DE2529937A1

DE2529937A1 - Serologisches reagenz und verfahren zu seiner herstellung

Info

Publication number: DE2529937A1
Application number: DE19752529937
Authority: DE
Inventors: Shigetaka Matsuzawa; Yukio Sato; Seijun Wada
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1974-07-08
Filing date: 1975-07-04
Publication date: 1976-01-29
Also published as: JPS5443572B2; JPS519716A; DE2529937C2; GB1503547A; NL7508139A; US4060597A

Description

Die Erfindung betrifft eine Verbesserung eines Latex-Reagenz für serologische Reaktionen.

Die Bestimmung von antigenen Substanzen, wie Bakterien oder Viren, oder deren Zersetzungsprodukten sowie ihrer Antikörper ist ein extrem wichtiges Verfahren für die Diagnose von Krankheiten, wozu mittels einer Vielzahl von Techniken Tests durchgeführt werden, die in solche Hauptkategorien, wie Agglutinierungsreaktionen (einschließlich Agglutinierungs-Inhibierungs-Reaktionen), Sedimentationsreaktionen, Komplement-Ιο Fixierungsreaktionen usw. eingeteilt werden können.

Australia-Antigen (auch bekannt als "Hepatitis-assoziiertes Antigen") tritt insbesondere im menschlichen Serum auf, welches mit Transfusions-assoziiertem Hepatitis-Virus infiziert ist, und wird als Transfusions-assoziiertes Hepatitis-Virus oder als eine diesem Virus eng assoziierte Substanz angesehen. Daher wurden zahlreiche Tests entwickelt, weil die Bestimmung dieses Antigens nicht nur eine unvermeidliche Prozedur in der Prophylaxe von Transfusions-assoziierter Hepatitis, sondern auch extrem wirksam in der Prognose von Hepatitis-Patienten und bei der Abschätzung von therapeutischen Effekten ist.

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Ein weiteres Beispiel ist die Verwendung zur Bestimmung des ; Rheumafaktors. Ein Patient mit chronischer rheumatischer Arthritis, die eine typische auto-immune Krankheit ist, erzeugt Rheumafaktor, der ein Auto-Antikörper gegenüber mensch-5 lichem Immunglobulin G (nachfolgend wird Immunglobulin G als j IgG bezeichnet) ist. Da durch die Bestimmung dieses Rheumafaktors chronische rheumatische Arthritis diagnostiziert werden kann, sind bis heute so zahlreiche Tests, wie der Waaler-Rose-Test, der modifizierte Heller-Test und die Agglutinierung von mit menschlichem IgG sensibilisierten Latexteilchen vor-_: geschlagen worden, in all denen die Gegenwart des Rheumafaktors im Serum mittels der Agglutinierungsreaktion geprüft wird.

Unter diesen Tests für verschiedene Antigene und Antikörper haben sich die auf der Agglutinierungsreaktion beruhenden Techniken (einschließlich der Agglutinierungs-Inhibierungs-Reaktion), bei denen ein teilchenförmiger Träger verwendet wird, der etwas serologisch aktive Substanz aufweist, z.B. ein darauf absorbiertes Antigen oder einen Antikörper, als nützlich erwiesen und SensibiIlsierungsmethoden sind allgemein gebräuchlich. Als gebräuchliche teilchenförmige Träger können unter anderem erwähnt werden menschliche und tierische; Erythrocyten und andere Zellen, Mikroben-Zellen, Kollodiumteilchen, Kaolin, Bentonit, Aktivkohle, Cellulosederivate, .

ψϊ> Latexteilchen (z.B. Teilchen von Naturkautschuk oder synthe- :

ι

tischem Kautschuk, Polystyrollatex, Polyvinyltoluollatex) usw. Jedoch haben viele von ihnen nur begrenzte Anwendungs- ', bereiche, da viele solcher Paktoren, wie die Kapazität des Trägers zur Adsorption der serologisch aktiven Substanz, seine Lebensdauer, seine Empfindlichkeit und, wenn Zellen verwendet werden, das Absterben oder Verderben der Zellen, nur um einige zu nennen, eine Rolle spielen. Polystyrollatex,ι der ein synthetisches Produkt darstellt, hat eine längere Lebensdauer als andere Träger und beeinträchtigt, trotz der Tatsache, daß Proteine und andere Stoffe fest gebunden werden,

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die antigenen Eigenschaften der gebundenen Proteine praktisch nicht. Wegen dieser beim Polystyrollatex entdeckten erwünsch-' ten Eigenschaften wurde er als Rohmaterial für eine große Anzahl von serologischen klinischen Te st reagent ien verwendet.

Bei den angewendeten Herstellungsverfahren ändert sich der | Polystyrollatex hinsichtlich seiner kolloidchemischen Eigen- ■ schäften und im Verhalten während der serologischen Reaktionen, und während ein Polystyrollatex, der eine außerordentlich große kolloidchemische Stabilität aufweist, keine serologischen Agglutinierungsreaktionen mehr verursacht, unterliegt \ ein instabiler Latex nicht-spezifischer spontaner Agglutina-

tion, so daß er nicht als serologisches Reagenz verwendet werden kann.

Aufgrund dieser Probleme sind beträchtliche Schwierigkeiten mit der Herstellung eines Polystyrollatex für serologische Reaktionen verbunden,und die üblichen Polystyrollatizes für serologische Reaktionen weisen die folgenden bekannten Nachteile auf:

1) Die mit verschiedenen Antigenen oder Antikörpern sensibilisierten Latizes neigen oft während der Lagerung zu spontaner Agglutinierung.

2) Selbst wenn der Latex von einem Typ ist, der während der Lagerung nicht zu spontaner Agglutinierung neigt, unter- " liegt er manchmal einer nicht-spezifischen Agglutinierung i . nach Vermischen mit dem Testserum, was zu einer falschen Diagnose führt.

5) Selbst wenn eine serologische Agglutinierungsreaktion negativ ist, gibt es Fälle, in denen der Latex bis zu einem ge* wissen Ausmaß von einer spontanen Agglutinierung betroffen ist, so daß der Latex ein etwas grobes Aussehen hat mit dem Ergebnis, daß in Tests wie bei einer Wirkungsprobe die Ab-'

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Schätzung der Ergebnisse manchmal schwierig wird.

Man könnte denken, daß es durch Verbesserungen der vorstehenden Nachteile möglich würde, die Eigenschaften von serologischen Diagnostik-Reagentien, hergestellt aus Polystyrollatexteilchen, zu verbessern und daß gleichzeitig neue Testmethoden entwickelt werden könnten. Wenn man jedoch daran denkt, die obigen Nachteile durch Verbesserung der kolloidchemischen Stabilität des Polystyrollatex zu eliminieren, werden serologische Agglutinierungsreaktionen unterdrückt. Anders ausgedrückt ist die Eigenschaft eines Reagenz, eine serologisch sensibilisierende Reaktion zu zeigen, eine Eigenschaft, die im Konflikt mit seiner kolloidchemischen Stabilität steht, so daß es bisher als extrem schwierig angesehen wurde, gleichzeitig diese beiden Erfordernisse zu erfüllen. !

Bei der gegebenen technischen Situation wurde nun überraschenderweise gefunden, daß ein überlegenes Latexreagenz für serologische Reaktionen, welches von den vorstehend geschilderten! Nachteilen frei ist, erhalten werden kann, wenn man an Latexteilchen oberflächenaktive Mittel eines speziellen Typs, z.B.

ein nicht-ionisches oberflächenaktives Mittel vom Äthylenoxyd-Typ adsorbieren läßt, diese Latexteilchen mit einer serologisch wirksamen Substanz, z.B. einem Antigen oder einem Antikörper, sensibilisiert und die sensibilisierten Latexteilchen in einem wäßrigen Lösungsmittel suspendiert.

Es ist daher Hauptgegenstand der Erfindung, ein Latexreagenz für serologische Reaktionen mit verbesserter Qualität bereitzustellen. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung dieses verbesserten Latexreagenz. Schließlich umfaßt die Erfindung weiter einen Basislatex o für serologische Reaktionen mit verbesserter Qualität.

