DE2724081A1

DE2724081A1 - Immobilisierte, nicht-spezifische proteasen und verfahren zu deren herstellung

Info

Publication number: DE2724081A1
Application number: DE19772724081
Authority: DE
Inventors: Hideo Hirohara; Shigeyasu Nabeshima; Tsuneyuki Nagase
Original assignee: Sumitomo Chemical Co Ltd
Current assignee: Sumitomo Chemical Co Ltd
Priority date: 1976-05-31
Filing date: 1977-05-27
Publication date: 1977-12-22
Also published as: US4146432A; FR2353563B1; NL7705966A; GB1536822A; FR2353563A1

Description

BLUMBACH · WESER · BER31ZN · KRAMER ZWIRNER . HIRSCH · BREHM

PATENTANWÄLTE IN MÜNCHEN UND WIESBADEN 2 ' 2 Ä O 8 1

Patenlconsult RadeckestraBe 43 8000 München AO Telelon (089) 883603/885404 Telex 05-212313 Telegramme Palenlconsull Patentconsull Sonnenberger Straße 43 6200 Wiesbaden Telelon (06121) 562943/561998 Telex 04-186237 Telegramme Palenlconsult

Beschreibung:

Diese Erfindung betrifft die Immobilisierung von Proteasen, welche von Bakterien erzeugt worden sind, die zur Gattung der Streptomyces gehören. Insbesondere betrifft diese Erfindung eine wasserunlösliche, enzymatisch aktive, immobilisierte Proteasenzusammensetzung, die nicht-spezifische Proteasen enthält mit Esterase-Aktivitäten und Amidase-Aktivitäten, welche von Bakterien erzeugt worden sind, die zur Gattung der Streptomyces gehören; diese Proteasen sind entweder an einem anionenaustauschenden Polysaccharid mit einer gesamten anionenaustauschenden Kapazität von nicht weniger als 0,5 meq/g (meq steht für milli-Äquivalent) immobilisiert, oder diese Proteasen sind an einem wasserunlöslichen, makroporösen, hochporösen oder makro-retikulierten, anionenaustauschenden Kunstharz immobilisiert, das eine spezifische Oberfläche von nicht weniger als 1 m /g und eine gesamte anionenaustauschende Kapazität von nicht weniger als 0,5 meq/g aufweist. Weiterhin ist die Erfindung auf ein Verfahren zur Herstellung dieser immobilisierten Proteasen gerichtet.

München: R. Kramer Dipl. Ing. . W. Weser Dipl.-Phys. Dr rer. nat. · P. Hirsch Dipl.-Ing. . H.P. Brehm Oipl.-Chem. Dr. phil. nat. Wiesbaden: P. G. Blumbach Dipl.-Ing. · P. Bergen Dipl Ing. Dr. jur. · G. Zwirner Dipl.-Ing. Dipl.-W-Ing.

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ORIGINAL INÖPECltD

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Für Enzyme ist üblicherweise bekannt, daß diese Substratepezifität aufweisen; das bedeutet, die Enzyme zeigen ihre katalytische Wirkung auf spezifischen Substraten, die jeweils für entsprechende Enzyme unterschiedlich sind. Für solche Bakterien, die zur Gattung der Streptomyces gehören, wie zum Beispiel Streptomyces griseus, Streptomyces fradiae, Streptomyces erythreus, Streptomyces rimosus und Streptomyces flavovirens ist bekannt, daß diese eine breite Subetratspezifität aufweisen; diese Bakterien erzeugen sogenannte "nicht-spezifische Proteasen". Diese breite Spezifität beruht auf der Tatsache, daß die zur Gattung der Streptomyces gehörenden Bakterien gleichzeitig verschiedene Arten von Endoproteasen und verschiedene Arten von Exoproteasen erzeugen, welche in ihren physikalischen und chemischen Eigenschaften relativ ähnlich zueinander sind. Zum Beispiel enthalten die aus Streptomyces griseus, Streptomyces fradiae und Streptomyces erythreus erhaltenen Proteasen sowohl Endoproteasen mit einer Substratspezifität wie etwa der Art von Trypsin-ähnlicher Aktivität, der Art von Chymotrypsin-ähnlicher Aktivität und der Art von Elastaseähnlicher Aktivität, wie Exoproteasen mit einer Substratspezifität, wie etwa der Art von Carboxypeptidase-ähnlicher Aktivität und der Art von Aminopeptidase-ähnlicher Aktivität. Kit diesen Bezeichnungen sollen im Rahmen dieser Unterlagen bezeichnet werden:

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Proteasen der Art von Trypsin-ähnlicher Aktivität zeigen Spezifität auf cationische Aminosäure-Reste wie etwa Lysin oder Arginin;

Proteasen der Art von Chymotrypsin-ähnlicher Aktivität zeigen Spezifität auf große hydrophobe Aminosäure-Reste, wie etwa Tryptophan-, Tyrosin oder Phenylalanin; und

Proteasen der Art von Elastase-ähnlicher Aktivität zeigen ßpezifität auf kleine Aminosäure-Reste, wie etwa Glycin oder Alanin.

