DE2804566C2

DE2804566C2 - Arginyl-Lysyl-Aspartyl-Valyl-Tyrosin und dessen Derivate, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung

Info

Publication number: DE2804566C2
Application number: DE2804566A
Authority: DE
Inventors: Gideon Short Hills N.J. Goldstein; David H. Lombard Ill. Schlesinger
Original assignee: Sloan Kettering Institute for Cancer Research
Current assignee: Memorial Sloan Kettering Cancer Center
Priority date: 1977-11-15
Filing date: 1978-02-03
Publication date: 1986-01-16
Also published as: SE7801030L; FR2408580A1; CA1105925A; JPS5476543A; DE2804566A1; FR2408580B1; SE446867B; CH639941A5; BE864121A; JPH0137399B2; JPS6118560B2; JPS6150998A

Description

a) die angegebene Pentapeptid-Sequenz aus den betreffenden, gegebenenfalls an funktlonellen Gruppen der Seltenkette geschützten Aminosäure-Derivaten über den durch kovälente Bindung des Tyrosyl-Restes an ein unlösliches Polymerharz erhaltenen Ester schrittweise aufbaut,

b) mit dem im Falle der Verknüpfung geschützter Amonlsäurereste erhaltenen Zwischenprodukt der Formel . _ .......

R¹ R² R³ R⁴

R⁵-ARG-LYS-ASP-VAL-TYR-Harz

in der R¹ bis R⁵ übliche Schutzgruppen für die jeweilige funktioneile Gruppe In der Seltenkette bzw. die a-Amlnogruppe des Arglnlns sind, entweder nach vorangehender selektiver Abspaliung von R⁵ Alkanoyl-Derlvate mit 1 bis 7 C-Atomen im Alkanoylrest herstellt und/oder die Abspaltung der sonstigen Schutzgruppen und des polymeren Tragers durchführt und

c) das so hergestellte Pentapeptld gegebenenfalls in die angegebenen C-termlnalen Derivate oder Salze überführt.

3. Verwendung der Verbindungen nach Anspruch 1 bei der Differenzierung von T-Lymphozyten, aber nicht von K.omplementrezeptor-(CR⁺)-B-Lymphozyten.

Die Erfindung betrifft das In Anspruch ^ genannte Pentapeptid und dessen Derivate, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung bei der Differenzierung von T-Lymphozyten.

Zahlreiche Polypeptide sind bekanntlich aus verschiedenen Organen von Tieren Isoliert worden. Ungefähr bis zum vergangenen Jahrzehnt war jedoch sehr wenig über den Thymus, ein Organ, das beim Menschen bei der Geburt etwa 0,8% seines Körpergewichts ausmacht, bekannt, obwohl bisher angenommen wurde, daß eine neuromuskuläre Blockierungssubstanz Im Thymus vorhanden war. Trotz sehr starkem Interesse an möglichen Funktionen des Thymus und frühzeitiger Spekulation und Versuchen war bis vor kurzem wenig Ober die Funktion des Thymus bekannt. Man weiß jedoch heute, daß der Thymus ein Verbindungsorgan sowohl mit eplthelialen (endokrinen) und lympholden (Immunologischen) Verbindungen 1st und bei den Immunitätsfunktionen des Körpers eine Rolle spielt. Der Thymus ist bekanntlich ein Verbundorgan, das aus einem vom dritten Branchlalbogen stammenden Eplthellalstroma und Lymphozyten besteht, die aus Stammzellen kommen, die Ihren Ursprung In hämopoetlschen Geweben haben; siehe Goldstein und Mitarbeiter »The Human Thymus«, Heinemann, London 1969. Lymphozyten werden Innerhalb des Thymus differenziert und treten als reife, vom Thymus abgeleitete Zellen, sog. T-Zellen aus, die zum Blut, zur Lymphdrüse, zur MIIz und zu den Lymphknoten zirkulieren. Die Induktion der Differenzierung von Stammzellen Innerhalb des Thymus scheint durch Sekretlonen der Eplthelialzellen des Thymus ausgelöst zu werden, jedoch verhinderten Schwierigkeiten mit biologischen Versuchen bisher die vollständige Isolierung und strukturelle Charakterisierung etwaiger Hormone, die vorhanden sein können.

Um die Bedeutung der differenzierenden biologischen Eigenschaften der Polypeptide gemäß der Erfindung verständlich zu machen, ist zu bemerken, daß die Funktion des Thymus In Relation zur Immunität grob als Bildung von aus dem Thymus stammenden Zellen oder Lymphozyten, sog. T-Zellen, angegeben werden kann. Die T-Zellen bilden einen großen Anteil der Gesamtmenge der zirkulierenden kleinen Lymphozyten. Die T-Zellen weisen Immunologische Spezlfltät auf und sind direkt an durch Zellen vermittelten Immunreaktionen (z. B. Homografi-Reaktlonen) als Nervenendorganzellen (effector cells) beteiligt. Die T-Zellen sondern jedoch keine humoralen Antikörper ab, da diese Antikörper durch Zellen abgesondert werden, die direkt vom

6fl Knochenmark unabhängig vom Einfluß des Thymus stammen. Diese letzteren Zellen werden als B-Zellen bezeichnet. FQr viele Antigene erfordern jedoch die B-Zellen die Anwesenheit von entsprechend reaktiven T-

Zellen, bevor sie Antikörper bilden können. Der Mechanismus dieses Prozesses der Zusammenarbeit der Zellen Ist noch nicht völlig geklärt. Auf der Grundlage dieser Erklärung kann festgestellt werden, daß, In funktlonellen Ausdrücken, der Thymus

für die Entwicklung der zellulären Immunität und zahlreiche Reaktionen der humoralen Antikörper notwendig Ist und diese Systeme beeinflußt. Indem er im Thymus die Differenzierung von hämopoetlschen Stammzellen zu T-Zellen auslöst. Dieser Induktive Einfluß wird durch Vermittlung von Sekretionen der Eplthelialzellen des Thymus, d. h. der Thymus-Hormone ausgeübt.

Um die Funktion des Thymus und des Zellsystems der Lymphozyten sowie die Zirkulation von Lymphozyten Im Körper zu verstehen, ist ferner darauf hinzuweisen, daß die Stammzelien im Knochenmark entstehen und den Thymus durch den Blutstrom erreichen. Innerhalb des Thymus werden die Stammzellen zu Immunologisch kompetenten T-Zellen differenziert, die zum Blutstrom wandern und zusammen mit den B-Zellen zwischen den Geweben, Lymphgefäßen und dem B'utstrom zirkulieren.

