DE2934756A1

DE2934756A1 - Zusammensetzung zur bestimmung von beta 2 -humanmikroglobulin und verfahren zu deren herstellung und deren verwendung

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Publication number: DE2934756A1
Application number: DE19792934756
Authority: DE
Inventors: Takashi Ogura; Tetsuo Tomiyama
Original assignee: Seikagaku Corp
Current assignee: Seikagaku Corp
Priority date: 1978-08-28
Filing date: 1979-08-28
Publication date: 1980-03-13
Also published as: SE446130B; CH645727A5; FR2435039B1; SE7907118L; GB2030294B; FR2435039A1; GB2030294A; JPS5530652A; DE2934756C2

Description

Zusammensetzung zur Bestimmung von ß2-Humanmikroglcbulin und Verfahren zu de ren Herstellung und de ren Verwendung

Die Erfindung "bezieht sich auf eine Zusammensetzung zur Bestimmung von ß^-Humanmikroglobulin, auf ein Verfahren zu deren Herstellung und auf deren Verwendung. Insbesondere bezieht sich die Erfindung auf eine Zusammensetzung zur Bestimmung von ßo-Humanmikroglobulin (sowohl qualitativ als auch quantitativ), die eine überlegene Lagerstabilität besitzt und mit guter Reproduzierbarkeit und einem hohen Grad an Genauigkeit rasch zuverlässige Ergebnisse liefert, ohne Störung durch andere Proteine, welche in einer Versuchs- oder Testprobe enthalten sein können, wobei eine einfache Bestimmungsarbeitsweise und ein einfaches Bestimmungsinstrument zur Anwendung gelangen.

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Insbesondere bezieht sich, die Erfindung auf eine Zusammensetzung zur Bestimmung von ßp-Humaniaikroglobulin, welche aus Teilchen eines synthetischen polymeren Latex,vorzugsweise aus Teilchen eines synthetischen polymeren Latex vom Styroltyp, ausgewählt aus der Gruppe von Styrolpolymeren, Styrolcopolymeren und den carboxylierten oder aminohaltigen, carboxyl!erten Produkten hiervon besteht; ferner bezieht sich die Erfindung auf ein Verfahren zur Herstellung dieser Zusammensetzung und auf die Verwendung dieser Zusammensetzung.

Bp-Humanmikroglobulin ist ein Protein nit einem relativ niedrigen Molekulargewicht von etwa 12 000 und es wird im Serum, im Urin, Cerebrospinalflussigkeit, Speichel, Milch oder dergleichen von Menschen gefunden- Die Wirkung in vivo von ßo-MikroglobulJn ist bis jetzt noch nicht vollständig geklärt. Es wurde jedoch vor kurzem gefunden, daß bei bestimmten Krankheiten, wie Entzündungen, Karzinomerkrankungen und Kierenerkrankungen der Gehalt an ßo-Mikroglobulin in den Korperflussxgkeiten des Patienten ansteigt. Beispielsweise sind Nierenerkranklingen in solche, welche durch glomerulare Störung hervorgerufen werden und in solche, welche durch Störungen in Harnkanälchen verursacht werden, unterteilt. Im letzteren Fall nimmt die Menge an ßp-Mikroglobulin zuerst im Blut, genauer im Serum und dann im Urin zu.

Das ß₂-Mikroglobulin ist ein Protein, welches die glomerulare Basalmembran durchdringt und dann von den Nierenkanälchen oder Harnkanälchen absorbiert wird. Wenn jedoch eine Störung der Harnkanälchen auftritt, sickert dieses Protein in den Urin, ohne erneut absorbiert zu werden. Demgemäß ist der ßo-Mikroglobulinspiegel im Urin einer der besten Parameter für die Wirkung der Harnkanälchen. Auf diese Weise kann eine Störung der Hieren- oder Harnkanälchen

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durch die Bestimmung des Spiegels von ßp-Mikroglobulin im Serum und Urin diagnostiziert werden.

Bisner war kein geeignetes Mittel zur Beurteilung einer Erkrankung der liieren- oder Harnkanälchen verfügbar. Sie kann jedoch nun mühelos durch, die Bestimmung des ßp-Mikroglobulinspiegels im Serum und Urin diagnostiziert werden, wodurch ein Weg für eine geeignete Behandlung der Erkrankung eröffnet wird. Dies ist für die klinische Anwendung äußerst wichtig und wertvoll.

Es bestand ein Interesse für die Entwicklung eines Verfahrens, durch welches ßp-Humanmikroglobulin im Serum oder im Urin mit einem hohen Ausmaß an Genauigkeit und Zuverlässigkeit bestimmt werden kann. Jedoch erwies sich keines der gebräuchlichen Kittel für die Bestimmung von ßo-Humanmikroglobulin als zufriedenstellend. Eine bekannte Maßnahme ist ein Verfahren einer einseinen Eadialimmunodiffusion, bei welchem in einer Agarplatte, welche einen β.-,-HumanmikiOglobulin-Antikörper enthält, Bohrungen geschaffen werden, in diese Bohrungen eine Versuchsprobe eingefüllt wird und aus einem Ausfällungsband, welches bei der Diffusion von ßo-Mikroglobulin auftritt, das ßp-Humanmikroglobulin bestimmt wird. Da dieses Verfahren eine niedrige Empfindlichkeit besitzt, kann damit das ßp-Mikroglobulin in der Versuchsprobe lediglich in einer Konzentration oberhalb einer bestimmten Grenze bestimmt werden.