Das bedeutet, die nicht-spezifischen Proteasen, welche von den zur Gattung der Streptomyces gehörenden Bakterien erzeugt werden, können auf verschiedene Substrate einwirken und sind deshalb von großer praktischer Bedeutung. Weiterhin zeigen diese Proteasen potente Esterase- und Amidase-Aktivitäten nicht nur gegenüber Estern oder Amiden von Aminosäuren, sondern gewöhnlich auch gegenüber Estern oder Amiden von Carbonsäuren. Um diesen Sachverhalt deutlicher auszudrücken, die katalytische Wirkung dieser Proteasen ist gekennzeichnet durch eine vorteilhafte ausgewählte Reaktivität eines Enzyme, so daß sie vorzugsweise auf L-Isomere einwirken, wobei lediglich geringe oder gar keine Reaktion mit den D-Isomeren erfolgt, Aus diesem Grunde wird von den nicht-spezifischen Prote-

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äsen, welche von den zur Gattung der Streptomyces gehörenden Bakterien erzeugt werden, erwartet, daß sie bei der optischen Spaltung von Estern oder Amiden von Aminosäuren oder Carbonsäuren wirksam sind, welche asymmetrische Kohlenstoffatome aufweisen, oder daß diese Proteasen wirksam sind bei der Einführung von Chiralität in prochirale Moleküle. Darüberhinaus sind die aus Streptomyces erhaltenen Proteasen in vieler Hinsicht von praktischem Vorteil, da sie billiger, einfacher und in größerem Umfang erzeugt werden können, als die von Tieren erzeugten Proteasen.

Man kann enzymatische Reaktionen dadurch durchfuhren, daß man das Enzym in Wasser gibt und dort auf ein Substrat in einer wässrigen Lösung einwirken läßt. In einer solchen wässrigen Lösung stellt die Enzymreaktion eine homogene Reaktion dar, was sich als großes Hindernis für die Durchführung einer kontinuierlichen Reaktion im industriellen Maßstab erweist; weiterhin ist es unter diesen Bedingungen sehr schwierig, die aktiven Enzyme nach der Reaktion abzutrennen, um sie wiederum für einen erneuten Einsatz zu verwenden. Darüberhinaus sind komplizierte, aufwendige Verfahrensschritte erforderlich, um das Reaktionsprodukt, das im Gemisch mit den Enzymen vorliegt, abzutrennen und zu reinigen. Im Hinblick darauf wäre es für die Bedürfnisse der Praxis sehr wertvoll, die nicht-spezifischen Proteasen zu immobilisieren, um sie wasserunlöslich zu machen.

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ORIGINAL INSPECTED

Bislang sind verschiedene Verfahren bekannt geworden, um Enzyme zu immobilisieren (vergl. beispielsweise O.K. Zaborsky in "Immobilized Enzymes", CR.C. Press, 1973» oder "Immobilized Enzymes" von Ichiro Chihata, Kodansha, 1975). Diese bekannten Verfahren können roh in die nachfolgenden vier Gruppen eingeteilt werden:

(1) Verfahren zur physikalischen oder ionischen Adsorption;

(2) Verfahren zur covalenten Bindung bzw. Anbringung der Enzyme an ein Trägermaterial;

(3) das Einschließen der Enzyme in ein Trägermaterial; und

(4) die Vernetzung der Enzyme mit einem Trägermaterial.

Jedes dieser Verfahren weist sowohl Vorteile wie Nachteile auf, und es ist schwierig zu entscheiden, welches dieser Verfahren das beste darstellt. Für die Bedürfnisse der Praxis erweisen sich jedoch diejenigen Verfahren als vorteilhafter, bei welchen der Immobilisierungsschritt einfach durchzuführen ist. Im Hinblick darauf stellt das Adsorptionsverfahren ein höchst vorteilhaftes Verfahren dar.

Von Mitz und Schieuter ist im Jahre 1959 beschrieben worden,

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ORIGINAL INSPECTED

daß sich Trypsin und Chymotrypsin an Carboxymethylcellulose, Cellulosecitrat und Cellulosephosphat adsorbieren lassen; hierbei war jedoch der Anteil an adsorbierten Proteinen sehr klein und deren Aktivitäten waren außerordentlich stark abgesenkt (vergl. Journal of the American Chemical Society, 81« 4024 (1959))· Später sind verschiedene Versuche unternommen worden, um diese proteolytischen Enzyme an Siliziumdioxid-Aluminiumoxid, oder gelartigen ionenaustauschenden Kunstharzen zu immobilisieren; auch hierbei war der Anteil an adsorbiertem Enzym sehr gering, und die Aktivität des immobilisierten Enzyms war sehr niedrig. Bei einem weiteren Versuch zur Immobilisierung roher Proteasen an Trägern mittels Adsorption sind Proteasen, die aus der Niere und Milz von Rindern isoliert wurden, an Diäthylaminoäthyl-Cellulose adsorbiert worden. Die erhaltenen rohen Proteasen wiesen jedoch außerordentlich geringe Aktivität auf.