Die Aufgabe der Erfindung wird gelöst, indem die Latexteilchen einer besonderen Reihenfolge von Verfahrensschritten

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unterworfen werden, d.h. indem man nicht-ionisches oberflächenaktives Mittel vom Äthylenoxyd-Typ an den Latexteilchen ₍ adsorbiert, die mit dem oberflächenaktiven Mittel beladenen Latexteilchen mit einer serologisch wirksamen Verbindung sen-, sibilisiert und die sensibilisierten Latexteilchen in -einem wäßrigen Lösungsmittel suspendiert.

Für die Zwecke der Erfindung können als Roh-Latizes sämtliche Latizes verwendet werden, die zur Herstellung von Latexreagentien für serologische Zwecke eingesetzt werden. Als Beispiele Lo für solche Rohlatizes seien Naturkautschuklatex und die Lati-,

zes von Kunstharzen, wie die Homo- und Copolymeren von Styroli oder dessen Derivaten (Methylstyrol, Äthylstyrol, Chlorstyrol), Olefine (z.B. Äthylen, Propylen), Acrylsäure oder deren Deri— j vate (Methylacrylat, Äthylacrylat), Methacrylsäure oder deren Derivate (Methylmethacrylat, Äthylmethacrylat, Acrylnitril, Acrylamid), Diene (Butadien, Chloropren, Isopren), Vinylchlorid, Vinylidenchlorid, Vinylacetat usw. genannt. Vorteilhaft sind die Latizes von Homo- oder Copolymeren von Styrol, Chlorstyrol, Methylmethacrylat, Vinylchlorid und I Vinylidenchlorid. Unter diesen Latices haben die Homopolymeren von Chlorstyrol, Vinylchlorid oder Vinylidenchlorid und die Copolymeren dieser Verbindungen mit anderen Monomeren (z.B. Styrol) ein spezifisches Gewicht ähnlich dem von Erythrocyten, d.h. von etwa 1,2 - 0,05· Daher werden Latexreagentien aus solchen Latices erfindungsgemäß angewendet für quantitative serologische Reaktionen mittels der an sich bekannten Mikrotitrationstechnik zusätzlich zu qualitativen serologischen Reaktionen. I

Ein solcher Rohlatex wird im allgemeinen vorteilhaft in Teilchengrößen von etwa 0,1 bis 1 λλ, insbesondere von etwa 0,3 bis etwa 0,9 M, verwendet.

Als nicht-ionische oberflächenaktive Mittel vom Äthylenoxyd-Typ werden vorteilhaft Blockcopolymeren von Äthylenoxyd und

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Polyoxypropylenglykol, Polyoxyäthylenalkyläther, Polyoxyäthylenalkylaryläther usw. verwendet. Die vorstehend genannten Blockcopolymeren von Äthylenoxyd und Polyoxypropylenglykol können durch ringöffnende Polymerisation von Äthylenoxyd und Polyoxypropylenglykol erhalten werden und haben die folgende Formel;

HO(CHg-CHgO )_a (CH-CHg-O)₁₃ (CHgCHgO)₀H

worin b eine Zahl im Bereich von 16 bis 66 und die Summe aus

a und c im Bereich von 2,5 bis 282 liegt. '.

JIo Von solchen Blockcopolymeren von Äthylenoxyd und Polyoxypro- : pylenglykol werden mit besonderem Vorteil solche verwendet, j die innerhalb ihrer Moleküle etwa 50 bis etwa 80 %, insbeson-¹ dere etwa 65 bis etwa 80 % Äthylenoxyd mit einem Molekulargewicht der hydrophoben Polyoxypropylenglykoleinheiten von etwa: 950 bis etwa 385O aufweisen. Als Beispiele von besonders ge- , eigneten Blockcopolymeren seien die handelsüblichen Blockcopolymeren (Wyandotte Chemical Corporation, USA) der Bezeichj nungen Pluronic F-38 (Äthylenoxydgehalt 80 %, Molekulargewicht j des Polyoxypropylenglykols 950), Pluronic F-68 (Äthylenoxyd- £0 gehalt 80 %, Molekulargewicht des Polyoxypropylenglykols 1750), Pluronic F-77 (Äthylenoxydgehalt 70 %, Molekulargewicht von Polyoxypropylen 2050) genannt. ^!

Von den vorstehend genannten Polyoxyäthylenalkyläthern sind ,

solche mit Alkylresten von 12 bis 18 Kohlenstoffatomen vor- \

£5 teilhaft. Als Beispiele seien Polyoxyäthylenlauryläther, j

Polyoxyäthylenoleylather, Polyoxyäthylencetyläther genannt. ^!

Als Polyoxyäthylenalkylaryläther sind solche vorteilhaft, \

deren Phenylreste mit Alkylresten mit 8 bis 18 Kohlenstoff- !

atomen substituiert sind. Als Beispiele seien hier Polyoxy- j

J5o äthylenoctylphenyläther, Polyoxyäthylennonylphenylather, j

Polyoxyäthylenlaurylphenyläther usw. genannt. Unter diesen | Polyoxyäthylenalkyläthern und Polyoxyäthylenalkylaryläthern

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werden mit besonderem Vorteil diejenigen verwendet, die etwa 250 bis 100 Mole, insbesondere etwa 30 bis etwa 70 Mole Äthylenoxyd im Molekül enthalten. Als Beispiele solcher Äther seien die handelsüblichen Produkte (Kai-ichi Kogyo Seiyaku, Japan) der Bezeichnung Emulsit 9 (Polyoxyäthylennonylphenyläther; J50 Mole Äthylenoxyd), Emulsit 25 (Poly oxy äthylennonylphenyläther; 50 Mole Äthylenoxyd), Emulsit 49 (Polyoxyäthylennonylphenylather; 70 Mole Äthylenoxyd), Emulsit L 16 (ein ; äquimolares Gemisch von Polyoxyathylenlauryläther und Poly- ' oxyäthylenmyristyläther; 40 Mole Äthylenoxyd), Emulsit L 36 , (ein äquimolares Gemisch von Polyoxyathylenlauryläther und ! Polyoxyäthylenmyristyläther; 60 Mole Äthylenoxyd) genannt.

Die Menge des nicht-ionischen oberflächenaktiven Mittels vom Äthylenoxyd-Typ, das an den Latexpartikeln adsorbiert wird, kann je nach der Art des Latex ausgewählt werden, wobei der Typ der in Frage kommenden serologischen Reaktion und andere

j Paktoren berücksichtigt werden. Im allgemeinen ist es vor- j teilhaft, daß das nicht-ionische oberflächenaktive Mittel ,

j vom Äthylenoxyd-Typ in Mengen von etwa 0,00001 bis etwa ' ο 5 Gew.-56, bezogen auf Latexteilchen, insbesondere von etwa ι 0,0001 bis etwa 1 Gew.-^ und für noch bessere Ergebnisse von j etwa 0,0001 bis etwa 0,1 Gew.-^ adsorbiert wird. Die Adsorption des nicht-ionischen oberflächenaktiven Mittels vom Äthylenoxyd-Typ wird zweckmäßig so durchgeführt, daß die I Latex-Teilchen mit dem oberflächenaktiven Mittel in einem * wäßrigen Medium, wie Wasser, in Berührung gebracht werden. Beispielsweise wird, nachdem ein Latex durch Emulsionspolymerisation oder andere geeignete Verfahren in einer Konzentration von etwa 5 bis 10 % hergestellt worden ist, das oberflächenaktive Mittel zugegeben, worauf das Gemisch bei Raumtemperatur stehengelassen wird. Nachdem die Adsorption des oberflächenaktiven Mittels ein Gleichgewicht erreicht hat, wird die überstehende Flüssigkeit verworfen, worauf die Latexteilchen in einem wäßrigen Medium redispergiert werden.