Die Zellen des Körpers, die Antikörper abscheiden, entwickeln sich auch aus hämopoetischen Stammzellen, jedoch wird ihre Differenzierung nicht durch den Thymus bestimmt. Sie werden daher als vom Knochenmark stammende Zellen oder B-Zellen bezeichnet. Bei Vögeln werden sie In einem dem Thypus analogen Organ differenziert, das als Bursa von Fabriclus bezeichnet wird. Bei Säugetieren wurde kein gleichwertiges Organ entdeckt, und es wird angenommen, daß die B-Zellen innerhalb des Knochenmarks differenzieren. Die physio- ίο logischen Substanzen, die diese Differenzierung diktieren, bleiben vollständig unbekannt.

Es Ist seit einiger Zeit bekannt, daß Beziehungen zwischen dem Thymus und den Immunitätscharakteristiken des Körpers bestehen, so daß großes Interesse für Substanzen, die vom Thymus Isoliert worden sind, gezeigt wurde. In dieser Hinsicht wurden In den letzten Jahren verhältnismäßig zahlreiche Artikel auf der Grundlage der wissenschaftlichen Arbeit veröffentlicht, die Stoffe, die im Rinderthymus vorhanden sind, betrifft. Von der Anmeldern wurde eine Anzahl von Arltkeln veröffentlicht, die die Forschung auf diesem Gebiet betreffen. Einschlägige Veröffentlichungen erschienen beispielsweise in »The Lancet«, 20.7.1968, Seite 119-122; »Triangle«, Band 11, Nr. 1 (1972) 7-i4; Annals of the New York Academy of Sciences 183 (1971) 230-240; Cilnlcal and Experimental Immunology 4, Nr. 2 (1967) 181-189; »Nature« 247 (1974) Π-14; Proceedings of the National Academy of Sciences USA 71 (1974) 1474-1478; »Cell« 5 (1975) 361-365 und 367-370, und »Lancet« 2 (1975)256-259.

In der Veröffentlichung von Goldstein und Manganaro In »Annals of the New York Academy of Sciences« 183 (1971) 230-240 wird Ober die Anwesenheit eines Thymus-Polypeptlds berichtet, das einen myasthenischen neuromuskulären Block bei Tieren hervorruft, der der menschlichen Krankheit Myasthenie gravls analog ist. Ferner wird In diesem Artikel festgestellt, daß zwei unterschiedliche Effekte durch gesonderte Polypeptide Im Rinderthymus hervorgebracht werden. Es wurde angenommen, daß eines dieser Polypeptide, als »Thymotoxin« bezeichnet, Myositls verursacht, jedoch wurde ferner darauf hingewiesen, daß dieses Polypeptld nicht isoliert worden war, obwohl es sich als Polypeptld mit einem Molekulargewicht von etwa 7000 erwies, eine starke reine positive Ladung hatte und am Ilonenaustauscherharz »CM-Sephadex« bei pH 8,0 zurückgehalten wurde.

In der Veröffentlichung In »Nature« 247 (4. 1. 1985) 11 werden als Thymln I und Thymln H Identifizierte Produkte beschrieben, die sich als neue Polypeptide erwiesen, die vom Rinderthymus isoliert wurden und spezielle Anwendungen auf verschiedenen therapeutischen Gebieten haben. Auf Grund des Gebrauchs ähnlicher Namen für andere Produkte, die "jerelts vom Thymus Isoliert worden waren, werden diese Produkte Thymin I und Thymln II nun als Thjmopoletln I und Thymopoletln II bezeichnet. Diese Produkte und Verfahren zu Ihrer Herstellung werden In der US-PS ·»" 20 951 beschrieben.

Die US-PS 4002 602 beschreibt langkettlge Polypeptide, die als ublqultäre immunopoetlsche Polypeptide (UBiP) bezeichnet werden. Dieses Peptid wurde später in Ubiquiiin umbenannt. Dieses Polypeptid ist ein 74-Amlnosäurepolypeptld, das durch seine Fähigkeit gekennzeichnet ist. In vitro In Konzentrationen von Nanogramm die Differenzierung sowohl von T-Zellen- als auch B-Zellen-Immunozyien aus Vorstufen, die im Knochenmark oder in der Milz vorhanden sind, auszulösen. Das Polypeptid ist somit wertvoll bei der Therapie von mangelnder Funktion des Thymus oder von Immunltätsmangeln.

Die US-PS 40 02 740 beschreibt synthetisierte Trldecapeptldmlschungen, die die Fähigkeit haben, die Differenzierung von L-Lymphozyten, aber nicht von Komplefaentrezeptor-B-Lymphozyten auszulösen. Dieses Polypeptld zeigte somit viele der Eigenschaften der langkettlgen Polypeptide, die gemäß der vorstehend genannten US-PS 41 20 951 isoliert und als Thymopoletln bezeichnet wurden.

Gegenstand der Erfindung sind das synthetisierte Pentapeptld gemäß Anspruch 1 mit einer ganz bestimmten Sequenz mit aktiven Stellen, das, wie gefunden wurde, viele der Eigenschaften des Isolierten langkettigen PoIypeptlds, das in den vorstehend genannten Veröffentlichungen und In der US-PS 41 20 951 als »Thymopoietln« bezeichnet wird, und des In der US-PS 40 C2 740 beschriebenen Tridecapeptlds aufweist, sowie die In Anspruch 1 angegebenen Derivate dieses Pentapeptids. Das Pentapeotld und seine Derivate sind im folgenden als »Pentapeptide« bezeichnet.

Die Erfindung stallt sich demgemäß die Aufgabe, neue Pentapeptlde, die biologisch wichtig sind und die Fähigkeit haben. In Konzentrationen von Nanogramm die Differenzierung von Knochenmarkzellen zu T-Zellen zu bewirken und hierdurch äußerst wertvoll im Immunitätssystem von Mensch und Tier sind, verfügbar zu machen.

Die Erfindung Ist ferner auf Verfahren zur Herstellung der neuen Pentapeptlde gemäß der Erfindung sowie auf deren Verwendung bei der Differenzierung von T-Lymphozyten, aber nicht von Komplementrezeptor-(CR*)-B-Lymphozyten gerichtet.

Die vorstehend genannten Aufgaben und Vorteile werden gemäß der Erfindung durch neue Pentapeptide verwirklicht, die die folgende Sequenz als aktive Stelle aufweisen: μ

-ARG-LYS-ASP-VAL-TYR-

In der ARG mit R und TYR mit R' gemäß Anspruch 1 verknüpft Ist.

