DE2904628C2

DE2904628C2 - Substanz SF-1739 HP-C, Verfahren zu deren Herstellung und Mittel mit antibakterieller und Antitumor-Wirkung, welche diese Substanz enthalten

Info

Publication number: DE2904628C2
Application number: DE2904628A
Authority: DE
Inventors: Takashi Yokohama Kanagawa Hisamatsu; Shigeharu Inouye; Michio Tokio/Tokyo Kojima; Takashi Yokohama Kanagawa Shomura
Original assignee: Meiji Seika Kaisha Ltd
Current assignee: Meiji Seika Kaisha Ltd
Priority date: 1978-02-08
Filing date: 1979-02-07
Publication date: 1985-07-04
Also published as: FR2416899A1; GB2017079A; DE2954282C2; US4209509A; GB2017079B; DE2904628A1; FR2416899B1

Description

optische Rotationsdispersionskurve gemäß t*. Fig. 7,

kernmagnetisches Resonanzspektrum gemäß Fig. 8,

Elementaranalyse:

Gefunden: C 59,58%; H 6,14%; N 12,63%; O 2U-5% (durch Differenz),
Löslichkeit:

leicht löslich in Wasser und Methanol, löslich in Aceton und Äthylacetat und wenig löslich in Hexan, Chromatografie:

durch Dünnschichtchrorriatografie an Silikagel wurden Rf-Werte von
0,40 (Chloroform zu Methanol = 9 :1)und
0,70 (Äthylacetat zu Methanol = 3:2) erhalten, wobei die F i g. 5 bis 8 Bestandteil dieses Anspruchs sind.

2. Verfahren zur Herstellung der Substanz SF-HP-C gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß eine Substanz SF-1739 einer Säurebehandlung unterworfen wird unter Bildung einer Substanz SF-1739 einer Substanz SF-1739 HP und Umsetzung des letzteren Produktes mit einem Cyanid.

3. Mittel mit antibakteriell und mit Antitumorwirkung. dadurch gekennzeichnet, daß es als Wirkstoff die antibiotische Substanz SF-1739 HP-C semäß Anspruch 1 und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger enthält.

Die japanische offengelegte, nicht geprüfte Patentanmeldung Nr. 1 25 798/1976 beschreibt, daß eine antibiotische Substanz SF-1739 durch Züchten von Streptomyces griseoplanus Stamm SF-1739 erhalten werden kann. Gemäß einer Mitteilung des jährlichen Berichtes von Meiji Seika Laboratories, Band 16. Seite 20, ist auch bekannt, daß die Substanz SF-1739 eine gelbe, zweisäurigs Base mit einer nicht-identifizierten chemischen Struktur und physiko chemischen und biologischen Eigenschaften derselben, wie sie in dem Bericht im einzelnen diskutiert werden, darstellt. Außerdem war es bekannt, daß die Subsi.inz SF-1739 unter alkalischen Bedingungen extrem instabil ist und daß dessen freie Base in verschiedene Fraktionen zersetzt wird, welche keine antibakteriellen Wirkungen aufweisen, nachdem sie im trockenen Zustand mehrere Tage stehen, wohingegen diese unter sauren Bedingungen sehr stabil ist.

Von der Anmelderin wurden Untersuchungen zur Stabilität der Substanz SF-1739 Unter sauren Bedingungen durchgeführt. Als Ergebnis zeigte sich, daß eine neue Substanz SF-1739 HP durch Behandlung der Substanz SF-1739 mit einer starken Säure erhalten werden kann und daß die neue Substanz potentielle antibakterielle Wirkung und Antitumor-Wirkung aufweist

Darüber hinaus werden unter Berücksichtigung der Tatsache, daß die neue und nützliche Substanz SF-1739 HP eine wesentlich höhere Toxizität zeigt weitere Untersuchungen an Derivaten der Substanz SF-1739 HP durchgeführt, um deren Toxizität zu reduzie ^-en. Dabei wurde eine neue Gruppe von Derivaten der Substanz SF-1739 HP gefunden, nämlich die Substanz SF-1739 HP-C, welche durch Umsetzung der Substanz SF-1739 HP mit einem Cyanid erhalten werden und wieche dem beabsichtigten Zweck in befriedigender Weise entspre-

t* chen.

Gegenstand der Erfindung ist die Substanz SF-1739 HP-C mit den im Patentanspruch 1 angegebenen Eigenschaften.

Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung der Substanz SF-1739 HP-C, sowie Mittel mit antibakterieller und mit Antitumor-Wirkung, welche als Wirkstoff die antibiotische Substanz SF-1739 HP-C neben einem pharmazeutisch annehmbaren Träger enthalten (vgl. die Patentansprüche 2 und 3).