Die Radioimmunoassay-Kethoäe ist ebenfalls eine gebräuchliche Methode,nach welcher ßp-Mikroglobulin unter Verwendung eines mit einem Radioisotopen indizierten ßp-Eumanmikroglobulin-Antikörper gemessen wird. Dieses Verfahren ist jedoch gefährlich und mühsam, da

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es die Verwendung einer radioaktiven Substanz umfaßt. Es kann daher nicht durchgeführt werden, wenn nicht eine ausreichende Kontrolle und Einrichtungen zur Anwendung der radioaktiven Substanz zur Verfugung stehen.

Ein weiteres Beispiel ist ein Verfahren unter Anwendung einer passiven Umkehr-Hämagglutinationsreaktion (RPHA), nach welchem ß₂-Mikroglobulin mit einer äquivalenten Empfindlichkeit, wie bei der Radioimmunoassay-Methode mühelos bestimmt werden kann. Da als Träger die roten Blutzellen von einem Tier verwendet werden, hat dieses Verfahren den Nachteil, daß bei der Herstellung von antikörpersensibilisierten roten Blutzellen,, Vorbehandlungen der roten Blutzellen, z.B. die Fixierung der roten Blutzellen und Behandlung der roten Blutzellen mit Bindereagenzien, wie Glutaraldehyd oder Gerbsäure erforderlich sind. Da außerdem eine nicht spezifische Reaktion, welche einem Antikörper für die als Träger verwendeten roten Blutzellen zugeschrieben wird, bei der praktischen Bestimmung häufig auftritt, ist es notwendig, eine Absorptionsbehandlung mit den roten Blutzellen und einen Kontrollversuch unter Verwendung von gebräunten Zellen durchzuführen.

Es wurden nunmehr Untersuchungen ausgeführt, um eine Mittel oder eine Methode zur Bestimmung von ßp-Humanmikroglobulin zu schaffen, die frei von den Nachteilen und Mangeln der gebräuchlichen, vorstehend beschriebenen Arbeitsweisen ist, und die zuverlässige Ergebnisse mit einem hohen Ausmaß an Genauigkeit unter Verv/endung eines einfachen Gerätes und unter Anwendung einer einfachen Bestimmungsarbeitsweise liefern kann. Diese Untersuchungen führten zu dem Ergebnis, daß eine Zusammensetzung, welche Teilchen eines synthetischen polymeren Latices, vorzugsweise Teilchen eines synthetischen polymeren Latices vom Styroltyp und einen ßp-Humanmikroglobulin-Antikörper als Überzug auf der Oberfläche der Teil-

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chen enthält, eine überlegene La gerbe ständigkeit besitzt und bei der raschen Bestimmung der Konzentration von ßp-Humanmikroglobulin in einer Versuchsprobe mit einem hohen Ausmaß an Genauigkeit und Zuverlässigkeit und einer guten Reproduzierbarkeit sehr brauchbar ist, wobei ein einfaches Meßinstrument und eine mühelose Bestimmungsarbeitsweise zur Anwendung gelangen, und wobei keine Störung durch andere Proteine, welche in der Versuchsprobe enthalten sein können, auftritt. Es wurde auch gefunden, daß die vorstehend genannte Zusammensetzung in einfacher Weise hergestellt und nicht nur als Latex sondern auch als getrocknetes Produkt gelagert werden kann.

Aufgabe der Erfindung ist daher die Schaffung einer neuartigen und ausgezeichneten Zusammensetzung zur Bestimmung von ß2-Humanraikroglobulin, eines Verfahrens zur Herstellung derselben und die Verwendung der vorstehend genannten Zusammensetzung.

ßp-Humanmikroglobulin ist in verschiedenen menschlichen Körperflüssigkeiten vorhanden. So können Urin, Milch, Serum und dergleichen als Ausgangs-ßo-Humanmikroglobulin für die Herstellung des ßp-Humanmikroglobulin-Antikörpers

in der Zusammensetzung gemäß der Erfindung verwendet

werden. Am zweckmäßigsten wird das Ausgangsmaterial aus dem Urin eines Patienten, der an einer der vorstehend

beschriebenen Krankheiten erkrankt ist, hergestellt.

Die Abtrennung des ß₂-Humanmikroglobulins kann unter

Anwendung von verschiedenen, an sich bekannten Arbeitsweisen ausgeführt werden. Beispiele für derartige Arbeitsweisen

umfassen ein Zonenelektrophoretisch.es Verfahren, das

Verfahren von Berggird u.a. (I. Berggird et al : J. Biol. Chem., 24-5, 4095, 1968) durch lonenaustausch-Chromatographie,

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Gelfiltration und das Verfahren von Ohsawa u.a. (M. Ohsawa et al : Experientia, _29, 1179, 1973).

Das Ausgangs-ßp-Humanmikroglobulin ist zweckmäßig eine Probe eines einzigen !Proteins, da der Einschluß von Verunreinigungen den nachfolgenden Arbeitsgang erschwert.

Ein Antikörper des ßp-Humanmikroglobulins, welches unter Anwendung der vorstehend genannten bekannten Arbeitsweisen erhalten werden kann, kann durch Verabreichung des ßp-Mikroglobulins a]s ein Antigen an ein Tier mit der Fähigkeit zur Erzeugung eines Antikörpers, z.B. Meerschweinchen, Kaninchen oder Ziegen, in üblicher V/eise zur Immunisierung desselben, Abnahme von Blut aus dem immunisierten Tier und Abtrennung des ßp-Humanmikroglobulin-Antikörpers aus dem so erhaltenen Blut hergestellt werden.