Die Erfindung Ist ferner auf Verfahren zur Herstellung der Pentapeptlde gemäß der Erfindung durch Peptldsynthese In der festen Phase sowie auf Verwendung der Peptide gemäß Anspruch 3 gerichtet. In Arzneimitteln, die die Pentapeptide enthalten und Menschen und Tieren verabreicht werden, um biologische Wlrkuneen darauf auszuüben.

Die erfindungsgemäßen Pentapeptlde haben therapeutischen Wert auf verschiedenen Gebieten.
Als hauptsächliche Ausführungsform umfaßt die Erfindung das Pentapeptid mit der Aminosäuresequenz I als aktiver Stelle:

I. ARG-LYS-ASP-VAL-TYR

Als weitere Ausführungsform ist die Erfindung auf Pentapeptide gerichtet, die die vorstehend genannte Sequenz als aktive Stelle aufweisen und durch die folgende allgemeine Formel II beschrieben werden können:

«° II. R-ARG-LYS-ASP-VAL-TYR-R'

Hierin stehen R für Wasserstoff oder Alkanoylreste mit 1 bis 7 C-Atomen und R' für einen Hydroxyrest, Alkoxyreste mit 1 bis 7 C-Atomen oder einen Aminorest. Beide Reste sind Substituenten an der Pentapeptldsequenz, die die biologische Aktivität der grundlegenden aktiven Sequenz nicht wesentlich beeinflussen. Unter dieser Angabe Ist zu verstehen, daß die endständigen Aminosäuren an dieser Pentapeptidkette modifiziert werden können, wenn funktioneile Gruppen (R und R') an diese endständigen Aminosäuren gebunden werden, ohne die biologische Aktivität des Moleküls wesentlich zu beeinflussen. Es Ist somit festzustellen, daß die endständigen Amino- und Carbonsäuregruppen nicht wie bei einigen Polypeptiden für die biologische Aktivität des Pentapeptlds wesentlich sind. In den Rahmen der Erfindung fallen daher Pentapeptide, die endständig unsubstitulert sind (R=H; R'=OH) und die endständig durch eine oder mehrere funktioneile Gruppen R und/oder R'. die die hler offenbarte biologische Aktivität nicht wesentlich beeinflussen, substituiert sind.

Diese Feststellung Ist so zu verstehen, daß diese funktlonellen Gruppen eine normale Sübst: Iution wie Acylierung an der freien Amlnogruppe und Amidierung an der freien Carbonsäuregruppe einschließen. Von diesen Aspekten aus erweisen sich die Pentapeptide gemäß der Erfindung als außergewöhnlich, da die Pentapeptide die

" gleiche biologische Aktivität wie langkettlge natürliche Peptide aufweisen, In denen diese Pentapeptldsequenz einen Teil bildet oder darin vorhanden Ist. Es wird daher aL.genommen, daß die Aktivitätsvoraussetzungen des Moleküls durch Stereochemie des Moleküls, d. h. die besondere »Faltung« des Moleküls erzeugt werden. In diesem Zusammenhang ist zu bemerken, daß Polypeptldblndungen nicht starr, sondern flexibel sind und in flächiger Form, als Schraube oder Helix u. dgl. vorliegen können. Als Ergebnis Ist das gesamte Molekül flexibel und »faltet sich« In ganz bestimmter Welse. Gemäß der Erfindung wurde gefunden, daß das Pentapeptid sich In der gleichen Welse wie das langkettige natürliche Polypeptld »faltet« und daher die gleichen biologischen Eigenschaften aufweist. Aus diesem Grunde kann das Pentapeptid mit verschiedenen funktionellen Gruppen substituiert werden, so lange die Substituenten die biologische Aktivität nicht wesentlich beeinträchtigen oder die natürlichen »Falten« des Moleküls nicht stören.

Gemäß einer spezielleren Ausführungsform umfaßt die Erfindung neue Psntapeptlde mit der folgenden Sequenz:

II. R-ARG-LYS-ASP-VAL-TYR-R' H'^rln steht R z. B. für Wasserstoff oder Acetyl oder Proplonyl, und R' steht für OH oder NH₂. Besonders

bevorzugt werden Pentapeptide, In denen R Wasserstoff und R' OH 1st.
In den Rahmen der Erfindung fallen ferner die pharmakologlsch unbedenklichen Salze der Pentapeptide. Als

Beispiele von Säuren, die Salze mit den Pentapeptlden bilden können, seien genannt: anorganische Säuren, z. B.

Salzsäure, Bromwasserstoffsäure, Perchlorsäure, Salpetersäure, Thlocyansäure, Schwefelsäure und Phosphorsäure, und organische Säuren, z. B. Ameisensäure, Essigsäure, Propionsäure, Glykoisäure, Milchsäure, Brenztraubensäu'e. Oxalsäure, Malonsäure, Bernsteinsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Anthranylsäure, Zimtsäure, Naphtha-

linsulfonsäure und Sulfanllsäure.
In den vorstehenden Strukturen werden die Aminosäurekomponenten des Peptids der Einfachheit halber

durch Abkürzungen gekennzeichnet: Die folgenden Abkürzungen werden verwendet:

·

Aminosäure Abgekürzte Bezeicnnung

L-Arginin	AI\G
L-Lysin	LYS
L-Asparaginsäure	ASP
L-Valin	VAL

L-Tyrosin TYR

Die Pentapeptldsequenz gemäß der Erfindung Ist ein durch fünf Aminosäuren gebildetes Peptid, das, wie festgestellt wurde, ähnliche Eigenschaften wie das aus 49 Aminosäuren gebildete, vom Rlnderthymus Isolierte Polypeptld hat, das in der US-PS 41 20 951 der Anmelderln beschrieben wird. Die Peptide gemäß der Erfindung zeichnen sich Insbesondere durch Ihre Fähigkeit aus, die selektive Differenzierung von THY-1*-T-Zellen (aber ¹^ nicht von CR*-B-Zellen) In Konzentrationen von 1 ng bis 10 μg/ml auszulösen. Thy-1 Ist ein an T-Zellen, aber nicht an B-Zellen vorhandenes Dlfferenzierungr-Alloantlgen, während CR ein an B-Zellen, aber nicht an T-Zel'en vorhanJ?,ner Komplementrezeptor Ist.

