DE3041224A1

DE3041224A1 - Verfahren zur fermentativen herstellung von d(-)- (beta) -hydroxyisobuttersaeure

Info

Publication number: DE3041224A1
Application number: DE19803041224
Authority: DE
Inventors: Shigeki Akashi Hyogo Hamaguchi; Junzo Akashi Hyogo Hasegawa; Hajime Kakogawa Hyogo Kawaharada; Masahiro Ono Hyogo Ogura; Masami Takasago Hyogo Shimazaki; Kiyoshi Akashi Hyogo Watanabe
Original assignee: Kanegafuchi Chemical Industry Co Ltd
Current assignee: Kanegafuchi Chemical Industry Co Ltd
Priority date: 1979-11-06
Filing date: 1980-11-03
Publication date: 1981-05-14
Also published as: DE3041224C2; ES8200400A1; ES496563A0; CH647806A5; IT1188962B; NL8006026A; IE802291L; GB2063873A; IT8050073A1; FR2468646B1; IE50473B1; NL192833C; IT8050073A0; NL192833B; GB2063873B; US4310635A; FR2468646A1

Description

Anmelder: Kanegafuchi Chemical Industry Company, Limited, 2-4, 3-chome_r Nakanoshima. Kitaku, OSAKA/Japan

Verfahren zur fermentativen Herstellung von D (- )-ß-Hydroxyisobuttersäure

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von D(-)~ß-Hydroxyisobuttersäure (nachfolgend abgekürzt als "D-HIBA" bezeichnet); sie betrifft insbesondere ein Verfahren zur vorteilhaften Herstellung von D-HIBA unter Ausnutzung der speziellen Fähigkeit von Mikroorganismen, durch asymmetrische Synchese eine optisch aktive Verbindung zu bilden.

D-HIBA stellt ein wertvolles Zwischenprodukt für die Synthese von physiologisch aktiven Substanzen mit asymmetrischen Kohlenstoffatomen, beispielsweise Arzneimitteln, wie l-(D-3-Mercapto-2-methylpropanoyl)-L-prolin, ein. antihypertensives Mittel, dar.

Ein Beispiel für ein bekanntes Verfahren zur Herstellung von ß-Hydroxyisobuttersäure (nachfolgend abgekürzt als "HIBA" bezeichnet), ist die chemische Synthese aus Formaldehyd und Äthyl-cc-brompropionat nach der Reformatsky-Reaktion (E.E. Blaise und I. Herman, "Ann. Chim. et Phys.", 17, 371, 1969); bei der unter Anwendung dieses Verfahrens erhaltenen HIBA handelt es sich jedoch um die optisch inaktive DL(+)-Form. Dieses Verfahren ist deshalb für die

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Herstellung von optisch aktiver HIBA unvorteilhaft, weil zur Herstellung dieser Verbindung weitere komplizierte Prozesse der chemischen Auftrennung in die optischen Antipoden erforderlich sind, in denen ein teueres Reagens, wie Chinin, verwendet wird (J. Retey und F. Lynen, "Biochemische Zeitschrift", 34J2, 256 bis 271, 1965). Ein Verfahren zur Herstellung von D-HIBA durch chemische Synthese ohne Auftrennung in die optischen Antipoden wurde von M. Sprecher und D.B. Sprinson in "Journal of Biological Chemistry", 241, 868 (1966) beschrieben; die in diesem Verfahren als Ausgangsmaterial verwendete threo-3~Methyl-L-asparaginsäure ist jedoch sehr teuer und die Syntheseverfahrensstufen sind außerordentlich kompliziert. Andererseits ist auch bereits ein Verfahren zur Herstellung von optisch aktiver HIBA durch Fermentation unter Verwendung von Pseudomonas putide bekannt (Charles T. Geodhue und James R. Schaeffer, "Biotechnology and Bioengineering", 13, 203, 1971); die bei diesem Verfahren erhaltene HIBA liegt jedoch in der L(+)-Form vor.