Im Rahmen dieser Erfindung ist bei Untersuchungen zur Immobilisierung von Proteasen die von zur Gattung der Streptomyces gehörenden Bakterien erzeugt worden sind, nunmehr festgestellt worden, daß eine rohe Enzymlösung, welche geringe spezifische Aktivität aufweist und die unmittelbar mittels Filtration von den Zellen aus einer Kulturbrühe abgetrennt worden ist oder danach lediglich einer vorläufigen Reinigung wie etwa der Ausfällung aus einem organischen Lösungsmittel unterzogen worden ist, mit einem anionenaustauschenden Polysaccharid vermischt werden kann,

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welches eine gesamte anionenaustauschende Kapazität von nicht weniger als 0,5 meq/g (meq steht für milli-Äquivalent) aufweist; oder diese rohe Enzymlösung kann mit einem makroporösen, hochporösen oder makro-retikulierten, anionenaustauschenden Kunstharz vermischt werden, welches eine gesamte anionenaustauschende Kapazität von nicht weniger als 0,5 meq/g und eine spezifische Oberfläche von nicht weniger

als 1 m /g vermischt werden; hierbei werden die Enzyme durch Adsorption leicht immobilisiert; dabei wird das rohe Enzym durch das Immobilisierungsverfahren teilweise gereinigt; weiterhin ist festgestellt worden, daß die Esterase-Aktivitäten von der Art der Trypsin-ähnlichen Aktivität, von der Art der Chymotrypsin-ähnlichen Aktivität und von der Art der Elastase-ähnlichen Aktivität, sowie die Aminopeptidase-Aktivität dieser immobilisierten Enzyme überraschenderweise um das zwei- bis mehrfache erhöht worden ist; schließlich ist noch festgestellt worden, daß in einigen Fällen, durch das Immobilisierungsverfahren eine Aktivität auftreten kann, die an den rohen Enzymen überhaupt nicht festzustellen war.

Diese durch das Immobilisierungsverfahren bewirkte Zunahme der Aktivität ist für Proteasen tierischen Ursprungs, wie etwa die Proteasen aus Rinderniere und Rindermilz völlig unbekannt. Das bedeutet, dieses Verfahren ist praktisch von großem Wert als Reinigungs-Immobilisierungs-Verfahren für rohe Enzyme. Selbst wenn die rohen Enzyme mittels Aus-

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salzen, mittels Gel-Chromatographie oder mittels Ionenaustausch-Chromatographie gereinigt worden sind, weisen diejenigen Proteasen, die von zur Gattung der Streptomyces gehörenden Bakterien erzeugt worden sind, die Eigenschaften eines Proteasengemiscb.es auf. Bei diesen teilweise gereinigten oder hochgereinigten Proteasen wird die Aktivität durch das Immobilisierungsverfahren nicht verstärkt. Es ist jedoch weiterhin festgestellt worden, daß dann, wenn als Träger für die Adsorptions-Immobilisierung der gereinigten Proteasen ein anionenaustauschendes Kunstharz verwendet wird, das eine gesamte anionenaustauschende Kapazität von nicht weniger als 0,5 meq/g und eine spezifische Oberfläche von nicht weniger als 1 m /g aufweist, die Proteasen mittels Adsorption in einem besonders großen Ausmaß immobilisiert werden; weiterhin ist festgestellt worden, daß die immobilisierten, unlöslichen Enzyme beständig sind und lediglich geringe Ablösung bzw. geringe Verminderung ihrer Aktivität zeigen, wenn in einem gewissen Umfang auf die Ionenstärke des Reaktionsgemisches geachtet wird. Im Ergebnis ist damit dargelegt worden, daß das Verfahren der vorliegenden Erfindung auch für die Immobilisierung von gereinigten Proteasen besonders vorteilhaft ist, welche von den zur Gattung der Streptomyces gehörenden Bakterien erzeugt worden sind.

Sie wesentliche Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, eine wasserunlösliche, enzymatisch aktive Enzym-

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zusammensetzung bereitzustellen, wobei nicht-spezifische Proteasen mit Esterase-Aktivitäten und Amidase-Aktivitäten, welche von den zur Gattung der Streptomyces gehörenden Bakterien erzeugt worden sind, an einem anionenaustauschenden Polysaccharid mit einer gesamten anionenaustauschenden Kapazität von nicht weniger als 0,5 meq/g adsorbiert werden; oder diese Proteasen werden an einem makroporösen, hochporösen oder makro-retikulierten, anionenaustauschenden Kunstharz adsorbiert, das eine spezifische Oberfläche von nicht weniger als 1 m /g und eine gesamte anionenaustauschende Kapazität von nicht weniger als 0,5 meq/g aufweist.

Weiterhin soll mit dieser Erfindung ein Verfahren angegeben werden, um die obengenannten rohen Proteasen gleichzeitig mit der Reinigung zu immobilisieren, wobei die genannten Proteasen mit dem genannten Anionen-Austauscher auf PoIysaccharidbasis oder den genannten anionenaustauschenden Kunstharzen behandelt werden.