Das bei diesem Verfahren verwendete Tier kann irgendein Tier sein, das die Fähigkeit zur Erzeugung von Antikörpern besitzt. Um jedoch eine große Menge an Antikörper zu erhalten, wird die Verwendung eines großen Tieres bevorzugt. Gewöhnlich sind Kaninchen oder Ziegen geeignet, wobei jedoch das zu verwendende Tier nicht auf diese beschränkt ist. Die Abtrennung eines ßp-Humanmikroglobulin-Antikörpers aus dem diesen enthaltenden Antiserum kann unter Anwendung von bekannten Maßnahmen ausgeführt v/erden. Beispielsweise wird das Antiserum ausgesalzen und eine Absorption-Eluierung unter Verwendung eines unlöslichen Antigens wird wiederholt.

Verschiedene synthetische Latexteilchen können für die Herstellung der Zusammensetzung für die Bestimmung von ßp-Humanmikroglobulin gemäß der Erfindung verwendet werden. Beispiele für Polymere oder Copolymere, welche diesen Latex bilden, umfassen Polystyrol, carboxyliertes Polystyrol,

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aminohaltiges.carboxyliertes Polystyrol, Polyvinyltoluol, Styrol/Butadien-Copolymeres, carboxyliertes Styrol/Butadien-Copolymeres, Styrol/Divinylbenzol-Copolymeres, Vinyltoluol/ tert.-Butylstyrol-Copolymeres, Polyester, Polyacrylsäure, Polymethacrylsäure, Polyacrylnitril, Acrylnitril/Butadien/ Styrol-Copolymeres, Polyvinylacetat-Acrylat, Polyvinylpyrrolidon und Vinylchlorid/Acrylat-Copolymeres.

Bevorzugte Teilchen von synthetischen polymeren Latices sind Teilchen von synthetischen Polymerlatices vom Styroltyp aus der Gruppe von Styrolpolyaeren, Styrolcopolymeren^ z.B. einem Copolymeren von Styrol mit einem Monomeren aus der Gruppe von Chlorstyrol, Methylmethacrylat und Vinylidenchlorid, und carboxylierte oder aminohaltige carboxylierte Produkte hiervon. Diese synthetischen Polymerlatexteilchen können nach Vorbehandlung ihrer Oberflächen mit einem nicht ionischen oberflächenaktiven Mittel verwendet werden. Beispielsweise werden diese Teilchen bevorzugt verwendet, nachdem ein nicht ionisches oberflächenaktives Mittel vom Äthylenoxydtyp einem Verfahren zum Anhaften daran gebracht wurde, das in der JP-Offenlegungsschrift Nr. 9716/76, offengelegt am 26. Januar 1976, beschrieben ist. Beispiele für geeignete nicht ionische oberflächenaktive Mittel vom Äthylenoxydtyp sind ein Blockcopolymeres von Äthylenoxyd und Polyoxypropylenglykol, Polyoxyäthylenalkyläther und PoIyoxyäthylenaIky1aryläther.

Gemäß der Erfindung besitzen die synthetischen Polymerlatexteilchen vorzugsweise einen mittleren Teilchendurchmesser von 0,01 bis 10 /um, insbesondere 0,1 bis 1 /um. Zur Erhöhung der Reproduzierbarkeit der Meßergebnisse werden vorzugsweise Teilchen mit einem relativ engen Bereich der Größenverteilung verwendet. Das spezifische Gewicht der Latexteilchen beträgt vorzugsweise etwa 0,9 bis 1,4- und insbesondere 1,1 bis 1,3. Im Falle einer Bestimmung unter

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-ßr-

Anwendung einer Aggjufcinationsreaktion auf einer Obgektträgerglasplatte können Latexteilchen mit einem "breiten Bereich des spezifischen Gewichts verwendet werden. Im Falle einer Mikrotitermethode werden Latexteilchen mit einem spezifischen Gewicht von wenigstens 1,1 bevorzugt verwendet. Die Zusammensetzung zur Bestimmung von ßp-Humanmikroglobulin gemäß der Erfindung kann in einfacher Weise hergestellt werden. Beispielsweise kann sie dadurch hergestellt werden, daß man einen synthetischen polymeren Latex vorzugsweise mit einer Konzentration von 0,05 bis 5 °/° mit einem ß2-Humanmikroglobulin-Antikö"rper mit einer Konzentration von 0,0001 bis 1 % in einem Puffer bei einem pH-Bereich von vorzugsweise etwa 5 his etwa 10, insbesondere etwa 6,5 his etwa 8 bei einer Temperatur von vorzugsweise

etwa 4 bis etwa 40 C in Berührung bringt. Das Inberührungkann do <=>

bringen/unter schwachem Rühren während etwa 30 min bis etwa 24 h ausgeführt werden.

Der zur Anwendung gelangende Puffer kann z.B. eine mit Phosphat gepufferte Salzlösung ^fT/60 Phosphatpuffer (pH 7,2) mit einem Gehalt von 0,15 M HaCl, abgekürzt PBÖ7 und eine glycingepufferte Salzlösung sein. Erwünschtenfalls kann 0,01 bis 0,1 % eines Proteins z.B. Rinderserum-

vo-TZUgswexse albumin (abgekürzt BSA) zu einer Antikörperlösung / zugesetzt werden, um eine nicht spezifische Agglutination zu verhindern. Nach der Beschichtungs- oder Überzugsreaktion wird die Reaktionsmischung mehrmals durch Zentrifugierung in einer neutralen Salzlösung z.B. einer glycingepufferten Salzlösung oder in PBS gewaschen. Schließlich können die Latexteilchen mit dem darauf aufgebrachten Überzug von dem ßp-Humanmikroglobulin-Antikörper in Form einer Suspension in einem Verdünnungsmittel gelagert werden. Das Verdünnungsmittel ist vorzugsweise eine Mischung, die durch Zugabe von

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etwa 0,1 % BSA zu einer glycingepufferten Salzlösung oder zu PBS erhalten vrurde. Es wird ferner "bevorzugt, dem Verdünnungsmittel 0,01 "bis 0,5 % von Natriumazid (NaN,) zuzusetzen.