Es gibt daher bisher kein industriell durchführbares Verfahren zur Herstellung von D-HIBA. Mikrobielle Prozesse, in denen die stereospezifischen katalytischen Eigenschaften von Mikroorganismen ausgenutzt werden, haben sich häufig als vorteilhafter für die Herstellung von optisch aktiven Verbindungen als die chemische Auftrennung von racemischen Verbindungen in die optischen Antipoden erwiesen.

Es wurde nun gefunden, daß bestimmte Mikroorganismen die

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Fähigkeit haben, Isobuttersäure (nachfolgend abgekürzt als "IBA" bezeichnet) oder Methacrylsäure (nachfolgend abgekürzt als "MA" bezeichnet) in D-HIBA umzuwandeln. Darauf beruht nun das den Gegenstand der vorliegenden Erfindung bildende fermentative Verfahren zur Herstellung von D-HIBA aus IBA, MA oder einer Mischung von IBA und MA.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von D(-)-ß-Hydroxyisobuttersäure aus Isobuttersäure oder Methacrylsäure durch stereoselektive Einwirkung von Mikroorganismen, welche die Fähigkeit haben, Isobuttersäure oder Methacrylsäure in D(-)-ß-Hydroxyisobuttersäure umzuwandeln, in einem wäßrigen Medium, wobei die D(-)-ß-Hydroxy-isobuttersäure danach aus dem wäßrigen Medium gewonnen bzw» abgetrennt wird.

In dem erfindungsgemäßen Verfahren wird ein Substrat verwendet, das ausgewählt wird aus der Gruppe IBA, MA und einer Mischung davon, das billig und in großen Mengen leicht zugänglich ist, das der Wirkung eines Mikroorganismus ausgesetzt wird, der die Fähigkeit hat, das Substrat in D-HIBA umzuwandeln. Die Umwandlung des Substrats in D-HIBA unter dem katalytischen Einfluß des Mikroorganismus erfolgt auf zweierlei Weise. Einerseits wird der Mikroorganismus aerob in einem das Substrat enthaltenden wäßrigen Nährmedium kultiviert, wobei die Vermehrung des Mikroorganismus und das Einwirkenlassen des Mikroorganismus auf das Substrat gleichzeitig in einer Stufe durchgeführt werden. Andererseits wird der Mikroorganismus zuerst in einem wäßrigen Nährmedium kultiviert, dann wird das Substrat

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der dabei erhaltenen Kulturbrühe oder einer Suspension von Zellen, die in der ersten Stufe erhalten wird, zugegeben und anschließend wird die Mischung aerob inkubiert. Die erfindtings gemäß verwendeten Mikroorganismen wandeln das Substrat in hoher Ausbeute nur in die D(-)-Form der HIBA umj deshalb kann bei Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens D-HIBA auf einfache Weise billig hergestellt werden.

Die erfindungsgemäß verwendeten Mikroorganismen haben die Fähigkeit, IBA oder MA in D-HIBA umzuwandeln ,,und sie können unter Anwendung der folgenden Verfahren leicht aus Kulturen oder Stämraen ausgewählt werden, die aus der Natur isoliert wurden:

IBA oder MA wird in einer zur Erzfelung einer Konzentration von etwa 2 Gew./Vol.-% ausreichenden Menge einer Kulturbrühe zugesetzt, die durch Kultivieren eines Mikroben- Stammes in einem Nährmedium, in dem der Teststamm wachsen kann, hergestellt wurde. Die dabei erhaltene Kulturbrühe wird nach dem Einstellen auf einen pH-Wert von 6 bis 9 1 bis 3 Tage lang bei 25 bis 35°C aerob inkubiert. Nach der Inkubation wird ein in Wasser gut.lösliches Salz, wie z.B. Ammoniumsulfat und Natriumsulfat, der Kulturbrühe zugesetzt und der pH-Wert wird auf weniger als 2 herabgesetzt, um die Extraktion von D-HIBA aus der Kulturbrühe zu erleichtern. Die Kulturbrühe wird mit einem mitWasser nicht mischbaren Lösungsmittel, wie Äthylacetat, extrahiert. Die Lösungsmittelschicht wird eingedampft und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und dann wird die optische Drehung des Extrakts in einer Methanollösung ge-