Zu den im Rahmen dieser Erfindung brauchbaren anionenaustauschenden Polysacchariden gehören: anionenaustauschende Cellulosen wie etwa Diäthylaminoäthyl-Cellulose (DEAE-Cellulose), Triäthylaminoäthyl-Cellulose (TEAE-Cellulose), Guanidoäthyl-Cellulose (GE-Cellulose) und ähnliche Cellulosen; weiterhin gehören hierzu vernetzte Dextrane, die unter der Handelsbezeichnung "Sephadex" bekannt sind, nämlich anionenaustauschendes Sephadex wie etwa Diäthylamino-

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äthyl-Sephadex (DEAE-Sephadex), Diäthyl-2-hydroxylpropylaminoäthyl-Sephadex (QAE-Sephadex) und ähnliche vernetzte Dextrane. Unter diesen Materialien werden DEAE-Sephadex und QAE-Sephadex besonders bevorzugt.

Als ein anionenaustauschendes Kunstharz mit einer spezifischen Oberfläche von nicht weniger als 1 m /g und einer gesamten anionenaustauschenden Kapazität von nicht weniger als 0,5 meq/g, welche im Rahmen dieser Erfindung als Träger bei der Immobilisierung dienen, können unter anderem solche ionenaustauschenden Kunstharze oder adsorbierenden Kunstharze verwendet werden, die unter den Handelsbezeichnungen "Amberlite", "Dowex¹¹, "Duorite" und "Diaion" bekannt sind, soweit diese Kunstharze anionenaustauschende Gruppen aufweisen, handelsüblich zugänglich sind, eine makroporöse, hochporöse oder makro-retikulierte Struktur aufweisen mit einer hohen spezifischen Oberfläche und hoher Porosität; häufig werden diese Kunstharze auch als Kunstharz vom "MR-Typ"(für makro-retikular), vom MP-Typ" (für makroporös), vom "Makronetzwerk-Struktur-Typ" oder vom "hochposösen Typ" bezeichnet. Die anionenaustauschenden Kunstharze können alternativ mittels verschiedener geläufiger Verfahren hergestellt werden. Zum Beispiel kann ein makroporöses Kunstharz dadurch erhalten werden, daß man in dem Polymerisationssystem zur Copolymerisation von Styrol mit einem geeigneten Divenylbenzol zusätzlich eine gegenüber der Polymerisation inerte Verbindung vorsieht,

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mittels dieser Polymerisationsreaktion eine ionenaustauschende Kunstharz-Matrix herstellt, und nach der Polymerisation diese inerte Verbindung mittels einem Lösungsmittel aus dem erhaltenen Kunstharz extrahiert. Die erhaltene Kunstharz-Matrix wird anschließend chlormethyliert, daraufhin mittels einem üblichen Verfahren aminiert, wobei schließlich ein makroporöses Kunstharz mit anionenaustaußchenden Gruppen erhalten werden kann.

Die wasserunlösliche, enzymatisch aktive Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung kann dadurch erhalten werden, daß die Ionenaustauscher zuerst nach einem üblichen Verfahren mit einer wässrigen Salzsäure-Lösung (0,01 bis 3 molar, vorzugsweise 0,05 his 1 molar) oder mit einer wässrigen Natriumhydroxid-Lösung (0,01 bis 3 molar, vorzugsweise 0,05 his 1 molar) behandelt werden, um die ionenaustauschenden Gruppen zu aktivieren; weiterhin ist es auch möglich, die Kunstharze mittels einer geeigneten Puffer-Lösung (0,01 bis 3 molar, vorzugsweise 0,05 his 1 molar) auf einen pH-Wert von 5»5 his 8,5 zu puffern; hierzu können beispielsweise auf einen pH-Wert im Bereich von 5»5 his 8,5 eingestellte Phosphat-Pufferlösungen oder Borat-Pufferlösungen verwendet werden; anschließend wird der auf diese Weise behandelte Anionenaustauscher für eine ausreichende Zeitspanne in eine gepufferte Enzymlösung eingebracht; im Anschluß daran kann gerührt werden, sofern dies angestrebt wird; schließlich wird der Anionenaustau-

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scher wieder aus der Enzymlösung herausgenommen, filtriert und gewaschen. Die Immobilisierung durch Adsorption wird bei einer Temperatur von 40 C oder darunter durchgeführt; vorzugsweise bei einer Temperatur um ungefähr 4° C. Die für die Adsorption erforderliche Zeitspanne beträgt zwei Stunden oder mehr. Die auf diese Weise erhaltenen wasserunlöslichen Proteasen weisen hohe Esterase-Aktivitäten, hohe Amidase-Aktivitäten und hohe Peptidese-Aktivitäten auf; weiterhin sind diese wasserunlöslichen Proteasen beständig, sofern sie nicht mit einer Salzlösung gewaschen worden sind, welche hohe Ionenstärke aufweist. Sofern es angestrebt wird, können diese wasserunlöslichen Proteasen getrocknet werden, etwa mittels Lyophilisierung, so daß sie in einer geeigneten Form für den Transport vorliegen und über eine lange Zeitspanne aufbewahrt werden können.

