DE2839668C2

DE2839668C2 -

Info

Publication number: DE2839668C2
Application number: DE2839668A
Authority: DE
Inventors: Tadashi Tokio/Tokyo Jp Arai
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1977-09-12
Filing date: 1978-09-12
Publication date: 1987-08-13
Also published as: FR2402665B1; FR2402665A1; DE2839668A1; JPS5444098A; IT7869099A0; US4248863A; GB2003853B; JPS5937952B2; GB2003853A; IT1108793B

Description

Die Erfindung betrifft neue antibiotisch wirksame Substanzen, nämlich Saframycin A, B, C, D und E, sowie ein Verfahren zu ihrer Herstellung und ein bestimmtes Arzneimittel (vgl. die Patentansprüche).

Bisher wurde über die Isolierung von etwa 3000 verschiedenen Arten antibiotisch wirksamer Substanzen berichtet. Wegen des Auftretens von Mikroorganismen, die resistent gegen gebräuchliche Antibiotika sind, sowie durch das Auftreten von neuen Infektionskrankheiten, das durch die verbreitete Anwendung von Antibiotika mit breitem antibakteriellem Spektrum, von Steroidhormonen, Antitumormitteln oder Immunsuppressoren verursacht wird, besteht jedoch ein steigendes Bedürfnis nach neuen antibiotisch wirksamen Substanzen.

Die Anmelderin hat bereits gefunden, daß Streptomyces lavendulae befähigt ist, einige antibiotisch wirksame Substanzen, Mimosamycin und Chlorocarcine A, B und C zu bilden (japanische Patentanmeldung Nr. 1 13 289/1975, offengelegt unter der Nummer 38 094/1977; DE-OS 26 41 908).

Der Erfindung liegen nun weitere Untersuchungen über Produkte zugrunde, die durch Züchtung von Actinomyceten erhalten werden konnten, wobei gefunden wurde, daß Actinomyceten, die zur Bildung von bekannten antibiotisch wirksamen Substanzen befähigt sind, darüber hinaus neue und wertvolle antibiotisch wirksame Substanzen, die Saframycine A, B, C, D und E bilden, und daß speziell Streptomyces lavendulae Stamm Nr. 314 diese antibiotisch wirksamen Substanzen mit hohem Aktivitätsgrad bildet.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, neue antibiotisch wirksame Substanzen zur Verfügung zu stellen, die wertvolle biologische Aktivität zeigen.

Ferner ist es Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zur fermentativen Herstellung dieser Antibiotika zu schaffen.

Gegenstand der Erfindung ist eine neue Gruppe antibiotisch wirksamer Substanzen, die als Saframycine A, B, C, D und E bezeichnet werden und die antibakterielle Aktivität hauptsächlich gegen gram-positive Bakterien und Antitumoraktivitäten besitzen; Gegenstand der Erfindung ist außerdem ein Verfahren zur Herstellung dieser antibiotisch wirksamen Substanzen (vgl. die Patentansprüche 1 bis 6).

Der erfindungsgemäß verwendete Mikroorganismus, Streptomyces lavendulae Stamm Nr. 314, wurde aus einer bei Kyoto gewonnenen Bodenprobe isoliert und gehört dem Genus Streptomyces an. Dieser Stamm ist unter der Hinterlegungsnummer 3218 bei dem Technical Research Institute of Microbial Industry, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, Japan hinterlegt worden.

Der bei FRI unter der Bezeichnung FERM-P 3218 hinterlegte Stamm wurde am 23. 2. 1987 in die Internationale Hinterlegungsstelle des FRI überführt und ist dort unter der Bezeichnung FERM BP-1300 hinterlegt.

Die Beobachtung der Luftmycels und der Sporen von Streptomyces lavendulae Stamm Nr. 314 erfolgte durch Züchtung des Stammes auf den Medien gemäß den Methoden des International Streptomyces Project (ISP) (Shirling, E.B. & D. Gottlieb; International J. Systematic Bacteriol. 16, 313-340, 1966); nämlich durch Züchtung auf Agarplatten mit einem Hefe-Stärke-Agar-Medium, anorganische Salze enthaltendem Stärke-Agar-Medium und Maltose enthaltendem Basalmedium für die Bestimmung des Kohlenstoffquellen- Ausnutzungsschemas (Agarmedium nach Pridham-Gottlieb) bei 27°C während 1 bis 2 Wochen. Außerdem wurde die Farbe des Mycels mit reifen Sporen, des vegetativen Mycels und anderer entsprechend der Farbplättchennummer bestimmt, die in "Descriptive Colar Name Dictionary", Container's Corporation of America, 1950 und "Color Harmony Manual", Container's Corporation of America, 1958, angegeben ist.

Der Stamm Nr. 314 entwickelt ein wellenförmig gefaltetes Luftmycel mit langer Verästelung in einem Durchmesser von etwa 0,6 bis 1,0 μm mit zahlreichen zylindrischen Sporen. Die Sporen haben eine Größe von 0,6 bis 1,0 μm × 0,8 bis 2,0 μm. Nach dem Standard gemäß ISP wird ein Stamm mit den vorstehend angegebenen morphologischen Eigenschaften in die Abteilung Rectiflexibiles eingeordnet. Die Lufthyphen haben jedoch Schleifen oder unvollständige oder langgestreckte Spiralen, die in Form von Spulen mit 1 bis 2 Windungen aufgewickelt sind. Der Stamm Nr. 314 wurde daher morphologisch in die Abteilung Retinaculiaperti eingeordnet. Wenn die Sporenoberfläche auf diesen Medien unter dem Elektronenmikroskop beobachtet wird, so zeigt sich, daß die Sporen des Stammes eine glatte Oberfläche haben. Die Haupteigenschaften des Stammes Nr. 314 bestehen darin, daß die Lufthyphen morphologisch der Abteilung Retinaculiaperti entsprechen, die Farbe der Lufthyphen mit reifen Sporen rosa bis lavendelfarben auf verschiedenen Medien ist, die Farbe des vegetativen Mycels auf einem synthetischen Medium manchmal blau bis bläulich-braun ist und daß die Bildung von Melaninpigment positiv ist. Bei einem Vergleich mit den Stämmen des Genus Streptomyces, die in "The Actinomycetes", S.A. Waksman, Vol. 2, 1959 und "Bergey's Determinative Bacteriology", 8. Auflage, 1974, beschrieben sind, wurde angenommen, daß der Stamm weitgehende Ähnlichkeit mit Streptomyces lavendulae hat. Der Stamm Nr. 314 wird in ein übliches Medium zur Bildung einer antibiotisch wirksamen Substanz eingeimpft und die Schüttelkultur wird bei 27°C während einer Züchtungsdauer von 18 bis 72 Stunden durchgeführt. Dabei wird ein Kulturfiltrat erhalten, welches hohe Aktivität gegen coliforme Bazillen hat. Das so erhaltene Filtrat wird unter alkalischen Bedingungen mit Aktivkohle behandelt, mit angesäuertem Aceton eluiert oder an einem schwachen Kationenaustauscherharz, beispielsweise Amberlite IRC-50 adsorbiert und mit 0,1 n Chlorwasserstoffsäure desorbiert, wobei eine gegen coliforme Bazillen wirksame antibakterielle Substanz erhalten wird. Die so erhaltene Substanz wird dann durch Chromatographie, beispielsweise an Amberlite CG-50 gereinigt und in Form ihres Reinecke-Salzes oder Picrats kristallisiert, wonach diese Substanz als Streptothricin identifiziert werden kann.