Gegebenenfalls kann diese Prozedur wiederholt werden. Wenn

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der Polymerlatex nach der Emulsionspolymerisation, die eine ' der üblichsten Methoden darstellt, hergestellt wird, kann das oberflächenaktive Mittel an den Latexteilchen durch Zu- ! gäbe des oberflächenaktiven Mittels zu dem Polymerisations- ; 5 reaktions-System bewirkt werden. Der so erhaltene Basis-Latex, an dessen Teilchen ein nicht-anionisches oberflächenaktives j Mittel vom Äthylenoxyd-Typ adsorbiert worden ist, zeigt ge- ! genüber bekannten Diagnostik-Latizes überlegene Stabilität.

Die Latexteilchen, an denen ein nicht-ionisches oberflächen- I aktives Mittel in der weiter oben beschriebenen Weise adsor- I { biert worden ist, werden dann mit einer serologisch wirksamen Substanz sensibilisiert, um ein Latexreagenz für serologische Reaktionen zu erhalten. Die serologisch wirksame Substanz kann beispielsweise eines der zahlreichen unterschiedlichen Anti- ^! ]L5 gene oder Antikörper sein, die für die Agglutinierung, Agglu-j tinierung-Inhibierung und andere serologische Reaktionen an- ' ! gewendet werden. Bei der Sensibilisierung der Latexteilchen i mit einer serologisch wirksamen Substanz können an sich be- \ kannte Sensibilisierungstechniken verwendet werden. Es ist £ vorteilhaft, die Latexteilchen mit der serologisch wirksamen j Substanz in einem wäßrigen Lösungsmittel, wie Wasser, einer < physiologischen Kochsalzlösung, einer Pufferlösung eines pH- ; Werts von insbesondere etwa 3*5 bis 9*5 (z.B. Glycinpuffer, \ Phosphatpuffer, Boratpuffer, Glycin-HCl-puffer, Glycin-NaCl- ί £5 puffer, Glycin-NaOH-puffer) in Berührung zu bringen. Im all- j gemeinen wird die Sensibilisierung durch Mischen einer die : serologisch wirksame Substanz enthaltenden Lösung mit dem ' : Basislatex und Stehenlassen der Mischung bewirkt. Falls gej wünscht, kann jedoch die Kontaktzeit durch Rühren oder Schütteln verringert werden. Als Beispiele für die genannten Lösungen, die eine serologisch aktive Substanz enthalten, seien' das Serum oder Plasma genannt, die solche aktiven Substanzen ■ enthalten, sowie die Suspensionen von gereinigten aktiven '< Substanzen. Insbesondere wird die Sensibilisierungsbehandlung !55 vorteilhaft bei einem pH-Wert von etwa 7,0 bis 8,6 und bei

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einer Temperatur von etwa 20 bis 3>7°C durchgeführt. Falls gewünscht, können nach der Sensibilisierungsbehandlung die verbleibenden Oberflächen der Latexteilchen mit Substanzen abgesättigt werden, die an den Latexteilchen adsorbierbar sind, j z.B. Rinderserumalbumin oder Pferdeserumalbumin.

Die so sensibilisierten Latexteilchen werden, nachdem sie j gegebenenfalls mit einem wäßrigen Lösungsmittel gespült wor- > den sind, in einem wäßrigen Lösungsmittel suspendiert. Als | wäßrige Lösungsmittel werden vorteilhaft Wasser, eine physio-Ιο logische Kochsalzlösung oder eine Pufferlösung eines pH-Werts von insbesondere etwa 3,5 bis 9*5 (z.B. Glycinpuffer, Phosphatpuffer, Boratpuffer, Glycin-HCl-puffer, Glycin-NaCl-puffer, ^! Glycin-NaOH-puffer) verwendet. Vom Standpunkt der praktischen Verwendung für serologische Reaktionen ist es im allgemeinen

vorteilhaft, die sensibilisierten Latexteilchen in einem wäß-I

rigen Lösungsmittel zu suspendieren, daß ein Produkt erhalten wird, welches die Latexteilchen bei der Verwendung in einer Menge von etwa 0,1 bis 5 Vol.-#, insbesondere von etwa 0,5 bis etwa 1 Vol.-^, bezogen auf das gesamte Produkt, enthält. Das so hergestellte Latexreagenz ist in dieser Form gebrauchsfertig, es kann jedoch durch zusätzliche erwünschte Ingredienzien wie Antiseptika (z.B. Natriumazid) ergänzt werden.

Das Latexreagenz gemäß der Erfindung kann für die Agglutinie-¹ rung, Agglutinierung-Inhibierung und andere serologischen Reaktionen auf an sich bekannte V/eise verwendet werden. Das -\ Latexreagenz für serologische Reaktionen gemäß der Erfindung i ist im wesentlichen gekennzeichnet durch die folgenden Vor- ■ teile gegenüber den bisher bekannten Latexreagentien für serologische Reaktionen: !

1. Es findet keine spontane Agglutinierung statt, selbst wenn j mit einer ziemlich hohen Konzentration einer Lösung eines kolloidchemisch instabilen Antigens sensibilisiert worden ist. Das bedeutet, daß sogar eine ziemlich schwache Anti-

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gen-Antikörper-Reaktion mit dem erfindungsgemäßen Latexreagenz bestimmt werden kannt.

2. Da der Latex selbst im sauren Bereich stabil ist, können

serologische Reaktionen in sauren Pufferlösungea erreicht 5 werden. Das ermöglicht die Testung von Antigen-Antikörper-Reaktionssystemen solcher Art, die mit den konventionellen Latizes nicht getestet werden konnten.

j J5· Verglichen mit den bekannten diagnostischen Polystyrol-

! latexreagentien können negative Reaktionsbilder eindeutig ^:

Io bestimmt werden. Das zeigt, daß das erfindungsgemäße Latex-

j reagenz frei von den Nachteilen bekannter Latexreagentien

ist, bei denen die Abschätzung hinsichtlich Positivität

I oder Negativ!tat einer Reaktion von Tester zu Tester va-

I riiert. I

15 ^. Der erfindungsgemäße Latex ist sowohl vor als auch nach der j Sensibilisierung mit der serologisch wirksamen Substanz

außerordentlich stabil. Es gibt daher für den Tester keine I Möglichkeit, durch spontane Agglutinierung oder durch das j Unbrauchbarwerden des Latexreagenz irregeführt zu werden.

2o Die folgenden Beispiele zeigen die Vorteile des erfindungsgemäßen Latexreagenz bei Anwendungen in serologischen Reak- _: tionen, jedoch betreffen die Beispiele lediglich einen begrenzten Teil der allgemeinen Brauchbarkeit des Reagenz, das für eine große Anzahl verschiedener serologischer Reaktionen '

25 verwendet werden kann. '

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Beispiel 1

Die Herstellung der Basislatizes und die Agglutinierung der Basislatizes nach Sensibilisierung mit menschlichem Serum.

Basislatizes:

Latex Nr. 1: Handelsüblicher, nicht sensibiHsierter Latex mit einem Gehalt an 1 Vol.-# Polystyrolteilchen eines durchschnittlichen Teilchendurchmessers von 0,81 /u.

Latex Nr. 2: Ein Reaktionsgefaß wird mit 40 g Styrolmonomerem, 0,5 g Natriumlaurylbenzolsulfonat (nachfolgend als NaDBS bezeichnet), 0,04 g Kaliumpersulfat (nachfolgend als KPS bezeichnet) und 100 g Wasser beschickt, worauf bei einer Temperatur von 70⁰C in Emulsion polymerisiert wird. Nach der Vollendung der Reaktion wird das Reaktionsgemisch 30 Minuten bei 6OOO UpM der Zentrifugalabscheidung unterworfen. Das erhaltene teilchenförmige Polymere mit einem durchschnittlichen Teilchendurchmesser von 0,75 u wird in Glycin-NaCl-puffer bei pH 8,4 zu einem Latex mit einem Gehalt von 1 Vol.-# Polystyrol disperglert.