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messen. Die eine Linksdrehung aufweisenden Extraktproben werden ausgewählt und auf eine Silicagel-Dünnschichtplatte aufgetragen. Wenn eine Probe die gleiche Beweglichkeit wie HIBA zeigt, hat der für die Herstellung der Probe verwendete Mikroorganismus fast immer die Fähigkeit, IBA oder MA in D-HIBA umzuwandeln. Um die Bildung von D-HIBA zu bestätigen, wird die Extraktprobe durch Säulenchromatographie über Silicagel weiter geiä.nigt und die Struktur des gereinigten Präparats wird durch apparative Analyse, wie !NMR, IR und dgl., bestimmt. Im Hinblick auf die Ergebnisse, die bei dieser Reihenuntersuchung von D-HIBA-bildenden Mikroorganismen erhalten werden, kann gesagt werden, daß der größte Teil der Kulturbrühe, deren Lösungsmitte!-.extrakt el....- -.inksdrehung aufweist, D-HIBA enthält» Dieses Reihenuntersuchungsverfahren ist einfach und macht das Auffinden von Mikroorganismen, die in der Lage sind, aus IBA oder MA D-HIBA zu bilden, sehr leicht.

In dem erfindungsgemäßen Verfahren können alle D-HIBA-bildenden Mikroorganismen,die unter Anwendung des vorstehend beschriebenen Reihenuntersuchungsverfahrens ausgewählt wurden, verwendet werden; verwendbar sind beispielsweise Mikroorganismen, die zu den folgenden Genera gehören: Candida, Torulopsis, Trygonopsis, Saccharomyces, Pichia, Debaryomyces, Wingea, Rhodosporidium, Aspergillus, Choanephora und Zygorhynchus.

Unter den Mikroorganismen, die zu den vorstehend angegebenen Genera gehören, sind erfindungsgemäß beispielsweise die folgenden Stämme verwendbar:

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^m'⁰-

Candida rugosa IFO 0750, Candida rugosa IFO 0591, Candida parapsilosis IFO 0708, Candida utilis IFO 0396, Torulopsis Candida IFO 0380, Trygonopsis variabilis IFO 0671, Saccharomyces cerevisiae IAM 4274, Saccharorayces rouxii IFO 0493, Pichia membranaefaciens IAM 4904, Debaryorayces hansenii IFO 0026, Wingea robertsii IFO 1277, Rhodosporidium toruloides IFO 0559, Aspergillus niger IAM 2532, Choanephora circinanus HUT 1324 und Zygorhynchus moelleri HUT 1305.

Bedeutung der Abkürzungen:

IFO: Institute for Fermentation, Osaka; Juso Nishinomachi, Higashi-yodogawa-ku,

Osaka, Japan
IAM: Institute of Applied Microbiology, University of Tokyo j 1-chome, Yayoi, Bunkyo-ku,

Tokyo, Japan
HUT: Faculty of Engineering,

Hiroshima University; 3-chome, Senda-machi, Hiroshima City, Japan.

