CH642058A5 - Polypeptide sowie diese polypeptide enthaltende arzneimittel. - Google Patents

Description

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, neue biologisch wertvolle Polypeptidsegmente und Polypeptide zur Verfügung zu stellen. Insbesondere besteht die Aufgabe darin, neue Polypeptidsegmente und Polypeptide zu schaffen, welche die Fähigkeit aufweisen, die Differenzierung von T-Lymphozyten und B-Lymphozyten zu induzieren und deshalb für das Immunsystem bei Mensch und Tier wertvoll sind. Entsprechend besteht die Aufgabe auch darin, Polypeptide sowie diese Stoffe enthaltende Arzneimittel zur Verfügung zu stellen.

Es werden neue biologisch wirksame Polypeptidsegmente zur Verfügung gestellt, welche die Aminosäuresequenz

-ALA-LYS-SER-GLN- (I)

aufweisen. Die biologische Wirksamkeit dieser Polypeptidsegmente wird im allgemeinen beibehalten, wenn ein Ersatz der L-Alanylgruppe in der ersten Stellung oder der L-Seryl-gruppe in der dritten Stellung oder ein Ersatz dieser beiden Gruppen durch .natürliche oder synthetische Aminosäurereste erfolgt. Bestimmte dieser substituierten Polypeptidsegmente sind in besonders überraschender Weise wirksam. Eine Substitution am Ende des Polypeptidsegments führt zum entsprechenden Polypeptid.

Die Polypeptidsegmente und Polypeptide können durch eine Peptidsynthese in der festen Phase hergestellt werden.

Da die vorgenannten Substitutionen erfolgen können, wobei die biologische Wirksamkeit der Polypeptidsegmente im allgemeinen erhalten bleibt, gehören zum Wesen der vorliegenden Erfindung auch biologisch wirksame Polypeptidsegmente mit der Aminosäuresequenz IA

-X-LYS-Y-GLN (IA)

in der X und Y gleich oder verschieden sind und jeweils einen Rest einer natürlichen oder synthetischen a-Amino-säure (nachfolgend «Aminosäure») darstellen. Wenn auch davon ausgegangen werden kann, dass der grössere Teil derartiger Substitutionen durch Reste X und Y die biologische Wirksamkeit beibehält, ist es möglich, dass gewisse natürliche oder synthetische Aminosäurereste das Falten des Moleküls (vgl. unten) beeinträchtigt und so im wesentlichen die biologische Wirksamkeit beseitigen. Derartige, diese Wirksamkeit zerstörende Substituenten fallen nicht unter die vorliegende Erfindung.

Die Substituenten X und Y sind natürliche Aminosäurereste, nämlich die L-Aspargyl-, L-Glutamyl-, L-Threonyl-, Glycyl-, L-Valyl, L-Leucyl-, L-Alanyl- und L-Serylgruppe, sowie synthetische Aminosäurereste, nämlich die Sarcosyl-und 2-MethylalanyIgruppe sowie die D-Formen der vorgenannten L-Aminosäuren. Ob eine bestimmte Substitution die biologische Wirksamkeit des Polypeptids beibehält,

kann leicht durch die Untersuchung des Differenzierens von Th-1+ T-Lymphozyten und Bu-1+ B-Lymphozyten gemäss dem nachfolgend beschriebenen Hühnchen-Induktionsversuch bestimmt werden. Verbindungen, die spezifisch wirksam sind in Konzentrationen der Grössenordnung Nano-gramm (ng)/ml, z.B. bei einer Konzentration von etwa 1 ng/ml oder weniger, werden gemäss diesem Versuch als biologisch wirksam angesehen.

Eine Liste entsprechender natürlicher Aminosäuren kann in vielen Veröffentlichungen gefunden werden, beispielsweise bei R. T. Morrison und R. N. Boyd, Organic Chemistry, Allyn und Bacon, 1959, Kapitel 33. Neben den natürlichen Aminosäuren, die in Proteinen gefunden werden, gibt es auch eine Reihe sogenannter synthetischer Aminosäuren, die in Proteinen nicht vorkommen, obwohl sie manchmal in der Natur zu finden sind, beispielsweise als Zwischenprodukte des Stoffwechsels. Diese synthetischen Aminosäuren können die D-Isomeren der entsprechenden optisch aktiven (L-Form) natürlichen Aminosäuren sein,

oder es handelt sich um davon völlig verschiedene chemische Individuen, wie Sarcosin (N-Methylglycin) oder 2-Me-thylalanin. Zusammenstellungen derartiger synthetischer Aminosäuren sind gleichfalls vielfach veröffentlicht worden.

Die vorgenannten Polypeptidsegmente IA müssen zusätzlich endständige Substituenten an der 4-Aminosäurese-quenz enthalten, wodurch das entsprechende Polypeptid gebildet wird. Diese endständigen Substituenten dürfen im wesentlichen die biologische Wirksamkeit des aktiven 4-Ami-r.osäuresegments nicht beeinträchtigen, was durch die Fähigkeit, das Differenzieren von Th-1+ T-Lymphozyten und Bu-1+ B-Lymphozyten beim nachstehend beschriebenen Hühnchen-Induktionsversuch zu induzieren, bestimmt wird.

s io

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Die erfindungsgemässen Polypeptide mit der Fähigkeit, die Differenzierung voö Th-1+ T-Lymphozyten und Bu-1+ B-Lymphozyten zu induzieren, sind dadurch gekennzeichnet, dass sie die Sequenz der allgemeinen Formel

R-X-LYS-Y-GLN-R' 01)

aufweisen, in der X und Y gleich oder verschieden sind und jeweils eine L-Asparagyl-, L-Glutamyl-, L-Threonyl-, Glycyl-, L-Valyl-, L-Leucyl-, L-Alanyl-, L-Seryl-, Sarcosyl-, 2-Methylalanyl-, D-Asparagyl-, D-Glutamyl-, D-Threonyl-, D-Valyl-, D-Leucyl-, D-Alanyl- oder D-Seryl bedeuten, sowie R und R' gleich oder verschieden sind und jeweils einen der Reste darstellen, die nachfolgend für R und R' angegeben sind:

R

Wasserstoff

C^-Alkyl

C6-i2-Aryl

C7-20-Alkaryl

C7_20-Aralkyl

C1_7-Alkanoyl

C2_7-Alkenyl

Gj-7-Alkinyl

GLN

SAR

R'

OH

NH2 NHR, N(R7)2 OR,

GLY

GLY-GLY

LY-GLY-SER

GLY-GLY-SER-ASN

wobei R7 einen C^-Alkyl-, C^-Alkenyl'-, C2_7-Alkinyl-, C6_?0-Aryl-, C7_20-Aralkyl- oder C7_20-Alkarylrest bedeutet, mit der Massgabe, dass R' nicht den Rest GLY-GLY-SER--ASN darstellt, wenn R den Rest GLN bedeutet, und ihre Salze, mit der weiteren Massgabe, dass die Polypeptide die Differenzierung der vorgenannten Lymphozyten im Hähnchen-Induktions-Versuch bei einer Konzentration von höchstens 1 ng/ml induzieren.

Die Substituenten R und R' an der endständigen Ami-nogruppe und der endständigen Carboxylgruppe haben keine Wirkung auf die biologische Wirksamkeit des Amino-säuresegments. Da das wirksame Tetrapeptidsegment innerhalb einer längeren Sequenz in dem in der Natur vorkommenden Material, das von Bach isoliert worden ist, enthalten ist, ist davon auszugehen, dass die endständige Amino-gruppe und die endständige Carboxylgruppe für die biologische Wirksamkeit des Tetrapeptids nicht notwendig sind, wie es für einige Polypeptide der Fall ist. Die Erfindung umfasst somit nicht nur jene Tetrapeptidsegmente, die durch Wasserstoffatome bzw. Hydroxylgruppen substituiert sind, sondern auch jene, die am Ende durch eine oder mehrere andere funktionelle Gruppen substituiert sind, die im wesentlichen die erreichte biologische Wirksamkeit nicht beeinträchtigen. Das von Bach beschriebene Nonapeptid wird von der vorliegenden Erfindung nicht umfasst.

Die genannten funktionellen Gruppen sind beispielsweise solche Gruppen, die durch normale Substitution, wie Acylierung an der freien Aminogruppe und Amidierung an der freien Carboxylgruppe sowie die Substitution weiterer Aminosäuren und Polypeptide entstehen. In dieser Hinsicht sind die Polypeptidsegmente der Erfindung äusserst ungewöhnlich, da sie die gleiche biologische Wirksamkeit wie das natürliche Nonapeptid aufweisen, von dem das wirksame Tetrapeptidsegment einen Teil bildet. Es wird angenommen, dass die Erfordernisse für eine biologische Wirksamkeit des Moleküls in seiner Stereochemie begründet sind, d.h. in besonderen «Falten1» des Moleküls. Es ist davon auszugehen, dass Polypeptidbindungen nicht fest sondern flexibel sind, und Polypeptide beispielsweise als Platten und Helices vorliegen können. Im Ergebnis ist das gesamte Molekül flexibel und faltet sich in bestimmter Weise. Es wurde gefunden, dass sich die neuen Tetrapeptidsegmente wahrscheinlich in ähnlicher Weise wie das entsprechende Tetrapeptidsegment in dem natürlichen Nona-5 peptid falten, da sie die gleichen biologischen Charakteristiken aufweisen. Aus diesem Grund können die Tetrapeptidsegmente an den Enden durch verschiedene funktionelle Gruppen substituiert sein, solange die Substituenten die biologische Wirksamkeit oder das natürliche Falten des Mole-io küls nicht beeinträchtigen.