Die Zusammensetzung zur Bestimmung von ß^-Humanmikroglobulin gemäß der Erfindung kann in Form eines Latices, wie vorstehend "beschrieben, und auch in Form eines getrockneten Produktes vorliegen. Die Zusammensetzung in Form eines getrockneten Produktes kann erhalten werden, indem man einen Stabilisator, z.B. eine Aminosäure (z.B. Glycin oder Natriumglutamat) oder Dextran zu dem vorstehend "beschriebenen Verdünnungsmittel zusetzt, die Latexmasse mit dem darauf befindlichen Überzug des ßo-Humanmikroglobulin-Antikörpers in dem Verdünnungsmittel suspendiert und die Suspension gefriertrocknet. Die Mengen von Aminosäuren und Dextran sind etwa 1,2 bis etwa 4 Gew.Teile, beziehungsweise etwa 1,6 bis etwa 6 Gew.Teile je 1 Gew.Teil Latexteilchen.

Die Zusammensetzung zur Bestimmung von ß2-Humanmikroglobulin gemäß der Erfindung besitzt eine gute Stabilität sowohl in Form eines Latices als auch in Form eines getrockneten Produktes. Das getrocknete Produkt kann während einer längeren Zeitdauer beispielsweise während mehrerer Jahre stabil gelagert werden.

Gemäß der Erfindung wird ein Verfahren zur Bestimmung von ß2-Humanmikroglobulin geschaffen, nach welchem ßp-Humanmikroglobulin in menschlichem Urin oder Serum unter Verwendung der Zusammensetzung, die synthetische Polymerlatexbeilchen und als Überzug auf den Oberflächenlatexteilchen einen ß^-Humanmikroglobulin-Antikörper umfaßt, qualitativ oder quantitativ bestimmt wird.

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Zur Bestimmung können an sich bekannte Maßnahmen zur Anwendung gelangen; beispielsweise kann die Konzentration von ßg-Mikroglobulin in Serum oder "Urin nach einem Mikrotiterverfahren mühelos bestimmt werden. Gemäß dieser Arbeitsweise wird eine bestimmte Menge eines Verdünnungsmittels der vorstehend erläuterten Art anteilsweise auf eine Mikroplatte gegossen und dann wird eine bestimmte Menge einer Versuchsprobe, z.B. von Serum oder Urin in die erste Bohrung oder den ersten Boden eingeführt und allmählich mit einem Verdünner verdünnt. Ebenfalls wird eine Verdünnungsreihe in der gleichen Weise unter Verwendung eines Standardantigens hergestellt. Eine bestimmte Menge eines mit ß2-Humanmikroglobulin-Antikörpers sensibilisierten Latices zu jeder Verdünnungsreihe zugegeben und damit gemischt. Bach Stehenlassen während einer bestimmten Zeitdauer bei Eaumtemperatur wird der Endpunkt der Agglutination beobachtet und die absolute Menge von ßg-Mikroglobulin kann durch Vergleich mit der Standardantigenreihe bestimmt werden.

Bei dem gebräuchlichen Verfahren der Einzelradialimmunodiffusion zur Bestimmung von ßp-Mikroglobulin kann das ß2~Mikroglobulin nicht bestimmt werden, wenn nicht dessen Menge wenigstens 5 /U-g je ml einerVersuchsprobe beträgt, falls die Versuchsprobe Serum oder Urin ist. Da die Neigung zum Auftreten von Fehlern bei einem ß₂-Mikroglobulingehalt von etwa 5 bis 10 /Ug besteht, wird eine etwas höhere Konzentration bevorzugt. Im Gegensatz dazu ist es bei dem Verfahren zur Bestimmung von ßg-Mikroglobulin gemäß der Erfindung unter Verwendung des mit dem ß2-Eiimanmikroglobulin-Antikörper sensibilisierten Latices möglich, eine Bestimmung auszuführen, wenn die Menge von ß2-Mikroglobulin mehr als 1 ng je ml beträgt. Somit zeigt das Verfahren gemäß der Erfindung eine sehr hohe Empfindlichkeit, und die Empfindlich-

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keit ist derjenigen äquivalent

oder höher als diese der Radioimmunoassay-Methode, die als eine Methode mit der höchsten Empfindlichkeit bei gebräuchlichen Analysen angesehen wird.

Bei einer anderen Ausführungsform der Bestimmung gemäß der Erfindung wird eine bestimmte Menge einer Versuchsprobe auf eine Objektträgerglasplatte getropft, und getrennt davon wird eine festgelegte Menge einer ßo-Humaninikroglobulinlösung von einer bekannten Konzentration tropfenweise zugegeben. Eine bestimmte Menge des mit dem ßp-Huaanmikroglobulin-Antikörper sensibilisierten Latices wird zu jeder der Lösungen zugegeben, worauf eine schwache Schwingbewegung erteilt wird. Bei Bewertung des sich ergebenden Agglutinationsmusters kann die Konzentration von dem ßp-Humanmikroglobulin in der Versuchsprobe innerhalb weniger Minuten qualitativ bestimmt werden. Eine halbquantitative Bestimmung kann ebenfalls ausgeführt werden, wenn die Versuchsprobe in einem Probeglas verdünnt wird und die Reaktion mit Bezug auf die jeweilige Verdünnung beobachtet wird.