Außerdem wurde ein Vergleich der Kultureigenschaften und physiologischen Eigenschaften unter Verwendung von Streptomyces lavendulae IFM 1031, eines Streptothricin-bildenden Stammes, Streptomyces racemochromogenes IFM 1081, der als identisch mit Streptomyces lavendulae angesehen wird und zur Bildung von Streptothricin befähigt ist, und des erfindungsgemäß verwendeten Stammes zur endgültigen Identifizierung durchgeführt.

Die Ergebnisse sind in Tabelle 1, 2 und 3 zusammengefaßt. Dabei zeigte sich, daß der Stamm Nr. 314 in jeder charakteristischen Eigenschaft, die zur Zeit zur Identifizierung eines Stammes des Genus Streptomyces herangezogen wird, mit Streptomyces lavendulae identisch ist, wenn auch geringe Unterschiede in mancher Hinsicht beobachtet werden, beispielsweise im Hinblick auf die Ausnutzung von L-Arabinose und dergleichen. Der Stamm wurde daher als Streptomyces lavendulae identifiziert. Auch Streptomyces racemochromogenes kann Streptothricin bilden, dieser Stamm ist jedoch aufgrund des vorher beschriebenen Vergleichsergebnisses offensichtlich verschieden von dem Stamm Nr. 314, der ein Streptomyces lavendulae-Stamm ist.

Tabelle 1

Vergleich von Streptomyces Stamm Nr. 314 mit bekannten Stämmen - (1)

Tabelle 1 (Fortsetzung)

Vergleich von Streptomyces Stamm Nr. 314 mit bekannten Stämmen - (2)

Tabelle 2

Vergleich der physiologischen Eigenschaften von Streptomyces Stamm Nr. 314 und bekannter Stämme

Tabelle 3

Vergleich des Kohlenstoffquellen-Ausnutzungsschemas von Streptomyces lavendulae Stamm Nr. 314 und bekannter Stämme

Der Saframycin-Komplex, der erfindungsgemäß hergestellt werden kann, ist bisher noch nicht aus einer Kulturbrühe der vorstehend beschriebenen, gut bekannten Mikroorganismen von Streptomyces lavendulae isoliert worden.

Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens kann der Saframycin- Komplex durch Züchtung von Streptomyces lavendulae Stamm Nr. 314 gebildet werden.

Die Züchtung kann prinzipiell nach üblichen Kulturverfahren für einen Mikroorganismus durchgeführt werden, es ist jedoch gewöhnlich günstig, eine Submerskultur in einem flüssigen Medium durchzuführen. Als Medium, welches sich für die Zwecke der Erfindung eignet, kann jedes beliebige Medium eingesetzt werden, welches die Nährstoffe enthält, die der Stamm Nr. 314 des Genus Streptomyces ausnutzen kann. Genauer gesagt, lassen sich synthetische, halbsynthetische oder natürliche Medien einsetzen und als Beispiele für die Bestandteile des Mediums sind folgende Substanzen zu erwähnen: Eine Kohlenstoffquelle, wie Glucose, Maltose, Fructose, Xylose, Stärke, Glycerin und dgl.; eine Stickstoffquelle, wie Fleischextrakt, Pepton, Glutenmehl, Baumwollsamenöl, Sojabohnenmehl, Maisquellwasser, Trockenhefe, Hefeextrakt, Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Harnstoff und andere organische oder anorganische Stickstoffquellen. Carbonate, Phosphate oder andere Salze von Metallen können zusätzlich dem Medium einverleibt werden. Falls während der Züchtung übermäßiges Schäumen beobachtet wird, ist es vorteilhaft, dem Medium ein Antischaummittel zuzusetzen, wie ein Pflanzenöl, beispielsweise Sojabohnenöl, oder ein Siliconöl, Polyoxyalkylene oder deren Derivate, Mineralöle und dgl.

Die Züchtungstemperatur liegt gewöhnlich innerhalb eines Bereiches von 27 bis 30°C. Da das Volumen des Mediums sich erhöht, ist es vorteilhaft, eine Impfkultur anzulegen und danach die Impfkultur in ein Medium einzuimpfen. Die Züchtungsdauer beträgt gewöhnlich etwa 18 Stunden bis etwa 24 Stunden.

Die vorstehend angegebenen Kulturbedingungen können in Abhängigkeit von dem zur Herstellung der erfindungsgemäßen Antibiotika verwendeten Mikroorganismen im Hinblick auf optimale Ergebnisse ausgewählt und angewendet werden.