Untersuchungen dieser synthetischen Peptide Im Induktionstest In vitro zeigten, daß sie die gleiche Induk-

tlonsspezlfltüt wie Thymopoletln II haben, d. h. sie bewirkten die Differenzierung von ΤΗΥ-Γ-Zellen zu Thy-I*- T-Zellen, aber nicht die Differenzierung von CR~-Zellen zu CR*-Zellen. Zwar wurden zahlreiche Substanzen Identifiziert, die Thymopoletln In vitro nachahmen können und die T-Zellendlfferenzlerung durch Steigerung des Intrazellularen cyclischen AMP bewirken, jedoch Ist zu betonen, daß nur wenige Substanzen bei solchen niedrigen Konzentrationen wirksam sind; die Peptide gemäß der Erfindung bewirken selektiv die Dlfferenzlerung von T-Zellen, aber nicht von CR*-B-Zellen. Es wurde ferner nachgewiesen, daß diese synthetischen Peptide auch die neuromuskuläre Transmission wie Thymopoletln selbst beeinträchtigen. So war 24 Stunden nach einer einzigen Injektion von 10 bis 100 Mg/Maus eine deutliche Beeinträchtigung der neuromuskulären Transmission durch Elektromyographle nachweisbar.

Auf Grund dieser Eigenschaften sind die Pentapeptlde gemäß der Erfindung therapeutisch wertvoll für die i" Behandlung von Mensch und Tier, da sie die Fähigkeit haben, die Differenzierung der In den hämopoetlschen Geweben gebildeten iymphopoetlschen Stammzellen zu vom Thymus stammenden Zellen oder T-Zellen auszulösen, die In die Immunreaktion des Körpers einzugreifen vermögen. Als Ergebnis finden die Produkte gpnyäß der Erfindung vielfache therapeutische Anwendungen. Da die Verbindungen die Fähigkeit haben, einige c^r genannten Funktionen des Thymus auszuüben, finden sie In erster Linie In verschiedenen Thymusfunktions- ι^ς und Immunitätsbereichen Anwendung. Ein primäres Anwendungsgebiet Ist die Behandlung des DlGeorge-Syndroms, eines Zustandes, bei dem das Fehlen des Thymus angeboren Ist. Durch Injektion der Pentapeptlde wird dieser Mangel überwunden. Auf Grund Ihrer biologischen Eigenschaften sind die Pentapeptlde, die bei niedrigen KotUcuiraiionen Sußers: aktiv sind, dadurch wertvoü, daß sie die kollektive Immunität des Körpers dadurch unterstützen, daß sie die therapeutische Stimulation der zellulären Immunität steigern oder unterstützen und hierdurch wertvoll für die Behandlung von Krankheiten werden, bei denen chronische Infektionen In vivo, z. B. fungöse oder Mycoplasma-Infektlonen, Tuberkulose, Lepra, akute und chronische Virusinfektionen u. dgl. auftreten. Ferner werden die Peptide für wertvoll auf jedem Gebiet gehalten, auf dem zelluläre Immunität umstritten Ist. Insbesondere dann, wenn Immunltätsmänge! wie beispielsweise bei dem oben genannten DlGeorge-Syndrom vorliegen. Wenn ferner eine übermäßige Antlkörperblldung durch ein Ungleichgewicht von 2> T-Zellen und B-Zellen vorliegt, können die Verbindungen diesen Zustand durch Anregung der Bildung von T-Zellen korrigieren. Sie können somit von therapeutischem We-rt bei gewissen Autoimmunleiden sein, bei denen schädigende Antikörper vorhanden sind, z. B. bei systemlsc'ism Lupus erythematodes. Auf Grund der Eigenschaften der Pentapeptlde sind sie ferner In vitro wertvoll durch Auflösung der Entwicklung von Oberflächenantigenen von T-Zellen, durch Auslösung der Entwicklung der funktioneilen Fähigkeit, Empfindlichkeit 3» für Mltogene und Antigene und Mitwirkung der Zellen in der Steigerung der Fähigkeit der B Zellen, Antikörper zu bilden, zu erreichen. Die Pentapeptlde sind ferner dadurch wertvoll, daß sie die unkontielllerte Proliferation von Lyniphozyten, die auf Thymopoletin ansprechen, hemmen.

Eine wichtige Eigenschaft der Pentapeptlde 1st Ihre Fähigkeit In vivo. Zellen mit den Eigenschaften der T-Zellen wiederherzustellen. Die Pentapeptlde gemäß der Erfindung sind daher als Folge ihrer Fähigkeit, die Immunreaktion des Körpers zu steigern, auf zahlreichen Gebieten wirksam. Da sie die neuromuskuläre Transmission beeinträchtigen, sind sehr hohe Dosen der Peptide gemäß der Erfindung wertvoll für die Behandlung von Krankheiten mit übermäßiger neuromuskulärer Transmission, z. B. Spastlzltät.

Eine weitere wichtige Eigenschaft der Peptide gemäß der Erfindung besteht darin, daß sie bei sehr niedrigen Konzentrationen von 1 ng/ml an wirksam sind und bei Konzentrationen von etwa 100 ng maximale Aktivität zeigen. Als Träger eignen sich alle für diesen Zweck bekannten Trager einschließlich normaler Kochsalzlösunger, vorzugsweise mit einem Protein als Verdünnungsmittel, z. B. Rinderserumalbumin, um Verluste durch Adsorption an Glasgeräte bei diesen niedrigen Konzentrationen zu verhindern Die Peptide gemäß der Erfindung sind In einer Dosierung oberhalb von etwa 1 mg/kg Körpergewicht wirksam. Für die Behandlung des DlGeorge-Syndroms können die Pentapeptlde in einer Dosis von etwa 1,0 bis 10 mg/kg Körpergewicht verabreicht werden. Im allgemeinen können Dosen im gleichen Bereich für die Behandlung der anderen genannten Zustände oder Krankheiten angewendet werden.

Die Pentapeptlde gemäß der Erfindung wurden nach ähnlichen Verfahren hergestellt, wie sie von Merrlfleld In Journal of the American Chemical Society 85 (1963) 2149-2154 beschrieben werden. Die Synthese bestand aus der stufenweisen Anlagerung von geschützten Aminosäuren an eine wachsende Peptldkette, die durch kovalente Bindungen an ein festes Harzteilchen gebunden war. Durch diese Arbeitsweise wurden Reagentlen u.:d Nebenprodukte durch Filtration entfernt, und die Umkrlstalllsatlon von Zwischenprodukten war überflüssig. Das allgemeine Konzept dieses Verfahrens beruht auf der Bindung der ersten Aminosäure der Kette an ein festes Polymerisat durch eine kovalente Bindung und die einzelne, stufenweise Anlagerung der nachfolgenden Aminosäuren, bis die gewünschte Sequenz zusammengesetzt ist. Abschließend erfolgt die Entfernung des festen Trägers und die Entfernung der Schutzgruppen. Bei diesem Verfahren wird eine wachsende Peptldkette erhalten, die an ein vollständig unlösliches festes Teilchen gebunden Ist, so daß sie In einer zweckmäßigen Form für die Filtration und die Entfernung von Reagentlen und Nebenprodukten durch Waschen vorliegt.