Die Zusammensetzung für die Bestimmung von ß^-Humanmikroglobulin in Form eines Latices oder in Form eines getrockneten Produktes ist den Zusammensetzungen überlegen, die durch Überziehen von roten Blutkörperchen oder anderen iCrägermaterialien mit ßp-Humanmikroglobulin erhalten wurden, da aufgrund des Fehlens eine Antigenizität des Trägers selbst nicht—spezifische Reaktionen außer der gewünschten Antigen-Antikörperreaktion nicht stattfinden, und weil ein ßp-Humanmikroglobulin-Antikörper direkt auf einen Latex mühelos durch einfaches Eintauchen einer Antikörperlösung in den Latex ohne Verwendung eines Binders als Überzug aufgebracht werden kann, und weil sie eine gute

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Lagerstabilität besitzt.

Die neuartige Zusammensetzung gemäß der Erfindung, welche Latexteilchen und einen darauf als Überzug aufgebrachten ß^-Humanaikroglobulin-Antikörper umfaßt, reagiert überhaupt nicht mit anderen Proteinen als dem ßg-Humanmikroglobulin und der träger reagiert ebenfalls nicht mit ßo-Mikroglobulin. Aufgrund dieser Tatsache kann gesagt werden, daß der ßo-Humanmikroglobulin-Antikörper an die Trägerlatexteilchen gebunden ist.

Die Erfindung wird nachstehend anhand von Herstellungsbeispielen und Arbeitsbeispielen näher erläutert.

Herstellungsbeispiel 1

Herstellung von ßo-Humanmikroglobulin:

C.

Ein Kilogramm Ammonium sulfat wurde zu etwa 2 1 Urin eines an Nierenentzündung erkrankten Patienten gegeben und die Lösung wurde über Nacht bei 4 ⁰C stehengelassen. Die gebildete Ausfällung wurde gesammelt und in Wasser gelöst. Das unlösliche Material wurde durch Zentrifugierung abgetrennt und die Ausfällung wurde in Salzlösung aufgelöst und auf eine Sephadex G100-Säule (ein Produkt von Pharmacia Pine Chemicals Co., Ltd., Schweden) (5 χ 100 cm), gepuffert mit einer 0,02M Erispufferlösung (pH 8,0) mit einem Gehalt von 1M Natriumchlorid aufgebracht. Der Puffer wurde bei einem Strömungsausmaß von 40 ml/h fließen gelassen, um eine Gelfiltration auszuführen. 400 ml eluierter Fraktionen wurden gesammelt, entsalzen und auf ein Volumen von 10 ml konzentriert. Dann wurde das Produkt auf eine DEAE-Cellulose-Säule (ein Produkt von Brown Company, USA) (2,5 x 40 cm) gepuffert mit einem 0,01 M Phosphatpuffer (pH 7,5) aufge-

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bracht und die Eluierung wurde ausgeführt, während die Konzentration von Natriumchlorid in dem Puffer linear auf 0,2 Mol zunahm. 70 ml einer Proteinfraktion, die an erster Stelle eluiert wurde, wurde gesammelt, entsalzen und auf 10 ml konzentriert. Die Flüssigkeit wurde auf eine SP-Sephadex C 50-Säule (Pharmacia Fine Chemicals Co., Ltd., Schweden) (2 χ 35 cm), gepuffert mit einem 0,OA-M Phosphatpuffer (pH 5_S9) aufgebracht und die Eluierung wurde bei einem Strömungsausmaß von 25 ml je h ausgeführt, wobei die Konzentration des Puffers linear auf 0,02 Mol erhöht wurde. 100 ml von Fraktionen von 73 ml bis 175 ml Eluat wurden gesammelt, entsalzen, konzentriert und gefriergetrocknet, wobei 60 ml eines weißen Pulvers erhalten wurden.

Das Produkt zeigte ein einzigesBand bei der Scheibenelektrophorese.

Herstellungsbeispiel 2

Herstellung von ß^-Humanraikroglobulin-Antikörper:

Das im Herstellungsbeispiel 1 erhaltene ßp-Humanmikroglobulin wurde in einer physiologischen Salzlösung in einer Konzentration von 4 mg/ml der letzteren aufgelöst. Die Lösung wurde mit einer gleichen Menge eines vollständigen Freund¹sehen Hilfsmittels vermischt. Die Mischung wurde in einer Menge von 0,1 ml in jedes Faßpolster von 4- gesunden Kaninchen mit einem Gewicht von etwa 2,3 bis2,5 kg dreimal in der Woche eingespritzt. Eine Voche später wurde 1 ml einer 0,1 %igen ßp-Humanmikroglobulinlösung indiziert. Drei Wochen nach der letzten Injektion wurde das Gesamtblut aus der Halsschlagader der Kaninchen entnommen. Das Blut wurde in üblicherweise zentrifugiert und das sich ergebende Serum wurde bei 56 ⁰C während 30 min gehalten, wobei etwa 200 ml Antiserum

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gebildet wurden.

Aus der Tatsache,daß ein einziges Ausfällungsband mit einem Antigen nach einem Ouchtalony-Terfahren und nach der Immunoelektrophorese gebildet wurde, wurde festgestellt, daß das sich ergebende Antiserum ein einziger Antikörper war.