Die bei diesem Verfahren in der Kulturbrühe angereicherten antibiotisch wirksamen Substanzen befinden sich gewöhnlich innerhalb des Mycels und in der Kulturflüssigkeit und werden aus dem durch Zentrifugieren oder Filtration gewonnenen Mycel und dem so erhaltenen Filtrat extrahiert. Dabei können im einzelnen die erfindungsgemäßen antibiotisch wirksamen Substanzen mit Hilfe üblicher Verfahrensweisen isoliert, gewonnen und gereinigt werden, die gewöhnlich zur Herstellung eines Naturprodukts angewendet werden, beispielsweise durch Ausnutzung der Löslichkeit und der Löslichkeitsunterschiede in geeigneten Lösungsmitteln, der Abtrennbarkeit und des Unterschiedes der Abtrennungsrate aus einer Lösung, der Differenz in der Absorption an und der Affinität gegenüber verschiedenen Adsorptionsmitteln, der Differenz in der Verteilung zwischen zwei flüssigen Phasen und dgl. Diese Verfahren können gewünschtenfalls jeweils einzeln oder wahlweise in Kombination mehrerer Verfahren oder auch wiederholt angewendet werden. Ein beispielhaftes Verfahren wird nachstehend erläutert.

Nach Beendigung der Züchtung wird die Kulturbrühe filtriert, um die Mycelien von dem Filtrat abzutrennen. Das Filtrat wird mit 10 n Natriumhydroxidlösung auf einen pH-Wert von 8,0 eingestellt. Das Filtrat kann vorher auf die Hälfte bis ein Drittel seines Volumens konzentriert werden, um eine bessere Extraktionswirksamkeit bei der Extraktion mit einem Lösungsmittel zu erreichen. Bei der vorstehend erwähnten Lösungsmittelextraktion verbleiben basische wasserlösliche Antibiotika, beispielsweise Streptothricin, welches gleichzeitig durch den Stamm Nr. 314 gebildet wird, in dem Filtrat, während der Saframycin-Komplex und dergleichen in die Lösungsmittelphase extrahiert wird. Die Lösungsmittelphase wird unter vermindertem Druck zur Trockene konzentriert, das Konzentrat wird in einer geringen Menge Äthylacetat gelöst, die Lösung wird mit wäßrigem Natriumcarbonat geschüttelt und die wäßrige Schicht abgetrennt, wobei die sauren Substanzen in die wäßrige Phase übergehen. Die Lösungsmittelphase wird mit 1 n Chlorwasserstoffsäure extrahiert, mit wäßrigem Ammoniak auf einen pH-Wert von 9 bis 10 eingestellt und mit Chloroform extrahiert. Diese Stufe wird mehrere Male wiederholt und die Lösungsmittelphase wird unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft, wobei eine rohe basische Komponente erhalten wird, welche den Saframycin-Komplex enthält. Diese Komponente wird der Säulenchromatographie an Silicagel mit Hilfe eines Gemisches aus Benzol und Äthylacetat unterworfen, wobei eine überwiegend Saframycin A enthaltende Fraktion erhalten wird. Die so erhaltenen Fraktionen werden der Säulenchromatographie an Sephadex LH-20 mit Methanol als Elutionsmittel unterworfen, wobei Saframycin A in Form eines gelben Sirups erhalten wird, welches dann mit kaltem Äther behandelt wird und dabei in Form eines gelben Pulvers gewonnen wird.

Die zuerst eluierte Chromatographiekolonne wird weiter mit einem Gemisch aus Äthylacetat und Methanol eluiert, wobei eine Fraktion erhalten wird, die hauptsächlich die Saframycine B, C, D und E enthält. Die so erhaltenen Fraktionen werden zur Trockene eingedampft, wobei ein Gemisch der Saframycine B, C, D und E erhalten wird. Dieses wird dann durch Säulenchromatographie an Silicagel gereinigt und schließlich der nachfolgenden Säulenchromatographie an Sephadex LH-20 unter Verwendung von Methanol als Elutionsmittel unterworfen, wobei die Saframycine B, C, D und E in Form eines gelben Pulvers erhalten werden. Aus der Lösung in Äther werden die Saframycine B, C und D in Form von orange-gelben Prismen, orange-roten Nadeln bzw. gelben Nadeln erhalten. Saframycin E wird durch Elution mit Aceton in Form eines gelben Pulvers erhalten.

Die Saframycine A, B, C, D und E sind basische antibiotisch wirksame Substanzen und sind somit zur Bildung von entsprechenden Säureadditionssalzen befähigt, die ebenfalls von der Erfindung umfaßt werden. Zu typischen Beispielen für solche Säureadditionssalze gehören Salze mit Chlorwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Stearinsäure, Propionsäure, Weinsäure, Maleinsäure und ähnlichen Säuren. Wie zu erwarten ist, besitzen derartige Salze die gleiche antibiotische Wirksamkeit wie die freien antibiotisch wirksamen Substanzen, wenn auch gewöhnlich Unterschiede im Hinblick auf die Aktivität und die Löslichkeitseigenschaften bestehen.

Die physikalisch-chemischen Eigenschaften der Saframycine A, B, C, D und E werden nachstehend zusammengefaßt.

A. Physikalisch-chemische Eigenschaften von Saframycin A

1.) Farbe und Aussehen: Gelbes Pulver in Form der Base Saframycin A
2.) Schmelzpunkt: 122-126°C
3.) Elementaranalyse:
C: 61,47%, H: 5,41%, N: 9,33%
4.) Molekulargewicht (Massenspektrum): 562
5.) Empirische Formel:
C₂₉H₃₀N₄O₈ · 2/5H₂O
6.) Spezifische Drehung:
7.) Ultraviolett-Absorptionsspektrum (in Fig. 1 gezeigt):
8.) Infrarot-Absorptionsspektrum (in Fig. 2 gezeigt):
9.) NMR-Spektrum (CDCl₃) (in Fig. 3 gezeigt):
δ: 1,90 (3H, s), 1,98 (3H, s), 2,24 (3H, s), 2,30 (3H, s), 4,04 (6H, s), 6,65 (3H, bs).
10.) Löslichkeit:
leicht löslich in Estern, Chloroform, Aceton, Alkoholen;
mäßig löslich in Äthyläther;
unlöslich in Wasser und n-Hexan
11.) Farbreaktion:
positive Dragendorff-Reaktion; negative Ninhydrin-, Perchlor-Eisen- und Anthron-Reaktion.

