CH635747A5 - Verfahren zur herstellung einer blutgerinnungsfoerdernden praeparation aus menschlichem blutplasma. - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer blutgerinnungsfördernden Präparation aus menschlichem Blutplasma, welche eine neue blutgerinnungswirksame Substanz, genannt «FEIBA», enthält.

Diese Substanz beeinflusst in neuartiger Weise die Blutgerinnung und bewirkt eine Umgehung der Faktor-VIII-Wirkung, was bedeutet, dass die Blutgerinnung ohne Fak-tor-VIII-Zufuhr normalisiert wird. Die Präparation ist insbesondere zur Behandlung von Hämophilie-A-Patienten mit Inhibitor geeignet. Die Abkürzung «FEIBA» steht für «Factor Eight Inhibitor-Bypassing Activity».

Die Hämophilie A ist eine seit langem bekannte Krankheit (Bluterkrankheit), bei der der Blutgerinnungsablauf durch das Fehlen der Aktivität eines Blutgerinnungsfaktors gestört ist. Dieser Faktor wird als Antihämophiler Faktor (AHF) oder Faktor VIII bezeichnet. Eine Heilung dieser angeborenen, durch defekte Gene bedingten Krankheit als solche ist nicht möglich. Die Behandlung kann - im Falle einer Blutung - nur durch intravenöse Zufuhr entsprechender Mengen an Faktor VIII, welcher aus dem Blut gesunder Spender stammt, erfolgen. Während man früher auf Vollblut bzw. Vollplasma angewiesen war, von denen grosse Mengen appliziert werden mussten, gibt es heute Präparate, die den Faktor VIII in konzentrierter und auch stabiler, gefriergetrockneter Form enthalten. Die Behandlung mit diesen Präparaten führt in den meisten Fällen zu einer raschen Blutstillung.

Es gibt jedoch auch Patienten, bei denen nicht nur ein Fehlen der Faktor-VIII-Aktivität vorliegt, sondern die auch einen gegen Faktor-VIII gerichteten Hemmstoff (Inhibitor) besitzen, der - je nach vorhandener Menge - die Wirkung von zugeführtem Faktor-VIII durch Neutralisation (Inhibition) zunichte macht. Bei diesen Faktor-VIII-Inhibitor-Pa-40 tienten gab es bisher wenig Aussicht auf eine erfolgreiche Behandlung. Die einzige Möglichkeit bestand in der Entfernung des Inhibitors vor der Behandlung mit Faktor-VIII-Konzentraten, was nur durch Plasmaaustausch des Patientenplasmas gegen Plasma eines gesunden Spenders oder ge-45 gen Plasmaersatzmittel möglich ist; dies erfordert einen grossen technischen und medizinischen Aufwand. Der Plasmaaustausch muss vor neuerlicher Behandlung wiederholt werden, da der Inhibitor - speziell nach Zufuhr von neuem Faktor VIII als Antigen durch «Boostereffekt» - sich wieder so nachbildet. Eine Behandlung der Inhibitorpatienten mit sogenannten «Immunsuppressiva» zur Unterdrückung der in vivo-Synthese des Inhibitors ist bisher meistens erfolglos verlaufen.

Seit kurzem zeichnet sich eine neue Möglichkeit zur Be-55 handlung von Faktor-VIII-Inhibitor-Patienten ab. Kurc-zynski und Penner, New. Engl. J. Med., Bd. 291, Seiten 164 bis 167,1974, berichteten als erste über eine erfolgreiche Behandlung von Faktor-VIII-Inhibitor-Patienten mit sogenannten «aktivierten» Prothrombinkomplex-Konzentraten. 60 Auch in Publikationen von Sultan, Brouet und Debre, New Engl. J. Med., Bd. 291, Seite 1087,1974, und Abildgaard, Britton und Roberts, Blood, Bd. 44, Seite 933,1974, wird über klinisch erfolgreiche Anwendungen von aktivierten Prothrombinkomplex-Präparaten bei blutenden Faktor-65 VHI-Inhibitor-Patienten berichtet.

Die sogenannte Aktivierung dieser Prothrombinkom-plex-Konzentrate ist wahrscheinlich auf unbekannte Verunreinigungen zurückzuführen. Die Präparate konnten bezüg-

lieh ihres wirksamen Prinzips nicht getestet und nicht standardisiert werden. Die Ergebnisse sind daher unsicher und kaum wiederholbar.