Es gibt zwei Möglichkeiten, um den Mikroorganismus auf das Substrat einwirken zu lassen. Eine Möglichkeit besteht darin, den Mikroorganismus in einem wäßrigen Medium aerob zu kultivieren, das von Beginn der Kultivierung an das Substrat enthält, so daß sich gleichzeitig mit der Vermehrung des Mikroorganismus D-HIBA in dem Medium anreichert. Die andere Möglichkeit besteht darin, im Rahmen eines Zweistufenverfahrens den Mikroorganismus zu kultivieren und den Mikroorganismus dann auf das Substrat

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• AA ·

einwirken zu lassen. Die erste Stufe dieses Zweistufenverfahrens kann durchgeführt werden durch Kultivieren des Mikroorganismus in einem wäßrigen Nährmedium. Die zweite Stufe dieses Zweistufenverfahrens kann durchgeführt werden durch Zugabe des Substrats zu einer Kulturbrühe, die in der ersten Stufe erhalten wurde, oder einer Suspension von Zellen, die in der ersten Stufe erhalten wurde, und anschließende aerobe Inkubation der dabei erhaltenen Mischung. Die Suspension von Zellen wird hergestellt durch Abtrennen der Zellen von einer Kulturbrühe des Mikroorganismus durch Zentrifugieren oder dgl. und anschließendes Suspendieren der Zellen in einem geeigneten wäßrigen Medium, beispielsweise einer wäßrigen Phosphatpufferlösung, Da die Enzyme der Mikroorganismen an der Umsetzung des erfindungsgemäßen Verfahrens beteiligt sind, können die abgetrennten Zellen auch verschiedenen Behandlungen, beispielsweise einer Trocknung und Homogenisierung und dgl., unterworfen werden, bevor sie in dem Medium suspendiert werden, um die Enzyrareaktion zu fördern. Daher fällt die Verwendung von Zellen, die auf verschiedene Weise behandelt worden sind, ebenfalls unter den Rahmen der vorliegenden Erfindung.

Für die Kultivierung des Mikroorganismus kann jedes beliebige Medium, in dem der verwendete Mikroorganismus wachsen kann, verwendet werden. Das Medium enthält in der Regel eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle und erforderlichenfalls eine Mineralquelle und dgl. Zu Beispielen für Kohlenstoffquellen in dem Medium gehören Kohlehydrate, wie Glucose, Saccharose, Stärke, Hydrolysate

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und Molassenj organische Säuren, wie Essigsäure, Fumarsäure und Milchsäure^ Alkohole, wie Methanol, Äthanol und Propanol; sowie weitere flüssige Kohlenwasserstoffe, wie η-Paraffine und Olefine, Öle und Fette, Glycerin und dgl«, die von den verwendeten Mikroorganismen assimiliert werden können.

Als Stickstoffquelle werden in dem Medium anorganische oder organische Verb5.ndüngen, wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniakwasser, Harnstoff, Aminosäuren, Pepton und Hydrolysate von Sojabohnenprotein, verwendet« Als Mineral können in dem Medium anorganische Säuresalze von Kalium, Magnesium, Zink, Eisen, Mangan_? Kupfer oder Calcium verwendet werden. Erforderlichenfalls können dem Medium Hefeextrakt, Fleischextrakt, Maisquellwasser, Vitamine oder mit Nucleinsäure verwandte Substanzen, wie Adenin und Guanin, zugesetzt werden.

Bezüglich der Kultivierungsbedingungen besteht kein spezieller Unterschied zwischen den beiden obengenannten Verfahren. Die Kultivierung des Mikroorganismus kann unter beliebigen Bedingungen, die das Wachstum des Mikroorganismus erlaben, durchgeführt werden, vorzugsweise wird sie jedoch bei einem pH-Wert von etwa 4,0 bis etwa 9,5 und bei einer Temperatur von etwa 20 bis etwa 40 C durchgeführt. In dem vorstehend beschriebenen Zweistufenverfahren ist es vorteilhaft, die Reaktion in der zweiten Stufe zu fördern, um diejenigen Enzyme des Mikroorganismus zu induzieren, welche die Umwandlung des Substrats in D-HIBA katalysieren, durch Zugabe einer geringen Menge des Substrats zu dem Medium in der ersten Stufe. Die Inkubation

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der zweiten Stufe in dem obengenannten Zweistufen-Verfahren kann vorzugsweise bei einem pH-Wert von etwa 6,0 bis etwa 9,5 und bei einer Temperatur von etwa 20 bis etwa 40 C durchgeführt werden.