B. Physikalisch-chemische Eigenschaften von Saframycin B-Base

1.) Farbe und Aussehen: Orangegelbe Prismen
2.) Schmelzpunkt: 108-109°C
3.) Elementaranalyse:
C: 62,36%, H: 5,71%, N: 7,66%
4.) Molekulargewicht (Massenspektrum): 537
5.) Empirische Formel:
C₂₈H₃₁N₃O₈
6.) Spezifische Drehung:
7.) Ultraviolett-Absorptionsspektrum (in Fig. 4 gezeigt):
8.) Infrarot-Absorptionsspektrum (in Fig. 5 gezeigt):
9.) NMR-Spektrum (CDCl₃) (in Fig. 6 gezeigt):
δ: 1,90 (3H, s), 1,98 (3H, s) 2,23 (3H, s), 2,28 (3H, s), 4,00 (6H, s), 6,28 (1H, bs).
10.) Löslichkeit:
leicht löslich in niederen Alkoholen, Chloroform, Estern, Aceton, Benzol;
mäßig löslich in Äthyläther;
unlöslich in Wasser, n-Hexan
11.) Farbreaktion:
positive Dragendorff- und Meyer-Reaktion;
negative Ninhydrin- und Ehrlich-Reaktion.

C. Physikalisch-chemische Eigenschaften von Saframycin C-Base

1.) Farbe und Aussehen: Orangerote Nadeln
2.) Schmelzpunkt: 143-146°C
3.) Elementaranalyse:
C: 61,61%, H: 5,96%, N: 7,39%
4.) Molekulargewicht (Massenspektrum): 567
5.) Empirische Formel:
C₂₉H₃₃N₃O₉
6.) Spezifische Drehung:
7.) Ultraviolett-Absorptionsspektrum (in Fig. 7 gezeigt):
8.) Infrarot-Absorptionsspektrum (in Fig. 8 gezeigt):
9.) NMR-Spektrum (CDCl₃) (in Fig. 9 gezeigt):
δ: 1,86 (3H, s), 2,00 (3H, s), 2,38 (3H, s), 2,44 (3H, s), 3,46 (3H, s), 3,96 (3H, s), 6,60 (1H, bs)
10.) Löslichkeit:
leicht löslich in niederen Alkoholen, Chloroform, Estern, Aceton, Benzol;
mäßig löslich in Äthyläther;
unlöslich in Wasser, n-Hexan
11.) Farbreaktion:
Positive Dragendorff- und Meyer-Reaktion,
negative Ninhydrin- und Ehrlich-Reaktion

D. Physikalisch-chemische Eigenschaften von Saframycin D

1.) Farbe und Aussehen: Gelbe Nadeln
2.) Schmelzpunkt: 150-154°C
3.)Elementaranalyse:
C: 60,48%, H: 5,68%, N: 7,59%
4.) Molekulargewicht (Massenspektrum): 553
5.) Empirische Formel:
C₂₈H₃₁N₃O₉
6.) Spezifische Drehung:
7.) Ultraviolett-Absorptionsspektrum (in Fig. 10 gezeigt):
8.) Infrarot-Absorptionsspektrum (in Fig. 11 gezeigt):
9.) NMR-Spektrum (CDCl₃) (in Fig. 12 gezeigt):
δ: 1,91 (3H, s), 2,17 (3H, s), 2,28 (3H, s), 2,45 (3H, s), 3,97 (3H, s), 4,06 (3H, s)
10.) Löslichkeit:
leicht löslich in niederen Alkoholen, Chloroform, Pyridin;
mäßig löslich in Estern, Aceton, Äthyläther;
unlöslich in Wasser, n-Hexan
11.) Farbreaktion:
Positive Dragendorff-Reaktion

E. Physikalisch-chemische Eigenschaften von Saframycin E

1.) Farbe und Aussehen: Gelbes Pulver
2.) Schmelzpunkt: 146-148°C
3.) Elementaranalyse:
C: 58,52%, H: 5,89%, N: 7,36%
4.) Molekulargewicht (umgerechnet aus dem aus dem Massenspektrum erhaltenen Wert des entsprechenden Triacetylderivats): 555
5.) Empirische Formel:
C₂₈H₃₃N₃O₉ · H₂O
6.) Spezifische Drehung:
7.) Ultraviolett-Absorptionsspektrum (in Fig. 13 gezeigt):
8.) Infrarot-Absorptionsspektrum (in Fig. 14 gezeigt):
9.) NMR-Spektrum (d-5-Pyridin) (in Fig. 15 gezeigt):
w: 1,83 (3H, s), 2,17 (3H, s), 2,30 (3H, s), 2,48 (3H, s), 3,82 (3H, s), 3,95 (3H, s),
5,22 (1H, s)
10.) Löslichkeit:
leicht löslich in niederen Alkoholen, Pyridin;
mäßig löslich in Aceton, Estern, Chloroform;
unlöslich in Wasser, n-Hexan
11.) Farbreaktion:
Positive Dragendorff-Reaktion

Die biologischen Aktivitäten der Saframycine A, B, C, D und E bestehen in einer antibakteriellen und Antitumor-Aktivität; diese Verbindungen können daher als Arzneimittel verwendet werden. Die antibakteriellen Spektren der Saframycine A, B, C, D und E sind in Tabelle 4 aufgeführt. Die Antibiotika zeigen antibakterielle Aktivität hauptsächlich gegen grampositive Bakterien, jedoch in geringem Maß gegen die meisten gramnegativen Bakterien. Bei kultivierten Zellen der L 1210-Leukämie der Maus kann Saframycin A das Zellwachstum in einer Konzentration von 0,02 μg/ml, Saframycin B in einer Konzentration von 5 μg/ml und die Saframycine C, D und E bei 20 μg/ml vollständig inhibieren.

In der nachstehenden Tabelle 4 sind die inhibierenden Mindestkonzentrationen der Saframycine gezeigt.

Tabelle 4

Antimikrobielles Spektrum der Saframycine A, B, C, D und E

Verwendetes Medium und Kulturbedingungen:
1% Glucose enthaltender Nähragar (3% Glycerin enthaltender Nähragar für säurefeste Bakterien, Blutagar für Streptococcus pyogenes und Brucella abortus);
37°C, 24 oder 48 Stunden.
Sabouraud-Dextrose-Agar für Fungi, 27°C, 48 Stunden (72 Stunden für Trichophyton mentagrophytes).