Die Fähigkeit des Moleküls, seine biologische Wirksamkeit und das natürliche Falten beizubehalten, ergibt sich klar aus der Tatsache, dass die erfindungsgemässen Tetrapeptidsegmente die gleichen biologischen Charakteristiken 15 wie das natürliche 9-Aminosäurepeptid aufweisen, das als FTS von Bach beschrieben worden ist. In diesem Nonapeptid könnte eine erfindungsgemässe Tetrapeptidsequenz innerhalb des Moleküls identifiziert werden, jedoch nur in Kombination mit den anderen' hier beschriebenen Amino-20 säuren. Da die erfindungsgemässen Tetrapeptidsegmente die gleiche biologische Wirksamkeit wie das Nonapeptid FTS aufweisen, ist es klar, dass die Aminosäuren und die an den endständigen Aminosäureresten des Tetrapeptidsegments substituierten Peptidketten die biologischen Charakteristi-25 ken nicht beeinträchtigen.

Dementsprechend können in der Formel II R und R' jeweils ein Substituent sein; der die biologische Wirksamkeit des Segments im wesentlichen nicht beeinträchtigt.

Jedoch können R und R' auch jeweils ein neutraler 30 Aminosäurerest oder ein Rest einer Polypeptidkette mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen sein. Beispiele hierfür sind nachfolgend angegeben:

35

R

GLN SAR

R'

GLY

GLY-GLY

GLY-GLY-SER

GLY-GLY-SER-ASN

40 mit der Massgabe, dass R' eine andere Gruppe als GLY--GLY-SER-ASN bedeutet, wenn R die Gruppe GLN darstellt.

Gemäss einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist X die L-Alanylgruppe, Y die L-Serylgruppe, R ein 45 Wasserstoffatom und R' eine Hydroxylgruppe. Diese bevorzugte Ausführungsform kann durch nachstehende Formeln angegeben werden:

H-N-CH-CÒNH—CH—CONH—CH-GONH—CH-COOH

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1

CH-

H- ALA -

t

(C,H2} 4 NH,

*2

LYS —

1

CH-I 2

OH

SER —

CCH2) 2 CONH„

GLN - OH

55 Eine weitere bevorzugte Ausführungsform besteht darin, dass X und Y gleich oder verschieden sind und jeweils eine Sarcosyl-, D-Alanyl- oder 2-Methylalanylgruppe bedeuten.

Gemäss einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist X eine Sarcosylgruppe, Y eine Sarcosyl- oder D-Alanyl-60 grappe, R ein Wasserstoffatom und R' eine Aminogruppe.

Die Erfindung erstreckt sich auch die Salze der genannten Polypeptide. AIS Säuren, welche Salze mit den Polypeptiden bilden können, kommen insbesondere anorganische Säuren, wie Salzsäure, Bromwasserstoffsäure, Perchlorsäu-65 re, Salpetersäure, Thiocyansäure, Schwefelsäure und Phosphorsäure, oder organische Säuren, wie Ameisensäure, Essigsäure, Propionsäure, Glykolsäure, Milchsäure, Brenztraubensäure, Oxalsäure, Malonsäure, Bernsteinsäure, Malein-

5

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säure, Fumarsäure, Anthranilsäure, Cinnaminsäure, Naph-thalinsulfonsäure oder Sulfanylsäure, in Frage.

Zur Vereinfachung werden die Aminosäurekomponenten1 der Peptide durch Abkürzungen dargestellt, die nachfolgend angegeben sind. Die D-Aminosäuren werden durch Vorsetzen eines D vor die Abkürzung gekennzeichnet, beispielsweise D-Alanin durch D-ALA.

Aminosäuren

Abkürzung

L-Alanin

ALA

L-Asparaginsäure

ASP

L-Asparagin

ASN

L-Serin

SER

L-Glutaminsäure

GLU

L-Glutamin

GLN

L-Leucin

LEU

L-Lysin

LYS

L-Threonin

THR

Glycin

GLY

L-Valin

VAL

Sarcosin

SAR

2-Methylalanin

2-Me-ALA

Die erfindungsgemässen Polypeptide sind 4-Aminosäu-repeptide (und deren substituierte Derivate), von denen gefunden wurde, dass sie ähnliche Eigenschaften aufweisen, wie das 9-Aminosäurepolypeptid FTS, das aus Schweineblut isoliert worden ist, wie Bach berichtet hat. Die erfindungsgemässen Peptide sind besonders charakteristisch in ihrer Fähigkeit, das Differenzieren von T-Vorläuferzellen als auch B-Vorläuferzellen zu induzieren. Gewisse erfin-dungsgemässe Polypeptide sind in einer Konzentration von 1 Picogramm (pg)/ml beim Hühnchen-Induktionsversuch wirksam..

Es wurde gefunden, dass die erfindungsgemässen Polypeptide die Differenzierung von Immunocyt-Vorläuferzel-len in vitro in der gleichen Weise wie das von Bach beschriebene Nonapeptid induzieren. Die erfindungsgemässen' Polypeptide induzieren das Differenzieren von T-Vorläuferzellen (gemessen unter Heranziehung des Antigens Th-1 bei der Thymus-Differenzierung) als auch von B-Vorläuferzellen (gemessen unter Heranziehung des Antigens Bu-1). In anderen Worten, die erfindungsgemässen Polypeptide haben die Fähigkeit, die Differenzierung von Th-1+ T-Lym-phozyten und Bu-1+ B-Lymphozyten zu induzieren.

Es wurde auch gefunden, dass die erfindungsgemässen Polypeptide die Bildung in vivo von cytotoxischen Lymphozyten nach Stimulieren durch allogene Antigene erhöhen. D.h., eine Verabreichung dieser Polypeptide an beispielsweise Ratten fördert die Bildung von Vorläufern von cytotoxischen Lymphozyten; dies wird durch einen Versuch in vitro an Rattenmilzzellen gemessen. Da die Erzeugung von cytotoxischen Lymphozyten mit dem Ausmass der Trans-plantat-Abstossung bei der Reaktion zwischen allogenem Transplantat und Wirt direkt korrespondiert, ist die vorgenannte Wirkung der Polypeptide ein weiterer Hinweis auf die immunologische Nützlichkeit der erfindungsgemässen Polypeptide.

Zum besseren Verständnis der Bedeutung der differenzierenden biologischen Charakteristiken der erfindungsgemässen Polypeptide wird darauf hingewiesen, dass die Funktion des Thymus bezüglich der Immunität im wesentlichen gesehen werden kann in der Bildung von vom Thymus abgeleiteten Zellen oder Lymphozyten, die «T-Zellen» genannt werden. Diese Zellen bilden einen grossen Anteil der Ansammlung von rezirkulierenden kleinen Lymphozyten. T-Zellen sind immunologisch spezifisch und sind als Effektorzellen direkt an durch Zellen vermittelten Immunreaktionen, wie Homotransplantat-Reaktionen, beteiligt. T-Zellen scheiden jedoch keine humoralen Antikörper ab. Diese Antikörper werden von Zellen (B-Zellen) abgeschieden, die unabhängig vom Einfluss des Thymus direkt vom Knochenmark abgeleitet sind. Jedoch erfordern B-Zellen für viele Antigene die Gegenwart von geeigneten reaktionsfähigen T-Zellen, bevor eine Bildung von Antikörpern möglich ist. Der Mechanismus dieses Vorgangs des Zusammenwirkens von Zellen ist noch nicht völlig aufgeklärt.

Somit kann gesagt werden, dass der Thymus für die Entwicklung von zellulärer Immunität und vielen humoralen Antikörperreaktionen erforderlich ist und diese Systeme durch Induzieren des Differenzierens von haematopoeti-schen Stammzellen gegenüber T-Zellen .innerhalb des Thymus beeinflusst. Dieser induktive Einfluss wird vermittelt durch Sekretionen der Epithelzellen des Thymus, d.h. durch Thymushormone.

Um die Wirkungsweise des Thymus und des Zellsystems der Lymphozyten und deren Zirkulation im Körper zu verstehen, muss man berücksichtigen, dass die Stammzellen' im Knochenmark gebildet werden und den Thymus durch den Blutstrom erreichen. Innerhalb des Thymus werden die Stammzellen differenziert zu immunologisch fähigen T-Zel-len, die zum Blutstrom wandern und, zusammen mit B-Zellen, zwischen den Geweben, Lymphgefässen und dem Blutstrom zirkulieren.

Die Zellen des Körpers, die Antikörper (B-Zellen) abscheiden, entwickeln sich aus haematopoetischen Stammzellen, jedoch wird ihre Differenzierung nicht durch den Thymus bestimmt. In Vögeln werden sie in einem Organ differenziert, das dem Thymus analog ist und «Bursa Fa-bricius» genannt wird. Bei Säugetieren wurde kein entsprechendes Organ gefunden. Man nimmt an, dass diese Zellen innerhalb des Knochenmarks differenziert werden. Daher werden sie «vom Knochenmark abgeleitete Zellen» oder «B-Zellen» genannt. Die physiologischen Stoffe, die dieses Differenzieren bestimmt, sind noch völlig unbekannt.

Die erfindungsgemässen Polypeptide sind therapeutisch wertvolle Verbindungen zur Behandlung von Menschen und Tieren. Da die neuen Polypeptide die Fähigkeit aufweisen, das Differenzieren von lymphopoetischen Stammzellen (die in den haematopoetischen Geweben entstehen) in vom Thymus abgeleitete Lymphozyten (T-Zellen) und immunokom-petenten B-Zellen zu induzieren, die in der Lage sind, an den Immunreaktionen des Körpers einzugreifen, sind die erfindungsgemässen Polypeptide in mehrfacher Hinsicht therapeutisch wertvoll.