Zum Isolaaren der D-HIBA aus der Kulturbrühe oder der Reaktionsmischung können übliche. Verfahren zur Extraktion und Reinigung einer organischen Säure, beispielsweise die Lösungsmittelextraktion und der Ionenaustausch, angewendet werden. Ein Beispiel für ein wirksames Gewinnungs- bzw. Abtrennungsverfahren durch Lösungsmittelextraktion ist das folgende:

Die Kulturbrühe oder Reaktionsmischung wird mit einer Mineralsäur«, wie Schwefelsäure tmd Chlorwasserstoffsäure, angesäuert, erforderlichenfalls wird ein anorganisches Salz, wie z.B. Ammoniumsulfat und Natriumsulfat, zugegeben, um die Ionenkonzentration der Brühe oder der Mischung zu erhöhen, und es wird mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel, wie Butanol, Methylisobutylketon und Äthylacetat, extrahiert. Durch Eindampfen der Lösungsmittel schicht bis zur Trockne wird rohe D-HIBA erhalten. Das auf diese Weise erhaltene D-HIBA-Präparat kann durch Säulenchromatographie unter Verwendung von Silicagel und dgl.weiter geiänigt werden, wobei man hochreine D-HIBA erhält.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein.

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Beispiel 1

Candida rugpsa IFO 0750, Candida rugosa IFO 0591, Candida parapsilosis IFO 0708, Candida utilis IFO 0396, Torulopsis Candida IFO 0380, Trygonopsis variabilis IFO 0671, Saccharomyces cerevisiae IAM 4274, Saccharomyces rouxii IFO 0493, Pichia membranaefaciens IAM 4904, Debaryomyces hansenii IFO 0026, Wingea robertsii IFO 1277, Rhodosporidium toruloides IFO 0559, Aspergillus niger IAM 2532, Choanephora circinanus HUT 1324 und Zyg.oihynchus moelleri HUT 1305 wurden jeweils in ein Medium inokuliert, das 40 g Glucose, 5 g Hefeextrakt, 3 g Pepton, 1 g Fleischextrakt sowie 20 g IBA oder 20 g MA oder 20 g einer Mischung aus gleichen Gewichtsmengen IBA und MA enthielt.Die Mikroorganismen wurden jewdls in einem 3 l-F.laschenfermentor bei 30 C, einem pH-Wert von 7,5 unter Rühren mit einer Geschwindigkeit von 500 UpM und unter Belüftung mit 1 w 24 Stunden lang kultiviert. Dann wurde der pH-Wert auf 8,5 erhöht und die Kultivierung wurde weitere 48 Stunden lang fortgesetzt. Die dabei erhaltene Kulturbrühe wurde mit Schwefelsäure angesäuert bis zur Erzielung eines pH-Wertes von 2,0, mit Ammoniumsulfat gesättigt und mit Äthylacetat extrahiert in einer Volumenmenge, die derjenigen der Kulturbrühe gleich war. Der über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknete Extrakt wurde unter vermindertem Druck eingeengt. Die eingeengte ölige Substanz wurde nach dem Auf*· lösen in einer geringen Menge Benzol auf eine mit Silikagel gefüllte Säule aufgegeben. Diese wurde zuerst mit Benzol/Aceton (Voluraenverhältnis 9:1) eluiert zur Entfernung von nicht-veränderter IBA oder MA, dann wurde sie mit Ben-

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je-

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zol/Aceton (Volumenverhältnis 1:3) eluiert, um die D-HIBA zu eluieren. Die D-HIBA enthaltenden Fraktionen wurden miteinander vereinigt und unter vermindertem Druck eingeengt, wobei man eine viskose Flüssigkeit erhielt. Die dabei erhaltene Flüssigkeit wurde durch Gaschromatographie, Silicagel-TLC (Dünnschichtchromatographie), NMR-Spektrum und dgl. als HIBA identifiziert. Die optische Drehung jedes Produkts wurde gemessen, wobei man als Ergebnis den Wert [oc]£⁵ - 13 - 18° (c - 3, Methanol) erhielt, was zeigt, daß die auf diese VJeise von jedem Mikroorganismus gebildete HIBA in der D(-)-Form vorlag. Die Ausbeuten der nach dem vorstehend beschriebenen Verfahren hergestellten D-HIBA sind in der folgenden Tabelle I angegeben.