Die Aminosäuren können an beliebige geeignete Polymerisate gebunden werden, die lediglich in den verwendeten Lösungsmitteln unlöslich sein und eine beständige physikalische Form, die leichte Filtration ermöglicht, aufweisen müssen. Das Polymerisat muß eine funktionell Gruppe enthalten, an die die erste geschützte Aminosäure durch eine kovalente Bindung fest gebunden werden kann. Für diesen Zweck eignen sich die verschiedensten Polymerisate, z. B. Cellulose, Polyvinylalkohol, Polymethacrylat und sulfonlertes Polystyrol, jedoch wurde für die Synthese gemäß der Erfindung ein chlormethyllertes Copolymerlsat von Styrol und D!v!ny!benzol verwendet.

Die verschiedenen funktlonellen Gruppen an der Aminosäure, die aktiv waren, aber nicht an den Reaktionen teilnehmen sollten, waren durch übliche Schutzgruppen, wie sie auf dem Gebiet der Polypeptide verwendet werden, während der gesamten Reaktion geschützt. Beispielsweise waren die funktlonellen Gruppen, z. B. die

Seltenkette an Arginin, Lysin, Asparaginsäure und Tyrosin, durch Schutzgruppen geschützt, die bei Vollendung der Sequenz entfernt werden konnten, ohne das als Endprodukt gebildete Pentapeptid nachteilig zu beeinflussen. Die Synthese wurde Insofern nach einer Modifikation der Feststoffsynthese durchgeführt, als Fluorescamln verwendet wurde, um durch ein Anzeichen von positiver Fluoreszenz zu bestimmen, ob die Kupplung vollstän-

s dig war [siehe Felix und Mitarbeiter In Anaiyt. Blochem. 52 (1973) 377]. Wenn vollständige Kupplung nicht angezeigt wurde, wurde die Kupplung mit der gleichen geschützten Aminosäure wiederholt, bevor die Schutzgruppen der ct-Amlnogruppe entfernt wurden.

Bei dem allgemeinen Verfahren wurde zunächst das an seinen Amino- und Hydroxylgruppen geschützte L-Tyrosln In absolutem Alkohol, der ein AmIn enthielt, zum Harz verestert. Das gekuppelte Amlnosaureharz

ίο wurde dann abflltrlert, mit Alkohol und Wasser gewaschen und getrocknet. Die Schutzgruppe an der Amlnogruppe des geschützten Tyroslns (z. B. t-Benzyloxycarbonyl, abgekürzt t-BOC) wurde dann entfernt, ohne andere Schutzgruppen zu beeinflussen. Das hierbei erhaltene gekuppelte Aminosäureharz, das die freie Amlnogruppe enthielt, wurde dann mit geschütztem L-VaIIn, vorzugsweise cr-t-BOC-L-Valln, umgesetzt, um das L-Valln an das Amlnosaureharz zu kuppeln. Die Reaktionen wurden dann mit geschützter !.-Asparaginsäure,

υ geschütztem L-Lysln und L-Arglnin wiederholt, bis das vollständige Molekül gebildet war. Dieses Verfahren wurde zur Bildung der basischen, aus fünf Aminosäuren gebildeten aktiven Sequenz angewendet.

Die Aufeinanderfolge von Reaktionen zur Herstellung der aus fünf AmlnosBuren gebildeten, die aktive Stelle darstellenden Sequenz kann wie folgt durchgeführt werden:

fj

Harz

4.

R4

H-Tyr-Harz

R4

i-BOC-Val-Tyr-Harz
R4

H-Val-Tyr-Harz

R₃

!-BOC-Asp-Val-Tyr-Harz

σ-BOC-Tyr-OH

Entfernung der Schutzgruppe der o-Aminogruppe

a-BOC-L-Valin Entfernung der Schutzgruppe
der a-Aminogruppe

Rj

a-BOC-Asp-OH Entfernung der Schutzgruppe
der o-Aminogruppe

H-Asp-Va!-Tyr-Harz
R₃ R₃ R«

I I !

a-BOC-Lys-Asp-Val-Tyr-Harz

R2

o-BOC-Lys-OH Entfernung der Schutzgruppe
der o-Aminogruppe

R₂ R₃

I I

H-Lys-Asp-Val-Tyr-Harz _R)

I ι

I a-AOC-Arg-OH

Ri Ri R3 R»

III I .

o-AOC-Arg-Lys-Asp-Val-Tyr-Harz Entfernung aller Schutzgruppen

H-Arg-Lys-Asp-Val-Tyr-OH

In der vorstehenden Folge von Reaktionen slni Ri, Rj, Rj und R« Schutzgruppen an den verschiedenen reaktionsfähigen Gruppen an den Aminosäure-Seltenketten, die nicht beeinflußt oder entfernt werden, wenn die Schutzgruppe an der ar-Amlnogruppe entfernt wird, um die weitere Reaktion zu gestatten. Vorzugswelse steht In dem vorstehenden, als Zwischenprodukt gebildeten Pentapeptldharz R, für Tosyl (Tos), Rj für Ben2yloxycarbonyl (Z), Rj für Benzyl (BzI) R₄ für 0-2,6-Dlchlorbenzyl and a-R_s für T-Amyloxycarbonyl UAOC). Als Harze eignen sich alle Harze, die vorstehend als geeignet für das Verfahren genannt wurden.

Das Peptld-Harz wird gespalten, um das Peptid vom Harz und den Schutzgruppen R,, R₂, Rj, R» und u?-R₅ zu befreien, wobei gleichzeitig das als Endprodukt gewünschte Pentapeptld erhalten wird. Die Schutzgruppen und das Harz werden nach üblichen Verfahren, z. B. durch Behandlung mit wasserfreiem Fluorwasserstoff, ges^.¹--ten, und das Peptid wird isoliert.

Während die bevorzugte Methode zur Herstellung der Pentapeptlde gemäß der Erfindung unter Verwendung eines unlöslichen, festen Polymeren erfolgt, wie es bei der Methode von Merrlfleld beschrieben Ist, kann man natürlich auch andere Herstellungsmethoden verwenden. Zum Beispiel kann ein verschieden fester Träger verwendet werden, wie z. B. ein N-Methyl-benzhydrylamlnharz, das unter gewissen Bedingungen von Vorteil ist. Bei diesem Verfahren wird die am endständigen C-Atom hängende Aminosäure direkt an das Harz gebunden, und das fertige Peptid kann vom Substrat In HF abgespalten werden, um endständige C-Amlde zu tllden. Verfahren zur Verwendung eines n-Methyl-benzhydrylamlnharzes sind von Monahan et al In Biochemical and Biophysical Research Communications, 48, 1100-1105 (1972) beschrieben. Verfahren zur Verwendung eines Bc~iih"dr"!sni'nhsrzcs sind vor. J. PJv!er st 2! Ip. Jcums! cf Medicinal Chemistry !973, Bd. 16, S. 545—549 beschließen.