Zunächst ist festzustellen, dass diese Polypeptide in verschiedenen Bereichen der Thymusfunktionen und der Immunität angewandt werden können, da sie die Fähigkeit aufweisen, gewisse der genannten Funktionen des Thymus auszuführen. Ein wesentliches Anwendungsgebiet ist die Behandlung des DiGeorge-Syndrom, das eine angeborene Abwesenheit des Thymus darstellt. Eine Injektion eines der erfindungsgemässen Polypeptide beseitigt diesen Nachteil.

Eine andere Anwendung ist bei Agammaglobulinämie gegeben, die auf eine Schädigung des mutmasslichen Hormons zur Differenzierung von B-Zellen zurückzuführen ist. Eine Injektion eines der erfindungsgemässen Polypeptide beseitigt diesen Nachteil.

Da die erfindungsgemässen Polypeptide bei niedrigen Konzentrationen extrem wirksam sind, sind sie zur Erhöhung der kollektiven Immunität des Körpers dadurch wertvoll, dass sie die therapeutische Stimulierung zellulärer und humoraler Immunität erhöhen. Sie sind wirkungsvoll bei der Behandlung von Krankheiten, bei denen in vivo chronische Infektion auftritt, wie Pilz- oder Mycoplasmainfektionen,

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Tuberkulose, Lepra und akute und chronische Virusinfektionen.

Weiterhin sind' die erfindungsgemässen Peptide nützlich auf dem Gebiet der zellulären und humoralen Immunität, insbesondere dort, wo ein Mangel an Immunität besteht, wie bei dem vorgenannten DiGeorge-Syndrom.

Aufgrund der besonderen Charakteristika der erfindungsgemässen Polypeptide sind sie auch in vitro sehr nützlich zur Induzierung der Bildung von Oberflächenantigenen von T-Zellen, zur Induzierung der Bildung von funktionellen Fähigkeiten zur Erreichung von Reaktionen gegenüber Mitogenen und Antigenen und beim Zusammenwirken von Zellen zur Verbesserung der Fähigkeit von B-Zellen zur Bildung von Antikörpern. Die Polypeptide sind in vitro wertvoll dadurch, dass sie die Bildung von B-Zellen induzieren, was anhand der Bildung von Oberflächenrezeptoren zusätzlich gemessen wird.

Die erfindungsgemässen Peptide sind auch nützlich zum Inhibieren einer unkontrollierten Wucherung von Lymphozyten, die auf Ubiquitin ansprechen (vgl. US-PS 4 002 602).

Ein wichtiges Charakeristikum dei erfindungsgemässen Polypeptide ist ihre Fähigkeit in vivo, Zellen mit den Charakteristiken von T-Zellen wiederherzustellen, sowie ihre Fähigkeit in vivo, Zellen mit Charakteristiken von B-Zellen wieder herzustellen. Deshalb sind diese Polypeptide wertvoll zur Behandlung von relativen oder absoluten Schädigungen von B-Zellen oder T-Zellen, unabhängig davon, ob diese Schädigungen auf Beschädigungen des Gewebes zurückzuführen sind, das B-Zellen oder den Thymus differenziert, oder ob andere Ursachen vorliegen.

Eine weitere wichtige Eigenschaft der erfindungsgemässen Polypeptide liegt in ihrer hohen Wirksamkeit bei sehr geringen Konzentrationen. Es wurde gefunden, dass die Polypeptide im allgemeinen in Konzentrationen von etwa 1 ng/ml wirksam sind, während gewisse besonders wirksame Polypeptide (H-SAR-LYS-D-ALA-GLN-NH2 und H-SAR-LYS-SAR-GLN-NH2) bereits bei Konzentrationen im Bereich von etwa 0,1 pg/ml Wirksamkeit zeigen. Als Träger können übliche Stoffe eingesetzt werden, beispielsweise normale Kochsalzlösungen, vorzugsweise mit einem Proteinverdünnungsmittel, wie Rinderserumalbumin, um bei diesen niedrigen Konzentrationen Verluste durch Adsorption an der Glasoberfläche zu vermeiden. Die erfindungsgemässen Polypeptide sind in Dosen von etwa über 1 fig/kg Körpergewicht oder bei besonderer Aktivität bei Dosen von etwa 1 ng/kg Körpergewicht wirksam.

Für die Behandlung des DiGeorge Syndroms können Polypeptide in einer Menge von etwa 1 bis etwa 100 [xg/kg Körpergewicht verabreicht werden, während man die äusserst aktiven erfindungsgemässen Polypeptide nur in einer Menge von etwa 1 bis etwa 100 ng/kg Körpergewicht zu verabreichen braucht. Im allgemeinen kann man die gleichen Dosiermengen zur Behandlung anderer erwähnter Zustände oder Krankheiten verabreichen. Die weiter oben angeführte Diskussion bezieht sich auf die parenterale Verabreichung, es ist aber selbstverständlich, das man die neuen Verbindungen auch oral verabreichen kann, wobei dann diese Mengen etwa 100 bis lOOOmal grösser sind als diejenigen die für Injektionen angewendet werden.

Die erfindungsgemässen Polypeptide können ähnlich dem Prinzip hergestellt werden, das in Journal of American Chemical Society, Bd. 85 (1963), S. 2149 bis 2154, beschrieben ist. Bei dieser Synthese erfolgt gewöhnlich eine schrittweise Addition von geschützten Aminosäuren an eine wachsende Peptidkette, die durch kovalente Bindungen an ein festes Polymerisat gebunden ist. Dabei können Reaktanten und Nebenprodukte durch Filtrieren abgetrennt werden, und das Umkristallisieren von Zwischenprodukten wird vermieden. Die Grundidee dieses Verfahrens hängt von der Bindung der C-endständigen Aminosäure der Kette an ein festes Polymerisat durch kovalente Bindung und der schritt-s weisen Addition der folgenden Aminosäuren bis zum Erreichen der gewünschten Sequenz ab. Schliesslich kann das Peptid vom festen Träger und den Schutzgruppen getrennt werden. Bei diesem Verfahren ist eine wachsende Peptidkette an ein völlig unlösliches festes Polymerisat gebunden, io so dass das Produkt leicht filtriert und von Reaktanten und Nebenprodukten freigewaschen werden kann.

Die Aminosäuren können an jedes gewünschte Polymerisat gebunden werden, das leicht von den nicht umgesetzten Ausgangsstoffen abgetrennt werden kann. Das Polyme-15 risat kann in den eingesetzten Lösungsmitteln unlöslich oder in bestimmten Lösungsmitteln löslich und in anderen unlöslich sein. Das Polymerisat soll eine stabile physikalische Form aufweisen, die ein leichtes Filtrieren ermöglicht. Es muss eine funktinellte Gruppe enthalten, an die die erste ge-20 schützte Aminosäure durch kovalente Bindung festgebunden werden kann. Beispiele für derartige unlösliche Polymerisate sind Cellulose, Polyvinylalkohol, Polymethacrylat und sul-foniertes Polystyrol. Bevorzugt ist ein chlormethyliertes Co-polymerisat aus Styrol und Divinylbenzol. Es können auch 25 Polymerisate eingesetzt werden, die in organischen Lösungsmitteln löslich, in wässrigen Lösungsmitteln jedoch unlöslich sind. Ein solches Polymerisat ist ein Polyäthylenglykol mit einem Molekulargewicht von etwa 20 000, das in Methylenchlorid löslich, jedoch in Wasser unlöslich ist. Der Einsatz 30 dieses Polymerisats zur Peptidsynthese ist in Nature, Bd. 237 (1972), S. 512, beschrieben.

Die verschiedenen funktionellen Gruppen an der Aminosäure, die reaktionsfähig sind, jedoch nicht an der Reaktion teilnehmen sollen, werden vorzugsweise während der 35 Reaktion durch auf dem Gebiet der Polypeptide übliche Schutzgruppen geschützt. Die funktionelle Gruppe bei Lysin kann durch Schutzgruppen geschützt werden, die bei Vervollständigung der Sequenz ohne nachteilige Wirkung auf das endgültige Polypeptid abgespalten' werden können. Bei 40 der Synthese wird insbesondere Fluorescamin eingesetzt, um durch Bestimmung der positiven Fluorescenz (vgl. Analyt. Biochem., Bd. 52 [1973], S. 377), festzustellen, ob das Kuppeln vollständig ist. Ist dies nicht der Fall, wird das Kuppeln gewöhnlich mit den gleichen geschützten Aminosäuren 45 wiederholt, bevor die Schutzgruppen abgespalten werden.

Die C-endständige Aminosäure kann an das Polymerisat auf verschiedene bekannte Weisen gebunden werden. Zusammenfassungen von Methoden zur Bindung von Ha-logenmethylharzen sind in Chem. Letters, S. 165 bis 168 (1978) und in Helv. Chim. Acta, Bd. 56 (1973), S. 1476, veröffentlicht.