Die genannten Enzyme können maximal in einem Anteil von 400 mg Enzym auf 1 g Anionenaustauscher adsorbiert werden, was von der Art der eingesetzten Anionenaustauscher, sowie deren spezifischer Oberfläche und Porosität abhängt.

Sie nachfolgenden Beispiele dienen lediglich zur Erläuterung der Erfindung ohne diese einzuschränken.

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Beispiel 1:

1,0 g DEAE-Sephadex A-25 (Ionenaustausch-Kapazität 3,5 meq/g) wurde zur Aktivierung mit 0,1 η Natriumhydroxid-Lösung behandelt und daraufhin wiederholt mit Wasser gut ausgewaschen. Daneben wurden 4 0 mg rohe Protease, die von zur Gattung der Streptomyces gehörenden Bakterien erzeugt worden war (mit einer Aktivität von 12,0 μ Mol/mg'Std. gegenüber N-Benzoyl-L-alginin-äthylester (BAEE) unter Umsatzbedingungen bei einem pH-Wert von 8,0 und einer Temperatur von 30⁰C) in 20 ml Tris-Salzsäure-Pufferlösung (pH-Wert 8,0 1=0,1) gelöst. In diese Lösung wurden 1,0 g des vorher aktivierten DEAE-Sephadex A-25 eingegeben und fortgesetzt langsam 6 Stunden lang bei 4⁰C gerührt. Nach der Saugfiltration über eine Glasfilternutsche wurde der Anionenaustauscher mit adsorbiertem Enzym gut mit reinem Wasser, sowie mit Tris-Salzsäure-Pufferlösung (pH-Wert 8,0, Ionenstärke 0,1) gewaschen. Der Anteil an adsorbierten Enzymen wurde mittels dem Absorptionsvermögen des Ultraviolett-Absorptionsspektrum des Filtrates bestimmt; hierbei ergab sich eine absorbierte Enzymmenge von 26 mg. Weiterhin wurde ein Prozentanteil der Immobilisierung von 90% festgestellt; die Aktivität des immobilisierten Enzyms gegenüber BAEE (bei der Bestimmung unter den gleichen Bedingungen, wie bei der Messung der Aktivität vor der Immobilisierung) betrug 63 uMol/mg*Std. Die Aktivität dieses immobilisierten Enzyms wurde nach einem absatzweise arbeitenden Verfahren mit einem

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stabilisierten pH-Wert bei pH 8,0 und bei 30⁰C einmal pro Tag bestimmt. Nach Ablauf von 14 Tagen wurde immer noch eine Aktivität von 60 jiMol/mg-Std. festgestellt.

Beispiel 2:

Im wesentlichen wurden die Untersuchungen analog zu Beispiel 1 durchgeführt; abweichend davon wurde an Stelle von DEAE-Sephadex nunmehr Amberlite IRA-93 (Ionenaustausch-Kapazität 4,6 meq/g) benutzt, der pH-Wert auf 8,0 eingestellt, die Immobilisierung für eine Zeitspanne von 7»2 Stunden durchgeführt und darüberhinaus die oben angegebenen Vereuchsbedingungen eingehalten und die Messungen analog durchgeführt. Hierbei ergab sich ein Anteil an immobilisiertem Enzym von 34 mg; die Aktivität des Enzyms in einer Lösung vor der Immobilisierung betrug 6,5 uMol/mg»Std. gegenüber BAEE bei einem pH-Wert von 7,2; nach der Immobilisierung wurde eine Aktivität von 32 uMol/mg*Std. gemessen.

Beispiel 3:

2,0 g DEAE-Sephadex A-25 wurden mit 0,1 η Natriumhydroxid-Lösung aktiviert; anschließend wurde der aktivierte Ionenaustauscher zu 200 mg roher Protease gegeben, die von Streptomyces fradiae erzeugt worden war (Aktivität gegenüber BAEE: 6,3 uMol/mg-Std. bei einem pH-Wert von 7»2 und

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bei einer Temperatur von 30 C); das Gemisch wurde langsam bei 4° C über Nacht gerührt, um die Adsorption durchzuführen. Anschließend wurde die adsorbierte Enzymmenge durch Messung des Ultraviolett-Absorptionsvermögen der abgetrennten Flüssigkeit bestimmt; hierbei ergab sich ein Anteil von 128 mg adsorbiertem Enzym. Durch die ImmObilisierung wurde die Aktivität gegenüber BAEE auf 36 uMol/ mg'Std. erhöht; d.h. durch die Immobilisierung wurde eine Erhöhung der Aktivität um 570 % erzielt. Die Aktivität gegenüber einem amidartigen, spezifischen Substrat wie N-Benzoyl-DL-alginin-p-nitroanilid wurde durch die Immobilisierung ebenfalls um 610 % erhöht.