Vt.-schledene Derivate des Grundpentapeptlds können auch unter Verwendung von dem Fachmann bekannten Methoden hergestellt werden. Es Ist offensichtlich, daß bei der Herstellung solcher Derivate es nötig Ist, funktioneile Gruppen zu blockleren, die mit der Reaktlonsfoige Im Wettstrelt treten können, um das gewünschte Produkt herzustellen. Beispielsweise sollte die ar-Carboxylsäuregruppe der Asparaginsäure oder die or-Amlnogruppe von Lysin während der Herstellung dieser Derivate blockiert werden.

Wie bereits erwähnt. Ist es bei der Durchführung des Verfahrens notwendig, die Aminogruppen zu schützen oder zu blockleren, um die Reaktion zu steuern und die gewünschten Produkte zu erhalten. Zu den geeigneten Schutzgruppen für die Aminogruppen, die zweckmäßig verwendet werden können, gehören die Saizblldung zum Schutz von stark basischen Aminogruppen oder schützende Urethansubstltuenten, z. B. Benzyloxycarbonyl und t-Butyloxycarbonyl. Vorzugswelse wird t-Butyloxycarbonyl (tBOC) oder t-Amyloxycarbonyl (tAOC) zum Schutz der ar-Amlnogruppe In den reagierenden Aminosäuren am Carboxylende des Moleküls verwendet, das die Schutzgruppen BOC und AOC sich nach dieser Reaktion und vor der anschließenden Stufe (In der die a-Amlnognippe selbst umgesetzt wird) durch verhältnismäßig milde Einwirkung von Säuren (z. B. Trlfluoresslgsäure) leicht entfernen lassen. Diese Behandlung beeinflußt im übrigen keine Schutzgruppen an den genannten Ketten. Die ar-Amlnogruppe kann somit durch Umsetzung mit einem beliebigen Material geschützt werden, das die ar-Amlnogruppe für die anschließende Reaktion bzw. die anschließenden Reaktionen schützt, aber später unter Bedingungen, die das Molekühl nicht anderweitig beeinträchtigen, entfernt werden können. Als Beispiele solcher Materialien sind organische Carbonsäurederivate zu nennen, die die Amlnogruppe acylieren.

Im allgemeinen können die Aminogruppen durch Umsetzung mit einer Virbindung, die eine Gruppe der

Formel

Il

R—O—C—

_ ...

enthält, worin R eine Gruppe 1st, die verhindert, daß die Amlnogruppe anschließende Kupplungsreaktionen eingeht und ohne Zerstörung des Moleküls entfernt werden kann, geschützt werden. Beispielswelse Ist R ein geradkettlger oder verzweigter Alkylrest, der ungesättigt sein kann und vorzugsweise 1 bis 10 C-Atome enthält, ein Arylrest vorzugsweise mit 6 bis IS C-Atomen, ein Cycloalkylrest vorzugsweise mit 5 bis 8 C-Atomen, ein Aralkylrest vorzugsweise mit 7 bis 18 C-Atomen, ein Alkarylrest vorzugsweise mit 7 bis 18 C-Atomen oder ein Heterocyclus, z. B. Isonicotlnyl. Die Aryl-, Aralkyl- und Alkarylkomponenten können außerdem beispielsweise durch einen oder mehrere Alkylreste mit 1 bis 4 C-Atomen weiter substituiert sein. Bevorzugt als Gruppen für R werden beispielsweise t-Butyl, t-Amyl, Phenyl, Tolyl, Xylyl und Benzyl. Besonders bevorzugte spezielle Schutzgruppen für die Aminogruppe sind beispielsweise Benzyloxycarbonyl, substituiertes Benzyloxycarbonyl, worin der Phenylrlng durch ein oder mehrere Halogenatome, z. B. Cl oder Br, substituiert Ist, Nitro, niedere Alkoxyreste, z. B. Methoxy, niedere Alkylreste, tertiäres Butyloxycarbonyl, tertiäres Amyloxycarbonyl, Cyciohexyloxycarbonyl, Vinyloxycarbonyl, Adamantyloxycarbonyl und Blphenyllsopropoxycarbonyl. Ferner können als Schutzgruppen beispielsweise Isonlcotinyloxycarbonyl, Phthaloyl, p-TolylsuIfonyl und Formyl verwendet werden.

«1 Bei der Durchführung des allgemeinen Verfahrens gemäß der Erfindung wird das Peptid durch Umsetzung der freien ar-Amlnogruppe mit einer Verbindung, die eine blockierte ar-Amlnogruppe enthält, aufgebaut. Für die Reaktion oder Kupplung wird die Carboxylkomponente der Verbindung, die angegriffen wird, an ihrer Carboxylgruppe aktiviert, so daß die Carboxylgruppe dann mit der freien ar-Amlnogruppe an der Peptldkette reagieren kann. Um die Aktivierung zu erreichen, kann die Carboxylgruppe In eine beliebige reaktionsfähige Gruppe, z. B.

einen Ester, ein Anhydrid, ein AzId oder Säurechlorid, umgewandelt werden. Es Ist ferner zu bemerken, daß während dieser Reaktionen die Aminosäurekomponenten sowohl Aminogruppen als auch Carboxylgruppen enthalten, und daß gewöhnlich eine Gruppe in die Reaktion eingeht, während die andere geschützt Ist. Vor der Kupplungsstufe wird die Schutzgruppe an der ar-Amlnogruppe oder endständigen Aminogruppe des an das Harz

gebundenen Peptids unter Bedingungen entfernt, die andere Schutzgruppen, z. B. die Gruppen an der ε-Aminognippe des Lysinmoleküls, nich: wesentlich beeinträchtigen. Bevorzugt als Verfahren für die Durchführung dieser Stufe wird eine milde saure Hydrolyse beispielsweise durch Umsetzung mit Trifluoressigsäure bei Raumtemperatur.

Es ist einleuchtend, daß die vorstehend beschriebene Reihe von Verfahrensstufen zur Bildung des speziellen : Pentapeptids der tilgenden Formel führt:

H-ARG-LYS-ASP-VAL-TYR-OH

Das substituierte Pentapeptid der Formel II, worin die endständigen ARG- und TYR-Amlnosäuregruppen ic durch Substituenten R und R' in der oben beschriebenen Welse welter substituiert werden können, wirf dann durch Umsetzung des basischen Pentapeptids mit für die Herstellung der gewünschten Derivate geeigneten Reagentien hergestellt. Die Reaktionen dieser Art, z. B. Acylierung, Veresterung und Amidierung, sind dem Fachmann bekannt.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter erläutert. In diesen Beispielen verstehen sich die i: Teile als Gewichtsteile, falls nicht anders angegeben.