Die Saframycine A, B, C, D und E sind Substanzen mit relativ geringer Toxizität, die von Mäusen mit einem durchschnittlichen Körpergewicht von 18 bis 20 g bei intravenöser Injektion von Saframycin A toleriert werden und bei der genannten Verabreichung einen Wert LD₅₀ = 12 mg/kg, bei intraperitonealer Injektion einen Wert LD₅₀ = 40 mg/kg und bei intraperitonelaer Injektion von Saframycin B, C, D oder E einen Wert LD₅₀ von 250 mg/kg zeigen.

Da Saframycin A die Substanz mit der stärksten biologischen Aktivität darstellt, wurde ihre Antitumor-Wirksamkeit weiter untersucht, wie nachstehend erläutert wird. Mäusen des Stammes DDY wurden 1 × 10⁵ Zellen von Ehrlich-Ascites-Tumor implantiert und die so behandelten Mäuse wurden 4 Tage lang, beginnend 24 Stunden nach der Tumor-Implantation, durch tägliche intraperitoneale Behandlung mit Saframycin A in einer Dosis von 0,5 mg/kg behandelt. Dabei wurden 30% der Mäuse geheilt und überlebten länger als 30 Tage. Bei einer Dosis von 1,0 mg/kg wurden 60% der Mäuse geheilt.

Die Wirkung von Saframycin A durch intraperitoneale Behandlung der lymphozytischen Leukämie L 1210 der Maus und der lymphoiden Leukämie P 388 der Maus wurden an BDF₁-Mäusen untersucht. Wenn die Behandlung mit Saframycin A 3 Stunden nach der intraperitonealen Implantation von 1 × 10⁵ Zellen des L 1210-Tumors begonnen wurde, führte Saframycin A in einer Tagesdosis von 1,5 mg/kg während zwei Tagen zu einem Wert T/C (Überlebens-Zeit der behandelten Gruppe zur Überlebenszeit der Kontrollprobe) von 183%. Bei P 388-Tumor wurde ein Implantat von 1 × 10⁶ Zellen angewendet und die Behandlung wurde nach 24 Stunden begonnen. Saframycin A in einer Tagesdosis von 0,75 mg/kg während 10 Tagen führte zu einem Wert T/C von 219%.

Danach wurde die Wirkung von Saframycin A gegen menschliche Tumoren geprüft, wofür zwei Linien des Cervixkarzinoms des Uterus, Melanom, Oat-Cell-Karzinom und Magenkarzinom verwendet wurden, die durch Heterotransplantation auf Nacktmäuse übertragen wurden. Es wurde gefunden, daß Saframycin A selektive Aktivität gegenüber Cervixkarzinom und Magenkarzinom besitzt und eine Inhibierung des Tumorwachstums und wesentliche histologische Veränderungen des Tumorgewebes verursacht.

Prüfung

Die antibakterielle Aktivität während der Züchtungs- und Extraktionsverfahren wird mit Hilfe der Agarplatten-Scheibenmethode unter Verwendung von Bacillus subtilis PCI 219 geprüft. Die Prüfung von Streptothricin erfolgt unter Verwendung von Escherichia coli Stamm F₁, da der Stamm Nr. 314 dieses Antibiotikum in großer Menge bilden kann. Das gemeinsame Vorliegen von Streptothricin läßt sich leicht durch Bestimmung der antibakteriellen Aktivität gegenüber E. coli nachweisen, da der Saframycin-Komplex, d. h. die in ein Lösungsmittel extrahierte Fraktion, keine Aktivität gegen E. coli zeigt.

Einige Ausführungsformen des Herstellungsverfahrens der erfindungsgemäßen antibiotisch wirksamen Substanzen werden nachstehend anhand der Beispiele gezeigt.

Beispiel 1 Schüttelkultur in Kolben A. Impfkultur

Eine Suspension eines gefriergetrockneten Präparats von Streptomyces lavendulae Stamm Nr. 314 in physiologischer Kochsalzlösung wurde hergestellt und auf Schrägagar mit der nachstehenden Zusammensetzung aufgeimpft:

Glucose 10 g L-Asparagin 5 g KH₂PO₄ 5 g Agar 15 g Leitungswasser1000 ml pH-Wert6,8-7,0

Die Züchtung wurde eine Woche lang bei 27°C durchgeführt, wobei eine Impfkultur mit reichlichem Wuchs und zahlreichen Sporen erhalten wurde.

B. Fermentation

100 Schüttelkolben, die jeweils ein Fassungsvermögen von 500 ml hatten und 100 ml des nachstehend definierten Kulturmediums enthielten, wurden unter aseptischen Bedingungen mit den aus der vorstehenden Impfkultur gewonnenen Sporen in einer Menge von zwei Ösen pro Flasche beimpft.

Glucose 1,0 g Stärke 10,0 g Polypepton 10,0 g Fleischextrakt 5,0 g NaCl 3,0 g Silicon KM 72 10 ml Leitungswasser1000 ml pH-Wert 7,0

Die Züchtung wurde 40 Stunden lang bei 27°C mit Hilfe einer hin- und hergehenden Schüttelvorrichtung (125 Ausschläge pro Minute, Amplitude 8 cm) durchgeführt.

Nach beendigter Züchtung wurde der Inhalt der Kolben kombiniert und das Mycel wurde mit Hilfe eines kontinuierlichen Zentrifugalabscheiders abgetrennt. Der so erhaltene überstehende Anteil (10 l) wurde auf einen pH-Wert von 8,0 eingestellt und dann 3mal mit je einem drittel Volumenteil Chloroform extrahiert.

Die Extrakte wurden kombiniert, durch Filterpapier filtriert und danach unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft, wobei 2,8 g einer dunkelbraunen festen Substanz erhalten wurden. Eine Lösung der Substanz in 50 ml Äthylacetat wurde mit 25 ml 1 n Natriumcarbonat geschüttelt, um saure Substanzen zu entfernen. Die organische Schicht wurde 5mal mit Anteilen von je 25 ml 1 n Chlorwasserstoffsäure extrahiert. Die Äthylacetatschicht wurde zur Trockene konzentriert, wobei 220 mg eines neutralen Rohextrakts erhalten wurden. Die kombinierten wäßrigen Schichten wurden mit wäßrigem Ammoniak auf einen pH-Wert von 8 bis 9 eingestellt und 5mal mit jeweils gleichen Anteilen an Chloroform extrahiert. Die organischen Schichten wurden kombiniert und erneut unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft, wobei 91 mg eines basischen Rohextrakts erhalten wurden, der den Saframycin-Komplex enthielt.