5 ml dieser immobilisierten Protease wurden in eine Säule (Durchmesser 7 mm, Länge 150 mm, mit einer äußeren Umkleidung zur Thermostatisierung) gepackt, und eine 0,05 molare BAEE-Lösung (auf einen pH-Wert von 7»0 eingestellt) mit einer Geschwindigkeit von SV=2,0 vom oberen Ende her durch die Säule geführt; hierbei wurde die Säulentemperatur bei 30°C gehalten. Durch quantitative Analyse mittels dem Hydroxylamin-Verfahren wurde der Anteil an unverändertem Ester in der durchgesetzten Lösung bestimmt; hierbei wurde festgestellt, daß 98 % des Esters hydrolysiert worden waren. Diese Reaktion wurde kontinuierlich über 12 Tage, jeweils eine Stunde pro Tag, durchgeführt; hierbei verminderte sich die Aktivität des immobilisierten Enzyms lediglich um 11 %.

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Beispiel 4:

1,0 g QAE-Sephadex (Ionenaustausch-Kapazität 3*0 meq/g) wurden mit 0,2 molarer Phosphat-Pufferlösung (pH-Uert 7,2) gepuffert; diesem Gemisch wurden 80 mg rohe, nicht-spezifische Protease zugesetzt, welche von zur Gattung der Streptomyces gehörenden Bakterien erzeugt worden waren; das danach erhaltene Gemisch wurde 6 Stunden lang langsam bei 4⁰C gerührt, um die Adsorption durchzuführen. Aus dem Ultraviolett-Absorptionsvermögen der abgetrennten Flüssigkeit wurde ein Anteil von 70 mg adsorbiertem Enzym errechnet. Zur Bestimmung der Art der Chymotrypsin-ähnlichen Aktivität wurde die Aktivität gegenüber N-Acetyl-L-tryptophan-äthylester (ATEE) bestimmt, der ein spezifisches Substrat für ein £(-Chymotrypsin darstellt. Hierbei wurde für die Enzymlösung vor der Immobilisierung gegenüber ATEE bei einem pH-Vert von 7*2 und bei 30°C eine Aktivität von 7,3 uMol/mg-Std. ermittelt; für das immobilisierte Enzym wurde unter den gleichen Bedingungen eine Aktivität gegenüber ATEE von 19 jiMol/mg.Std. ermittelt. Ab siebten Tag nach der Immobilisierung wurde immer noch eine Aktivität von 18 uNol/mg-Std. festgestellt.

Beispiel 5:

Ia wesentlichen wurde die Immobilisierung und die Messung der Aktivität analog zu Beispiel 4 durchgeführt; abweichend

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hierzu wurde als Immobilisierungsträger an Stelle von QAE-Sephadex Duorite A 161 (Ionenaustausch-Kapazität 3,5 meq/g) verwendet. Der Anteil an immobilisiertem Enzym betrug 64 mg; die Aktivität des immobilisierten Enzyms betrug 16,5 ^uMoI/ mg»Std.

Beispiel 6:

Zur Bestimmung der Elastase-Aktivität des in Beispiel 1 verwendeten, rohen Enzyms wurde die Aktivität gegenüber N-Benzoyl-DL-alanin-methylester (BA&ME) gemessen, der ein spezifisches Substrat für Elastase darstellt. Vor der Immobilisierung konnte bei einer Reaktionstemperatur von 40°C und einem pH-Wert zwischen 7>1 und 8,0 keine Aktivität festgestellt werden. Anschließend wurden 52 mg dieses rohen Enzyms durch Adsorption an einem g DEAE-Sephadex A-25 in Phosphat-Pufferlösung (pH-Wert 7» Ό immobilisiert; der Prozentgehalt an Immobilisierung betrug 8? %. Das immobilisierte Enzym zeigte eine Aktivität gegenüber BA&ME von 36 ^lMol/mg-Std. bei einem pH-Wert von 7»1 und bei 35°C, wobei sich lediglich das L-Isomere als aktiv erwies. Dieses Ergebnis zeigt, daß das rohe Enzym ohne die Immobilisierung von Inhibitoren durch das Adsorptions-Immobilisations-Verfahren an DEAE-Sephadex A-25 gereinigt werden kann. Nachdem die Aktivität dieses immobilisierten Enzyms über 6 Tage lang, jeweils ein bis mehrere Male pro Tag nach einem absatzweise arbeitenden Verfahren bestimmt worden war, ergab sich lediglich eine Abnahme der Aktivität

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um 4,7 %.

Anschließend wurde das immobilisierte Enzym mit 5 molarer wässriger Natriumchlorid-Lösung und mit 0,5 molarer Phosphat-Pufferlösung gewaschen, um das Enzym zu eluieren und •wiederzugewinnen. Hierbei wurden 86 % des immobilisierten Enzyms wiedergewonnen. Sie Aktivität des wiedergewonnenen Enzyms im gelösten Zustand gegenüber BAEE bei 30°C und einem pH-Wert von 8,0 wurde zu 68 yuIlol/mg-Std. bestimmt; gegenüber BA&ME betrug die Aktivität bei 35⁰C und einem pH-Wert von 7,1 37 jiMol/mg.Std.

