäure. Anschließend wurde die Mischung filtriert. Das Filtrat wurde durch eine Kolonne geleitet, die eine einem Volumen von 15 1 entsprechende Menge des Kationenaustauscherharzes Amberlite CG-50 ^(NH^-Form) zur Adsorption von Istamycin enthielt. Nach dem Waschen mit

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/ .,, 30120H

- kf - 7 r ' 27.03.80

45 1 Wasser wurde die Kolonne nacheinander mit wässrigen Lösungen von Ammoniak unterschiedlicher Konzentrationen - wie nachstehend angegeben - eluiert, wobei das Eluat in 3 1-Fraktionen aufgefangen wurde.

Fraktionen Nr. 1 - 20 mit 60 1 0,1On wässrigem Ammoniak Fraktionen Nr. 21-40 mit 60 1 0,15n wässrigem Ammoniak Fraktionen Nr. 41-60 mit 60 1 0,19n wässrigem Ammoniak Fraktionen Nr. 61-80 mit 60 1 0,26n wässrigem Ammoniak Fraktionen Nr. 81-100 mit 60 1 0,27n wässrigem Ammoniak Fraktionen Nr.101-120 mit 60 1 0,32n wässrigem Ammoniak Fraktionen Nr.121-140 mit 60 1 O,35n wässrigem Ammoniak Fraktionen Nr.141-160 mit 60 1 0,43n wässrigem Ammoniak Fraktionen Nr.i6i-180 mit 30 1 1,0On wässrigem Ammoniak.

Die Fraktionen Nr. 82-104 wurden vereinigt und unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt. Man erhielt auf diese Weise 38,05 g Istamycin A_Q als pulverförmiges Rohprodukt. Die Fraktionen Nr. 105-134 wurden ebenfalls vereinigt und unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt. Hierbei erhielt man 19,19 g Istamycin B_Q als pulverförmiges Rohprodukt.

Beispiel 7

Das pulverförmige Rohprodukt, welches aus Istamycin A_Q bestand und in einer Menge von 2,0 g gemäß Beispiel 6 erhalten worden war, wurde mit Hilfe der Säulenchromatographie gereinigt. Es wurde eine Säule mit 180 g Silikagel verwendet, die mit der unteren Phase eines Lösungsmittelgemisches aus Chloroform-Methanol-8,5%igem wässrigen Ammoniak (Volumenverhältnis 2:1:1) entwickelt wurde. Das Eluat wurde in 25 ml-Fraktionen aufgefangen. Die aktiven Fraktionen Nr. 65 bis 104 wurden vereinigt und unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt. Man erhielt auf diese Weise reines Istamycin A als farb-

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30120H

27.03.80 loses kristallines Pulver. Ausbeute 586 mg.

Das pulverförmige rohe Istamycin B_Q (2,0 g), welches gemäß Beispiel 6 erhalten worden war, wurde ebenfalls durch Säulenchromatographie an Silikagel in der vorstehend angegebenen Weise gereinigt; die einzige Ausnahme dabei war, daß das Eluat in 23 ml-Fraktionen aufgefangen wurde. Die aktiven Fraktionen Nr. 73 bis 170 wurden vereinigt und unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt. Man erhielt auf diese Weise reines

Istamycin B₀ als farbloses kristallines Pulver in einer Menge von 1369 mg.

030046/0637

Claims

.S.

27.03.80

Patentansprüche

\ 1)/lstamycinkomplex, umfassend Istamycin A der Formel H₃CNH

NH,

(D,

H₂NCH₂CON

CH,

Istamycin B der Formel

NH,

(II),

H₂NCH₂CON

^0CH

030046/0837

ORIGINAL INSPECTED

27.03.80

30Ί20Η

Istamycin A der Formel

CH₂NHCH₃
0

(III)

OCH.

oder der Formel

CH₂NHCH₃

(IV)