Beispiel 1

Für die Herstellung des Pentapeptids gemäß der Erfindung würfen die folgenden Materialien im Handel bezo- ?c gen:

a-AOC-Ng-Tos-L-Arginin

a-BOC-2-Chlor-benzyloxycarbonyl-L-Lysin

(Z-BOC-O-Benzyl-L-Asparaginsäure a-BOC-L-Valin

a-BOC-2,6-Dlchlorbenzyl-L-Tyrosln

Jn diesen Reagentien bedeutet BOC t-Butyloxycarbonyl, AOC t-Amyloxycaroonyl und Tos Tosyl. Reagentien von »Sequenalw-Qualität für die Bestimmung der Aminosäuresequenz, Dlcyclohexylcarbodllmid, Flurescamin x und das Harz wurden ebenfalls Im Handel bezogen. Als Harz wurde ein Polystyrol-Divinylbenzolharz verwendet, das eine Teilchengröße von 37-74 μπι hatte und 1% Dlvinylbenzol und 0,75 mMol Chlorid pro g Harz enthielt.

Zur Herstellung des Pentapeptids wurden 2 mMol ar-BOC-O^.o-Dlchlorbenzyl-L-tyrosin 24 Stunden bei 80° C In absolutem Alkohol, der 1 mMol Trläthylamln enthielt, zu 2 mMol chlormethyllertem Harz verestert. Das erhaltene gekuppelte Aminosäureharz wurde abfiltriert, mit absolutem Alkohol gewaschen und getrocknet. Anschließend würfen die cr-BOC- oder ar-AOC-Amlnosäuren In der gleichen Welse an die von der Schutzgruppe befreite a-Amlnogruppe des Peptld-Harzes In der richtigen Reihenfolge gekuppelt, wobei das Pentapeptid gemäß der Erfindung unter Verwendung äquivalenter Mengen Dlcyclohexylcarbodllmid erhalten wurde. Nach jeder Kupplungsreaktlon wurde ein aliquoter Teil des Harzes mit Fluorescamln getestet. Wenn positive Fluoreszenz festgestellt wurde, würfe die Kupplung als unvollständig angesehen und mit der gleichen geschützten Aminosäure wiederholt. Als Ergebnis der verschiedenen Kupplungsreaktionen wurde das folgende Pentapeptld-Harz erhalten:

Tos Z BzI BzI (CI₂)

a—AOC-ARG —LYS-ASP—VAL-TYR-Harz

Hierin steht AOC für Amyloxycarbonyl, Tos für Tosyl, Z für Benzyloxycarbonyl, BzI für Benzyl und BzI(Gj) für O-2,6-Dlchlnrbenzyl. ^S()

In einer Kelf-Spaltapparalur (Peninsula Laboratories, Inc.) wurde dieses Peptld-Harz gespalten und die Schutzgruppen unter Verwendung von wasserfreiem Fluorwasserstoff bei 0°C für 60 Minuten mit 1,2 ml Anisol pro g Peptld-Harz als Radikaifänger entfernt. Das Peptidgemisch wurde gefriergetrocknet und mit wasserfreiem Äther gewaschen. Das Peptid wurde mit Eisessig und Wasser extrahiert und dann an P-6-Bio-Gel in I n-Esslgsäure Chromatographien. Für das erhaltene Pentapeptid wurde festgestellt, daß es eine Reinheit von 94% und die folgende Sequenz hatte:

H-ARG-LYS-ASP-VAL-TYR-OH

Beispiel 2 w>

Zur Ermittlung der Aktivität und der Eigenschaften des Pentapeptids wurden Bestimmungen an gesunden, 5 bis 6 Wochen alten nu/nu-Mäusen beiderlei Geschlechts durchgeführt, die auf einer BALB/c-Grundlage gezüchtet (wobei Thymozyten das Thy-1,2-Oberflächenantlgen ausdrücken) und unter üblichen Bedingungen gehalten wurden. Für die Antlseren wurden Antl-Thy-1,2-Seren In Thy-1-Mäusen beiderlei Geschlechts (Thy-I « congenlc mice) hergestellt.

Für die Auslösung der Differenzierung von Thy-T-T-Zellen oder CR'B-Zellen In vitro wurden die Induktion der Thymozytendlfferenzlerung von Prothymozyten In vitro durchgeführt, wie von Komuro und Boyse beschrie-

ben [Lancet 1 (1973) 740], wobei das Auftreten von Thy-1,2 als Anzeichen der Differenzierung der T-Zellen diente. Die Induktion der Differenzierung der CR⁺B-ZeUen von CR'B-Zellenvorstufen In vitro erfolgte unter ähnlichen Bedingungen, wobei als Kriterium des Tests die Fähigkeit der CR⁺B-Zellen diente, Schafserythrozyten, die mit subagglutinierenden Mengen von Kaninchen-Antikörpern und nlcht-lytlschem Komplement bedeckt (coated) waren, zu binden. Milzzellenpopulationen von gesunden nu/nu-Mäusen, an diskontinuierlichen Rlnderserumalbumln-Gradlenten fraktioniert, wurden als Quelle beider Vorstufentypen (Thy-1" und CR") verwendet, weil sie sehr wenig oder keine Thy-1*-Zellen und geringe Anzahlen von CR⁺-Zellen aufweisen.

Als Ergebnis dieser Bestimmung wurde gefunden, daß das Pentapeptld eine Selektivität von Wirkungen ähnlich derjenigen von Thymopoletin II in der Induktion der Differenzierung von T-Lymphozyten und von

ίο Komplementrezeptoren-(CR*)-B-Lyinphozyten zeigten. Das Pentapeptld führte die Differenzierung von Thy-1*- T-Zellen in Konzentrationen von 1 ng bis 10 Mg/ml herbei. In Konzentrationen von 0,01 ng bis IQ Mg/m! bewirkte es nicht die Differenzierung von CR'-B-Zellen.

Beispiel 3

Zur Bestimmung der Wirkung dieses Peptlds auf die neuromuskuläre Transmission erhielten Mäuse durch Intraperitoneale Injektion 10 bis 100 US Peptid In 1 η-Kochsalzlösung. 24 Stunden später wurde die nj.^omuskuläre Transmission durch Elektromyographle ermittelt, wie In »Lancet« 12 (1975) 256-269 beschrieben. Eine nachweisbare neuromuskuläre Störung bei den Mäusen, denen das Peptid injiziert worden war, war nachweisbar.