Herstellunpisbeispiel 3

Herstellung von unlöslichem ß^-Humanmikroglobulin:

5 mg von ßp-Humanmikroglobulin wurden in 5 ml einer 0,2M Essigsäur epufferlösung (pH 5»0) gelöst und etwa 0,5 ml einer 5 %igen Rinaerserumalbuminlösung wurden zugegeben. Dann wurde 5 %iger Glutaraldehyd tropfenweise zugegeben, bis eine Ausfällung gebildet wurde. Die Ausfällung wurde gesammelt, homogenisiert und mit EBS und dann mit einem Glycin-Salzsäure-Euffer (pH 2,8) und ferner mit EBS gewaschen und bei unter -20 ⁰C gelagert.

Herstellungsbeispiel 4

Eeinigung von ßp-Humanmikroglobulin-Antikörper:

Zu dem Antiserum wurde eine gleiche Menge einer gesättigten Lösung von Ammoniumsulfat ,gegeben, worauf vollständig gemischt wurde. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur während 30 min stehengelassen. Die sich dabei bildende Ausfällung wurde durch Zentrifugalabscheidung gesammelt, mit 0,5 gesättigter Lösung von Ammoniumsulfat gewaschen und dann gegen EBS dialysiert. Dann wurde das im Herstellungsbeispiel 3 hergestellte unlösliche ßp-Humanmikroglobulin zu dem Dialysat zugegeben und die Mischung wurde anschließend bei Saumtemperatur

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30 min stehen-gelassen. Die Mischung wurde zur Trennung in eine überstehende Flüssigkeit und in eine Abscheidung zentrifugiert. Zu der überstehenden Flüssigkeit wurde erneut unlösliches ßo-Humanmikroglobulin zugegeben und die Mischung wurde in gleicher Weise behandelt. Die zwei Ausfällungen wurden vereinigt und mit PBS gewaschen. Dann wurde ein Glycin-Salzsäure-Puffer (pH 2,8) zugegeben und die Mischung wurde 5 min lang geschüttelt, worauf zentrifugiert wurde. Die Ausfällung wurde in ähnlicher Weise mit einem Glycin-Salzsäure-Puffer behandelt und die sich ergebenden überstehenden Flüssigkeiten vereinigt. Die Mischung wurde gegen PBS dialysiert, wobei ein gereinigter ßg-Humanmikroglobulin-Antikörper gebildet wurde.

Arbeitsbeispiel 1

Mit ßo-Humanmikroglobulin-Antikörper sensibilisierter Latex:

Polystyrollatex (ein Produkt von Takeda Chemical Industry Co., Ltd; SDL 59; spezifisches Gewicht 1,14; Teilchendurchmesser 0,9 /tun) wurde mit PBS so verdünnt, daß die Konzentration der Teilchen 0,25 % erreichte, worauf eine gleiche Menge eines gereinigten Antikörpers, der bis auf das 60-fache mit PBS verdünnt wurde, zugegeben wurde. Die Mischung wurde bei 37 ⁰C während zwei Stunden gehalten, worauf . zentrifugiert wurde. Die Latexteilchen wurden gesammelt und mit PBS und dann mit einem Verdünnungsmittel gewäsehen. Danach wurden die Latexteilchen bis auf eine Konzentration von 0,25 % unter Verwendung eines Verdünnungsmittels suspendiert, wobei ein mit ß2-Humanmikroglobulin-Antikörper sensibilisierter Latex gebildet wurde.

Wenn eine ß2-Humanmikroglobulinlösung zu diesem sensibilisierten Latex zugegeben wurde, trat eine Agglutination ein. Es fand jedoch keine Agglutination statt, wenn Albumin-,

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IgG-, IgM- und IgA-Lösungen jeweils hierzu zugegeben wurden.

Das verwendete Verdünnungsmittel war PBS mit einem Gehalt an 0,08 % BSA und 0,1 % Natriumazid.

.Arbeitsbeispiel 2

Bestimmung von ßo-Humanmikroglobulin:

Ein Verdünnungsmittel in einer Menge von 0,025 ml wurde jeweils in eine Bohrung einer Mikroplatte vom V-Ί^ρ gegossen und 0,025 ml Serum oder eines mit einem geeigneten Verdünnungsmittel verdünnten SeruEB wurden der ersten Bohrung zugegeben und mit einem Verdünner nach einem Reihendoppelverdünnungsverfahren allmählich verdünnt. Ferner wurden 0,025 ml einer Standardlösung mit einem Gehalt von 0,01 >ug ßp-Humanmikroglobulin je ml der ersten Bohrung einer weiteren Reihe zugegeben und in gleicher Weise verdünnt. Dann wurden 0,025 ml des mit ß2-Humanmikroglobulin-Antikörper sensibilisierten Latices in jede der Bohrungen gegossen und nach ausreichendem Vermischen bei Raumtemperatur während mehr als 10 h stehengelassen, um den Endpunkt der Agglutination zu beobachten. Wenn eine Antigen-Antikörper-Reaktion stattfand, wurden die Latexteilchen auf der gesamten Oberfläche des Bodens einer Bohrung dispergiert. Wenn keine Antigen-Antikörper-Reaktion stattfand, sammelten sich die Latexteilchen in der Mitte von jeder Bohrung. Auf diese Weise kann der Endpunkt der Agglutination bewertet werden. Nach dem vorstehend angegebenen Verfahren wurde die Menge von ßo-Mikroglobulin mit Bezug auf sieben Proben von Serum, das auf das 100-fache verdünnt war, und sieben Proben von Urin, der auf das 50-fache verdünnt war, bestimmt. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle I zusammengestellt.