Beim allgemeinen Verfahren kann zunächst L-Gluta-min, das an seiner Aminogruppe geschützt ist, durch Ver-55 estern in absolutem Äthanol, das ein Amin enthält, an das Polymerisat gebunden werden. Das gekuppelte Aminosäu-repolymerisat wird dann gewöhnlich filtriert, mit Äthanol und Wasser gewaschen und getrocknet. Die Schutzgruppe an der a-Aminogruppe des Glutamins ist beispielsweise die 60 tert.-Butyloxycarbonylgruppe (t-BOC) und kann dann abgespalten werden. Das erhaltene gekuppelte Aminosäure-Polymerisat mit einer freien Aminogruppe wird dann vorzugsweise mit einem geschützten L-Serin, insbesondere a-t-BOC--O-Benzyl-L-Serin, umgesetzt, um das L-Serin zu kuppeln. 65 Die Umsetzungen können dann mit geschütztem L-Lysin und L-Alanin wiederholt werden, bis das gewünschte Molekül vorliegt. Die Reaktionsfolge ist aus dem nachfolgendem Schema ersichtlich:

7

642058

Polymerisat

I

ct-R-j^-Gln-OH

a-R^-Gln- "Polymerisat

Abspaltung der a-Amino-Schutzgruppe v

ff-Gln-, Polymerisat

I ,2

a~Rl~L~Ser-0H

i 2 -J'

a-^-Ser-Gln-Polymerisat

Abspaltung der a-Amino-. S chut z grupp.e i -

K-Ser-Gln- Polymerisat

R, , 13 {2v

Ro

I3

ct-R1-Lys-OH

a-R^-Lys-Ser-Gln-:Polymerisat

Abspaltung der a-Amino-

Schutzgrupps f 3 R\2l

H-Lys-Ser-Gln-Polymerisat

3^ i2

cx—-Ala—OH

a-R^-Ala-Lys-Ser-Gln-^01^^3^

Abspaltung aller-Schutzgruppen und des Polymerisats

H-Ala-Lys-Ser-Gln-OH

oxycarbonylgruppe (AOC) zum Schutz der a-Aminogruppen in den Aminosäuren eingesetzt, die eine Reaktion am Carb-oxylende des Moleküls eingehen, da diese Schutzgruppen nach der Reaktion und vor dem folgenden Reaktionsschritt 5 (bei dem die a-Aminogruppe selbst reagiert) leicht abgespalten werden können durch relativ mild wirkende Säuren, wie Trifluoressigsäure. Diese Behandlung beeinträchtigt nicht Schutzgruppen zum Schutz anderer reaktionsfähiger Seitenketten. Das bedeutet, dass die a-Aminogruppen durch io Umsetzen mit solchen Verbindungen geschützt werden können, welche die Aminogruppen für die folgende Reaktionen) schützen, wobei diese Schutzgruppen jedoch später unter Bedingungen abgespalten werden können, bei denen das Molekül nicht anderweitig angegriffen wird. Beispiele für ls derartige Verbindungen sind organische Carbonsäurederivate, welche die Aminogruppe acylieren.

Im allgemeinen können die Amin'ogruppen durch Umsetzen mit einer Verbindung geschützt werden, welche die allgemeine Formel

20

O

R„—O—C-

In der vorstehenden Reaktionsfolge bedeuten Rx eine Schutzgruppe der a-Aminogruppe und R2 und R3 Schutzgruppen an den reaktionsfähigen Seitenketten von L-Serin und L-Lysin, die nicht angegriffen oder abgespalten werden, wenn Rj abgespalten wird; dadurch wird die weitere Reaktion möglich. Bei dem vorstehend als Zwischenprodukt auftretenden Pentapeptid-Polymerisat bedeutet Ri vorzugsweise eine tert.-Butyloxycarbonylgruppe, R2 eine gegebenenfalls substituierte Benzylgruppe, wie die 4-Chlor-benzylgruppe, und R3 eine substituierte Benzyloxycarbonyl-gruppe, wie die 2,6-DichIorbenzyloxycarbonylgruppe. Das Polymerisat ist eines der vorstehend speziell genannten Polymerisate.

Nach der Herstellung des letzten Zwischenprodukts wird das Peptid-Polymerisat gewöhnlich gespalten, um die Gruppen Rj, R2 und R3 sowie das Polymerisat abzuspalten. Die Schutzgruppen können in üblicher Weise abgespalten werden, z.B. durch Behandeln mit wasserfreiem Fluorwasserstoff, wobei das freie Peptid erhalten wird.

Es ist erforderlich, die Aminogruppen zu schützen, um die Reaktionen zu den gewünschten Endprodukten zu führen. Geeignete Aminoschutzgruppen sind beispielsweise salzbildende Gruppen für stark basische Aminogruppen oder Urethanschutzgruppen, wie die p-Methoxybenzyloxycarb-onyl- und tert.-Butyloxycarbonylgruppe. Vorzugsweise wird die tert.-Butyloxycarbonylgruppe (BOC) oder die tert.-Amyl-

25 aufweist, in der R4 jeden Rest bedeutet, der die Aminogruppe davon abhält, in die nachfolgende Kupplungsreaktion einzugreifen, und der ohne Zerstörung des Moleküls wieder abgespalten werden kann. R4 bedeutet einen unverzweigten oder verzweigten, gesättigten oder ungesättigten Alkylrest 30 mit vorzugsweise 1 bis 10 Kohlenstoffatomen und vorzugsweise substituiert durch mindestens ein Halogenatom oder eine Cyangruppe, einen Arylrest mit vorzugsweise 6 bis 15 Kohlenstoffatomen, einen Cycloalkylrest mit vorzugsweise 5 bis 8 Kohlenstoffatomen, einen Aralkylrest mit vorzugs-35 weise 7 bis 18 Kohlenstoffatomen, einen Alkarylrest mit vorzugsweise 7 bis 18 Kohlenstoffatomen oder einen hete-rocyclischen Rest, wie die Isonicotinylgruppe. Die Aryl-, Aralkyl- und Alkarylreste können auch durch einen oder mehrere Alkylreste mit 1 bis etwa 4 Kohlenstoffatomen süb-40 stituiert sein. Bevorzugte Reste für R4 sind in tert.-Butyl-, tert.-Amyl-, Tolyl-, Xylyl- und Benzylgruppe. Besonders bevorzugte Aminoschutzgruppen sind beispielsweise die Ben-zyloxycarbonylgruppe, eine substituierte Benzyloxycarbonyl-gruppe, in der die Phenylgruppe substituiert ist durch min-45 destens ein Halogenatom, wie ein Chlor- oder Bromatom, eine Nitrogruppe, ein Niederalkoxyrest, wie die Methoxy-gruppe, Niederalkylrest, tert.-Butyloxycarbonyl-, tert.-Amyl-oxycarbonyl-, Cyclohexyloxycarbonyl-, Vinyloxycarbonyl-, Adamantyloxycarbonyl- und Biphenylisopropoxycarbonyl-50 gruppe. Andere Schutzgruppen sind beispielsweise die Isoni-cotinyloxycarbonyl-, Phthaloyl-p-Tolylsulfonyl- und Formyl-gruppe.

Zur Durchführung des Verfahrens kann das Peptid durch Umsetzen der freien a-Aminogruppe mit einer Ver-55 bindung aufgebaut werden, die geschützte Aminogruppen aufweist.

Zur Kupplungsreaktion wird die zu kuppelnde Verbindung bevorzugt an ihrer Carboxylgruppe aktiviert, so dass die Carboxylgruppe mit der freien a-Aminogruppe an der 60 Peptidkette reagieren kann. Um die Aktivierung zu erreichen, kann die Carboxylgruppe in jede reaktionsfähige Gruppe überführt werden, beispielsweise in einen Ester, ein Anhydrid, Azid oder Säurechlorid. Es kann auch ein geeignetes Kupplungsmittel während der Umsetzung zugege-65 ben werden. Geeignete Kupplungsmittel sind beispielsweise Carbodiimide (wie Dicyclocarbodiimid), und Carbonyl-diimidizol (vgl. Peptide Synthesis, Interscience, 1976, Kapitel 5).

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Während dieser Reaktionen weisen die Aminosäuregruppen sowohl Aminogruppen als auch Carboxylgruppen auf, wobei im allgemeinen eine Gruppe in die Reaktion eintritt, während die andere Gruppe geschützt ist. Vor dem Kuppeln wird die Schutzgruppe vorzugsweise an der a- oder endständigen Aminogruppe des angegriffenen Peptids unter Bedingungen abgespalten, die im wesentlichen andere Schutzgruppen, z.B. die Gruppe an der s-Aminogruppe des Lysin-moleküls, nicht wesentlich beeinträchtigen. Die bevorzugte Verfahrensweise für diesen Schritt ist eine milde Acidolyse, beispielsweise eine Umsetzung mit Trifluoressigsäure bei Raumtemperatur.

Die vorgenannten Reaktionsschritte führen zur Herstellung des Tetrapeptids der Formel III

H-ALA-LYS-SER-GLN-OH (ffl)

Dieses Tetrapeptid enthält ein erfindungsgemässes Tetrapeptidsegment, das für die biologische Wirksamkeit notwendig ist. Das Ersetzen von L-Alanyl und/oder L-Seryl durch einen natürlichen oder synthetischen Aminosäurerest kann durch Ersetzen von Alanin und/oder Serin durch die entsprechende geschützte natürliche oder synthetische Aminosäure im vorgenannten Reaktionsschema erfolgen, wobei das Tetrapeptid der Formel III A erhalten wird:

H-X-LYS-Y-GLN-OH (IIIA)

in der X und Y die vorstehende Bedeutung haben. Das substituierte Tetrapeptid der Formel II, in der die endständige Aminosäuregruppe wie vorstehend weiter substituiert sein kann, kann dann hergestellt werden durch Umsetzen des Tetra-Peptids der Formel IIIA oder der geschützten Peptid-Polymerisat-Vorstufe mit geeigneten Reaktionspartnern, um die gewünschten Derivate zu erhalten. Reaktionen dieser Art, wie Acylierung, Veresterung und Amidierung,

sind' bekannt. Andere Aminosäuren, d.h. Aminosäuregruppen, welche die biologische Wirksamkeit der Tetrapeptidse-quenz nicht beeinträchtigen, können an jedes Ende der Peptidkette durch die gleiche Reaktionsfolge angefügt werden, durch die das Tetrapeptid selbst synthetisiert worden ist. Auch kann der Ersatz von Alanin und/oder Serin dadurch erreicht werden, dass man den gewünschten Substituenten (in geschützter Form) anstelle von Alanin oder Serin in der vorstehenden Reaktionsfolge einsetzt, nach der das unsubstituierte Tetrapeptid erhalten wird.