Latex Nr. 3: Ein Reaktionsgefäß wird mit 40 g monomerem Styrol, 0,24 g Natriumlaurylsulfat (nachfolgend als NaLS^ bezeichnet), 0,02 g KPS und 100 g Wasser beschickt, worauf die Emulsionspolymerisation unter den gleichen Bedingungen wie bei Latex Nr. 2 durchgeführt wird. Nach der Beendigung der Reaktion werden 0,8 g Pluronic F-68 (Wyandotte Chemical Corporation, USA) zugegeben. Nach 3-stündigem Rühren I bei Raumtemperatur werden die Polystyrolteilchen|

bei 6OOO UpM während 30 Minuten zentrifugiert und in einem Glycin-NaCl-puffer bei pH 8,4 zu

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einem Latex mit einem Gehalt von 1 Vol.-# Polystyrolteilchen mit einem durchschnittlichen Teilchendurchmesser von 0,8 yu redispergiert.

Latex Nr. 4: Das für den Latex Nr. 3 beschriebene Verfahren wird wiederholt mit der Abweichung, daß das NaLS durch 0,5 g NaDBS und das Pluronic P-68 durch 1,0 g Emulsit L 16 (Dai-ichi Kogyo Seiyakuj, Japan) ersetzt wird.

Latex Nr. 5:

Latex Nr. 6;

Ein Reaktionsgefäß wird mit 100 g monomerem Styrol, 1 g KPS und 150 g Wasser beschickt, j worauf dann die Polymerisation bei 70⁰C unter j Stickstoff durchgeführt wird. Nach 15-stündiger j Reaktion wird ein Latex aus Polystyrolteilchen mit einem durchschnittlichen Teilchendurchmesser von 0,71 /U erhalten. Nach der Reaktion werden 100 g einer 1 #igen (Gew.-^) Lösung von Pluronic P-68 zu diesem Latex zugegeben, worauf 3 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen wird. Der Latex wird dann bei 6000 UpM während J>0 Minuten abzentrifugiert und die sedimentierten Polystyrolteilchen in Glycin-NaCl-puffer von pH 8,4 zu einem Latex mit 1 Vol.-# Polystyrolteilchen redispergiert.

Ein Reaktionsgefäß wird mit 56 g monomerem Styrol, 14 g monomerem Chlorstyrol, 0,75 g KPS und 280 g Wasser beschickt, worauf unter Stickstoff und unter Rühren bei 70⁰C polymerisiert wird. Nach lO-stündiger Reaktion wird ein homogener aus Copolymerteilchen von Styrol und Chlorstyrol bestehender Latex erhalten. Zu diesem Latex werden 140 g einer 1 #igen (Gew.-^) Lösung von Emulsit 49 (Dai-ichi Kogyo Seiyaku, Japan") zugegeben. Nach 3-stUndigem Rühren bei Raumtempe-

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Latex Nr. 7;

ratur wird der Latex zentrifugiert und die sediment ierten Latexteilchen in Glycin-NaCl-puffer
von pH 8,4 zu einem Latex mit einem Gehalt an
1'.Vol.-Ji Teilchen eines durchschnittlichen Teilchendurchmessers von 0,6ja suspendiert.

Ein Reaktionsgefäß wird mit 30 g Methylmethacrylatmonomerem, 0,1 g NaLS, 0,05 g KPS und 270 g
Wasser beschickt, worauf unter Rühren in einer

Stickstoffatmosphäre die Emulsionspolymerisation^

bei 70°C für 4 Stunden durchgeführt wird. Hier- ; bei wird ein Latex eines Homopolymeren von ^; Methylmethacrylat mit einem durchschnittlichen ; Teilchendurchmesser von 0,55 u erhalten. Zu die-¹ sem Latex werden 30 g einer 2 #igen Lösung von ^!

Emulsit L 36 (Dai-ichi Kogyo Seiyaku, Japan")
gegeben, worauf 3 Stunden bei Raumtemperatur
gerührt wird. Der Latex wird dann mittels Zen-

! trifugieren bei 6000 UpM für 30 Minuten sedimen-

j2o tiert. Die abgeschiedenen Teilchen werden in

Glycin-NaCl-puffer eines pH-Werts von 8,4 zu

; einem Latex mit einem Gehalt an 1 Vol.-# sus

pendiert.

' Latex Nr. 8: Ein Reaktionsgefäß wird" mit 42 g monomerem Sty-25 rol, 28 g monomerem Chlorstyrol, 0,9 g KPS und

280 g Wasser beschickt, worauf 6 Stunden unter

Rühren und unter Stickstoffatmosphäre die Poly- >

merisation bei 70⁰C durchgeführt wird. Dabei ■

wird ein teilchenförmiger Copolymerlatex von ■

Styrol und Chlorstyrol mit einem durchschnitt- _;

liehen Teilchendurchmesser von 0,9 u erhalten. i

Zu diesem Latex werden 70 g einer Lösung von ^!

1 Gew.-% Emulsit 25 (Dai-ichi Kogyo Seiyaku, !

Japan) zugegeben. Nach 3-stündigem Rühren bei ' Raumtemperatur wird der Latex bei 6000 UpM wäh-

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rend J)Q Minuten zentrifugiert. Die sedimentierten Teilchen werden in Glycin-NäCl-puffer vom pH 8,4 zu einem Latex mit einem Gehalt an .-$ des Copolymeren suspendiert.

5 Latex Nr. 9: Ein Reaktionsgefaß wird mit 4o g Vinylchlorid-

monomeren, 0,8 g NaLS, 0,3 g KPS und 60 g Wasser beschickt, worauf unter Stickstoff und Rühren 20 Stunden lang bei 55°C polymerisiert wird. Dabei wird ein teilchenförmiger Polyvinylchlorid-Io latex mit einem durchschnittlichen Teilchendurch

messer von 0,35/U erhalten. Zu diesem Latex werden 80 g einer Lösung von 1 Gew.-% Pluronic P-68

I gegeben. Nach 3-stündigem Rühren bei Zimmertem-

i peratur wird zentrifugiert. Die sedimentierten

jl5 Teilchen werden in Glycin-NaCl-puffer vom pH-

! Wert 8,4 zu einem Latex mit einem Gehalt an

j 1 Vol.-# Teilchen suspendiert.

Ein Testro'hr wird mit je 1 Vol.-Teil der oben beschriebenen ; Basislatizes und 1 Vol.-Teil einer Reihenverdünnung von ^o menschlichem Serum in Glycin-NaCl-puffer vom pH-Wert 8,4 ί gefüllt, worauf nach gründlichem Vermischen die Stärke der

spontanen Agglutinierung, die bei Raumtemperatur stattgefunden hatte, mit dem unbewaffneten Auge und unter einem Mikrosj kop bei einer Vergrößerung um das 80-fache bestimmt. Die Re-25 sultäte zeigt die folgende Tabelle 1:

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	Latex	Nr. 1	Abschätzung	Zeit	2 24	Tabelle 1	Verdünnung von menschlichem Serum ( -factO
	.Latex	Nr. 2	Methode	nach nach	2 24		5 10 20 40 80 160 320 640 1280
	Latex	Nr. 3	unbewaffne tes Auge	nach nach	2 24		_{+++ +++ ++} + ₊ ++ ₊₊
	Latex	Nr. 4	X 80	nach nach	2 24		++++++ -H. + ₊ -π- _{+++ +++ ++}
	Latex		unbewaffne tes Auge	nach nach	2 24	Std. Std.	_{+++ +++ +++} ++ ₊₊₊ ++ _{++ +++} ++
5098		X 80	nach nach	2 24	Std. Std.	_{+++ +++ ++ ++ +++ ++ ++ +++ +}
85/1	unbewaffne tes Auge	nach nach	2 24	Std. Std..
co «ο	x- 80	nach nach	Std. Std.	+ + + - -
	unbewaffne tes Auge	Std. Std.	- ■ - - -
		Std. Std.
		Std. Std.