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Tabelle I : LatexagRlutinationswert

Probe

Konzentration von
Standard-ßo-Mikroglobulin

Agglutationsmuster

(ng/ml)

2,5 1,25 0,625 0,312 0,156 0,078 0,03S

Konz entration in der Probe (ng/ml)

Gesunder Erwachsener (32 Jahre

alter Mann)

Gesunder Erwachsener (43 Jahre

alter Mann)

Gesunder Erwachsener (22 Jahre

alter Mann)

Leukämie-Patient (9 Jahre alt,

männlich)

53 Jahre alter Mann, erkrankt an Magenkrebs

62 Jahre alter Mann, erkrankt an Nierenversagen

32 Jahre alte Frau, erkrankt an SLE

0,5 1

8 8

über 8

Gesunder Erwachsener (32 Jahre

alter Mann) Gesunder Erwachsener (43 Jahre

alter Mann) Gesunder Erwachsener (22 Jahre

alter Mann)

57 Jahre alter Mann mit Knochenmarkerkrankung (Myeloma)

9 Jahre alt, männlich, erkrankt an Leukämie

62 Jahre alter Mann, erkrankt an Nierenversagen

32 Jahre alte Frau, erkrankt an SLE 0,25 0,13 0,25

über 8 Ot <

Anmerkung

+: positiv; -: negotiv

Arbeitsbeispiel 5

Bestimmung von ßo-Humanmikroglobulin durch Objektglas-Aggregation (Slide Aggregation):

Polystyrollatex (ein Produkt von Dow Chemical; Teilchendurchmesser 0,22 + 0,006 /um; spezifisches Gewicht 1,05) wurde mit einem Glycin-Natriuachlorid-Puffer (pH 8,4) auf 1 % verdünnt und eine gleiche Menge des gereinigten Antikörpers wurde zugegeben. Die Mischung wurde über Nacht bei 4 ⁰C stehengelassen und dann zentrifugiert, wobei der Latex abgetrennt wurde. Der Latex wurde einmal mit einem Glycin-Natriumchlorid-Puffer gewaschenund auf eine Konzentration von 1 % in einem Glycin-Natriumchlorid-Puffer mit einem Gehalt von 1 % BSAsuspendiert, wobei ein sensibilisierter Latex gebildet wurde.

50 yul einer ßp-Humanmikroglobulin-Lösung mit einer Konzentration von 400 ng/ml, 200 ng/ml, 100 ng/ml, 50 ng/ml oder 25 ng/ml wurden getrennt tropfenweise auf ein Objektglas aufgebracht. Dann wurden 50 /Ul des erhaltenen sensibilisierten Latices tropfenweise auf die Oberseite jeweils zugegeben und unter sanftem Rühren während einiger Minuten wurde die Reaktion beobachtet. Ein Agglutinationsmuster erschien, wenn die Konzentration der ßo-Humanmikroglobulinlösung 400 ng/ml, 200 ng/ml und 100 ng/ml betrug. Es trat jedoch kein Agglutinationsmuster in Erscheinung bei einer Konzentration von 50 ng/ml und 25 ng/ml.

Nach der vorstehend angegebenen Arbeitsweise wurde der Gehalt an ß2-Humanmikroglobulin bei sechs Beispielen von Seren und

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sechs Beispielen von Urin bestimmt. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle II zusammengefaßt.

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Tabelle II: Latexagglutinationswert

Fersuchsprobe	Agglutinations muster	Serum (verdünnt auf das 50-fache)	—	Konzentration in der Probe	100 50 25 + +
Gesunder Erwachsener (32 Jahre alter Mann)
Gesunder Erwachsener (43 Jahre alter Mann)	+	weniger als 2,5 g/nl
Gesunder Erwachsener (22 Jahre alter Mann)	+	It
Leukämie-Patient (9 Jahre alt, männlich)	+	M
62 Jahre alter Mann, er krankt an Hierenversagen		mindestens 5 g/ml
J2 Jahre alte Frau, erkrankt an SLE	_	[I
Urin (verdünnt auf das 10-fache)	_	η
Gesunder Erwachsener (32 Jahre alter Mann)	—
Gesunder Erwachsener (43 Jahre alter Mann)	+ +	weniger als 0,5 g/ml
Gesunder Erwachsener (22 Jahre alter Mann)	+	It
Leukämie-Patient (9 Jahre alt, männlich 62 Jahre alter Mann, erkrankt an Nierenversagen		It
32 Jahre alte Prau, erkrankt an SLE	400 200 ++ +	mindestens 1 g/ml 11
Kontrolle	Il
Konzentration der Standard- ß₂-Mikroglobulinlösung (ng/ml) Agglutinationsmuster

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Arbeitsbeispiel 4

Durch Ausführung einer Behandlung in gleicher Weise wie in Arbeitsbeispiel 1 wurde ein Latex sensibilisiert, gewaschen und in einem Verdünnungsmittel mit einem Gehalt von 0,5 % Glycin und 0,7 % Dextran T-10 (ein Produkt von Pharmacia Pine Chemicals Co., Ltd., Schweden) so suspendiert, daß die Konzentration der Latexteilchen 1,25 % erreichte. Die Suspension wurde dann in üblicher Weise gefriergetrocknet, wobei eine Zusammensetzung von Latexteilchen mit einer Empfindlichkeit gegenüber einem ßp-Humanmikroglobulin-Antikörper erhalten wurde.