Die Erfindung bezweckt die Überwindung der geschilderten Nachteile und Schwierigkeiten und stellt sich die Aufgabe, eine Präparation zu schaffen, die in wiederholbarer und gezielter Weise eine Erzeugung der gewünschten Faktor-VIII-Inhibitor-Bypass-Aktivität gewährleistet. Die Fak-tor-VIII-Inhibitor-Bypass-Aktivität soll mit Hilfe eines geeigneten Testsystems messbar und standardisierbar sein. Die Präparation soll klinisch wirksam und verträglich sein, d.h. bei blutenden Faktor-VHI-Inhibitor-Patienten zu einer Blutstillung führen und keine unerwünschten Nebenwirkungen zeigen.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäss dadurch gelöst, dass menschliches, Zitrationen enthaltendes Plasma in Abwesenheit von freien Calciumionen mit wasserunlöslichen anorganischen gerinnungsphysiologisch-oberflächenaktiven Stoffen, wie Kieselgel oder Kaolin, behandelt wird, wobei die neue Substanz gebildet wird, anschliessend die wasserunlöslichen Stoffe abgeschieden werden und dann der Überstand mit basischen Ionenaustauschern, wie diäthylamino-äthylgruppenhaltigen hochmolekularen Stoffen, behandelt wird, wobei die Substanz FEIBA zusammen mit den Faktoren II-VII-IX-X daran adsorbiert wird, worauf diese eluiert und konzentriert werden. Die neue Substanz mit der FEIB-Aktivität ist ein Protein mit einem höheren Molekulargewicht als jenes der nichtaktivierten Faktoren II, VII, IX, X (Prothrombinkomplex).

Während letztere Faktoren ein Molekulargewicht von etwa 70 000 aufweisen, hat die neue blutgerinnungsfördern-de Substanz ein Molekulargewicht im Bereich von etwa 100 000, woraus sich ergibt, dass ihrer Bildung eine chemische Umsetzung zugrundeliegt. Die durch die Behandlung von Plasma mit wasserunlöslichen anorganischen gerin-nungsphysiologisch-oberflächenaktiven Stoffen entstandene Substanz mit FEIB-Aktivität stellt eine komplexe Form von Gerinnungsfaktoren dar, die im Ausgangsplasma nicht vorhanden war und die durch chemische Umsetzung von im Plasma vorhandenen Molekülen entstanden ist.

Als Ausgangsmaterial für die Herstellung der neuen Präparation wird menschliches Zitratplasma verwendet, welches alle Gerinnungsfaktoren in nativer Form enthält; ferner können auch Plasmafraktionen verwendet werden, die nach Abtrennung des Faktors VIII (AHF) anfallen, wie z.B. ein Plasmaüberstand von Kryopräcipitat oder von Präcipitat I nach Cohn.

Vorteilhaft erfolgt die Bildung der Substanz FEIBA unter Einhaltung eines pH-Bereichs von 5,5 bis 8,5 und einer Temperatur von 0 bis 30 °C.

Zweckmässig werden hierbei die wasserunlöslichen anorganischen gerinnungsphysiologisch-oberflächenaktiven Stoffe in einer Menge von 0,05 bis 5%, vorzugsweise 0,1 bis 1 %, bezogen auf die Menge des Plasmas, verwendet.

Zur Behandlung des Plasmas können Stoffe eingesetzt werden, die zum Grossteil aus feinteiligem Siliciumdioxyd bestehen, z.B. Stoffe aus der Gruppe der Diatomeenerden, wie Celit, oder Stoffe, die aus Siliciumdioxyd und Aluminiumdioxyd zusammengesetzt sind, z.B. Kaolin. Allgemein sind Stoffe geeignet, die als «oberflächenaktiv» im Gerinnungssystem bekannt sind bzw. die durch ihre Oberflächenaktivität in der Lage sind, die Kontaktphase der Blutgerinnung einzuleiten. Während die durch diese Stoffe oberflä-chenaktivierbaren Gerinnungsfaktoren (Faktoren XI und XII) in ihrer aktivierten Form in dieser Stufe adsorbiert werden, bleiben die Faktoren II, VII, IX, X zusammen mit der gebildeten Substanz FEIBA im Überstand und können nach Abtrennung der oberflächenaktiven, wasserunlöslichen Stof635 747

fe unter Anwendung bekannter Methoden abgetrennt bzw. angereichert werden. Für letzteren Schritt können z. B. schwach basische Ionenaustauscher verwendet werden; diäthylaminoäthyl(DEAE)gruppenhaltige, hochmolekulare Stoffe, z. B. DEAE gebunden an Cellulose oder quervernetzte Dextrane, haben sich besonders bewährt. Durch Adsorption an die erwähnten Ionenaustauscher, Waschung und Elution der adsorbierten Plasmaproteine mit erhöhter Ionenstärke kann die Proteinfraktion, welche die FEIB-Aktivität nun in gereinigter und angereicherter Form enthält, isoliert werden. Nach Entfernung der Salze durch Dialyse und anschliessende Gefriertrocknung erhält man die rohe, die FEIB-Aktivität enthaltende Fraktion in trockener, stabiler Form. Aus dieser entsteht das fertige Präparat z. B. durch Wiederauflösung in Wasser, Zusatz von Salzen, pH-Einstellung, Sterilfiltration und neuerliche Gefriertrocknung.