Der neutrale Rohextrakt (220 mg) wurde unter Verwendung von 6 g Silicagel (Siebgröße 70-230 Maschen; 62 μm bis 210 μm) unterworfen und die Elution erfolgte mit Äthylacetat : Benzol (1 : 4), wobei 110 mg der Fraktion erhalten wurden, die vorherrschend Saframycin A enthielten.

Diese wurden der Säulenchromatographie unter Verwendung von Sephadex LH-20 und von Methanol als Elutionsmittel unterworfen, wobei 18 mg Saframycin A als rohe pulverförmige Substanz erhalten wurde.

Der basische Rohextrakt (91 mg) wurde an 3 g Silicagel (Siebgröße 70-230 Maschen; 62 μm bis 210 μm) der Säulenchromatographie unterworfen und die Säule wurde nacheinander mit Äthylacetat : Benzol (1 : 4), (1 : 1), Äthylacetat und 5% Methanol enthaltendem Äthylacetat entwickelt, wobei nacheinander die Saframycine A, D, C, B und E erhalten wurden. Jede Fraktion wurde der Säulenchromatographie an Sephadex LH-20 unter Verwendung von Methanol als Elutionsmittel unterworfen, um den Hauptteil der Verunreinigungen zu entfernen. Die Saframycin A- Fraktion und das vorstehend erwähnte rohe Pulver von Saframycin A wurden kombiniert und wiederholt der Säulenchromatographie an Silicagel (Siebgröße 230 Maschen, entsprechend 62 μm) unterworfen, wobei 11 mg reines pulverförmiges Saframycin A erhalten wurden. Die Fraktionen, welche jeweils die pulverförmigen rohen Saframycine B, C und D enthielten, wurden wiederholt der Säulenchromatographie am Silicagel (230 Maschen, entspr. 62 μm) unterworfen, wobei 41 mg Saframycin B, 18 mg Saframycin C und 6 mg Saframycin D jeweils in Form einer pulverförmigen Rohsubstanz erhalten wurden. Die pulverförmigen Rohsubstanzen wurden aus kaltem Äther umkristallisiert, wobei 21 mg, 8 mg bzw. 3 mg der kristallinen Saframycine B, C bzw. D erhalten wurden. Die Saframycin E enthaltende Fraktion wurde erneut der Säulenchromatographie an Sephadex LH-20 und der anschließenden Säulenchromatographie an Silicagel (Siebgröße 230 Maschen, entsprechend 62 μm) mehrmals unterworfen, wobei 18 mg Saframycin E in Form einer pulverförmigen Rohsubstanz erhalten wurden, die dann aus Aceton umkristallisiert wurde, so daß 3 mg reines Saframycin E in Form eines Pulvers erhalten wurden.

Beispiel 2 Fermentation in Krug-Fermentern

A. Eine Impfkultur wurde in gleicher Weise wie in Beispiel 1 hergestellt, mit der Abänderung, daß die Züchtung 24 Stunden lang durchgeführt wurde.

B. Vier Krug-Fermenter, die jeweils ein Volumen von 20 l hatten und 15 l des nachstehend angegebenen Kulturmediums enthielten, wurden unter Druck in üblicher Weise sterilisiert.

Glucose 5,0 g Stärke 5,0 g Polypepton 10,0 g Fleischextrakt 5,0 g NaCl 3,0 g Leitungswasser1000 ml pH-Wert7,0-7,2

Die Züchtung wurde 18 Stunden lang unter folgenden Bedingungen fortgesetzt:

Impfkultur1% Züchtungstemperatur27°C Rühren550 Upm Strömungsrate der aseptischen Luft1 Volumen Medium pro Minute Antischaummittel (Silicon KM 72)bei Bedarf zugesetzt

Nach Ablauf der vorstehend angegebenen Zeit war die Maximalkonzentration des gebildeten Saframycin-Komplexes erhalten worden und danach nahm der Titer rasch ab. Der pH-Wert der Kulturbrühe fiel unter 6,0 ab und stieg danach auf etwa 6,8 an. Das Volumen des Mycels nahm rasch zu und die Glucose war zu diesem Zeitpunkt nahezu aufgebraucht. Bei der Maximalkonzentration an Saframycin zeigte die Verdünnungsmethode unter Verwendung von Bacillus subtilis PCI 219 als Testorganismus 512 Verdünnungseinheiten und bei der Agarplatten-Diffusionsmethode wurde ein Hemmhof von etwa 40 mm erhalten. Die Maximalproduktion von Streptothricin wurde später, nach etwa 30 Stunden, erreicht. Aus der aus den Krug- Fermentern gesammelten Kulturbrühe (etwa 240 l) wurde das Mycel mit Hilfe eines kontinuierlichen Zentrifugalabscheiders abgetrennt und danach wurde die Kulturflüssigkeit mit Hilfe einer Centro-Konzentriervorrichtung (augenblicklich wirksame Konzentriervorrichtung unter vermindertem Druck) auf ein Drittel des Volumens konzentriert.

Das Filtrat wurde mit einer 1 n wäßrigen Lösung von Natriumhydroxid auf einen pH-Wert von 8,0 eingestellt. Danach wurde das eingestellte Filtrat 3mal mit dem gleichen Volumen an Methylendichlorid unter Rühren in Zeitabständen von 1 Stunde extrahiert. Die organischen Schichten wurden abgetrennt, kombiniert und unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft, wobei 16,4 g des rohen Saframycin-Komplexes erhalten wurden. Der Komplex wurde 3mal einer Gegenstromverteilung unter Verwendung von Methanol-n-Hexan unterworfen. Die Methanolschichten wurden kombiniert und unter vermindertem Druck zur Trockene konzentriert. Der Rückstand wurde in 200 ml Benzol gelöst und 2mal durch Schütteln mit 100 ml 1 n Natriumcarbonat gut gewaschen. Die gewaschene Benzolschicht wurde 5mal mit jeweils 60-ml-Anteilen 1 n Chlorwasserstoffsäure geschüttelt, um basische Substanzen in die Chlorwasserstoffsäure überzuführen. Die Chlorwasserstoffsäure- Schichten wurden kombiniert, mit wäßrigem Ammoniak wieder auf einen pH-Wert von 8 bis 9 eingestellt und danach 5mal mit dem gleichen Volumen an Chloroform extrahiert. Die organische Schicht wurde abgetrennt und unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft, wobei 2,7 g eines rohen basischen Extrakts erhalten wurden. Die Benzolschicht wurde zur Trockene eingedampft, wobei 2,7 g eines neutralen Rohextrakts erhalten wurden. Die Gesamtmenge des so aus vier Krug-Fermentern hergestellten Rohprodukts schwankte im Bereich von etwa 0,2 g bis 1,2 g.