OCH,

030046/0637

27.03.80

3012QH

und Istamycin B der Formel
CH₂NHCH₅

(ν)

einschließlich der Säureanlagerungssalze derselben.
2) Verbindung gemäß Anspruch 1, nämlich Istamycin A oder ein Säureanlagerungssalz derselben.
3) Verbindung gemäß Anspruch 1, nämlich Istamycin B oder ein Säureanlagerungssalz derselben.
4) Verbindung gemäß Anspruch 1, nämlich Istamycin A oder ein Säureanlagerungssalz derselben.
5) Verbindung gemäß Anspruch 1, nämlich Istamycin B oder ein Säureanlagerungssalz derselben.
6) Verfahren zur Herstellung des als Antibiotikum wirksamen Istamycin-Komplexes, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Istamycin erzeugenden Stamm von Streptomyces unter aeroben Bedingungen in einem Kulturmedium, welches Kohlenstoff- und Stickstoffquellen enthält, züchtet, bis sich eine ausreichende Menge Istamycin in demselben angesammelt hat.

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27.03.80
7) Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet; daß man den Istamycin-Komplex aus dem Kulturmedium abtrennt.
8) Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man als Istamycin erzeugenden Stamm Streptomyces tenjimariensis SS-939, welcher durch die Hinterlegungsnummern FERM-P 4932 bzw. ATCC 31603 gekennzeichnet ist, verwendet.
9) Verfahren zur Herstellung von Istamycin A, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Istamycin A erzeugenden Stamm von Streptomyces unter aeroben Bedingungen in einem Kulturmedium, welches Kohlenstoff- und Stickstoffquellen enthält, züchtet, bis sich eine ausreichende Menge an Istamycin A in dem Kulturmedium angesammelt hat.
10) Verfahren zur Herstellung von Istamycin B, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Istamycin B erzeugenden Stamm von Streptomyces unter aeroben Bedingungen in einem Kulturmedium, welches Kohlenstoff- und Stickstoffquellen enthält, züchtet, bis sich eine ausreichende Menge an Istamycin B in dem Kulturmedium angesammelt hat.
11) Verfahren zur Herstellung Istamycin A_Q, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Istamycin A erzeugenden Stamm von Streptomyces unter aeroben Bedingungen in einem Kulturmedium, welches Kohlenstoff- und Stickstoffquellen enthält, züchtet, bis sich eine ausreichende Menge an Istamycin A_Q in dem Kulturmedium angesammelt hat.

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-5 27.03.80

30120U
12) Verfahren zur Herstellung von Istamycin B_Q, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Istamycin B erzeugenden Stamm von Streptomyces unter aeroben Bedingungen in einem Kulturmedium, welches Kohlenstoff- und Stickstoffquellen enthält, züchtet, bis sich eine ausreichende Menge an Istamycin B in dem Kulturmedium angesammelt hat.
13) Verfahren nach den Ansprüchen 9,10, 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Züchtung den Stamm Streptomyces tenjimariensis SS-939 verwendet.
14) Verfahren nach Anspruch 9, 10, 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, daß man jeweils Istamycin A, Istamycin B, Istamycin A_Q oder Istamycin B aus dem Medium abtrennt.
15) Verfahren zur Herstellung von Istamycin A aus Istamycin A, dadurch gekennzeichnet, daß man Istamycin A unter alkalischen Bedingungen hydrolysiert.
16) Verfahren zur Herstellung von Istamycin B_Q aus Istamycin B, dadurch gekennzeichnet, daß man Istamycin B unter alkalischen Bedingungen hydrolysiert.
17) Arzneimittel, enthaltend eine antibakteriell wirksame Menge an wenigstens einer der Verbindungen Istamycin A, Istamycin B oder einem pharmazeutisch akzeptablen Säureanlagerungssalz derselben in Kombination mit einem pharmazeutisch akzeptablen Trägermaterial.
18) Verwendung des Arzneimittels gemäß Anspruch 17 zur Verhinderung des Bakterienwachstums bei Tieren.

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- 4^ -Jb 27.03.80
19) Neuer Mikroorganismus, nämlich Streptomyces tenjimariensis SS-939, gekennzeichnet durch die Hinterlegungsnummern FERM-P 4932 und ATCC Nr. 31603.

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