Untersuchungen über die Eigenschaften der erfindungsgemäss hergestellten Präparationen brachten den Beweis,

dass für die FEIB-Aktivität die Faktoren IIa (Thrombin) und Xa nichts beitragen. Thrombin in Spuren, wie es in der erfindungsgemäss hergestellten Präparation enthalten sein kann, ergibt keine Verkürzung der aktivierten partiellen Thromboplastinzeit von Faktor VHI-Inhibitorplasma. Auch Sojabohnen-Trypsininhibitor - ein bekannter Inhibitor von Faktor-Xa-Aktivität - hemmt die FEIB-Aktivität der Präparation nicht. Aufgrund von gelchromatographischen Untersuchungen hat sich ergeben, dass die neue Substanz ein höheres Molekulargewicht aufweist als die bekannten Faktoren des Prothrombinkomplexes II, VII, IX und X. Da ferner die aktivierten Faktoren des Prothrombinkomplexes durch enzymatische Abspaltung eines Bruchstückes des entsprechenden nativen (nichtaktivierten) Gerinnungsfaktors entstehen, somit kleinere Moleküle entstehen als die Moleküle der entsprechenden nichtaktivierten Faktoren, ist mit Sicherheit anzunehmen, dass die FEIB-Aktivität in den erfindungsgemäss hergestellten Präparationen nicht durch einen aktivierten Faktor des Prothrombinkomplexes bewirkt wird, sondern eben durch die neu gebildete Substanz mit höherem Molekulargewicht.

Zur Kennzeichnung der neuen Substanz kann einerseits das Verhältnis der Aktivitäten der Gerinnungsfaktoren II, VII, IX und X zur FEIB-Aktivität herangezogen werden: Dieses Verhältnis, ausgedrückt in Einheiten, liegt zwischen 0,1 und 10, vorzugsweise zwischen 0,5 und 2, wobei eine Einheit Faktor II-VII-IX-X der Aktivität dieser Faktoren entspricht, die durchschnittlich in 1 ml frischem menschlichem Zitratplasma enthalten ist, und eine FEIBA-Einheit als jene FEIB-Aktivität definiert ist, welche die aktivierte partielle Thromboplastinzeit eines hochtitrigen Faktors-Vlll-Inhibi-torplasmas auf die Hälfte des Leerwertes verkürzt. Anderseits kann zur Kennzeichnung der neuen Substanz auch ihre amidolytische Aktivität herangezogen werden. Unter amido-lytischer Aktivität versteht man die Fähigkeit einer Substanz, in standardisierten Peptidverbindungen, die über eine Amidbindung mit dem Chromophor p-Nitroanilin verbunden sind, das p-Nitroanilin abzuspalten, welches photometrisch bestimmt wird. Solche standardisierten Peptidpräpa-rate werden z.B. von der Firma KABI in Schweden hergestellt; so sind das Peptid S-2160 N-Benzoyl-L-phenylalanyl-L-valyl-L-arginin-p-nitroanilid • HCL (Kurzform: Bz-Phe-Val-Arg-p-nitroanilid • HCl) für Thrombin spezifisch, S-2222 N-Benzoyl-L-isoleucyl-L-glutamyl-L-glycyl-L-arginyl-p-nitroanilid • HCl (Kurzform: Bz-Ile-Glu-Gly-Arg-p-nitro-anilid • HCl) für Xa und S-2251 D-Valyl-L-leucyl-L-lysyl-p-nitroanilid • 2HC1 (Kurzform: D-Val-Leu-Lys-p-nitro-anilid • 2HC1) für Plasmin. Testet man die erfindungsgemäss hergestellte Präparation gegenüber den genannten Substraten, so findet man eine vernachlässigbare geringe amido-

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lytische Aktivität. Anderseits würde ein Test eines Präparates mit einem Gehalt von Thrombin und/oder Faktor Xa, wenn man diese auf die gleiche FEIB-Aktivität einstellt, die die erfindungsgemäss hergestellte Präparation zeigt, eine hohe amidolytische Aktivität zeigen.

Ein weiteres Merkmal der erfindungsgemässen Präparation ist auch darin zu sehen, dass sie, wenn überhaupt, nur eine geringe Thrombinaktivität besitzt. Das Verhältnis der Thrombinaktivität zur FEIB-Aktivität übersteigt 0,02 nicht, wobei die Thrombin-Aktivität in NIH-Einheiten (NIH = US-National Institute of Health) und die FEIB-Aktivität in FEIBA-Einheiten ausgedrückt ist.

Das erfindungsgemässe Verfahren und die Eigenschaften der danach hergestellten Präparationen sind in den folgenden Beispielen und Testergebnissen näher erläutert:

Beispiel 1

Frisch gefrorenes Plasma wird bei 0 bis +4 °C aufgetaut und das dabei anfallende Kryopräcipitat durch Zentrifugie-ren abgetrennt. Der Kryoüberstand wird mit 0,5 n Salzsäure auf pH 7,0 gestellt, mit 5 g Kaolin pro 1 Liter Kryoüberstand versetzt und bei +4°C 1 Stunde gerührt. Hierauf wird Kaolin durch Zentrifugieren abgetrennt. Die generierte Substanz FEIBA wird nun - zusammen mit den Faktoren des Prothrombinkomplexes - an DEAE-Sephadex adsorbiert.