I.SubstanzSF-1739HP
/Zwischenprodukt)

(1) Physiko-chemische Eigenschaften

Diese Substanz weist keinen definierten Schmelzpunkt auf und schmilzt unter Schwarzfärbung über einen weiten Bereich, der bei etwa 150 bis 180° C beginnt. Sie weist das in F i g. 1 wiedergegebene ultraviolette Absorptionsspektrum auf, welches in Methanol (in Fig. 1 mit einer ausgezogenen Linie ( —) wiedergegeben) drei Absorptionsmaxima bei 220 nm (£!?_m = 407), 275 nm (132) und 535 ηm (21) aufweist. Das Absorptionsspektrum in 0,05 N HCI - 95% Methanol (in F i g. 1 mit einer punktierten Linie (...) wiedergegeben) weist zwei Absorptionsmaxima bei 265 nm (E TL = 754), 410 (16) auf und das Absorptionsspektrum in 0,05 N NaOH - 95% Methanol (in F i g. 1 mit einer gestrichelten Linie ( ) wiedergegeben) weist Ab-

sorptionsmaxima bei 221 nm (E !^% _m = 440). 277 (124). 345 (Schulter) und 540 (24) auf. Sie weist ein Infrarot-Absorptionsspektrum (in Nujol) wie in Fig. 2 gezeigt auf. mit charakteristischen Absorptionsbanden bei 3350, 1655, 1600, 1540, 1355. 1265,1235, 1180, 1120, 1080. 1020,

1000. 965, 945, 920. 910, 865, 830. 790 und 750 cm-' und ein kernmagnetisches Resonanzspektrum (in D2O) gemäß F i g. 3. Ihr Massenspektrum zeigt Spitzen bei m/e 412, 430, wodurch bestimmt wurde, daß ihr Molekulargewicht etwa dem der Substanz SF-1739 entspricht. Die genannte Substanz weist die folgende analytische Zusammensetzung auf: C 62,19%. H 6.95%. N 8,50%, O 22,36% (durch Differenz). Sie zeigt eine optische Rotationsdispersionskurve gemäß F i g. 4. aus welcher ihre spezifische Rotation [λ] &, + 70° (in 0.05% Methanol) bestimmt wurde. Sie stellt eine schwärzlich purpurfarbene Substanz dar, welche leicht in Wasser und Methanol löslich ist, in Aceton und Äthylacetat löslich ist und in Hexan sich nur wenig löst. Ihre Rf-Werte an einer Silikagel-Dünnschichtchromatografie-Platte (E. Merck), -betragen 0,45, wenn diese in Chloroform zu Methanol (9 :1) und 0,23, wenn diese mit n-Butanol zu Methanol zu 0,1 N HCl (4:2:1) entwickelt werden, während die korrespondierenden Werte der Substanz SF-1739 je-

weils 0,76 und 039 betragen. Die Stabilität der Substanz SF-1739 HP ist im Vergleich zu der Ausgangssubstanz SF-1739 wesentlich erhöht; sie ist sowohl unter sauren als auch alkalischen Bedingungen stabil. Wenn sie z. B. über Nacht in 5 N HCl bei Raumtemperatur stehen gelassen wird, so ist sie vollständig stabil, wohingegen die Ausgangssubstanz SF-1739 im wesentlichen zur Substanz SF-1739 HP umgewandelt wird. Auch wenn die genannte Substanz in 0,1 N NaOH - Methanol über Nacht bei Raumtemperatur stehen gelassen wird, so wird deren antibakterielle Wirkung nicht wesentlich reduziert, wohingegen die Ausgangssubstanz SF-1739 im wesentlichen inaktiviert wird

(2) Herstellung

Diese Substanz kann aus der Substanz SF-1739 durch Behandlung mit einer Säure hergestellt werden. Für diese Säurebehandlung lassen sich anorganische Säuren, wie Salzsäure. Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure und dergleichen, und anorganische Säuren, wie Trifluoressigsäure, Methansulfonsäure, Trifluormethansulfonsäure und dergleichen, verwenden. Die Reaktionsparameter können je nach der Art und der Konzentration der verwendeten Säure und des verwendeten Lösungsmittels variieren. Bei Verwendung einer anorganischen Säure, wird die Behandlung am besten unter Kühlung oder bei Raumtemperatur über einen Zeitraum von 1 Tag bis 1 Woche durchgeührt, wenn eine höhere Konzentration von 5 bis ION angewendet wird, oder bei Raumtemperatur oder höherer Temperatur für einen oder mehrere Tage, wenn eine niedrigere Konzentration von nicht über 5 N angewendet wird. Bei einer erhöhten Temperatur von über 80° C nimmt die Bildung von Nebenprodukten manchmal zu. Die Behandlung kann in einer wäßrigen Lösung ziemlich schnell fortschreiten, während sie in wäßrigen Methanol langsamer abläuft Die Umwandlung bzw. Umsetzung der Substanz SF-1739 zur Substanz SF-1739 HP kann bei einem pHvonunte: 3 durchgeführt werden.