D-HIBA-Ausbeute (g)

Substrat Mikroorganismus " ■ ______^^	IBA	MA	IBA+MA
Candida vugosa IFO 0750	8.2	7.9	7.8
Candida rugosa IFO 0591	6.5	7.8	8.4
Candida parapsilosis IFO 0708	5.5	6.2	5.5
Candida utilis IFO 0396 ■ . ;__:	5.4	8.8	5.3
Torulopsis Candida IFO 0380 ■ .	2.1	1.1	3.6
Trygonopsis variabitis IFO 0671	• 5.8	2.5	2.9
Saocharomyces cerevisiae IAM 4274	3.2	1.7	3.3
Saeeharomyees vouxii IFO 0493	4.6	2.0	4.0
j Pichia membvanaefaciens IAM 4904	7.0	1.3	1.9
-; Debaryomyces hansenii IFO 0026	9.2	4.3	7.0

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-Jb-

Tabelle I (Fortsetzung)

Wingea vobevtsii IFO 1277	1.9	0.8	1.1·
- Rhodpsporidium torutoides IFO 0559	2.5	4.0	2.2
Aspergillus nigev IAM 2532 . _;, \	: 2.3	2.3	3.5
Choanephora civainanus HUT 1324	1.8	1.5	0.6
Zygorhynchus moelleri HUT 1305	1.3	1.1	1.5

Beispiel 2

Es wurden die gleichen Stämme wie in Beispiel 1 jeweils in 1 1 eines Mediums inokuliert, das 20 g Glucose, 5 g Hefeextrakt sowie 1 g IBA. oder 1 g MA. oder 1 g einer zu gleichen Gewichtsmengen aus IBA und MA bestehenden Mischung enthielt. Die Mikroorganismen wurden jeweils in einem 3 1-Flaschenfermentor bei 30⁰C, bei einem pH-Wert von 6,0 unter Rühren mit 500 UpM und unter Belüften mit 1 wm 20 Stunden lang kultiviert. Dann wurden 30 g IBA, MA oder 30 g einer zu gleichen Gewichtsmengen aus IBA und MA bestehenden Mischung zu der erhaltenen KuItürbrühe zugegeben. Die Kulturbrühe wurde nach dem Einstellen ihres pH-Wertes auf 8,5 72 Stunden lang inkubiert. Nach der Inkubation wurde die Reaktionsmischung auf die·gleiche Weise wie in Beispiel 1 angegeben behandelt, wobei man D-HIBA erhielt. Der Bereich der optischen Drehung der auf diese Weise erhaltenen D-HIBA war der gleiche wie in Beispiel 1. Die D-HIBA-Ausbeuten sind in der folgenden Ta-

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/11-

belle II angegeben.