Zu diesem Zwecke werden 0,5 g DEAE-Sephadex A-50 pro 11 Kaolinüberstand zugesetzt und eine halbe Stunde bei +4 °C gerührt. Das DEAE-Sephadex wird abgetrennt; das überstehende Plasma kann zur Gewinnung von Gamma-Globulin und Albumin verwendet werden; DEAE-Sephadex wird einem zweifachen Waschprozess mit einer Trinatrium-citrat-Natriumchlorid-Lösung unterworfen, wobei ein pH-Wert von 7,5 eingehalten wird.

Zur Elution wird das DEAE-Sephadex mit 3% Natriumchlorid, 0,1% Trinatriumcitrat • 2H20 (2% des ursprünglichen Plasmavolumens) 20 Minuten gerührt und durch Filtration das Eluat gewonnen. Dieses wird über Nacht gegen 0,05% Trinatriumcitrat • 2HzO, 0,1% Natriumchlorid-Lösung bei pH 7,0 bei +4 °C dialysiert, hierauf eingefroren und einem ersten Lyophilisationsvorgang unterworfen (bulk). Im bulk-Material wird die FEIB-Aktivität sowie die Aktivität der Faktoren des Prothrombinkomplexes bestimmt.

Für die Herstellung der pharmazeutisch anwendbaren Präparation mit FEIB-Aktivität soll das Verhältnis Einheiten Faktor II-VII-IX-X zu FEIBA-Einheiten zwischen 0,5 und 2 liegen; dies kann durch Mischung geeigneter bulk-Chargen erfolgen. Das bulk-Material wird mit destilliertem, pyrogenfreiem Wasser gelöst, so dass die FEIB-Aktivität zwischen 10 und 50 FEIBA-Einheiten pro ml beträgt (vor-liegendenfalls 25 FEIBA-Einheiten pro ml). Nach Zusatz der nötigen Salze zur Herstellung der Isotonie und Einstellung des pH zwischen 7,0 und 7,5 wird die Lösung durch Membranfilter geklärt und zuletzt durch ein 0,2 |xm Membranfilter sterilfiltriert. Die Lösung wird unter sterilen Bedingungen zu 20 ml in die Endbehälter verfüllt, tiefgefroren und lyophilisiert.

Beispiel 2

Als Ausgangsmaterial dient wieder frisch gefrorenes Plasma bzw. der daraus resultierende Kryoüberstand. Dem Kryoüberstand werden ohne pH-Stellung (nativer pH = 7,8) 10 g Celit 512 pro 1 Liter Kryoüberstand zugesetzt und 3 Stunden bei +4°C gerührt. Nach Abtrennung des Celits durch Zentrifugation wird die Aufarbeitung der Präparation mit der generierten Substanz FEIBA in gleicher Weise vorgenommen wie in Beispiel 1.

An den fertigen Präparationen wurden neben den üblichen Sicherheitstests auf Sterilität, Unschädlichkeit, Pyro-genfreiheit, Abwesenheit von HBS-Antigen Tests auf Wirksamkeit (FEIB-Aktivität), Gehalt an Prothrombinkomplex-Faktoren, Thrombingehalt sowie die amidolytische Aktivität mit den 3 Substraten S-2160, S-2222 und S-2251 durchgeführt.

Die vorgenommenen Tests wurden in nachfolgend beschriebener Weise durchgeführt:

1. Wirksamkeitstest (Bestimmung der FEIBA-Einheiten).

a) Reagenzien:

Faktor-VIII-Inhibitorplasma: Zitratplasma eines Patienten mit Hämophilie A mit einem Inhibitor gegen Faktor VIII (Inhibitortiter mindestens 10 Einheiten per ml), lyophilisiert. Während der Testperiode wird das Inhibitorplasma ins Eisbad gestellt.

Phospholipid-Kaolin-Suspension: Das Phospholipid-Konzentrat (Tachostyptan, Hormon Chemie München) wird 1:200 im Owrens Puffer verdünnt und mit 0,5% Kaolin G/V (0,5 g pro 100 ml) versetzt. Das Gemisch wird tiefgefroren gelagert. Während der Testperiode wird es bei Raumtemperatur gehalten. Zitrat-/Kochsalzlösung als Verdünnungsmittel für Proben:

0,7% Natriumchlorid/0,7%Natriumzitrat-2H20 m/20 Kalziumchlorid:

Während der Testperiode wird es bei 37 °C gehalten.

b) Testmethode:

Nach Auflösung der zu untersuchenden Fraktion FEIBA Probe und eines FEIBA-Standardpräparates mit definierten FEIBA-Einheiten pro ml in der angegebenen Menge destillierten Wassers, werden unter Verwendung von Zi-trat-/Kochsalzlösung 6 geometrische Verdünnungen hergestellt, wobei man mit 5 FEIBA-Einheiten pro ml beginnt. Diese Verdünnungen werden während der Testperiode in einem Eisbad gehalten. Die Reagenzien werden auf folgende Weise in Glasröhrchen pipettiert:

0,05 ml Faktor-VIII-Inhibitorplasma 0,05 ml Probe (Verdünnungen der Testproben und des Standards, sowie auch Zitrat-/Kochsalzlösung als Leerwert)

0,05 ml Phospholipid Kaolin Suspension 6 Minuten bei 37 °C inkubieren 0,05 ml m/20 Kalziumchlorid

Die Zeit von der Kalziumchloridzugabe bis zur Gerinselbildung wird mit einer Stoppuhr gemessen (Kippen der Teströhrchen oder Anwendung eines automatischen Ko-agulometers).

c) Berechnung der FEIBA-Einheiten pro Flasche: Es wird eine Eichkurve erstellt, indem man die Gerinnungszeiten (in Sekunden) der Verdünnungen des FEIBA-Standard-Präparates gegen die entsprechenden Konzentrationen (in FEIBA-Einheiten pro ml) auf doppelt logarithmisches Millimeterpapier aufträgt. Die FEIB-Aktivitäten der Testprobenverdünnungen werden unter Verwendung der Eichkurve und durch Multiplikation mit dem entsprechenden Verdünnungsfaktor errechnet. Der Mittelwert dieser Ergebnisse entspricht der FEIB-Aktivität der Testprobe, ausgedrückt in FEIBA-Einheiten pro ml. Multipliziert man diesen Wert mit dem Lösungsvolumen (in ml), dann erhält man die Gesamtmenge der FEIBA-Einheiten pro Flasche.

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2. Bestimmung der Aktivität der Gerinnungsfaktoren II, VII, IX und X.

A) Faktor-II-Bestimmung:

a) Reagenzien:

Serum: Blut eines gesunden Spenders (ohne Antikoagu-lans) wird 24 Stunden bei 37 C inkubiert. Vom geronnenen Blut wird das Serum entfernt, zentrifugiert, in Portionen aufgeteilt und tiefgefroren aufbewahrt. Rinderoxalatplasma mit Bariumsulfat absorbiert (als Quelle für Faktor V und als Verdünnungsmittel für Proben): Neun Teile Rinderblut werden mit einem Teil l,34%igen Natriumoxalat vermischt. Das sich ergebende Plasma wird mit 10% Bariumsulfat absorbiert. Nach der Zentrifugierung wird das absorbierte Plasma in Portionen abgefüllt und tiefgekühlt aufbewahrt.

«Thromborel» (kalziumhaltiges, menschliches Thrombo-plastin) Behringwerke AG, Marburg-Lahn.

b) Testmethode:

Die Reagenzien (sie werden mit Ausnahme von Thromborel während des Testvorganges in einem Eisbad aufbewahrt), werden auf folgende Weise in Glasröhrchen pipettiert:

0,05 ml Serum

0,05 ml Probe (Reihenverdünnung der zu testenden Probe bzw. eines «normalen Plasmas» oder eines Standards)

eine Minute bei 37 °C inkubieren 0,2 ml Thromborel (ist während des Testvorganges auf 37 °C zu halten)

Die Zeit ab der Zugabe von Thromborel bis zur Gerinnselbildung wird mit einer Stoppuhr gemessen.

c) Berechnung der Faktor-II-Konzentration:

Aus gepoolten Plasmaproben von mindestens 15 gesunden Spendern wird ein Standardplasma hergestellt. Dieses «Poolplasma» gilt als «normales Plasma» und seine Fak-tor-II-Aktivität wird mit 100% angenommen. Nun wird eine Eichkurve erstellt, indem man die Gerinnungszeiten der Plasmareihenverdünnungen dieses gepoolten Plasmas (unverdünnt, 1:2,1:4,1:8,...) gegen die entsprechenden Konzentrationen auf doppelt logarithmisches Millimeterpapier aufträgt. Die Faktor-II-Konzentrationen der Testprobenverdünnungen werden unter Verwendung der Eichkurve in Prozent des normalen Plasmas ausgedrückt und mit dem entsprechenden Verdünnungsfaktor multipliziert. Der Durchschnittswert dieser Ergebnisse entspricht der Aktivität des Testmaterials in Prozent des Faktors II. Die Menge des in einer Flasche vorhandenen Faktors II wird nach der folgenden Formel berechnet:

Einheiten (% Faktor-II-Konzentration) x (Volumen in ml) Faktor II ÏÔÔ

Eine Einheit Faktor II ist äquivalent zu jener Faktor-II-Aktivität, die durchschnittlich in 1 ml frischem Zitratplasma vorhanden ist.

B) Faktor-VII-Bestimmung:

a) Reagenzien:

Faktor-VII-Mangelplasma: Zitratplasma eines Patienten mit schwerem Faktor-VII-Mangel (Faktor VII unter 1 %), in tiefgefrorenem Zustand gelagert oder nach Zugabe von 1% Gewicht/Volumen HEPES lyophilisiert, mit einem pH-Wert von 7,0.

Zitrierte Kochsalzlösung als Verdünnungsmittel der Proben: 0,7% Trinatriumzitrat • 2H20, 0,7% Natriumchlorid.