Beispiel 7:

1,0 g makroporöses anionenaustauschendes Kunstharz Duorite A-161 wurde mit 1/50 η Natriumhydroxid-Lösung behandelt und anschließend mit Wasser gewaschen. Dieses Kunstharz wurde zu einer wässrigen Lösung von 100 mg Pronase E gegeben, die eine handelsüblich zugängliche Gruppe von gereinigten Proteasen von Streptomyces griseus darstellt· Das Gemisch wurde 5 Stunden lang bei 5°C langsam gerührt, um das Enzym an dem Kunstharz zu adsorbieren; anschließend wurde eine Saugfiltration über eine Glasfilternutsche durchgeführt, und der Filterkuchen sorgfältig mit 0,05 molarer Phosphat-Pufferlösung (pH-Wert 7*0) und mit Wasser gewaschen. Das Filtrat und die Waschwässer wurden wiedergewonnen, und aus dem Ultraviolett-Adsorptionsvermögen bei

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280 mn der wiedergewonnenen Lösung wurde ein Anteil von mittels Adsorption an dem Kunstharz immobilisiertem Enzym von 86 mg errechnet. Die spezifische Aktivität dieses immobilisierten Enzyms gegenüber BAEE als Substrat (gemessen mit dem Hiranuma Präzisions pH-stat PS-11) bei einem pH-Wert von 7,0 und bei 30⁰C bei überschüssigem Substrat über das vorhandene Enzym betrug 3»8 uMol/mg*Min.; demgegenüber betrug die spezifische Aktivität des flüssigen Enzyms unter den gleichen Meßbedingungen 9»0 jiMol/mg»Min. Dementsprechend ergab sich eine Gesamtaktivität des immobilisierten Enzyms von 326 uMol/Min. Auch 10 Tage nach der Immobilisierung wies dieses immobilisierte Enzym immer noch 88 % seiner ursprünglichen Aktivität auf.

Beispiel 8:

1,0 g makroporöses, anionenaustauschendes Kunstharz Amberlite IfiA-93 wurde mit 0,1 molarer Phosphat-Pufferlösung (pH-Wert 7*0) gepuffert; anschließend wurde dieses Kunstharz in 20 ml 0,05 molare Phosphat-Pufferlösung eingebracht, in der 100 mg Enzym aufgelöst waren. Dieses Enzym war durch Kultivierung von Streptomyces fradiae (ATCC 15438) mittels einem üblichen Verfahren im Verlauf von drei Tagen in einem Kulturmedium (Basal-Medium) erzeugt worden; daraufhin wurde die Kulturbrühe filtriert, mittels Ammoniumsulfat (60 %ige, gesättigte Lösung) ausgesalzt, anschließend mit Aceton ausgefällt, daraufhin an DEAE-

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Cellulose chromatographyert und schließlich lyophilisiert. Das Gemisch aus Kunstharz und Enzym wurde in der Pufferlösung 5 Stunden lang bei 4°C langsam gerührt, um das Enzym durch Adsorption an dem Kunstharz zu immobilisieren. Aus dem Ultraviolett-Adsorptionsvermögen der abgetrennten Flüssigkeit wurde ein Anteil an immobilisiertem Enzym von 92 mg errechnet. Die Aktivität des immobilisierten Enzyms unter Umsatz-Bedingungen bei 40°C und einem pH-Wert von 7,0 gegenüber BAEE als Substrat betrug 4,1 uMol/mg*Min.; dies entspricht 82 % der Aktivität des in flüssigem Zustand vorliegenden Enzyms vor der Immobilisierung. Das immobilisierte Enzym wurde in eine Säule (Durchmesser 7 nun, Länge 140 mm, Umkleidung zur Thermostatisierung) gepackt und eine 0,2 molare BAEE-Lösung (auf einen pH-Wert von 7>0 eingestellt) wurde mit einer Geschwindigkeit von SV=12 von oben her durch die Säule geführt, wobei die Kolonne auf einer Temperatur von 40°C gehalten wurde. Bei der quantitativen Analyse des nicht-umgesetzten Esters wurde festgestellt, daß der Ester zu 100 % hydrolysiert worden war. Nachdem diese Reaktion kontinuierlich über eine Zeitspanne von 10 Tagen fortgeführt worden war, betrug die Kestaktivität des immobilisierten Enzyms in der Säule immer noch 80 % der ursprünglichen Aktivität.

Beispiele 9 bis 13:

Die Immobilisierung wurde analog zu Beispiel 7 durchgeführt, wobei die in der nachfolgenden Tabelle angegebenen Kunst-

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harze eingesetzt wurden. Die Messungen der Aktivitäten wurden analog zu Beispiel 7 durchgeführt, wobei die in der nachfolgenden Tabelle aufgeführten Ergebnisse erhalten wurden.