Nach Beendigung der Behandlung, kann mit Hilfe einer üblichen Methode die Substanz SF-1739 HP leicht aus dem Reaktionsgemisch gewonnen werden, wobei man sich die oben angegebenen physiko-chemischen Eigenschaften der Substanz SF-1739 HP zunutze macht. Zum Beispiel kann das Reaktionsgen.sch mit einer Base neutralisiert werden, z. B. Natriumhydrogencarbonat, Kaliumcarbonat und dergleichen, zur Trockne konzentriert werden und der Rückstand mit Methanol extrahiert werden und der Exti ikt direkt durch eine präparative Siiikagel-Dünnschichtchromatografie gereinigt werden. Al'srnativ kann folgendes Verfahren durchgeführt werden, wobei weniger Nebenprodukte bei dieser Behandlung geDildet werden: Das Reaktionsgemisch kann konzentriert werden, der Rückstand in Methanol aufgelöst und die erhaltene Lösung neutralisiert werden, die dann durch eine Sephadex-Säule LH-20 (erhältlich von Pharmacia, Schweden) geleitet wird, die dann mit Methanol oder einem Lösungsmittelgemisch von Äthylacetat und Methanol entwickelt bzw. eluiert wird, um das gewünschte Produkt zu reinigen.

II. Substanz SF-1739 HP-C
(1) Physäkp-chemische Eigenschaften

Diese Substanz weis; keinen definierten Schmelzpunkt auf und schmilzt unter Schwarzfärbung über einen weiten Bereich, der bei etwa 120 bis 15C°C beginne. Sie hat das in F i g. 5 gezeigte ultraviolette Absorptionsspektrum und weist in Methanol (mit einer ausgezogenen Kurve in F i g. 5 angezeigt) drei Absorptionsmaxima bei 222 nm (E !*, = 400), 273 nm (146) und 540 nm (30), in 0,1 N HCI - 90% Methanol (in F i g. 5 mit einer punktierten Linie angezeigt) Absorptionsmaxima bei 204 nm, 266 nm (E 11 = 174) und 410 nm (22) und in 0,1 N NaOH - 90% Methanol (in F i g. 5 mit einer Kettenlinie angezeigt) Absorptionsmaxima bei 222 nm (E !¹S_n = 422), 275 nm (14) und 550 nm (23) auf. Sie besitzt das in Fig.6 dargestellte Infrarot-Absorptionsspektrum (in Nujol) mit charakteristischen Absorptionsbanden bei 3350, 1660, 1535, 1355, 1265, 1235, 1200, 1175, 1140, 1120, 1080, 1060, 1000, 940, 910, 880, 835 und 795 cm-'. Die optische Rotationsdispersionskurve ist in F i g. 7 wiedergegeben und das kernmagnetische Resonanzspektrum (in D2O) wird in F i g. 3 geneigt Die Substanz besitzt folgende analytische Zusammensetzung:

C 59,58%, H 6,14%, N 12,63%. O 21,65% (durch Differenz). Die Substanz ist schwärzlich \-. :purfarben und ist leicht löslich in Wasser und Methanol, Ic such in Aceton und Äthylacetat und wenig löslich in Hexan. An Silikagei-Dünnschichtchromatografie-PIatten (E. Merck) weist sie Rf-Werte von 0,40 bei Entwicklung mit Chloroform Zi. Methanol (9:1) und 0,70 bei Entwicklung mit Äthylacetat zu Methanol (3 :2) auf, während die entsprechenden Werte der Substanz SF-1739 HP jeweils 0,26 und 0J1 betragen. Die Substanz ist im trockenen Zustand und in neutraler, saurer und aiaklischer methanolischer Lösung stabil.