«Thromborel» (kalziumhaltiges humanes Thrombopla-stin) der Behrling-Werke AG, Marburg Lahn.

b) Testmethode:

Das Mangelplasma und die Verdünnungen der Probe werden im Eisbad aufbewahrt. «Thromborel» wird während der Untersuchung bei 37 "C gelagert.

Die Reagenzien werden auf folgende Weise in Glasröhrchen pipettiert:

0,05 ml Faktor-VII-Mangelplasma 0,05 ml Probe (Reihenverdünnungen der zu testenden Probe, bzw. eines «normalen Plasmas» oder eines Standards)

Eine Minute inkubieren bei 37 °C 0,2 ml «Thromborel»

Die Zeit von der «Thromborel»-Zugabe bis zur Gerinnselbildung wird mit einer Stoppuhr gemessen.

c) Berechnung der Faktor-VII-Konzentration:

Die Berechnung der Faktor-VII-Konzentration erfolgt in gleicher Weise wie für Faktor II beschrieben.

C) Faktor-IX-Bestimmung:

a) Reagenzien:

Faktor-IX-Mangelplasma: Zitratplasma eines Patienten mit schwerer Hämophilie B (Faktor IX unter 1 %) in tiefgefrorenem Zustand gelagert.

Phospholipid/Kaolin-Suspension: Phospholipid-Konzen-trat (Tachostyptan, Hormon Chemie München) wird 1:200 in Owren's Puffer verdünnt, mit Kaolin versetzt (0,5 g per 100 ml) und tiefgekühlt gelagert. Rinderoxalatplasma, mit Bariumsulfat absorbiert, als Verdünnungsmittel für Proben: 9 Teile Rinderblut werden mit einem Teil l,34%igem Natriumoxalat vermischt. Das sich ergebende Plasma wird mit 10% Bariumsulfat absorbiert. Nach dem Zentrifugieren wird das absorbierte Plasma in Portionen abgefüllt und tiefgefroren aufbewahrt. m/20 Kalziumchlorid b) Testmethode:

Inkubation von Faktor-IX-Mangelplasma mit Phosphor-lipid/Kaolin-Suspension: Die erforderliche Menge von Mangelplasma wird mit einem gleichen Volumen von Phospholipid/Kaolin-Suspension vermischt, 5 Minuten bei 37 °C inkubiert und dann 30 Minuten in einem Eisbad gelagert.

Die Reagenzien (sie werden mit Ausnahme von Kalziumchlorid während des Testvorganges in einem Eisbad aufbewahrt), werden auf folgende Weise in Glasröhrchen pipettiert:

0,2 ml inkubierte Mangelplasma-Phospholipid/Kaolin-Suspension

0,1 ml Probe (Reihenverdünnungen der zu testenden Probe bzw. eines «normalen Plasmas» oder eines Standards) eine Minute bei 37 °C inkubieren

0,1 ml m/20 Kalziumchlorid (ist während des Testvorganges bei 37 C zu halten)

Die Zeit ab der Zugabe von Kalziumchlorid bis zur Gerinnselbildung wird mit einer Stoppuhr gemessen.

c) Berechnung der Faktor-IX-Konzentration:

Die Berechnung der Faktor-IX-Konzentration erfolgt in gleicher Weise wie für Faktor II beschrieben.

D) Faktor-X-Bestimmung:

a) Reagenzien:

Faktor-X-Mangelplasma: Zitratplasma von einem Patienten mit schwerem Faktor-X-Mangel (Faktor X unter 1 %) wird tiefgekühlt gelagert oder nach Hinzufügung von 1 % HEPES und Einstellen des pH-Wertes auf 7,0 lyophilisiert.

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Zitrat-Kochsalzlösung als Verdünnungsmittel für Proben: 0,7% Natriumchlorid/O,7% Natriumzitrat • 2H20 «Thromborel» (kalziumhaltiges, menschliches Thrombo-plastin), Behrling-Werke AG, Marburg/Lahn.

b) Testverfahren:

Die Reagenzien (sie werden mit Ausnahme von Thromborel während des Testvorganges in einem Eisbad aufbewahrt), werden auf folgende Weise in Glasröhrchen pipettiert:

0,05 ml Faktor-X-Mangelplasma 0,05 ml Probe (Reihenverdünnungen der zu testenden Probe bzw. des «normalen Plasmas» oder eines Standards)

eine Minute bei 37 °C inkubieren

0,2 ml Thromborel (ist während des Testvorganges auf

37 "C zu halten)

Die Zeit ab der Zugabe von Thromborel bis zur Gerinnselbildung wird mit einer Stoppuhr gemessen.

c) Berechnung einer Faktor-X-Konzentration:

Die Berechnung der Faktor-X-Konzentration erfolgt in gleicher Weise wie für Faktor II beschrieben.