Ausser der Reaktionstechnik unter Verwendung einer festen Phase gemäss Merrifield können auch klassische Techniken beim beschriebenen Verfahren angewandt werden, beispielsweise gemäss der Beschreibung in Peptide Synthesis, Interscience, 1966. Die Identität und Reinheit der auf solche Weise hergestellten Peptide wird in üblicher Weise, wie durch Dünnschichtchromatographie, Elektrophorese und Aminosäureanaiyse, bestimmt.

Die Beispiele erläutern die Erfindung. Die Teile beziehen sich auf das Gewicht, soweit nichts anderes angegeben ist.

Beispiel 1

Zur Herstellung des Polypeptids werden die folgenden handelsüblichen Stoffe eingesetzt:

a-BOC-L-Glutamin-o-nitrophenylester a-BOC-s-2-chlorbenzyloxycarbonyl-L-lysin a-BOC-O-benzyl-L-serin a-BOC-L-Alanin.

BOC bedeutet die tert.-Butyloxycarbonylgruppe. Die Reagenzien zur Bestimmung der Aminosäuresequenz, die

Cyclohexylcarbodiimid, Fluorescamin und das Polymerisat sind gleichfalls handelsüblich. Letzteres ist ein Polystyrol-Vinylbenzol-Polymerisat mit einer Korngrösse von 0,037 bis 0,074 mm, das 1 % Divinylbenzol und 0,75 mMol Chlorid pro g Polymerisat enthält.

Zur Herstellung des Polypeptids werden 2 mMol a-BOC--L-Glutamin in absolutem Äthanol, das 1 mMol Triäthyl-amin enthält, 24 Stunden bei 80°C mit 2 mMol chlormethy-liertem Polymerisat verestert. Der erhaltene Amintosäure-Polymerisat-Ester wird abfiltriert, mit absolutem Äthanol gewaschen und getrocknet. Anschiessend werden die anderen a-BOC-Aminosäuren in ähnlicher Weise mit der von der Schutzgruppe befreiten «-Aminogruppe des Peptid-Po-lymerisats in der richtigen Sequenz gekuppelt, wobei das er-findungsgemässe Polypeptid unter Verwendung äquivalenter Mengen von Dicyclohexylcarbodiimid erhalten wird.

Nach jeder Kupplungsreaktion werden jeweils gleiche Teile des Polymerisats mit Fluorescamin geprüft. Wird positive Fluoreszenz gefunden, wird dies als Anzeichen für eine nicht-vollständige Reaktion angesehen, und die Kupplungsreaktion wird mit den gleichen geschützten Aminosäuren wiederholt. Schliesslich wird nach mehreren Kupplungsreaktionen das Tetrapeptid-Polymerisat als Zwischenprodukt erhalten.

Das Peptid-Polymerisat wird gespalten, und die Schutzgruppen Werden in einer Kel-F-Spaltapparatur (Peninsula Laboratories, Inc.) unter Verwendung von wasserfreiem Fluorwasserstoff bei 0°C während 60 Minuten und 1,2 ml Ani-sol pro g Peptid-Polymerisat als Spülmittel abgetrennt. Das Peptidgemisch wird mit wasserfreiem Diäthyläther gewaschen und mit wässriger Säure extrahiert. Der Extrakt wird lyophilisiert. Das Peptid wird an P-6 Bio-Gel in 1 n Essigsäure chromatographiert. Das erhaltene Polypeptid ist zu 94% rein. Als seine Sequenz wurde ermittelt:

H-ALA-LYS-SER-GLN-OH

Zur Identifizierung werden die Dünnschichtchromatographie und die Elektrophorese wie folgt durchgeführt:

Zur Dünnschichtchromatographie wird eine Probe von 30 [ig an Kieselgel (Brinkman Silica Gel mit Fluoreszenzindikator, 20 X 20 cm; 0,1 mm Dicke) unter Verwendung der folgenden Laufmittel behandelt:

Rr1: n-Butanol:Pyridin:Essigsäure:Wasser; 30:15:3:12 R 2: Äthylacetat:Pyridin-Essigsäure:Wasser; 5:5:1:3 R 3: Äthylacetat:n-Butanol:Essigsäure:Wasser; 1:1:1:1.

Die Elektrophorese wird an einer Probe von 100 jxg an einem Whatman-Papier (3 mm; 11,5 X 56,5 cm) unter Verwendung einer Pyridin-Acetat-Pufferlösung (pH-Wert 5,6) und einer Spannung von 1000 Volt während 1 Stunde durchgeführt.

Sprühreagenzien für die Dünnschichtchromatographie. und die Elektrophorese sind Pauly und Ninhydrin.

Die folgenden Ergebnisse wurden erhalten:

Rr1 = unbeweglich; Rf2 = unbeweglich; Rf3 = 0,336. Die Elektrophorese ergab eine Wanderung von 9,4 cm gegen die Kathode.

Beispiel 2

Zur Bestimmung der Wirksamkeit und deren Charakteristiken des gemäss Beispiel 1 hergestellten Tetrapeptids wird der nachfolgende Hühnchen-Induktionsversuch durchgeführt. Dieser Versuch ist im einzelnen in Science, Bd. 193 (23. Juli 1976), S. 319 bis 321, beschrieben.

Als Quelle für induzierbare Zellen wird Knochenmark von frisch ausgebrüteten Hühnchen gewählt, da diesem

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Material eine beachtliche Zahl von Bu-1+- oder Th-1+ -Zellen fehlt. Gesammelte Zellen vom Oberschenkelknochen und Tibiotarsus von fünf neu ausgebrüteten Hühnchen des Stamms SC (Hy-Linie) werden durch Ultrazentrifugieren an einem diskontinuierlichen 5-schichtigen Rinderserumalbumin-Gradienten (BSA) fraktioniert. Zellen aus den zwei helleren Schichten werden vereinigt, gewaschen und zur Inkubation mit einer Konzentration von 5 X 108-Zellen/ml mit der entsprechenden Konzentration des Testpolypeptids in RPMI-1630-Medium suspendiert, das ergänzt ist mit 15 mMol Hepes, 5% y-Globulin-freiem fetalem Kalbsserum, Desoxyribonuclease (14 bis 18 Einheiten/ml), Heparin (5 Einheiten/ml), Penicillin (100 Einheiten/ml) und Strepto-mycin (100 [ig/ml). Kontrollproben werden mit BSA (1 ng/ml) oder mit Medium allein inkubiert. Nach der Inkubation werden die Zellen im Cytotoxizitätsversuch geprüft unter Einsatz von Hühnchen Cl und Meerschweinchen C2 bis C9 Komplimentfraktionen, wie im Stand der Technik beschrieben. Der Anteil von Bu-1+- oder Th-1+-Zellen in jeder Schicht wird aus Cytotoxozitätsindex 100 x(a-b)/ a berechnet, wobei a und b die Prozentsätze von lebensfähigen Zellen in den komplementären Kontroll- und Testproben darstellen. Der Prozentsatz der induzierten Zellen wird durch Subtrahieren der Mittelwerte der Kontrollinkubationen ohne induzierende Mittel (im allgemeinen 1 bis 3%) von den Werten der zu untersuchenden Induktionen erhalten.

Die spezifische Wirkung des Testpolypeptids und seine Ähnlichkeit zu Ubiquitin werden gezeigt durch das Inhibieren der Induktion von Bu-1+-B- und Th-+-T-Zellen durch die Testpolypeptide bei Zugabe von Ubiquitin in einer Konzentration von 100 [ig/ml. Diese hohe Dosis an Ubiquitin inaktiviert die Ubiquitinrezeptoren und verhindert SO' die Induktion von Zellen durch irgendein Mittel, das über diese Rezeptoren wirkt.

Als Ergebnis dieses Versuches wird gefunden, dass das gemäss Beispiel 1 hergestellte Tetrapeptid eine biologische Wirksamkeit ähnlich der des Ubiquitins hinsichtlich des Induzierens der Differenzierung von Th-1+-T- und Bu-1+-B-Lymphozyten bei Konzentrationen in der Grössenordnung von ng/ml entfaltet.

Beispiel 3

A) Der Versuch von Beispiel 2 wird wiederholt, jedoch unter Einsatz eines der nachfolgenden Testpolypeptide:

H-GLN-ALA-LYS-SER-GLN-GLY-GLY-SER-ASN-OH

H-GLN-ALA-LYS-SER-GLN-OH

H-SAR-ALA-LYS-SER-GLN-OH

In jedem Fall wird eine biologische Wirksamkeit ähnlich der des Ubiquitins beobachtet.