(2) Herstellung der Substanz

Die Substanz SF-1739 KP-C kann aus der Substanz SF-1739 HP, die wie oben unter I (2) angegeben, hergestellt wird, durch Reaktion mit einem Cyanid hergestellt werden.
Geeignete Cyanide sind beispielsweise ein Alkali-, Erdalkali- oder organische Amin- (einschließlich AmmoHak)-Salze der Blausäure (Cyanwasserstoffsäure), wie Natrium-, Kalium-, Lithium-, Magnesium- oder Ammoniumcyanid und eine Verbindung, welche sekundär ein Cyanidion (CN ~) bildet, wei Cyanogenbromid.

Die Reaktion kann unter Kühlung cder bei Raumtemperatur schnell ablaufen und ist in ca. 5 bis 30 Minuten im wesentlichen abgeschlossen. Bei erhöhter Temperatur, welche über Raumtemperatur liegt, besteht die Tendenz der zunehmenden Bildung von Nebenprodukten. Geeignete Lösungsmittel für die Reaktion sind beispielsweise Wasser, Alkohole, Dimethylformamid oder ein Lösi'ngsmittelgemisch aus einem wassermischbaron organischen Lösungsmittel und Wasser.

Nach Beendigung der Reaktion kann das gewünschte Produkt auf einfache Weise gewonnen und durch eine übliche Methode gereinigt werden, wobei man sich die oben aufgeführten physiko-chemischen Eigenschaften jeder Substanz zunutze macht. Das Reaktionsgemisch kann z. B. zur Trockne eingedampft werden und der Rückstand Tiit Methanol extrahiert werden, worauf der Extrakt direkt durch präparative Silikagel-Dünnschichtchromatografie gereinigt wird.

In alternativer Weise (wobei weniger Nebenprdoukte bei der jeweiligen Reaktion gebildet werden) kann das Reaktionsgemisch konzentriert, der Rückstand in Methanol aufgelöst und die erhaltene Lösung über eine Säule aus Sephadex LH-20 (Pharmacia) geleitet werden, welche daraufhin mit Methanol oder einem Lösungsmit-

telgemisch aus Äthylacetat und Methanol entwickelt werden kann.

I. Antimikrobielle Wirkung

Tabelle 1 zeigt die minimale Inhibierungskonzentration der Substanz SF-1739 HP-C.

Tabelle 1

Antimikrobielle Wirkung der Derivate der Substanz SF-1739

III.AkuleToxizität

Tabelle 4 zeigt die akute Toxizität (Lp₅₀) der SubstanzSF-1739 HP-C(intravenös an Mäuse verabreicht).

Tabelle 4

Substanz

Microbe

MIC(mcg/ml)
Substanz SF-1739
HP-C

Bacillus subtilis 0,78

Staphylococcus aureus 209 P 3.125

Sarcinalutea < 0,19

Escherichia coli > 100

Escherichia coli K-12R > 100
Klebsiella pneumonia 50

Pseudomonas aeruginosa > 100
Proteus vulgaris 50

II. Antitumor-Wirkung
A) Cytopathogene Wirkung in vitro

Tabelle 2 zeigt die minimale cytopathogene Konzentration der Substanz SF-1739 gemäß der Erfindung.

Tabelle 2

Testsubstanz

Minimale cytopathogene
Konzentration (mcg/ml)*)
HeLa S3 Hep. 4 2

Rarrnma

180

SF-1739
HP-C

<0,4

0,9

*) Ermittelt nach 48stündiger Gewebekultur.

B) In-vivo-carcinostatischer Effekt bei Mäusen

Männliche Mäuse vom Stamm CDFi (Alter etwa 5 Wochen, Gewicht 19 ± 1 g.jede Gruppe bestehend aus 3 bis 5 Tieren) wurden intraperitoneal mit P-388 Leukämiezellen 10⁶/0,02 ml/Maus inokuliert. Die Testsubstanz wurde in der angegebenen Dosis in Wasser aufgelöst und intraperitoneal zu 2 bis 0,2 ml/Tag/Maus 3 Tage hintereinander 24 Stunden nach der Inokulation verabreicht Daraufhin wurde die Zunahme der Lebensspanne (ILS) berechnet Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 zusammengefaßt

Tabelle 3

LD₅₀ (mg/kg)

SF-1739 HP-C

20-25

Die Verabreichung der Substanz SF-1739 HP-C in der Behandlung verschiedener Tumorarten kann oral und parenteral in Form einer Präparation, welche im allgemeinen einem üblichen festen oder flüssigen pharmazeutisch annehmbaren Träger oder Exzipienten beigemischt ist, erfolgen.

Bei Verwendung der Substanz SF-1739 HP-C als antibakterielles Mittel wird diese ebenfalls oral oder parenteral in Form einer festen oder flüssigen Präparation, wie sie im allgemeinen für andere bekannte antibakterielle Mittel oder Antibiotika angewandt wird, verwendet.