3. Thrombintest.

a) Reagenzien:

1 %ige Fibrinogenlösung menschlichen Ursprungs standardisiertes Thrombin (Topostasin, Roche, 3000 NIH-Thrombin-Einheiten pro Flasche) 0,7% Natriumchlorid/0,7% Natriumzitrat • 2HzO als Verdünnungsmittel (Zitrat-/Kochsalzlösung).

b) Testmethode:

Nach Auflösung des lyophilisierten Produktes in der angegebenen Menge destillierten Wassers werden sechs geometrische Verdünnungen unter Verwendung von Zitrat-/ Kochsalzlösung und acht geometrische Verdünnungen vom standardisierten Thrombin hergestellt, wobei man mit 1 NIH-Einheit per ml beginnt.

Testverfahren:

0,2 ml l%ige Fibrinogenlösung und 0,2 ml Probe (Fraktion FEIBA- und Thrombinverdün-nungen, sowie auch ein Leerwert mit Zitrat-/Kochsalz-lösung) werden bei 37 °C inkubiert. Die Zeit bis zur Gerinnselbildung wird durch Kippen der Teströhrchen in immer grösser werdenden Zeitabständen, und zwar von 10 Minuten bis zu einer Stunde, gemessen. Dieser Vorgang erstreckt sich auf mindestens 6 Stunden. Ein letztes Kippen der Röhrchen erfolgt nach der Inkubation über Nacht. Der Leerwert (Verdünnungsmittel als Probe) muss über Nacht stabil bleiben (keine Gerinnselbildung).

c) Berechnung der Thrombin-Konzentration:

Es wird eine Eichkurve erstellt, indem man die Gerinnungszeiten der geometrischen Verdünnungen des Stan-dardthrombins gegen die entsprechende Konzentration (Thrombineinheiten pro ml) auf doppelt logarithmisches Millimeterpapier aufträgt. Die Thrombin-Konzentrationen der Testproben Verdünnungen werden unter Verwendung der Eichkurve und durch Multiplikation mit dem entsprechenden Verdünnungsfaktor errechnet. Der Mittelwert dieser Ergebnisse entspricht der Thrombin-Aktivität der Testprobe, ausgedrückt in Thrombineinheiten pro ml. Multipliziert man diesen Wert mit dem Lösungsvolumen in ml, so erhält man die Gesamtmenge der Thrombin-Einheiten pro Flasche.

4. Bestimmung der amidolytischen Aktivität.

a) Reagenzien:

Chromogene Substrate:

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S-2160: N-Benzoyl-L-phenylalanyl-L-valyl-L-arginin-p-nitroanilid • HCl (Kurzform: Bz-Phe-Val-Arg-p-nitro-anilid • HCl) 0,5 mg/ml H20 = 0,73 m molar S-2222: N-Benzoyl-L-isoleucyl-L-glutamyl-L-glycyl-L-ar-ginyl-p-nitroanilid • HCl (Kurzform: Bz-Ile-Glu-Gly-Arg-p-nitroanilid • HCl) 1,4 mg/ml H20 = 1,91 m molar S-2251: D-Valyl-L-leucyl-L-lysyl-p-nitroanilid • 2HC1 (Kurzform: D-Val-Leu-Lys-p-nitroanilid • 2HC1) 1,65 mg/ml H20 = 2,99 m molar Puffer:

6,06 g «Tris» (Tris(hydroxymethyl)-aminomethan) = 0,05 molar

10,6 g Natriumchlorid = 0,18 molar Mit 1 Liter dest. Wasser lösen. Der pH-Wert wird mit konzentrierter Salzsäure auf 7,4 eingestellt.

b) Testvèrfahren:

I,0 ml Puffer

0,1 ml Testprobe (Präparation enthaltend FEIBA) 0,2 ml Substrat (S-2160 bzw. S-2222 bzw. S-2251)

Dieses Gemisch wird in eine auf 37 °C temperierbare Kü-vette (Schichtdicke 1 cm) gefüllt und in einem Photometer bei 405 nm die Zunahme der optischen Dichte in Zeit-intervallen von 1 Minute gemessen.

c) Auswertung:

Aus mindestens 5 Einzelmessungen wird die durchschnittliche Zunahme der optischen Dichte pro Minute berechnet und mit 1000 multipliziert; dieser Wert wird mit AOD • 103/min bezeichnet und dient zur Charakterisierung der amidolytischen Aktivität (Enzymaktivität) der untersuchten Probe in bezug auf das jeweils eingesetzte Substrat.

Dividiert man nun die gemessenen AOD • 103/min-Werte durch die Aktivität der Testprobe in FEIBA-Einheiten pro 0,1 ml (eingesetzte Probenmenge) bzw. in Faktor II, VII, IX, X-Einheiten pro 0,1 ml, so ergibt sich eine für die jeweilige Testprobe - unter den erwähnten Testbedingungen - charakteristische «spezifische amidolytische Aktivität», d.h. der auf 1 Einheit FEIBA bzw. 1 Einheit Faktor

II, VII, IX, X bezogene AOD • 103/min-Wert.

Die nach den Beispielen 1 und 2 hergestellten Präparationen zeigten bei den in der beschriebenen Weise durchgeführten Tests die in der Tabelle angegebenen Eigenschaften.