	Latex	Tabelle 1 (	Zeit	Fortsetzung^
	Latex Nr.5		- nach 2 Std. nach 24 Std.	ι Verdünnung von menschlichem Serum ( -fach)
	Latex Nr.6	Abschätzung	- nach 2 Std. nach 24 Std.	5 10 20 40 80 160 320 640 1280
	Latex Nr.7	Methode	■ nach 2 Std. nach 24 Std.	-__ + +
8 6 09	Latex Nr.8	unbewaffne tes Auge	■ nach 2 Std. nach 24 Std.	± ±
85/1	Latex Nr.9	unbewaffne tes Auge	• nach 2 Std. nach 24 Std.	— : —. — — — — — mm _
139	Γ- mm ·	unbewaffne tes Auge	. ·. « — 4- — — — — ± ±
	unbewaffne tes Auge	__ «■ _ 4- 4- — ·■* mm mm
	unbewaffne tes Auge	sehr starke Agglutinierung starke Agglutinierung mäßige Agglutinierung schwache Agglutinierung Spur oder zweifelhafte Agglutinierung keine Agglutinierung

CO CÖ CO

! - 17 -

Wie die vorstehenden Ergebnisse zeigen,sind die erfindungsgemäßen Latexreagenzien herausragend stabil bei einer weit reduzierten Intensität der spontanen Agglutinierung, so daß diese Reagentien für diagnostische Zwecke wertvoll sind.

i 5 Beispiel 2

Die Relation der Konzentration eines Protein-Antigens (menschliches IgG), welches für die Sensibilisierung von Polystyrollatex angewendet wird und die Intensitätsprofile der Aggluti- * nierungsreaktionen, die durch anti(menschliches IgG) Antikörper von Immunglobulin M(IgM) und IgG-Typen induziert werden.

1 Vol.-Teil einer 1 #igen Polystyroldispersion in Glycinpuffer von pH 8,2 wird mit 1 Vol.-Teil einer Lösung von menschlichem IgG, verdünnt mit Glycinpuffer von pH 8,2, vermischt,und nach Stehenlassen im Wasserbad (j57°C) für 2 Stunden und bei 5 ⁰C für 2 Tage wird das Gemisch gut geschüttelt, um eine homogene Emulsion zu erhalten. Auf einer Glasunterlage wird 1 Tropfen dieser Emulsion mit 1 Tropfen eines mit Glycinpuffer 20-fach verdünnten Serums eines an rheumatischer Arthritis erkrankten Patienten, welches den Rheumafaktor enthält, der ein änti-IgG Antikörper vom IgG-Typ ist, oder mit einem anti-menschlichen-IgG-Hyperimmun-Kaninchenserum, welches anti-menschlichen-IgG Antikörper vom IgM-Typ enthält, vermischt.

Nach 3-minütigem Schütteln werden die Intensitäten der Agglutinierungsreaktion verglichen. Die Resultate sind in Tabelle dargestellt:

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Tabelle 2

Latex

cn
ο
to

OO

to

(JD

Latex Nr. 1

Latex Nr. 2

Latex Nr. 3

	Verdünnung des Antigens ( -fach) * '	+++++ + + ± ±
	Vor- Kontrolle rats- 2- 4- 8- 16- 32- 64- 128- 256- lö- fech fach fach fach fach fach fach fach Pürier _K1 allein	++ ++ + J- ± ± ±
		± ± ± ± ± ± ±
	++ ++ ₊₊	+++++++++ + + + _±
	+ + -L	+ + + 4-Ii-- +
	₊₊	±±±----- ±
	++	1---- ,----< ι ι ;
	J-	!....: J.



Art des Antikörpers
Serum des rheumatischen Patienten
Kaninchen- Hyperimmunserum
Kontrolle (Puffer)
Serum des rheumatischen Patienten
Kaninchen- Hype rimmunserum
Kontrolle (Puffer)
Serum des rheumatischen Patienten
Kaninchen- Hyperimmunserum
Kontrolle (Puffer)

1): Die Lösung des menschlichen IgG, das Antigen, hat eine unverdünnte Konzentration von 10 mg/ml. Diese Vorratslösung von Antigen wird doppelt verdünnt. Daher bedeutet "16-fach", daß der l#ige Polystyrollatex mit einem gleichen Volumen an Antigenlösung von (10 χ 1/16) mg/ml Konzentration sensibilisiert wird.

ι oo

ro cn N> CO CD

252993?

f j

J ; = Der Bereich,über den eine intensive Agglutinie-

I I

rung durch anti-menschlichen IgG-Antikörper vom IgG-Typ induziert wird. Jede durchgezogene Linie Öedeutet, daß im Bereich links davon eine korrekte Abschätzung wegen spontaner Agglutinierung undurchführbar ist.

j Nach diesem Versuch zeigen die herkömmlichen handelsüblichen j Produkte Latex Nr. 1 und Latex Nr. 2 von Beispiel 1 ähnliche ' Intensitätsprofile für sowohl IgG-als auch IgM-Antikörper-Io Typen. Im Gegensatz hierzu findet beim Latex Nr. 3 eine in-[ tensive Agglutinierung nach Sensibilisierung mit einer geeigj neten Konzentration von Antigen statt, wenn der Antikörper ! vom IgG-Typ ist, jedoch neigt die Agglutinierung dazu, in Gej gegenwart von überschüssigem Antigen inhibiert zu werden. !15 Gegen die Antikörper vom IgM-Typ weist der Latex Nr. 3 ein

Intensitätsprofil der Agglutinierungsreaktion ähnlich den j Profilen der Latizes Nr. 1 und Nr. 2 auf, und es ist daher j möglich, durch diese Erscheinung einen anti-menschlichen-IgG-

Antikörper vom IgM-Typ von einem anti-menschlichen IgG-Anti-2o körper vom IgG-Typ zu unterscheiden. Es folgt ebenfalls aus der obigen Tabelle, daß sogar nach Mischung mit einer verhältnismäßig hohen Konzentration von proteinösem Antigen (in diesem Fall menschlichem IgG) Latex Nr. 3 keiner spontanen Agglutinierung unterliegt.

25 Beispiel 3

Herstellung eines hoch sensibilisierten serodiagnostischen Reagenz für rheumatische Arthritis.

Im Serum von Patienten mit rheumatischer Arthritis existiert ein Auto-Antikörper für menschliches IgG; diese Krankheit kann

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daher durch Bestimmung dieses Antikörpers (RA-Faktor) diagnostiziert werden, jedoch reagiert das heute allgemein angewendete RA-Reagenz (mit menschlichem IgG sensibilisierter Polystyrollatex) nicht adequat mit dem RA-Faktor, der nur sehr
schwach reaktionsfähig ist. Das Ergebnis dieses Experiments
zeigt die überlegene Empfindlichkeit des durch Sensibilisierung von Latex gemäß dieser Erfindung mit einer Vergleichs- ; weise hohen Konzentration von menschlichem IgG erhaltenen ■

Reagenz. i

Aliquote Teile einer 1 #igen Suspension des Latex gemäß der j Erfindung (Latex Nr. 3 aus Beispiel 1) werden jeweils mit glei-

chen Volumenteilen verschiedener Serumverdünnungen von Human- : IgG vermischt, worauf jede Mischung erst 2 Stunden bei 37°C
und dann 1 Tag bei 5 C stehengelassen wird. Darauf wird die

Mischung.2-mal je 10 Minuten durch Zentrifugieren bei 9000 UpM gewaschen, worauf anschließend in Glycin-puffer von pH 8,2 redispergiert wird. Die so erhaltenen sensibilisierten Teilchen werden in Glycinpuffer von pH 8,2 mit einem Gehalt von 0,01 % > NaN-, zu einem serodiagnostischen Reagenz mit einem Gehalt von ■ 0,5 Vol.-Ji an sensibilisierten Teilchen suspendiert. Darauf ; werden die Agglutinierungsreaktionen mit verschiedenen RA- : positiven Sera verschiedener Reaktionsintensität und mit RA- ! negativem Serum untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3
dargestellt. Es zeigt sich, daß mit ansteigender Menge von ; adsorbiertem (sensibilisiertem) Antigen Agglutinierungsreak- j tionen sogar durch die Sera von rheumatischen Patienten mit ! schwacher Reaktivität induziert wurden. ;

509885/1139

Tabelle J5

Patient enserum 2o-fach verdünnt

ODj

RA(+)

RA(-)

Nr. 46 Nr. 47 Nr. 33 Nr.30

Nr. 23

Verdünnungen von 10 mg/ml menschlicher IgG-Vorratslösung,
die für die Sensibilisierung Verwendet wurde

5-fach 10-fach 20-fach 40-fach 80-fach 160-.fach 320-fach

IV)

Testverfahren: 1 Tropfen einer 20-fachen Verdünnung des Serums wird mit

Tropfen des Latexreagenz vermischt. Nach 3-minütigem
Schütteln wird die Agglutinierung bestimmt.