Die Züchtung wurde 20mal unter Verwendung von vier Krug-Fermentern und einer Gesamtmenge der Kulturbrühe von 1200 l wiederholt, wobei 12,4 g eines rohen neutralen Extrakts und 12,6 g des rohen basischen Extrakts gebildet wurden.

Die Isolierung und Reinigung der Saframycine A, B, C, D und E aus den so erhaltenen Extrakten erfolgte z. B. in der nachstehend erläuterten Weise.

Der neutrale Rohextrakt (12,4 g) wurde der Säulenchromatographie an 120 g Silicagel (Siebgröße 70-230 Maschen; 210-62 μm) unter Verwendung von Äthylacetat : Benzol (1 : 4) als Elutionsmittel unterworfen, wobei 1,2 g der Saframycin A enthaltenden Fraktion gebildet wurden. Diese wurde dann der Säulenchromatographie unter Verwendung von Sephadex LH-20 und von Methanol als Elutionsmittel unterworfen, bei der 220 mg rohen pulverförmiges Saframycin erhalten wurde.

Der basische Rohextrakt (12,8 g) wurde der Säulenchromatographie an Silicagel (Siebgröße 70-230 Maschen, entsprechend 210-62 μm) unter Verwendung von Äthylacetat : Benzol (1 : 1) als Elutionsmittel unterworfen, wobei der Hauptanteil der Verunreinigungen an der Säule adsorbiert wurde. Das den Saframycinkomplex enthaltende Eluat wurde erneut der Säulenchromatographie unter Verwendung von Sephadex LH-20 unterworfen, um den größten Anteil der Verunreinigungen zu entfernen, wobei 6,3 g der Fraktion verblieben, die 6,3 g des Saframycin-Komplexes enthielt. Die Fraktion wurde an 180 g Silicagel (Siebgröße 70- 230 Maschen, entsprechend 62-210 μm) chromatographiert bei der nacheinander mit Äthylacetat : Benzol (1 : 4), Äthylacetat : Benzol (1 : 1), Äthylacetat und 5% Methanol enthaltendem Äthylacetat entwickelt wurde, wobei nacheinander die Saframycine A, B, C, D und E erhalten wurden. Jede Fraktion wurde an Sephadex LH-20 mit Methanol als Elutionsmittel der Säulenchromatographie unterworfen, wobei der größte Anteil der Verunreinigungen entfernt wurde und auf diese Weise wurden 52 mg der Fraktion von Saframycin A erhalten. Diese Fraktion und 220 mg des vorstehend als Rohpulver erhaltenen Saframycins wurden kombiniert und wiederholt an Silicagel (230 Maschen, entsprechend 62 μm) der Säulenchromatographie unterworfen, wobei 142 mg rohes pulverförmiges Saframycin A erhalten wurden, welches dann aus kaltem Äther umkristallisiert wurde, wobei 72 mg reines Saframycin A erhalten wurden.

Die Fraktionen, welche die Saframycine B, C, D und E enthielten, wurden gesondert wiederholte Male an Silicagel (230 Maschen, 62 μm) der Säulenchromatographie unterworfen und an einer Sephadex LH-20-Säule chromatographiert, wobei 590 mg Saframycin B, 60 mg Saframycin C, 29 mg Saframycin D bzw. 29 mg Saframycin E in Form der rohen pulverförmigen Substanzen erhalten wurden. Diese wurden jeweils aus kaltem Äther umkristallisiert, wobei 411 mg Saframycin B, 32 mg Saframycin C und 12 mg Saframycin D erhalten wurden. Die Umkristallisation des rohen Saframycins E aus Aceton ergab 9 mg Saframycin E in Form der reinen pulverförmigen Substanz.

Claims

1. Antibiotisch wirksame Substanz, Saframycin A, gekennzeichnet durch folgende physikalisch-chemische Eigenschaften: Farbe und Aussehen: Gelbes Pulver in Form der Saframycin A-Base;
Schmelzpunkt: 122-126°C;
Elementaranalyse:
C : 61,47%, H : 5,41%, N : 9,33%;
Durch Massenspektrum bestimmtes Molekulargewicht: 562;
Empirische Formel:
C₂₉H₃₀N₄O₈ · 2/5 H₂O;
Spezifische Drehung: Das in Fig. 1 gezeigte Ultraviolett-Absorptionsspektrum mit den Absorptionswerten: Das in Fig. 2 gezeigte Infrarot-Absorptionsspektrum mit den Werten: Das in Fig. 3 gezeigte NMR-Spektrum (CDCl₃) mit den Werten:
δ: 1,90 (3H, s), 1,98 (3H, s), 2,24 (3H, s), 2,30 (3H, s) 4,04 (6H, s), 6,65 (3H, bs);
Löslichkeitsverhalten:
leicht löslich in Estern, Chloroform, Aceton, Alkoholen;
mäßig löslich in Äthyläther;
unlöslich in Wasser, n-Hexan;
Farbreaktion:
Dragendorff-Reaktion: positiv;
Ninhydrin-, Perchlor-Eisen- und Anthron-Reaktion: negativ,
wobei die Fig. 1, 2 und 3 Bestandteil dieses Anspruchs sind.