Tabelle II

D-HIBA-Ausbeute (g)

~~~~ ■——______^^ Substrat Mikroorganismus . " —________^^	IBA	MA	IBA+MA
• Candida rugosa IFO 0750	8.3	10.. 2	7.8
t - - .. . - I Candida vugosa IFO 0591 . "■;"	6.1	9.4	8.5
ü I Candida parapsilosis IFO 0708	7.7	10.5	9.7
i j Candida utilis IFO Ü396	5.7	6.1	4.7
j Torulopsis Candida IFO 0380.	1.9	1.6	3.3
I Trygonopsis variahilis IFO 0671	" 5".O	4.3	3.6
Saccharomyces oerevisiae IAM 4274	3.2	1.5	3.8
Saccharomyces rouxii IFO 0493	4.4	1.8	2.0
Piohia membvanaefaoiens IAM 4904 j	4.5	1.7	1.8
i - j Debaryomyoes Jiansenii IFO 0026	8.5	5.9	8.6
! Wingea robertsii IFO 1277	2.2	0.6	3.1
Shodospovidium toruloides IFO 0559	2.4	0.8	2.5
iisper^iZZus niger IAM 2532 : . ;	2.3	1.0	1.2
Choanephora oivoinanus HUT 1324	0.9	0.7	0.5
Zygorhynchus moelleri HUT 1305	1.8	0.9 ·	2.2

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Beispiel 3

Die gleichen Stämme, wie sie in Beispiel 1 verwendet worden waren, wurden jeweils in 1 1 eines Mediums inokuliert, das 20 g Glucose, 5 g Hefeextrakt, 3 g Pepton, 3 g Fleischextrakt sowie 1 g IBA oder 1 g MA oder 1 g einer aus gleichen Gewichtsmengen IBA und MA bestehenden Mischung enthielt. Die Mikroorganismen wurden jeweils in einem 3 1-Flaschenfermentor bei 30 C und bei einem pH-Wert von 6,0 unter Rühren mit 500 UpM und unter Belüften mit 1 wm 24 Stunden lang kultiviert. Durch Zentrifugieren wurden aus der dabei erhaltenen Kulturbrühe die Zellen abgetrennt, zweimal mit einer 0,9 %-igen Kochsalzlösung gewaschen und in einem 1/15 M Phosphatpuffer (pH 8,5) suspendiert.

Zu der Zellensuspension wurden 30 g IBA, MA oder 30 g einer Mischung von IBA und MA (Gewichtsverhältnis IBA: MA « 1ϊ1) und 30g Glucose zugegeben. Die dabei erhaltene Mischung wurde 48 Stunden lang bei pH 8,5 inkubiert. Nach der Inkubation wurde die Reaktionsmischung auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 behandelt, wobei man D-HIBA erhielt. Der Bereich der optischen Drehung der auf diese Weise erhaltenen D-HIBA war der gleiche wie in Beispiel 1. Die D-HIBA-Ausbeuten sind in der folgenden Tabelle III angegeben.

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Tabelle III

D-HIBA-Ausbeute (g)

■———-t_____^^ . Substrat	IBA	MA	IBA-HMA
I Mikroorganismus ~ ___^	9.4	9.2	8.8
Candida rugosa IFO 0750	8.3	7.7	9.5
ί 'Candida rugosa IFO 0591 ' ."·..	11.0	9.9	9.3
Candida parapsilosi-s IFO 0708	6.2	5.9	4.4
Candida utilis IFO 0396	2.1	1.5	2.0
! Torulopsis Candida IFO 0380	4.4	5.0	4.6
I Trygonopsis variabilis IFO 0671 ■ ■ ■ ■ '	2.5	2.1	1.8
I Saccharomyces cerevisiae IAM 4274	3.6	3.3	4.2
Saecharomyces rouxii IFO 0493	7.4	8.5	8.8
Pichia membranaefaciens IAM 4904	6.2	4.7	5.1
I Deharyomyces hansenii IFO 0026	1.5	1.6	1.3
■ Wingea robertsii IFO 1277	2.0	1.5	1.7
Ehodosporidium toruloides IFO 0559 '	0.7	1.2	1.4
Aspergillus niger IAM 2532 - · -..	1.1	1.8	2.2
Choanephora eircinanus HUT 1324	• 1.6	2.2 "	1.6
Zygorhynchus moelleri HUT 1305 . . .

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Claims

Anmelderϊ Kanegafuchi Chemical Industry Company, Limited, 2-4, 3-chome, Nakanoshima, Kitaku, OSAKA/Japan Patentansprüche

1. Verfahren zur Herstellung von D(-)-ß-Hydroxyisobut-