B) Der Versuch gemäss Beispiel 2 wird wiederholt,

jedoch unter Einsatz eines der folgenden Testpolypeptide:

H-SAR-LYS-D-ALA-GLN-NH2

H-SAR-LYS-SAR-GLN-NH2

h-d-ala-lys-d-ala-gln-nh2

In jedem Fall wird eine biologische Wirksamkeit ähnlich der des Ubiquitins beobachtet. Für das erstgenannte Polypeptid liegt diese Aktivität im Konzentrationsbereich von etwa 1 pg/ml bis 100 pg/ml. Für das zweite Polypeptid wird die Aktivität bei einer Konzentration von 0,1 pg/ml beobachtet.

Beispiel 4 bis 6

Unter Einsatz der vorstehend beschriebenen Reaktionstechniken zur Herstellung substituierter Polypeptide werden Polypeptide der allgemeinen Formel

R-X-LYS-Y-GLN-R'

hergestellt. Diese Peptidamide werden unter Einsatz eines Benzhydrylamin-Polymerisats gemäss der bekannten Technik des Arbeitens in fester Phase erhalten.

Beispiel

R

x

Y

R'

4

h

SAR

D-ALA

nh2

4A

h

SAR

SAR

nh2

5

h

D-ALA

D-ALA

nh2

5A

h

D-ALA

SAR

nh2

6

h

SAR

2-Me-ALA

nh2

6A

h

SAR

SAR

oh

Die gemäss den Beispielen 4 bis 6 hergestellten Polypeptide behalten die biologische Wirksamkeit, wie sie vorstehend für das aktive Polypeptidsegment beschrieben ist.

Zur Identifizierung werden Dünnschichtchromatographie und Elektrophorese in folgender Weise eingesetzt.

Zur Dünnschichtchromatographie werden Proben von 20 (xg an Kieselgel (5 X 20 cm) unter Verwendung von n-Butanol : Essigsäure : Äthylacetat : Wasser (1:1:1:1) als Laufmittel (Rf1) und an Cellulose 6064 (Eastman, 20 X 20 cm) unter Verwendung von n-Butanol : Pyridin : Essigsäure : Wasser (15 : 10 : 3 : 12) als Laufmittel (R£2) eingesetzt. Die Elektrophorese erfolgt mit Proben von 50 [ig an Whatman-Papier (Nr. 3; 5,7 X 55 cm) unter Verwendung einer Pyridin-Acetat-Pufferlösung (pH-Wert 5,6) und bei einer Spannung von 1000 Volt während 1 Stunde. Die Verbindungen wandern gegen die Kathode.

Sprühreagenzien für die Dünnschichtchromatographie und die Elektrophorese sind Pauly und Ninhydrin.

Die folgenden Ergebnisse wurden erhalten (die R£-Werte und die Werte der Elektrophorese werden bezüglich H-ARG-LYS-ASP-VAL-TYR-OH) angegeben:

Elektrophorese

Beispiel

Rf1

R,2

Wanderung

Reinheit

A

0,44

0,68

2,07

98%

4A

0,88

0,60

1,78

98%

5

0,56

0,71

2,10

98%

Gemäss der Dünnschichtchromatographie und der Elektrophorese nach Beispiel 1 werden die folgenden Ergebnisse für die Verbindung gemäss Beispiel 6 erhalten: Rf1 = 0,155); Rt2 = unbeweglich, R,3 = 0,265; Elektrophoresewanderung 13,1 cm gegen die Kathode.

Beispiel 7

Die Tetrapeptid-Polymerisate mit geschütztem LYS und SER (hergestellt gemäss den Beispielen 1 und 6A) werden durch Umsetzen mit Essigsäureanhydrid acyliert und nachfolgend von den Schutzgruppen und dem Polymerisat befreit. Man erhält die acylierten Derivate:

CHaCO-ALA-LYS-SER-GLN-OH

ch3co-SAR-LYS-SAR-GLN-OH

5

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10

Beispiel 8

Die geschützten Tetrapeptid-Polymerisate gemäss den Beispielen 1 und 6 A werden durch Umsetzen mit Natrium-methoxid in Methanol unter Abspaltung des Polymerisats umgeestert und anschliessend von den Schutzgruppen; befreit. Man erhält die folgenden veresterten Derivate:

H-ALA-LYS-SER-GLN-OCH3

H-SAR-LYS-SAR-GLN-OCH3

Beispiel 9

Die geschützten Tetrapeptid-Polymerisate gemäss den Beispielen 1 und 6A werden mit Diäthylamin unter üblichen Reaktionsbedingungen vom Polymerisat gespalten und nachfolgend von den Schutzgruppen befreit. Man erhält die folgenden aminosubstituierten Derivate:

H-ALA-LYS-SER-GLN-N(€2H5)2

H-SAR-LYS-SAR-GLN-N(C2Hs)2

Beispiel 10

Gemäss den Methoden in den Beispielen 1 und 6A, jedoch unter Einsatz einer äquivalenten Menge von in geeigneter Weise geschütztem N-a-Äthyl-L-Alanin oder N-a-Äthyl-Sarcosin, werden die nachfolgenden Peptide erhalten.

C2H5-ALA-LYS-SER-GLN-OH

C2H5-SAR-LYS-SAR-GLN-OH

Beispiel 11

Durch Abspalten des Polymerisats aus den geschützten Tetra-Peptid-Polymerisaten gemäss Beispiel 10 unter Verwendung von Ammoniak in Dimethylformamid unter amidierendeni Bedigungenund nachfolgendes Abspalten der Schutzgruppen werden die nachfolgenden Peptidamide erhalten:

C2H5-ALA-LYS-SER-GLN-NH2

C2H5-SAR-LYS-SAR-GLN-NH2

Beispiel 12

Die geschützten acetylierten Tetrapeptid-Polymerisate gemäss Beispiel 7 werden mit Ammoniak in Dimethylformamid unter amidierenden Bedingungen umgesetzt und nachfolgend von den Schutzgruppen befreit. Man erhält die folgenden Peptidamide:

CH3CO-ALA-LYS-SER-GLN-NH2

ch3co-sar-lys-sar-gln-nh2

Beispiel 13 bis 26

Unter Einsatz der vorstehend beschriebenen Reaktionstechniken zur Verlängerung der Polypeptidkette werden di folgenden Polypeptide erhalten, welche die reaktionsfähige Aminosäuresequenz enthalten, jedoch an den endständigen Amino- und Carboxylgruppen R ünd R' substituiert sind. Es werden Polypeptide der allgemeinen Formel r-ala-lys-ser-gln-r'

erhalten. Die Bedeutungen von R und R' sind in der nachstehenden Tabelle angegeben.

Beispiel

R

R'

13

GLN

OH

14

SAR

OH

15

H

GLY

16

H

GLY-GLY

17

H

GLY-GLY-SER

18

H

GLY-GLY-SER-ASN

19

GLN

GLY

20

GLN

GLY-GLY

21

GLN

GLY-GLY-SER

22

SAR

GLY

23

SAR

GLY-GLY

24

SAR

GLY-GLY-SER

25

SAR

GLY-GLY-SER-ASN

26

GLN

GLY-GLY-SER-ASN

Die in den Beispielen 4 bis 26 erhaltenen Polypeptidderivate behalten die biologische Wirksamkeit, wie sie vorstehend für die wirksamen Polypeptidsegmente beschrieben ist.

Gemäss der in Beispiel 1 beschriebenen Dünnschichtchromatographie und Elektrophorese für die Verbindungen der Beispiele 13 und 14 werden die folgenden Ergebnisse erhalten:

Beispiel

Rf1

Rf2

Rt3

Elektrophoresewanderung gegen die Kathode

13

unbeweglich unbeweglich

0,303

7,4 cm

14

unbeweglich unbeweglich

0,186

8,3 cm

Gemäss der Dünnschichtchromatographie und der Elektrophorese in den Beispielen 4 und 5 werden für die Verbindung von Beispiel 26 folgende Ergebnisse erhalten:

rf1 = 0,23; r,2 = 0,25; Elektrophoresewanderung gegen die Kathode 0,88.

Beispiel 27

Zur Erläuterung der vorteilhaften Eigenschaften der erfindungsgemässen Polypeptide wird nachfolgend ein Mikro-kultur-Versuch zur Abschätzung der Häufigkeit der cytotoxischen Lymphozyten beschrieben, die nach Stimulation durch allogene Antigene gebildet werden. Die Häufigkeiten von cytotoxischen Vorstufen zwischen Kontrolltieren und solchen Tieren, denen verschiedene Konzentrationen der zu untersuchenden Stoffe injiziert worden sind, werden in einem Versuch mit begrenzter Verdünnung verglichen.

Versuchsmaterial und. Verfahren

Mäuse:

Zucht C57 BL/6J (weiblich, 8 Wochen) Jackson Laboratori Bar Harbor, Maine.

Zucht DBA/2J, (männlich oder weiblich) Jackson La-boratory, Bar Harbor, Maine.

Medien:

Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), RPMI1640, fetales Kalbsserum (FCS) - (Nr. R776116), N-2-Hydroxy-äthylpiperazin-N'-2-äthansulfonsäure (HEPES) Puffer (Gibo,

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Grand Island); 2-Mercaptoäthanol (Eastman Kodak, Rochester, N.Y.).

Die Zellen werden mit PBS gewaschen und in RPMI gezüchtet, das 10% FCS, 10 mMol HEPES-Puffer mit 5 X IO-5 Mol 2-Mercaptoäthanol enthält.