Tabelle

Beispiel 1 Beispiel 2

so

Abfüll- bzw. Auflösungsvolumen 20 ml FEIBA-Einheiten pro Flasche Faktor-II-Einheiten pro Flasche

Faktor-VII-Einheiten pro Flasche Faktor-IX-Einheiten pro Flasche Faktor-X-Einheiten pro Flasche

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1,4(0,003) 1,0(0,004)

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2,5(1,79)

2(1,43)

Die Zahlen in Klammer geben das jeweilige Verhältnis zu den FEIBA-Einheiten an. Bei den amidolytischen Aktivitäten ist die Zahl in Klammer die «spezifische amidolytische Aktivität», d.h. der jeweilige AOD • 103/min-Wert pro eine im beschriebenen Testsystem eingesetzte FEIBA-Einheit.

s

Claims (10)

635 747

1. Verfahren zur Herstellung einer blutgerinnungsför-dernden Präparation aus menschlichem Blutplasma, welche eine neue blutgerinnungswirksame Substanz, genannt «FEI-BA», enthält, dadurch gekennzeichnet, dass menschliches, Zitrationen enthaltendes Plasma in Abwesenheit von freien Calciumionen mit wasserunlöslichen anorganischen gerinnungsphysiologisch-oberflächenaktiven Stoffen behandelt wird, wobei die neue Substanz gebildet wird, anschliessend die wasserunlöslichen Stoffe abgeschieden werden und dann der Überstand mit basischen Ionenaustauschern behandelt wird, wobei die Substanz FEIBA zusammen mit den Faktoren II-VII-IX-X daran adsorbiert wird, worauf diese eluiert und konzentriert werden.

2. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekenn-. zeichnet, dass die Bildung der Substanz FEIBA unter Einhaltung eines pH-Bereiches von 5,5 bis 8,5 und einer Temperatur von 0 bis 30 °C erfolgt.

2

PATENTANSPRÜCHE

3. Verfahren nach Patentanspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die wasserunlöslichen anorganischen gerinnungsphysiologisch-oberflächenaktiven Stoffe in einer Menge von 0,05 bis 5%, vorzugsweise 0,1 bis 1 %, bezogen auf die Menge des Plasmas, verwendet werden.

4. Verfahren nach einem der Patentansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die anorganischen, gerinnungsphysiologisch-oberflächenaktiven Stoffe Kieselgel oder Kaolin sind.

5. Verfahren nach einem der Patentansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die basischen Ionenaustauscher diäthylaminoäthylgruppenhaltige hochmolekulare Stoffe sind.

6. Verfahren nach einem der Patentansprüche 1 bis 5 zur Herstellung einer Präparation, in welcher das Verhältnis der Aktivitäten der Gerinnungsfaktoren II-VII-IX-X zur FEIB-Aktivität, ausgedrückt in Einheiten zwischen 0,1 und s 10 liegt, wobei eine Einheit Faktor II-VII-IX-X der Aktivität dieser Faktoren entspricht, die durchschnittlich in 1 ml frischem menschlichem Zitratplasma enthalten ist und eine FEIBA-Einheit als jene FEIB-Aktivität, welche die aktivierte partielle Thromboplastinzeit eines hochtitrigen Faktor-

io VII-Inhibitorplasmas auf die Hälfte des Leerwertes verkürzt, definiert ist.

7. Verfahren nach einem der Patentansprüche 1 bis 5 zur Herstellung einer Präparation, in welcher die spezifische amidolytische Aktivität bezüglich der Substrate N-Benzoyl-

i5 L-phenylalanyl-L-valyl-L-arginin-p-nitroanilid • HCl, N-Benzoyl-L-isoleucyl-L-glutamyl-L-glycyl-L-arginyl-p-nitro-anilid • HCL, D-Valyl-L-leucyl-L-lysyl-p-nitroanilid • 2HC1, d.h. dieAOD • 103/Min.-Werte pro 1 FEIBA-Einheit nicht grösser als 4, vorzugsweise kleiner als 3, sind und die

20 AOD • 103/Min.-Werte pro 1 Einheit Faktor II, VII, IX, X nicht grösser als 3, vorzugsweise kleiner als 2 sind.

8. Verfahren nach einem der Patentansprüche 1 bis 5 zur Herstellung einer Präparation, in welcher das Verhältnis von Thrombinaktivität zu FEIB-Aktivität 0,02 nicht übersteigt,

25 wobei die Thrombinaktivität in NIH-Einheiten und die FEIB-Aktivität in FEIBA-Einheiten ausgedrückt ist.

9. Verfahren nach einem der Patentansprüche 1 bis 5 zur Herstellung einer Präparation, in welcher das Verhältnis der Aktivitäten der Gerinnungsfaktoren II-VII-IX-X zur

30 FEIB-Aktivität zwischen 0,5 und 2 Einheiten liegt.

10. Präparation, hergestellt nach einem der Patentansprüche 1 bis 9.