Arbeitsbeispiel 5

Ein Verdünnungsmittel wurde zu der in Arbeitsbeispiel 4 erhaltenen Latexteilchenzusammensetzung mit einer Empfindlichkeit gegenüber ίϊρ-Humanmikroglobulin-Antikörper zugegeben. Bei Ausführung der gleichen Arbeitsweise wie in Arbeitsbeispiel 2 wurde dann die Menge von 3p-Mikrogibbulin in Serum und Urin bestimmt. Es wurden dabei ähnliche Ergebnisse erhalten.

Aus den in den vorstehenden Beispielen erhaltenen Ergebnissen ist klar ersichtlich, daß die Menge von ßp-Mikrοglobulin in Serum und Urin von Patienten, die an verschiedenen Krankheiten erkrankt sind, einen offensichtlich höheren Wert als derjenige in den Seren und Urinflüssigkeiten von gesunden Erwachsenen zeigten. Demgemäß ist die Bestimmung der Menge von ßp^-Mikroglobulin in Blut und Urin äußerst wertvoll für die Diagnose von diesen Erkrankungen.

Getrennt wurde die Menge von ß₂-Mikroglobulin in dem Serum

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und in Urin von Menschen gemessen, wobei ein mit ßp-Humanmikroglobulin-Antikörper sensibilisierter Latex, hergestellt aus dom Antiserum einer Ziege unter Anwendung der gleichen Arbeitsweise wie in Herstellungsbeispiel 4 und in den nachfolgenden Arbeitsbeispielen, verwendet wurden. Die Ergebnisse waren völlig die gleichen wie in den vorstehend aufgeführten Tabellen.

Unter Verwendung des mit ßp-Humanmikroglobulin-Antikörper sensibilisierten Latices oder der den sensibilisierten Latex gemäß der Erfindung enthaltenden Zusammensetzung kann die Menge von ßo-Mikroglobulin innerhalb einer kürzeren Zeitdauer gemessen werden, wenn eine Probe (menschliches Serum oder menschlicher Urin) in einer sehr geringen Menge von weniger als 0,03 el vorhanden ist. Die Empfindlichkeit ist äußerst hoch und ein ng von ß^-Mikroglobulin je 1 ml der Versuchsprobe kann bestimmt werden. Demgemäß gewährt die Zusammensetzung gemäß der Erfindung eine wichtige und brauchbare Information für die Diagnose von Leukämie, Nierenerkrankungen, Entzündungen oder dergleichen, und ihr Anwendungsbereich ist sehr breit. Da ferner die Menge der Versuchsprobe sehr gering sein kann, ist die Zusammensetzung gemäß der Erfindung besonders geeignet für Kinder, insbesondere für Neugeborene und Säuglinge, von welchen lediglich eine kleine Blutmenge ent -nommen werden kann.

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Claims

Pat ent ansprüciie

1J Zusammensetzung zur Bestimmung von ßo-Humanmikroglobulin, ■bestehend aus synthetischen Polymerlatexteilchen und einem als Überzug auf die Oberflächen der Latexteilchen aufgebrachten ß2-Humanmikroglobulin-lntikörper.
2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Latexteilchen einen mittleren Teilchendurchmesser von 0,01 bis 10 yum besitzen.
3. Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Latexteilchen ein spezifisches Gewicht von 0,9 bis 1,4 besitzen.
4. Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie ferner einen Stabilisator aus der Gruppe von Aminosäuren und Dextran enthält.
5. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die synthetischen Polymerlatexteilchen Teilchen eines synthetischen Polymerlatex vom Styroltyp aus der Gruppe von Laticesvon Styrolpolymeren, Styrolcopolymeren und den carboxylierten oder aminohaltigen carboxylierten Produkten hiervon sind.
6. Zusammensetzung zur Bestimmung von ßo-Humanmikroglobulin nach Anspruch 1, bestehend aus Teilchen eines synthetischen Polymerlatices vom Styroltyp mit einem mittleren Teilchendurchmesser von 0,01 bis 10/um und einem spezifischen Gewicht von 0,9 bis 1,4, aus der Gruppe von Styrolpolymeren, Styrolcopolymeren und den carboxylierten oder aminohaltigen carboxylierten Produkten hiervon, und einem auf die Oberflächen

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der Latexteilchen als Überzug aufgebrachten ßo-Eumanmikroglobulin-Antikörper.
7· Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß sie in Form eines Latices vorliegt.
8. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß sie in Form eines getrockneten Produktes von dem Latex vorliegt.
9..Verfahren zur Bestimmung von ßp-Humanmikroglobulin, dadurch gekennzeichnet, daß man in menschlichem Urin oder Serum unter Verwendung einer Zusammensetzung, bestehend aus synthetischen Polymerlatexteilchen und einem auf die Oberfläche der Teilchen als Überzug aufgebrachten ßg mikroglobulin-Antikörper qualitativ oder quantitativ g mikroglobulin bestimmt.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Bestimmung unter Anwendung eines Mikrotiterverfahrens ausgeführt wird.
11. Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung zur Bestimmung von ßp-Humanmikroglobulin, bestehend aus synthetischen Polymerlatexteilchen und einem auf die Oberfläche der Teilchen als Überzug aufgebrachten ßp-Eumanmikroglobulin-Antikörper, dadurch gekennzeichnet, daß man einen synthetischen Polymerlatex mit einer Konzentration von 0,05 bis 5 % mit einem ßp-Humanmikroglobulin-Antikörper mit einer Konzentration von 0,0001 bis 1 % in einem Puffer bei einem pH von etwa 5 bis etwa 10 bei einer Temperatur von etwa 4 bis etwa 40 C in Berührung bringt.

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