Wirkstoff Verabreichung:

Den Testtieren (C57 BL/6J) werden verschiedene Konzentrationen von H-SAR-LYS-SAR-GLN-NH2 (Nr. G 040) in einer Menge 0,2 ml injiziert (i.v. oder i.p.). 24 Stunden später werden sie zur Untersuchung getötet.

Zellbehandlungen:

Es werden Zellsuspensionen der Milz der Mäuse C57 BL/6J oder DBA/2J durch Kleinhacken und' Hindurch-pressen des Organs durch ein Drahtnetz (60 gauge) unter Verwendung eines Stempels einer 5-ml-Injektionsspritze in eine Falcon-Petrischale (Falcon 3002, 15 X 60 mm) hergestellt. Die Zellsuspensionen werden 10 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen, damit sich die grossen Gewebestücke absetzen. Die Zellsuspensionen werden dann in Cor-ning-Zentrifugenröhrchen (Corning 25 310) von 15 ml gegeben und 10 Minuten bei einer Drehzahl von 1500 U/min zentrifugiert (Beckmen TJ-6-Zentrifuge). Alle Zellsuspensionen werden mindestens dreimal zusätzlich mit PBS gewaschen. Nach der dritten Waschung werden die Responder-Zellen (C57 BL/6J) im Kulturmedium erneut suspendiert und im Coulter-Zähler gezählt. Die Stimulator-Zellen (DBA/ 2J) werden in RPMI bis 710 Zellen/ml erneut suspendiert. 30 |ig Mitomycin C werden zu jedem ml der DBA/2J-Milz-zellen gegeben, und die Gemische werden 30 Minuten bei 37°C inkubiert. Nach der Behandlung mit Mitomydin C werden die Milzzellen dreimal mit PBS gewaschen, um jeden Überschuss an Mitomycin C zu beseitigen. Die DBA-Zellen werden dann erneut in dem Kulturmedium suspendiert und im Coulter-Zähler gezählt.

Gemischte Lymphocytkulturen (MLC) MLC werden in Mikrotiterschalen (Linbro Chemicals New Häven, Conn., IS-MVC-96) angesetzt. Jede Schale weist 96 Vertiefungen mit V-Boden auf. Die Vertiefungen an der Aussenseite der Schale werden nicht für Zellkulturen verwendet, sondern mit PBS gefüllt, um eine Verdampfung aus den mit Kulturen gefüllten Vertiefungen zu vermeiden. 60 Proben werden in jeder Schale angesetzt. Im allgemeinen enthält jede Schale drei Responder-Zellkonzentrationen (jeweils 20 Wiederholungen) und eine Stimulator-Zellkonzentra-tion. Die Responder-Zellen werden im allgemeinen in Konzentrationen von 7,5 X105, 5 X105 und 2,5 X 105/ml suspendiert. Die Vertiefungen der Mikrotiterschalen werden jeweils mit 0,1 ml gefüllt. Die Stimulator-Zellkonzentrationen betragen 10®, 2,5 X 106 und 5 X 106/ml. Auch hier werden 0,1 ml in den Vertiefungen der Schale eingesetzt. Die gleiche Sti-mulator-Zellkonzentration wird auf der ganzen Schale verwendet. Es werden auch Kontrollproben angesetzt, die nur Responderzellen ohne Stimulatorzellen enthalten, um die durch das Medium verursachte Hintergrundstimulation abzuschätzen. Die Zellen1 werden 6 Tage bei 37°C in einem 5 % Kohlendioxid enthaltenden feuchten Inkubator gezüchtet.

T arget-Zellen:

Die im cytotoxischen Versuch verwendete Target-Zelle ist eine DBA-Mastocytom-Zellreihe P 815. Die Zellreihe wird mittels Routinedürchgang durch DBA/2J-Mäuse aufrechterhalten. 5 X 10® Zellen P815 werden für jeden Durchgang verwendet. Die Tumorzellen von der Bauchhöhle des

Trägers werden 4 bis 5 Tage nach dem Durchgang verwendet. Sie werden dreimal mit PBS gewaschen und dann mit Cr51 in einer Konzentration von 100 jxci/107 Zellen markiert. Das Markieren wird 1 Stunde bei 37°C in einem befeuchteten Inkubator durchgeführt. Die markierten Target-Zellen werden dann dreimal mit PBS gewaschen, um überschüssige Markiersubstanz abzutrennen.

Cytotoxischer Versuch:

Nach 6tägiger Züchtung werden von jeder Vertiefung 0,1 ml des Mediums entnommen, ohne das Zell-Pellet zu stören. Dann werden unter Verwendung einer automatischen Mikropipette (MLA-Pipette) in jede Vertiefung 100 (il der Target-Zellen, enthaltend 2,5 X 104 Cr51-markierte Target-Zellen, gebracht. Das Zell-Pellet wird während des Verfahrens (für jede Vertiefung muss eine neue Pipettenspitze verwendet werden) erneut suspendiert. Die Mikrotiterschalen werden dann bei Raumtemperatur und 1000 U/min während eines Zeitraumes von 7 Minuten zentrifugiert (Sorvall GLC-2B). Die Schalen werden dann 4 Stunden bei 37° inkubiert. 100 [il der überstehenden Flüssigkeit werden entnommen und in Gamma-Zähltöhrchen (Amershen 196 271) gegeben. Die Röhrchen werden dann in einem Beckmen-Gamma-Zähler (Beckmen 310) gezählt. Die Zählung erfolgt im allgemeinen während 1 Minute.

Bestimmung der Häufigkeiten der Precursoren von cytotoxischen Lymphocyten (CLP)

Die begrenzende Verdünnungsanalyse ist ein Versuch mit einer Antwort im Sinne von «alle oder keiner», beschrieben durch die Poisson-Wahrscheinlichkeitsverteilung. Die Wahrscheinlichkeit einer Nicht-Reaktion ist gegeben durch den Ausdruck Po=e~8N, wobei 8 die Häufigkeit von CLP und N die Zahl der Lymphozyten pro Vertiefung bedeuten. Somit sollte eine graphische Darstellung des Logarithmus der Wahrscheinlichkeit von nicht-reagierenden Kulturen gegenüber der Zelldosis eine gerade Linie mit einer Steigung von -8, die Frequenz von CLP ergeben.

In den Beispielen wird die Hintergrund-Chromabgabe (spontane Abgabe) von 20 Vertiefungen gemittelt, die gerade Responder-Zellen (C57 BL/6J) mit keinen Stimulator-Zellen enthalten. Untersuchte Vertiefungen werden als positiv bewertet, wenn ihre Zählungen grösser sind als die mittleren Spontanwerte durch mehr als 2,07 Standardabweichungen (P < 0,05). Die spontane Lösung liegt im allgemeinen bei 9 bis 15 % der gesamten in die Target-Zellen eingeschlossenen Zählungen. Entsprechend der Poisson-Gleichung Po=-8N, wenn Po=e-1 = 0,37 (entspricht 37% nicht-reagierenden Kulturen), 8 = 1/N, so ist das Reziproke der Zahl der reagierenden Zellen (entsprechend 37 % nicht--reagierenden Kulturen) die CLP-Häufigkeit. Im allgemeinen werden die Zahl der Zellen pro Vertiefung und ihr entsprechender Wert für den Prozentsatz der Nicht-Reagieren-d'en in einen1 Computer eingegeben, der die beste Regressionslinie durch diese Punkte und die Zahl der Zellen pro Vertiefung, die 37 % nicht reagierenden Kulturen entspricht, berechnet. Das Reziproke dieses Werts ist die Häufigkeit der Precursoren der cytotoxischen Lymphozyten (CLP).

Ergebnisse:

Die Häufigkeiten der Precursoren der cytotoxischen Lymphozyten für jede Stimulatorzellkonzentration werden in einem Diagramm als Funktion der Wirkstoffdosis aufgetragen. Die mittlere und die Standardabweichung der 20 Wiederholungen werden zum Vergleich auch berechnet. Die drei verwendeten Stimulatorzellkonzentrationen sind 105 (suboptimale Stimulation) 2,5 X 105 (optimale Stimulation)

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und 5 X IO5 (überoptimale Stimulation). Es ergibt sich, dass der Wirkstoff die Bildung von Precursoren der cytotoxischen Lymphozyten fördert, und zwar bei Konzentrationen von etwa 1 pg/Maus bis etwa 100 ng/Maus (entsprechend etwa 50 pg/kg bis etwa 5 jxg/kg Körpergewicht) in Gegenwart von suboptimalen Stimulator-Zellkonzentrationen. Der untersuchte Arzneistoff wirkt deshalb als ein Immunoregulator bei diesen Konzentrationen zur Erhöhung der zellulären Immunreaktion von behandelten Mäusen.

v

Claims (5)

1. 642058
2. 2. Polypeptid nach Anspruch 1 der Sequenz der Formel

   H-ALA-LYS-SER-GLN-OH

   und seine Salze.

   3. Polypeptide nach Anspruch 1 der Sequenz der Formel

   R-X-LYS-Y-GLN-R'

   in der X und Y gleich oder verschieden sind und jeweils die Gruppe D-ALA oder SAR darstellen sowie R und R' die in Anspruch 1 angegebene Bedeutung haben, und ihre Salze.

   4. Polypeptid nach Anspruch 1 der Sequenz der Formel

   H-SAR-LYS-SAR-GLN-NH2

   und seine Salze.

   5. Polypeptid nach Anspruch 1 der Sequenz der Formel

   H-SAR-LYS-D-ALLA-GLN-NH2

   und seine Salze.