Zur Herstellung eines RA-Reagenz von hoher Empfindlichkeit ist es daher erwünscht, die Sensibilisierung mit Lösung von menschlichem IgG der höchsten Konzentration innerhalb des Testbereichs vorzunehmen, jedoch unterlagen bei dieser Konzentration Latex Nr. 1 und Nr. 2 aus Beispiel 1 spontaner Agglutinierung, so daß kein RA-Reagenz hergestellt werden konnte. Aufgrund dieses Ergebnisses werden gleiche Volumenteile von Latex Nr. 3 mit Lösung von menschlichem IgG (Konzentration 2 mg/ml) sensibilisiert, um ein RA-Reagenz zu j Io erhalten. Dieses RA-Reagenz und ein kommerzielles Polystyrollatex-Reagenz für rheumatische Arthritis wird mit den Sera von Patienten, bei denen klinisch rheumatische Arthritis diagnostiziert worden ist, getestet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 dargestellt.

5 09885/1139

Tabelle 4

RA-Reagenz	Serodiagnostische Daten (Anzahl von Fällen, Prozent)	mäßig positiv	schwach positiv	negativ
handelsübliches RA-Reagenz	stark positiv	3 (12 Ji)	9 (36 Ji)	5 (20 Ji)
Latexreagenz gemäß ier Erfindung	8 (32 %)	6 (24 $>)	4 (16 Ji)	3 (12 Ji)
12 (48 Ji)

CD CD CO

Während mit dem handelsüblichen RA-Reagenz 20 % der Seren von \ Patienten mit rheumatischer Arthritis als RA-negativ beurteilt wurden, waren es mit dem Reagenz aus Latex Nr. J gemäß der Erfindung nur 12 %. Das Vorkommen von rheumatischer Arthritis, j > die negative serologische Reaktionen liefert, ist gut bekannt, und es ist daher wahrscheinlich, daß diejenigen Fälle, die j nicht mit dem RA-Reagenz aus Latex Nr. J> gemäß der Erfindung reagiert haben, im wesentlichen Fälle von "sero-negativer rheumatischer Arthritis" im strengen Sinne dieses Wortes sind.

Es ist zu bemerken, daß im Fall des RA-Reagenz, welches auf dem Latex gemäß der Erfindung basiert, keine nicht-spezifische Agglutinierung gegenüber RA-negativen Seren selbst nach mehr als 5 bis 10 Minuten stattfindet und daß es daher leichter ist, eine Beurteilung abzugeben, als mit dem handelsüblichen RA-Reagenz, welches dazu neigt, fiktive Resultate zu liefern, wenn die Abschätzung des Tests nicht innerhalb von 1 bis 3 Minuten vorgenommen wird. Die obigen Ergebnisse zeigen auch, daß in vielen Fällen eine intensive und eindeutige Agglutinierung selbst mit RA-positiven Sera von schwacher Reaktivität stattfindet, so daß auch in dieser Hinsicht das Vorkommen von fehlerhaften Beurteilungen verringert wird.

Beispiel 4

Ein Beispiel einer Latex-Agglutinierungsreaktion unter Verwendung eines Latex, der mit einem Speichel (Sekretions-Typ) in einem sauren Puffer sensibilisiert worden ist.

Es ist anerkannt, daß Polystyrollatex Protein- und Riboprotein-f Antigene adsorbiert und durch die entsprechenden Antikörper agglutiniert wird, jedoch Polysaccharid-Antigene nicht gut j adsorbiert und daher auch nicht stark durch Antipolysaccharid-> Antikörper agglutiniert wird. Jedoch wird eine klar positive Reaktion beobachtet, wenn eine wasserlösliche Substanz vom ABO-Bluttyp, eines der typischen Polysaccharid-Antigene, am

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erfindungsgemäßen Latex adsorbiert wird und ein Agglutinierungsreaktionstest unter Verwendung eines sauren Puffers durchgeführt wird. Der Speichel wird unmittelbar nach der Sammlung auf dem Wasserbad 20 Minuten bei 100°C erhitzt und dann abgekühlt. Danach wird durch Zentrifugieren bei 12000 UpM während 15 Minuten sedimentiert. Die überstehende Flüssigkeit wird
gesammelt und gegen die Pufferlösung dialysiert. Diese Vor- ^: ratslösung wird mit dem Puffer verdünnt und mit einem glei- ^: chen Volumen an 1 #igem Polystyrollatex (Latex Nr. 3* redis-

pergiert in Puffer des geforderten pH-Werts) gemischt. Das
Gemisch wird erst 2 Stunden bei 37°C und dann 1 Tag bei 5°C
stehengelassen, worauf Rinder-Serumalbumin in einer Endkonzentration von 1 Vol.-# zugefügt wird und die Mischung weiter < 2 Stunden bei 37°C und 1 Tag bei 5⁰C stehengelassen wird. ι

Danach wird 2-mal durch 5-minütige Zentrifugalsedimentierung
bei 6000 UpM gewaschen und in Pufferlösung redispergiert und
schließlich in einem Puffer, der ein Rinderserumalbumin in
einer Endkonzentration von 1 % enthält, dispergiert. Die Dispersion wird durch ein Filtrierpapier zwecks Herstellung eines Testreagenz filtriert. Als Puffer werden Glycinpuffer vom pH

8,2 (Glycin-NaOH-puffer) und ein Glycinpuffer vom pH 3,5 (GIycin-HCl-puffer) für alle Operationen der Sensibilisierung,
des Waschens und der Redispergierung verwendet. Das Anti-A-
oder Anti-B-Agglutininserum wird dann auf jeden der mit menschlichem Speichel sensibilisierten Polystyrollatizes einwirken

gelassen und die Relation des Verdünnungsfaktors des für die
Sensibilisierung des Polystyrols verwendeten Speichels (bezogen auf das Volumen des Speichelvorrats) zu den Agglutinintitern wird bestimmt. In diesem Experiment wird der erfindungsgemäße mit AS-Speichel sensibilisierte Latex allein durch Anti-A-Serum und der mit BS-Speichel sensibilisierte Latex nur durch Anti-B-Serum agglutiniert. Es gibt daher kein Spezifizitäts-Problem. Die Wirkung ist bedeutend höher, wenn ein Glycin-HCl-puffer vom pH 3,5 angewendet wurde. Im Fall des Latex Nr.2 tritt bereits beim bloßen Dispergieren in einem Puffer vom

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pH 3,5 Agglutinierung ein und selbst bei dH 8,2 unterliegt
der Latex spontaner Agglutinierung im Stadium des Vermischens mit Speichel bei der vorerwähnten Sensibilisierungsoperation, wobei die Agglutinierung durch die nachfolgenden Schritte der Sensibilisierung nicht rückgängig gemacht wurde. Aus diesem
Grund konnte dieses Produkt für Tests mit Agglutininsera nicht verwendet werden.

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Typ des
Polystyrol
latex

pH des
Puffer:

ABO-Gruppen
ι und Ss-System
des Speichels

Tabelle 5

Verdünnungen des für die Sensibilisierung
des Polystyrollatex verwendeten Speichels

4

8

16

32

64

128

peg Kontrolle
³ (Puffer)

O
O

3.5

AS

CVJ

COO

16
O

8
O

4
O

2
O

O
O

Np.3

8.2

BS

Typ des
Aggluti
nins

8
O

O
8

O
16

O
32

O
16

O
8

O
4

O
2

O
O

AS

Anti-A
Anti-B

O
4

1
O

O
O

8.2

BS

Anti-A
Anti-B

1
O

O
O

50968

AS

Anti-A
Anti-B

O
1

1
O

O
O

BS

Anti-A
Anti-B

2
O

O
1

O
O

UJ
IO

AS

Anti-A
Anti-B

O
O

Nr.2

BS

Anti-A
Anti-B

O
O

^war κ,
ffi

AS

Anti-A
Anti-B

O
O

Wegen nicht-spezifischer
kein Test möglich.