Beispiel 4

Das Pentapeptld von Beispiel 1 wurde auf einem Substrat hergestellt, das ein Benzhydrylamlnharz enthielt, wobei die Methode von J. Rlvler et al, Journ. Med. Chem. Bd. 16, Nr. 5, S. 545-548 (1973) verwendet wurde. Bei der Synthese war Dlcyclohexylcarbodllmid das Kupplungsmittel, und die Kupplung wurde in CHiCIi durchgeführt. Das Peptid wurde dann vom Substrat mit Fluorwasserstoff abgespalten, um das Pepüd freizusetzen, worauf die Schutzgruppen entfernt wurden und das folgende Derivat erhalten wurde:

H-ARG-LYS-ASP-VAL-TYR-NH,

Die Identifizierung erfolgte durch Donnschichtchromatographie und Elektrophorese, wobei die folgenden Werte erhalten wurden: Dünnschichtchromatographie: Probe: 30 Mg Kieselgel (Brinkman-Glasplatte, 5 χ 20 cm, 0,25 mm dick) ._

R^: n-BuOH : Pyridin : HOAc : H₂O 30 : 15 : 3 : 12

r/ : EtOAc : Pyridin : HOAc : H₂O 5 : 5:1: 3

r/ : EtOAc : n-BuOH : HOAc : H₂O 1 : 1 : 1 : 1
Spray-Reagenz: Pauly, Ninhydrin, Sakapuchi und J₂

Dünnschichtchromatographie
Rf Rf V

Elektrophorese: Peptid wanderte zur Kathode

H-Arg-Lys-Asp-Val-Tyr-NH₂

0,53

0,68 0,26 7,5 cm

Elektrophorese: Whatman-Papler 3 mm (11,5 cm χ 56 cm)

Probe: 100 Mg pH 5,6, Pyrldlnacetat-Pufferlösung 1000 V, 1 Stunde

Spray-Reagenz: Ninhydrin und Sakaguchl

Dieses Pentapeptld-amld zeigte bei Verwendung In einer Konzentration von 1 Mg/ml In 89%lger Twomey-Lösung eine maximale Aktivität von 105% und eine minimale Aktivität von 70% Im Vergleich zu dem basischen Pentapeptld gemäß Beispiel 1.

Beispiel 5

Das gem. Beispiel 1 hergestellte Pentapeptld wird verestert, um den Äthylester herzustellen. Bei der Herstellung dieses Esters Ist es nötig, die Säuregruppen an der Asparaginsäure mit einer leicht säuresensitiven Schutzgruppe während der Herstellung zu blockieren, wobei die bevorzugte Schutzgruppe t-Butyl Ist. Die ct-Amlnoblocklerungsgruppe Ist sensitiv gegenüber einer leichten Base und Ist vorzugsweise Fluorenylmethoxycarbonyl. Wenn eine solche sr-Amlnoblocklerungsgruppe verwendet wird, kann sie für die Addition jedes Aminosäureesters ohne Störung der säuresensitiven Schutzgruppe am Asparaglnsäurerest entfernt werden. Nach Herstellung des geschützten Pentapeptldharzes entfernt die Behandlung mit einer milden Base und anschließend die

10

Behandlung mit einer milden Säure diese zwei Schutzgruppen. Umesterung mit Äthylformiat unter Verwendung von Sulfurylchlorid als Katalysator spaltet das Pentapeptld aus dem Harz, um selektiv den endständigen C-Ester zu bilden. Die Veresterung findet an der freien Säuregruppe des Asparaginsäureesters nicht statt. Die verbleibenden Schuugruppen werden entfernt und das Peptid der folgenden Formel isoliert:

H-ARG-LYS-ASP-VAL-TYR-OC₂Hs

Aminosäure-Analyse:	Arg	Lys	Asp	VaI	Tyr
berechnet:	1,00	1,00	1,00	1,00	1,00
gefunden:	1,00	1,01	1,00	0,99	0,98
Dünnschicht-Chromatographie (Silicagel	GF, 250	μΓΠ)
Lösungsmittel-System
3:1:1 n-BuOH :				0,17
4:2:3:1 n-BuOH ;	: Pyr			0,72

: HOAC : H₂O
; HOAC : H₂O

Arg	Lys	Asp	VaI	Tyr
1,00	1,00	1,00	1,00	1,00
0,98	1,00	1,02	0,87	1,02

--■-·-■

Beispiel 6

Das gemäß Beispiel 1 hergestellte Pentapeptid wurde durch Umsetzung mit Acetylchlorld nach bekannten Verfahren acyllert, wobei das folgende acyllerte Derivat erhalten wurde:

CHjCO-ARG-LYS-ASP-VAL-TYR-OH ²' Optische Rotation: - 30.8°

(C= 1.32; 0,1 N-HOAC;)

w Aminosäure-Analyse:

berechnet:
gsfunde':

Peptidgehalt: 63%
Dünnschicht-Chromatographie (Silicagel 60, 250

Lösungsmittel-System R₁

4:1:1 n-BuOH : H₂O : HOAC 0,20

5:5:1:3 EtOAC : Pyr : HOAC : H₂O 0,55

3 : 2 : 1 Pyr : HOAC : H₂O 0,73

Beispiel 7-

Das gemüß Beispiel 6 hergestellte Pentapeptid wurde ferner durch Umsetzung mit Ammoniak nach bekannten Verfahren amldlert, wobei das folgende Derivat gebildet wurde:

CHjCO-ARG-LYS-ASP-VAL-TYR-NH,

Die gemäß den Beispielen 5 bis 7 hergestellten Pentapeptldd^rlvate bewahren die hler für die basische Aminosäuresequenz beschriebene biologische Aktivität.

Aminosäure-Analyse:	Arg	Lys	Asp	VaI	Tyr
berechnet:	1,00	1,00	1,00	1,00	1,00
gefunden:	0,99	0,98	1,00	0,92	0,99

Claims

Patentansprüche:

1. Arginyl-Lysyl-Aspartyl-Valyl-Tyrosln und dessen Derivate der allgemeinen Formel II

R-ARG-LYS-ASP-VAL-TYR-R'

In der R für Wasserstoff oder Alkanoyl-Reste mit 1 bis 7 C-Atomen und R' für einen Hydroxyrest, Alkoxyreste mit 1 bis 7 C-Atomen oder einen Amlnorest stehen, sowie deren pharmakologisch unbedenkliche Salze.

2. Verfahren zur Herstellung der Verbindungen der allgemeinen Formel II nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man jeweils in an sich bekannter Welse