   6. Therapeutisches Mittel, dadurch gekennzeichnet,

   dass es als Wirkstoffkomponente mindestens ein neues Polypeptid, welches die Sequenz der folgenden Formel

   R-X-LYS-Y-GLN-R'

   (II)

   aufweist, in der

   X und Y gleich oder verschieden sind und jeweils eine L-Asparagyl-, L-Glutamyl-, L-Threonyl-, Glycyl-, L-Valyl-,

   Wasserstoff

   OH

   C1_7-Alkyl nh2

   C6-!2-Aryl

   NHR,

   C7.20-Alkaryl

   N(R7)2

   C7.20-Aralkyl or7

   C^-Alkanoyl

   C2_7-Alkenyl

   GLY

   C2_7-Alkinyl

   GLY-GLY

   GLN

   LY-GLY-SER

   SAR

   GLY-GLY-SER-ASN

   20 wobei

   R, einen C^-AIkyl-, C2-7-AIkenyl-, C2_,-Alkinyl-, C6_20--Aryl-, C7.20-Aralkyl- oder C7_20-Alkarylrest bedeutet,

   mit der Massgabe, dass R' nicht den Rest GLY-GLY--SER-ASN darstellt, wenn R den Rest GLN bedeutet,

   mit der weiteren Massgabe, dass die Polypeptide die Differenzierung der vorgenannten Lymphozyten im Hähnchen-Induktions-Versuch bei einer Konzentration von höchstens 1 ng/ml induzieren,

   oder Salze davon enthält.

   7. Mittel nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Wirkstoffkomponente eine Verbindung gemäss Anspruch 3 ist.

   8. Mittel nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Wirkstoffkomponente eine Verbindung gemäss An-

   35 sprach 4 oder 5 ist.

   25

   30

   Bekanntlich sind viele Polypeptide aus verschiedenen 40 Geweben, Organen und dem Blut von Tieren isoliert worden. Viele dieser Polypeptide stehen in Beziehung zur Immunfunktion des Körpers, beispielsweise die verschiedenen Immunglobuline und das Thymushormon Thymopoetin. Die Isolierung verschiedener derartiger Polypeptide ist in den 45 US-PSen 4 002 602 und 4 002 740 beschrieben.

   Bis vor etwa 10 Jahren war über den Thymus wenig bekannt, obwohl man heute weiss, dass er eines der wesentlichen Organe ist, die für die Immunfunktion bei Säugetieren und Vögeln verantwortlich sind. Trotz grossen Inteso resses an möglichen Funktionen des Thymus sowie theoretischen Überlegungen und experimentellen Untersuchungen war bis vor kurzem über die Funktion des Thymus wenig bekannt. Jedoch weiss man jetzt, dass der Thymus ein kombiniertes Organ mit sowohl epithelialen (endocrinen) als 55 auch lymphoiden (immunologischen) Komponenten darstellt und somit an den Immunfunktionen des Körpers beteiligt ist. Der Thymus besteht aus einem epithelialen Grundgewebe, das vom dritten Aortenbogen stammt, und Lymphozyten, die von Stammzellen abgeleitet sind, die ursprünglich 60 in haematopoetischen Geweben vorkommen (vgl. Goldstein, The Human Thymus, Heinemann, London. 1969). Lymphozyten sind innerhalb des Thymus differenziert und treten aus als reife, vom Thymus stammende Zellen, sogenannte T-Zellen, die durch das Blut, die Lymphe, die Milz und die 65 Lymphknoten zirkulieren. Die Induktion der Differenzierung von Stammzellen innerhalb des Thymus scheint durch Sekretionen der Epithelzellen des Thymus vermittelt zu werden.

   2

   PATENTANSPRÜCHE 1. Polypeptide mit der Fähigkeit, die Differenzierung von Th-1" T-Lymphozyten und Bu-1+ B-Lymphozyten zu induzieren, und ihre Salze, dadurch gekennzeichnet, dass sie die Sequenz der allgemeinen Formel

   R-X-LYS-Y-GLN-R'

   (II)

   L-Leucyl-, L-Alanyl-, L-Seryl-, Sarcosyl-, 2-Methylalanyl-, D-Asparagyl-, D-Glutamyl-, D-Threonyl-, D-Valyl-, D-Leu-cyl-, D-Alanyl- oder D-Seryl bedeuten, sowie

   R und R' gleich oder verschieden sind und jeweils einen der Reste darstellen, die nachfolgend für die R und R' angegeben sind:

   R R'

   aufweisen, in der X und Y gleich oder verschieden sind und jeweils eine L-Asparagyl-, L-Glutamyl-, L-Threonyl-, Gly-cyl-, L-Valyl-, L-Leucyl-, L-Alanyl-, L-Seryl-, Sarcosyl-, 2-Methylalanyl-, D-Asparagyl-, D-Glutamyl-, D-Threonyl-, D-Valyl-, D-Leucyl-, D-AIanyl- oder D-Seryl bedeuten, sowie R und R' gleich oder verschieden sind und jeweils einen der Reste darstellen, die nachfolgend für R und R' angegeben sind:

   R

   Wasserstoff

   C^-Alkyl

   Ce-12'Aryl

   C7_20-Alkaryl

   C7_20-Aralkyl

   C^-Alkanoyl

   C2.7-AIkenyl

   C2_7-Alkinyl

   GLN

   SAR

   r'

   oh nh2

   nhr7

   n(r7)2

   or7

   gly gly-gly ly-gly-ser gly-gly-ser-asn

   10

   15

   wobei R7 einen C,_7-Alkyl-, C2_7-Alkenyl-, C2_7-Alkinyl-, C6.20-Aryl-, C7.20-Aralkyl- oder C7_20-Alkarylrest bedeutet, mit der Massgabe, dass R' nicht den Rest GLY-GLY-SER--ASN darstellt, wenn R den Rest GLN bedeutet, und ihre Salze, mit der weiteren Massgabe, dass die Polypeptide die Differenzierung der vorgenannten Lymphozyten im Hähn-chen-Induktions-Versuch bei einer Konzentration von höchstens 1 ng/ml induzieren.
3. 3

   642058

   Es war bekannt, dass der Thymus mit den Immuneigenschaften des Körpers im Zusammenhang steht. Deshalb richtete sich grosses Interesse auf Stoffe, die aus dem Thymus isoliert worden sind. In dieser Hinsicht erschienen in den letzten Jahren zahlreiche Veröffentlichungen, die sich auf entsprechende Untersuchungen am Rinderthymus beziehen. Veröffentlichtungen auf diesem Gebiet sind beispielsweise in The Lancet, 20. Juli 1968, S. 119 bis 122; Triangle, Bd. II, Nr. 1 (1972), S. 7 bis 14; Annais of the New York Academy of Sciences, Bd. 183 (1971), S. 230 bis 240; Clinical and Expérimental Immunology, Bd.
4. 4, Nr. 2 (1969), S. 181-189; Nature, Bd. 247 (1974), S. 11-14; Pro-ceedings of the National Academy of Sciences USA, Bd. 71

   (1974), S. 1474 bis 1478; Cell, Bd.
5. 5, (1975), S. 361 bis 365 und 367 bis 370; Lancet, Bd, 2 (1975), S. 256 bis 259; Pro-ceedings of the National Academy of Sciences USA, Bd. 72

   (1975), S. 11 bis 15; Biochemist y, Bd. 14 (1974), S. 2214 bis 2218; Nature, Bd. 255 (1975), S. 423 bis 424.

   Eine zweite Klasse von Lymphozyten mit Immunfunktion sind die B-Lymphozyten oder B-Zellen. Diese sind differenziert in der Bursa Fabricius bei Vögeln und in einem bis jetzt noch nicht identifizierten Organ bei Säugetieren. Die T-Zellen und B-Zellen wirken in verschiedener Hinsicht bei der Immunität zusammen (vgl. Science, Bd. 193 (23. Juli 1976), S. 319, sowie Cold Spring Harbor Sympo-sia on Quantitative Biology, Bd. XLI (1977), S. 5.

   Kürzlich wurde von J. F. Bach ein Nonapeptid aus einem vom Schwein stammenden Serum isoliert und als «facteur thymique serique» (FTS) identifiziert. Die Isolierung dieses Stoffs und seine Struktur sind in C. R. Acad. Sc. Paris, t. 283 (29. November 1976), Sériés D-1605 sowie Nature, Bd. 266 (3. März 1977), S. 55, beschrieben. Die Struktur dieses Nonapeptids wurde als

   GLX-ALA-LYS-SER-GLN-GLY-GLY-SER-ASN

   identifiziert, wobei die Gruppe «GLX» entweder Glutamin oder Pyrog'.utaminsäure bedeutet. Der Stoff, bei dem die Gruppe GLX diese Bedeutungen hat, wurde synthetisiert. In den vorgenannten Veröffentlichungen von Bach ist beschrieben, dass sein Nonapeptid FTS in einem E-Rosetten-Versuch T-Zellen (und nicht B-Zellen) selektiv differenziert. Daraus schloss er, dass es sich bei dem Stoff um ein Thymushormon handelt. Kürzlich wurde eine gründlichere Untersuchung der Wirksamkeit dieses Nonapeptids veröffentlicht, wonach FTS sowohl T-Zellen als auch B-Zellen differenziert und deshalb in seiner Wirksamkeit mehr Ubi-quitin als Thymopoetin ähnelt [Natura, Bd. 269 (1977, S. 597],

   Es wurde nun gefunden, dass ein synthetisiertes 4-Ami-nosäurepolypeptidsegment dieses Nonapeptids FTS viele der in den vorgenannten Veröffentlichungen diskutierten Charakteristiken des Nonapeptids aufweist.