Agglutinierung

war N)
CD

BS

Anti-A
Anti-B

Wegen nicht-spezifischer
kein Test möglich.

Agglutinierung

UJ
war ^₀

AS

Anti-A
Anti-B

Wegen nicht-spezifischer
kein Test möglich.

Agglutinierung

war

BS

Anti-A
Anti-B

Wegen nicht-spezifischer
kein Test möglich.

Agglutinierung

Anti-A
Anti-B

S = Sekretions-Typ; s = non-Sekretions-Typ.

Die Zahlen in der Tabelle stehen für Agglutinintiter; "1" bedeutet, daß Reaktionen nur mit unverdünntem Agglutininserum auftreten;

"0" bedeutet, daß keine Reaktion selbst durch unverdünntes Agglutininserum ausgelöst wird.

Beispiel 5

Sensibilisierung des Latex mit Australia-Antigen.

Australia-Antigen (Hepatitis-assoziiertes Antigen, Transfu- ; sion-assoziierter Hepatitisvirus) wird gut an Polystyrollatex j adsorbiert, jedoch wird, um eine intensive Agglutinierung ! durch Australia-Antikörper zu gewährleisten, bevorzugt eine große Menge von Australia-Antigen am Polystyrollatex adsorbiert. Da Latex Nr. 1 und Nr. 2 spontaner Agglutinierung nach Vermischen mit Sera unterliegen, die Australia-Antigen enthal-

ten, wenn die Serumkonzentration hoch ist, können sie nur mit ! hoch verdünnten Sera (100-bis 150-fach oder mehr) vermischt ; werden. Im Gegensatz hierzu unterliegt erfindungsgemäßer La- j |2o tex keiner spontanen Agglutinierung nach Vermischen mit einer i j 10-fachen Verdünnung von menschlichem Serum, welches Australia, Antigen enthält. Daher ist es möglich, daraus ein Latex-Reagenz herzustellen, welches gut definierte Agglutinierungen zeigt. Nachfolgend ist beispielhaft ein Verfahren für die Herstellung eines solchen Reagenz beschrieben: Ein menschliches Serum mit einem Gehalt an Australia-Antigen wird mit einem Glycin-Puffer von pH 8,2 10-fach verdünnt und 15 Minuten bei 12000 UpM einer Zentrifugal-Sedimentierung unterwor- ! fen. Das Überstehende wird abgetrennt und mit einem gleichen ■ ο Volumen Latex Nr. 3 vermischt. Die Mischung wird 2 Stunden bei 37°C gelagert, worauf Rinder-Serumalbumin zugesetzt wurde,, um zu einer Endkonzentration von 1 % zu kommen. Abschließend wird NaN, in einer Endkonzentration von 0,1 % zugesetzt. Das

509885/1139

System wird 4 Tage bei 5⁰C stehengelassen und dann filtriert.
Dieses Reagenz wird zur Bestimmung von Australia-Antigen ver-^:

wendet. Seine Reaktivität bleibt langer als 1 Jahr stabil; ^:

während dieser Zeit tritt keine spontane Agglutinierung auf. !

Der Test mit diesem Reagenz wird in folgender Weise durchge- \

führt: <

1 Tropfen des zu testenden menschlichen Serums und 1 Tropfen J

des Reagenz werden in ein kleines Testrohr getropft und aus- ι

reichend durch Schütteln vermischt. Danach wird bei 2500 UpM '

während J50 Minuten durch Zentrifugieren sedimentiert und auf ,

positive oder negative Agglutinierung untersucht. Die posti- '

ve Agglutinierung wird als Anzeichen für die Gegenwart von ' Australia-Antigen angesehen.

Beispiel 6

Ein Beispiel der Anwendung als ein Reagenz für Antigen-Antikörper-Reaktionen in Gegenwart von Fibrinogen (Bestimmung von
Haptoglobin in Plasma).

Fibrinogen ist das am leichtesten ausfällbare von allen Plasma Proteinen; Polystyrollatexteilchen werden durch seine Gegenwart nicht spezifisch agglutiniert. Im Fall von Latex Nr. 1
und Nr. 2 treten solche nicht-spezifischen Agglutinierungen
bei Fibrinogenkonzentrationen von nicht kleiner als 0,1 mg/ml
auf. Latex Nr. 4 andererseits unterliegt der Agglutinierung ; bei Konzentrationen von nicht kleiner als 2 bis 5 mg/ml. Da-

her wird, wenn ein Polystyrollatex mit einem daran absorbier-

-AntikÖrper <

ten Antiplasmaprotein/für die Bestimmung von Plasmaproteinen

umgesetzt werden soll, der Latex Nr. 4 gemäß der Erfindung ! als geeignet angesehen. Die beispielhafte Bestimmung von Hap- j toglobin, einem der Plasmaproteine, wird in der folgenden Weise durchgeführt: Ein Anti-human-Haptoglobin-Precipitin-Serum
wird auf das 50-fache mit einem Glycinpuffer vom pH 8,2 verdünnt und durch Zentrifugieren bei 12000 UpM während I5 Minu-

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ten sedimentiert. Das Überstehende wird mit gleichen Volumteilen Latex Nr. 4 gemischt, worauf das Gemisch 2 Stunden bei 57°C und danach 4 Tage bei 5°C stehengelassen wird. Es wird dann durch Zentrifugieren bei 9000 UpM für 5 Minuten zwecks Ausfällung der Latexteilchen sedimentiert, worauf nach dem Verwerfen des Überstehenden die Teilchen in Glycinpuffer vom j pH 8,2 mit einem Gehalt von 0,1 % NaN-, resuspendiert werden. ^l Dieses Reagenz unterliegt keiner nicht-spezifischen Agglutinierung mit einer 20-fachen Verdünnung von Plasma. Auf einer Glasplatte wird ein Tropfen einer 20-fachen Verdünnung von menschlichem Serum mit 1 Tropfen dieses Reagenz vermischt und , die Mischung wird dann 2 Minuten beobachtet, während die Glasplatte in einer Richtung rotiert. Der Latex unterliegt der Agglutinierung, wenn das Plasma Haptoglobin enthält, während keine Agglutinierung im Fall von haptoglobinfreiem Plasma stattfindet.

Beispiel 7

Ein Beispiel für die quantitative Agglutinierungsreaktion durch Mikrotitration unter Verwendung des mit Kaninchen-IgG sensibilisierten Latex.

Latex Nr. 8 wird mit gleichen Volumteilen Glycinpuffer vom pH 8,2, der 1,0 Vol.-# gereinigtes Kaninchen-IgG enthält, vermischt, worauf das Gemisch 2 Stunden bei 37°C und danach 2 Ta-! ge bei 5°C stehengelassen wird. Hierauf wird das Gemisch 2-mal durch 15-minütiges Zentrifugieren bei 4000 UpM gewaschen und darauf in Glycinpuffer vom pH 8,2 redispergiert. Die so sensibilisierten Teilchen werden in Glycinpuffer vom pH 8,2, wel-. eher 0,1 Gew.-^ NaN-, enthält, zu einem Latexreagenz mit einem Gehalt von 0,3 Vol.-# an sensibilisierten Teilchen suspendiert.

Unter Verwendung des so hergestellten Reagenz wird der Anti-Kaninchen-IgG-Titer der in der folgenden Tabelle 6 aufgeführten Seren in der folgenden Weise bestimmt:

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Das verwendete Serum wird mit Glycinpuffer vom pH 8,2 durch serienmäßige 2-Fach-Verdünnungen verdünnt, worauf die Verdünnungsreihen in eine Mikrotiter-Platte in einer Menge von 1 Tropfen (etwa 0,025 ml) pro Loch eingebracht werden. 1 Tropfen (etwa 0,025 ml) des Latexreagenz wird in jedes Loch der Mikrotiter-Platte zugesetzt. Nach dem Schütteln wird die Mikro titer-Platte 4 Stunden bei Zimmertemperatur gehalten, worauf [ auf Agglutinierungsklumpen in herkömmlicher Weise, die bei- ! spielsweise im "Journal of Immunology", 88, 520-529 (19β2) beschrieben ist, geprüft wird. Der Gehalt an Anti-Rabbit-IgG-Antikörper wird als die reziproke Zahl der höchsten Verdünnung des jeweiligen Serums, bei der sich mit dem Latexreagenz ein Agglutinierungsklumpen zeigt, bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 dargestellt.