dadurch gekennzeichnet, daß auf ein Substrat, das ausgewählt wird aus der Gruppe Isobuttersäure, Methacrylsäure und einer Mischung von Isobuttersäure und Methacrylsäure, in einem wäßrigen Medium ein Mikroorganismus einwirken gelassen wird, der die Fähigkeit hat, das Substrat in D(-)-ß-Hydroxyisobuttersäure umzuwandeln, und daß die D(-)-ß-Hydroxyiso·" buttersäure aus dem wäßrigen Medium gewonnen (abgetrennt) wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein Mikroorganismus verwendet wird, der zu einem Genus aus der Gruppe Candida, Torulopsis, Trygonopsis, Saccharomyces, Pichia, Debaryomyces, Wingea, Rhodosporidium, Aspergillus, Choanephora und Zygorhynchus gehört.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß ein Mikroorganismus verwendet wird,, der zu einer Spezies aus der Gruppe Candida rugosa, Candida parapsi·* losis, Candida utilis, Torulopsis Candida, Trygonopsis variabilis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces rouxii,

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Pichia membranaefaciens, Debaryomyces hansenii, Wingea robertsii, Rhodosporidium toruloides, Aspergillus niger, Choanephora circinanus und Zygorhynchus moelleri, gehört.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus in einem das Substrat enthaltendaa wäßrigen Medium aerob kultiviert wird.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Kultivierung bei einem pH-Wert von etwa 4 bis etwa 9,5 und einer

geführt wird.

9,5 und einer Temperatur von etwa 20 bis etwa 40 G durch»

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Substrat einer durch Kultivieren des Mikroorganismus in einem wäßrigen Medium hergestellten Kulturbrühe zugesetzt wird und daß dann die dabei erhaltene Mischung aerob inkubiert wird.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß eine geringe Menge Isobuttersäure, Methacrylsäure oder einerMischung von Isobuttersäure und Methacrylsäure dem wäßrigen Medium zugesetzt wird, wenn der Mikroorganismus kultiviert wird, um Enzyme des .... Mikroorganismus zu induzieren.

8. Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus bei einem pH-Wert von etwa 4,0 bis etwa 9,5 und bei einer Temperatur von etwa 20

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bis etv;a 40 C kultiviert wird und daß die Mischung bei einem pH-Wert von etwa 6,0 bis etwa 9,5 und bei einer Temperatur von etwa 20 bis etwa 40 C inkubiert wird.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Substrat einer Zellsuspension zugesetzt wird, die durch Abtrennen der Zellen von einer durch Kultivieren des Mikroorganismus in einem wäßrigen Medium hergestellten Kulturbrühe und anschließendes Suspendieren der Zellen in einem wäßrigen Medium hergestellt wurde, und daß dann die dabei erhaltene-Mischung aerob inkubiert wird.

ΙΟ« Verfahren nach Anspruch 9, dadurch ^kennzeichnet, daß eine geringe Menge Isobuttersäure, Methacrylsäure oder einer Mischung von Isobuttersäure und Methacrylsäure dem wäßrigen Medium zugesetzt wird, wenn der Mikroorganismus kultiviert wird, um Enzyme des Mikroorganismus zu induzieren.

11. Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus bei einem pH-Wert von etwa 4,0 bis etwa 9,5 und bei einer Temperatur von etwa 20 bis etwa 40°C kultiviert wird und daß die Mischung bei einem pH-Wert von etwa 6,0 bis etwa 9,5 und bei einer Temperatur von etwa 20 bis etwa 40 C inkubiert wird.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß die D(-)-ß-Hydroxyisobuttersäure durch

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Extraktion mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel aus dem wäßrigen Medium gewonnen bzw. abgetrennt wird.

13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß als mit Wasser nicht mischbares Lösungsmittel Butanol, Methylisobutylketon oder Äthylacetat verwendet wird,

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