B e i s ρ i e 1 1

a) Herstellung der Substanz SF-1739 H P

Eine Lösung von 6 mg SF-1739-Hydrochlorid in 3 ml 5 N Salzsäure wurde bei Raumtemperatur 1 Woche stehen gelassen. Die Lösung wurde mit festem Natriumhydrogencarbonat neutralisiert und die neutralisierte Lösung unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde in einer kleinen Menge Methanol aufgelöst. Unlösliches abfiltriert und das FiI-trat konzentriert. Der Rückstand wurde auf eine präparative Silikagel-Dünnschichtchromatografie-Platte (2 χ iöö χ iOö mm, E. Merck) aufgetragen, die dann mit einem Lösungsmittelgemisch aus Chloroform und Methanol (9:1) entwickelt wurde. Eine purpurfarbene Bande mit einem Rf-Wert von 0,45 wurde aus der Platte ausgeschnitten und mit Methanol extrahiert.

Der Extrakt wurde zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde wiederum in einem Lösungsmittelgemisch aus Methanol und Aceton (2 :1) aufgelöst und der unlösliche Anteil abfiltriert. Das Filtrat wurde zur Trockne konzentriert, wobei 33 mg der Substanz SF-1739 HP erhalten wurden.

50

b) Herstellung der Substanz SF-1739 HP-C

Testsubstanz

Dosis (mg/kg)

SF-i739HP-C

16
8
4
2
1

Zu einer Lösung von 71 mg der Substanz SF-1739 HP in 5 ml Wasser wurden 144 mg Natriumcyanid gegeben und das erhaltene Gemisch 30 Minuten lang bei Raumtemperatur stehen gelassen. Daraufhin wurde dieses unter vermindertem Druck unterhalb 35° C durch Addition von n-ButanoI zur Trockne konzentriert Der Rückstand wurde in einer kleinen Menge Methanol aufgelöst der unlösliche Anteil abfiltriert und das Filtrat konzentriert Der Rückstand wurde auf eine präparative Silika-

gel-Dünnschichtchromatografie-Platte

(2 χ 100 χ 100 mm, erhältlich von E Merck) aufgetragen.

70,2 die daraufhin mit einem Lösungsmittelgemisch aus

53,8 Äthylacetat und Methanol {3 :2) entwickelt wurde. Eine

113.5 65 purpurfarbene Bande mit einem Rf-Wert von 0,70 wurde abgekratzt und mit Methanol extrahiert. Der Extrakt

59,4 wurde zur Trockne konzentriert und der Rückstand in

einem Lösungsmittelgemisch aus Methanol und Aceton

ILS(⁰Zo)

(2:1) wieder aufgelöst. Der unlösliche Anteil abfiltriert und dann das Filtrat zur Trockne konzentriert, wobei 35 mg der Substanz SF-1739 HP-C erhalten wurden.

Beispi el 2

Zu einer Lösung aus 73 mg der Substanz SF-1739 HP in 2 ml Methanol wurden 72 mg Kaliumcyanid gegeben und das erhaltene Gemisch 5 Minuten lang bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde auf eine präparative Silikagel-Dünnschichtchromatografie-Platte (2 χ 100 χ 100 mm, erhältlich von E. Merck) aufgetragen, die dann mit einem Lösungsmittelgemisch aus Äthylacetat und Methanol (3 :2) entwickelt wurde. Eine purpurfarbene Bande mit einem Rf-Wert von 0,70 wurde durch Abkratzen entfernt und mit Methanol extrahiert. Der Extrakt wurde zur Trockne konzentriert, der Rückstand in einem Lösungsmittelgemisch aus Methanol und Aceton (2 :1) wieder aufgelöst, der unlösliche Anteil abfiltriert und dann das Filtrat zur Trockne konzentriert, wobei 50 mg der Substanz SF-1739 HP-C erhalten wurden.

Hierzu 4 Blatt Zeichnungen

40

50

55

Claims

Patentansprüche:

1. Substanz SF-1739 HP-C mit den folgenden physiko-chemischen Eigenschaften:

gemäß

schwärzlich purpurfarbene Substanz,

Ultraviolett-Absorptionsspektrum

Fig. 5,

Infrarot-Absorptionsspektrum gemäß Fig.6 mit charakteristischen Absorptionsbanden bei

3350. 1660, 1600, 1535. 1355, 1265, 1235, 1200, 1175, 1140, 1120,1080, iO6O, 1000, 940, 910, 880,