Tabelle 6

Klinische Diagnose	Serum Nr.	Anti-Kaninchen-IgG-Titer
Patienten mit rheumatischer Arthritis	1	256
Normale oder solche Patienten mit anderen Krankheiten als rheu matischer Arthritis	2	128
5	512
4	256
5	128
6	52
7	16
8	16
9	52

Eine Person, deren Serum Titer von 64 oder höher mittels des oben erwähnten Tests ergibt, kann serologisch als Patient mit

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rheumatischer Arthritis diagnostiziert werden. Die vorstehen- , den Beispiele 1 bis 7 sollen lediglich einen Teil der breiten j Anwendbarkeit des erfindungsgemäßen Latexreagenz für eine Viel zahl von verschiedenen serologischen Reaktionen zeigen; das I

i ι erfindungsgemäße Latexreagenz kann vorteilhaft für eine große Vielfalt von serologischen Reaktionen, die an sich bekannt sind, verwendet werden. Solche Reaktionen sind beispielsweise in "Methodology of Immunochemical and Immunological Research" von J.B.G. Kwapinski et al (Wiley-Interscience, New York, 1972), Seiten 574-440, beschrieben.

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Claims

Patentanspruch e

1) Verfahren zur Herstellung eines Latexreagenz für serologi- ', sehe Reaktionen, dadurch gekennzeichnet, daß man ein nichtionisches oberflächenaktives Mittel vom Äthylenoxyd-Typ an Latexteilchen adsorbieren läßt, diese Latexteilchen mit j einer serologisch wirksamen Substanz sensibilisiert und ; die sensibilisierten Latexteilchen in einem wäßrigen Lo- [ sungsmittel suspendiert.

2) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Latexteilchen aus einem Kunstharz bestehen. I

J5) Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Kunstharz ein Homo- oder Copolymeres von Styrol, Chlorsty- j rol, Methylmethacrylat, Vinylchlorid und Vinylidenchlorid verwendet wird.

4) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die j Latexteilchen aus Polystyrol bestehen. S

5) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die j Latexteilchen aus Copolymeren von Styrol und Chlorstyrol | bestehen.

6) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Latexteilchen einen Durchmesser im Bereich von etwa 0,1 bis!

etwa 1 ju aufweisen. {

7) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man ' als nicht-ionische oberflächenaktive Mittel vom Äthylenoxyd-Typ Blockcopolymere von Äthylenoxyd und Polyoxypropylenglykol oder Polyoxyäthylenalkylather oder Polyoxyäthylenalkylarylather verwendet.

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8) Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man Blockcopolymere verwendet, die in ihren Molekülen etwa 50 bis etwa 80 % Äthylenoxyd enthalten und bei denen das Molekulargewicht des hydrophoben Polyoxypropylenglykol-Anteils j

etwa 950 bis etwa 3850 beträgt. j

9) Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß der j Alkylrest der Polyoxyathylenalkylather 12 bis 18 Kohlenstoff atome aufweist.

10) Verfahren nach Anspruch 9* dadurch gekennzeichnet, daß die j Polyoxyathylenalkylather etwa JO bis etwa 100 Mole Äthylenoxyd enthalten.

11) Verfahren nach Anspruch 7» dadurch gekennzeichnet, daß der Alkylarylrest der Polyoxyathylenalkylarylather aus Phenylresten besteht, die mit Alkylresten von 8 bis 18 Kohlen-

stoffatomen substituiert sind. ι

12) Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Polyoxyathylenälkylarylester etwa J>Q bis etwa 100 Mole Äthylenoxyd im Molekül enthalten. '

Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Adsorption durchgeführt wird, indem die Latexteilchen mit dem oberflächenaktiven Mittel in wäßrigem Medium in Berührung gebracht werden.

Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das oberflächenaktive Mittel an den Latexteilchen in einer Menge von etwa 0,00001 bis etwa 5 Gew.-%, bezogen auf die Latexteilchen, adsorbiert wird.

15) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als serologisch aktive Substanz ein Antigen oder einen Antikörper verwendet.

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Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als serologisch wirksame Substanz Australia-Antigen oder Human-Immunoglobulin G verwendet. '

17) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Sensibilisierung durchgeführt wird, indem die Latexteilchen mit der serologisch wirksamen Substanz in einem wäßrigen j Lösungsmittel zusammengebracht werden. :

18) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als wäßriges Lösungsmittel Wasser, eine physiologische Koch- | salzlösung oder eine Pufferlösung verwendet werden. ^;

19) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die I Menge der sensibilisierten Latexteilchen im Bereich von etwa 0,1 bis etwa 5 Vol.-#, bezogen auf das resultierende _: Reagenz beträgt. ',

2o) Latexreagenz für serologische Reaktionen, hergestellt durch Adsorption von nicht-ionischen oberflächenaktiven Mitteln [ vom Äthylenoxyd-Typ an Latexteilchen, Sensibilisierung der j Latexteilchen mit einer serologisch wirksamen Substanz und | Suspendierung der sensibilisierten Latexteilchen in einem ί

wäßrigen Lösungsmittel. J

21) Latexreagenz nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß

die Latexteilchen aus einem Kunstharz bestehen, das nicht- ! ionische oberflächenaktive Mittel vom Äthylenoxyd-Typ ein Blockeopolymeres aus Äthylenoxyd und Polyoxypropylenglykol

oder Polyoxyäthylenalkyläther oder Polyoxyäthylenalkylaryl-j äther ist und die serologisch wirksame Substanz ein Antigen oder ein Antikörper ist.

22) Basislatex für serologische Reaktionen, dadurch gekennzeichnet, daß seine Teilchen ein nicht-ionisches oberfIachenakti- ves Mittel vom Äthylenoxyd-Typ adsorbiert enthalten.

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23) Latex nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß die Latexteilchen aus Kunstharz bestehen.

24) Latex nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß das Kunstharz ein Homopolymeres oder Copolymeres von Styrol, Chlorstyrol, Methylmethacrylat, Vinylchlorid und Vinylidenchlorid ist.

25) Latex nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß die Latexteilchen aus Polystyrol bestehen.

26) Latex nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß die Latexteilchen aus einem Copolymeren von Styrol oder Chlorstyrol bestehen.

27) Latex nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß die Latexteilchen einen Durchmesser im Bereich von etwa 0,1 bis etwa 1 Ai aufweisen.

28) Latex nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß das nicht-ionische oberflächenaktive Mittel vom Äthylenoxyd-Typ ein Blockcopolymeres von Äthylenoxyd und Polyoxypropylenglykol oder Polyoxyathylenalkyläther oder Polyoxyäthylenalkylaryläther ist.

29) Latex nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, daß das Blockcopolymere im Molekül etwa 50 bis 80 % Äthylenoxyd bei einem Molekulargewicht des hydrophoben Polyoxypropylenglykol-Anteils von etwa 950 bis 3850 hat.

30) Latex nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, daß der Alkylanteil des Polyoxyäthylenalkyläthers 12 bis 18 Kohlenstoff atome aufweist.

31) Latex nach Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, daß der Polyoxyäthylenalkylather etwa 30 bis 100 Mole Äthylenoxyd ep fr-fr HI t-,

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32) Latex nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, daß der Alkylaryl-Anteil des Polyoxyathylenalkylaryläthers Phenyl- \ reste enthält, die mit Alkylresten von 8 bis 18 Kohlenstoffatomen substituiert sind.

33) Latex nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, daß der ! Polyoxyäthylenalkylarylather etwa 30 bis 100 Mole Äthylenoxyd im Molekül enthält.

Latex nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß das an den Latexteilchen absorbierte oberflächenaktive Mittel in Mengen von etwa 0,00001 bis etwa 5 Gew.-^, bezogen auf die Latexteilchen, vorliegt.

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