2. Antibiotisch wirksame Substanz, Saframycin B, gekennzeichnet durch folgende physikalisch-chemische Eigenschaften: Farbe und Aussehen: Orange-gelbe Prismen;
Schmelzpunkt: 108-109°C;
Elementaranalyse:
C: 62,36%, H: 5,71%, N: 7,66%;
Durch Massenspektrum bestimmtes Molekulargewicht: 537;
Empirische Formel:
C₂₈H₃₁N₃O₈;
Spezifische Drehung: Das in Fig. 4 gezeigte Ultraviolett-Absorptionsspektrum mit den Absorptionswerten: Das in Fig. 5 gezeigte Infrarot-Absorptionsspektrum mit den Werten: Das in Fig. 6 gezeigte NMR-Spektrum (CDCl₃) mit den Werten:
δ: 1,90 (3H, s), 1,98 (3H, s), 2,23 (3H, s), 2,28 (3H, s), 4,00 (6H, s), 6,28 (1H, bs);
Löslichkeitsverhalten:
leicht löslich in niederen Alkoholen, Chloroform, Estern, Aceton, Benzol;
mäßig löslich in Äthyläther;
unlöslich in Wasser, n-Hexan;
Farbreaktion:
Dragendorff- und Meyer-Reaktion: positiv;
Ninhydrin- und Ehrlich-Reaktion: negativ,
wobei die Fig. 4, 5 und 6 Bestandteil dieses Anspruchs sind.

3. Antibiotisch wirksame Substanz, Saframycin C, gekennzeichnet durch folgende physikalisch-chemische Eigenschaften: Farbe und Aussehen: Orange-rote Nadeln;
Schmelzpunkt: 143-146°C;
Elementaranalyse:
C: 61,61%, H: 5,96%, N: 7,39%;
Durch Massenspektrum bestimmtes Molekulargewicht: 567;
Empirische Formel:
C₂₉H₃₃N₃O₉;
Spezifische Drehung: Das in Fig. 7 gezeigte Ultraviolett-Absorptionsspektrum mit den Absorptionswerten: Das in Fig. 8 gezeigte Infrarot-Absorptionsspektrum mit den Werten: Das in Fig. 9 gezeigte NMR-Spektrum (CDCl₃) mit den Werten:
δ: 1,86 (3H, s), 2,00 (3H, s), 2,38 (3H, s), 2,44 (3H, s), 3,46 (3H, s) 3,96 (3H, s),
6,60 (1H, bs);
Löslichkeit:
leicht löslich in niederen Alkoholen, Chloroform, Estern, Aceton, Benzol;
mäßig löslich in Äthyläther;
unlöslich in Wasser, n-Hexan;
Farbreaktion:
Dragendorff- und Meyer-Reaktion: positiv;
Ninhydrin- und Ehrlich-Reaktion: negativ,
wobei die Fig. 7, 8 und 9 Bestandteil dieses Anspruchs sind.

4. Antibiotisch wirksame Substanz, Saframycin D, gekennzeichnet durch folgende physikalisch-chemische Eigenschaften: Farbe und Aussehen: Gelbe Nadeln;
Schmelzpunkt: 150-154°C;
Elementaranalyse:
C: 60,48%, H: 5,68%, N: 7,59%;
Durch Massenspektrum bestimmtes Molekulargewicht: 553;
Empirische Formel:
C₂₈H₃₁N₃O₉;
Spezifische Drehung: Das in Fig. 10 gezeigte Ultraviolett-Absorptionsspektrum mit den Absorptionswerten: Das in Fig. 11 gezeigte Infrarot-Absorptionsspektrum mit den Werten: Das in Fig. 12 gezeigte NMR-Spektrum (CDCl₃) mit den Werten:
δ: 1,91 (3H,s), 2,17 (3H, s), 2,28 (3H, s), 2,45 (3H, s), 3,97 (3H, s), 4,06 (3H, s);
Löslichkeit:
leicht löslich in niederen Alkoholen, Chloroform, Pyridin;
mäßig löslich in Estern, Aceton, Äthyläther;
unlöslich in Wasser, n-Hexan;
Farbreaktion:
Dragendorff-Reaktion: positiv,
wobei die Fig. 10, 11 und 12 Bestandteil dieses Anspruchs sind.

5. Antibiotisch wirksame Substanz, Saframycin E, gekennzeichnet durch folgende physikalisch-chemische Eigenschaften: Farbe und Aussehen: Gelbes Pulver;
Schmelzpunkt: 146-148°C;
Elementaranalyse:
C: 58,52%, H: 5,89%, N: 7,36%;
Molekulargewicht (errechnet aus dem Massenspektrum des Triacetylderivats): 555;
Empirische Formel:
C₂₈H₃₃H₃O₉ · H₂O;
Spezifische Drehung: Das in Fig. 13 gezeigte Ultraviolett-Absorptionsspektrum mit den Absorptionswerten: Das in Fig. 14 gezeigte Infrarot-Absorptionsspektrum mit den Werten: Das in Fig. 15 gezeigte NMR-Spektrum (d-5-Pyridin) mit den Werten:
δ: 1,83 (3H, s), 2,17 (3H, s), 2,30 (3H, s), 2,48 (3H, s), 3,82 (3H, s), 3,95 (3H, s),
5,22 (1H, s);
Löslichkeit:
leicht löslich in niederen Alkoholen, Pyridin;
mäßig löslich in Aceton, Estern, Chloroform;
unlöslich in Wasser, n-Hexan;
Farbreaktion:
Dragendorff-Reaktion: positiv,
wobei die Fig. 13, 14 und 15 Bestandteil dieses Anspruchs sind.

6. Verfahren zur Herstellung der Saframycine A, B, C, D und E der Ansprüche 1 bis 5 sowie gegebenenfalls ihrer Säure- Additionssalze, dadurch gekennzeichnet, daß man Streptomyces lavendulae FERM BP-1300 in einem üblichen Kulturmedium züchtet, den gebildeten Komplex der basischen Saframycine A, B, C, D und E aus der Kulturbrühe mittels Lösungsmittelextraktion gewinnt und danach die Saframycine A, B, C, D und E aus dem Komplex durch Chromatographie isoliert und sie gegebenenfalls in ein gewünschtes Säure-Additionssalz überführt.

7. Arzneimittel, enthaltend einen pharmazeutisch geeigneten Träger oder Exzipienten und gegebenenfalls übliche Zusatzstoffe sowie einen oder mehrere Wirkstoffe, dadurch gekennzeichnet, daß es als Wirkstoff eine oder mehrere der antibiotisch wirksamen Substanzen Saframycin A, B, C, D und E und/oder deren Säure-Additionssalze mit pharmazeutisch geeigneten Säuren enthält.