Bei den Beispielen 10 und 12 wurden Enzyme eingesetzt, die zu dem in Beispiel 8 verwendeten Enzym ähnlich waren; bei den anderen Beispielen wurde das gleiche handelsüblich zugängliche Pronase E eingesetzt, wie bei Beispiel 7. Die spezifische Oberfläche jedes Kunstharzes wurde nach der Vakuumtrocknung bei 60°C mittels dem BET-Verfahren bestimmt; hierzu wurde ein Instrument verwendet, das die. spezifische Oberfläche auf Grund der Gasadsorption mißt. Als Vergleichsbeispiel sind die Ergebnisse aufgeführt, die bei der Immobilisierung von Trypsin an einem gel-förmigen Ionenaustauscher-Harz erhalten wurden.

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Tabelle :

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	Ionen- aus- tauscher- Harz	Spez. Ober fläche (mVg)	Sub strat*	Gesamtaktivität (/lMol/Min.)	Immobi lisier tes Enzym	prozen tuale Immo bili sierung (%)
Bei spiel				Enzym in "flüs sigem" Zustand	392
	Duorite ß-37	95,3	BAEE	618	49	63Λ
9	Dowex MWA-1	5,6	BAME	53	104	92,4
10	Amberlite IRA 900	26	ATEE	153	121	68,0
11	Diaion SA 316	3	BAEE	195	72	62,1
12	Duorite A-161	6,8	BAME	75	3	96,0
13	Amberlite	0,1 >	BAEE	189		1,6
Ver-

gleiche- IR-121 beispiel Enzym: Trypsin

♦ ATEE: N-Acetyl-L-tyrosinethylester BAHE: N-Benzoyl-DL-alanin-methylester

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Claims

BLUMBACH · WESER . BERGEN · KRAMER ZWIRNER · HIRSCH · BREHM

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SUMITOMO CHEMICAL COMPANY, LIMITED 77/8723

15, Kitahama 5-chome, Higashi-ku,
Osaka, Japan

Immobilisierte, nicht-spezifische Proteasen und Verfahren zu deren Herstellung

Patentansprüche:

1; Eine wasserunlösliche, enzymatisch aktive, immobilisierte Proteasenzusammensetzung,
gekennzeichnet durch die nachfolgenden Merkmale:

a) die Zusammensetzung enthält enzymatisch aktive Proteasen, die von zur Gattung der Streptomyces gehörenden Bakterien erzeugt worden sind;

München: R. Kramer Dipl.-Ing. . W. Weser Dipl.-Phys. Dr. rer. nat. · P. Hirsch Dipl.-Ing. . H. P. Brehm Dipl.-Chem. Dr. ph,I. nat Wiesbaden: P. G. Blumbach Dipl.-Ing. · P. Bergen Dipl.-Ing. Dr. jur. · G Zwirner O:pl.-Ing. Dipl.-W. mg.

709851/0785 ORIGINAL INSPECTED

272 A OB 1

b) diese Proteasen sind an einem wasserunlöslichen, makroporösen, hochporösen oder makro-retikulierten, anionenaustauschenden Kunstharz immobilisiert, welches eine spezifische Oberfläche von nicht we-

p
niger als 1 m /g und eine gesamte anionenaustauschende Kapazität von nicht weniger als 0,5 meq/g aufweist; oder

c) diese Proteasen sind an einem wasserunlöslichen, anionenaustauschenden Polysaccharid immobilisiert, welches eine gesamte, anionenaustauschende Kapazität von nicht weniger als 0,5 meq/g aufweist.
2. Proteasenzusanunensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,

daß die von den zur Gattung der Streptomyces gehörenden Bakterien erzeugten Proteasen Esterase-Aktivitäten und Amidase-Aktivitäten aufweisen.
3. Proteasenzusaiiimensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,

daß die von den zur Gattung der Streptomyces gehörenden Bakterien erzeugten Proteasen nicht-spezifische Proteasen darstellen, welche die Art einer Chymotrypsin-ähnlichen Aktivität, die Art einer Trypsin-ähnlichen Aktivität und die Art einer Elastase-ähnlichen Aktivität aufweisen.

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272MJ81
4. Proteasenzusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,

daß die von den zur Gattung der Streptomyces gehörenden Bakterien erzeugten Proteasen Endoprotease-Aktivität und Exoproteaße-Aktivität aufweisen.
5. Proteasenzusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,

daß die von den zur Gattung der Streptomyces gehörenden Bakterien erzeugten Proteasen als Rohmaterial vorliegen.
6. Proteasenzusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,

daß die von den zur Gattung der Streptomyces gehörenden Bakterien erzeugten Proteasen als teilweise gereinigtes oder hochgereinigtes Material vorliegen.
7. Proteasenzusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß

die Gattung der Streptomyces aus der nachfolgenden Gruppe ausgewählt ist, nämlich der Streptomyces griseus, Streptomyces fradiae, Strepromyces erythreus, Strepto- mjcee rimosus und Streptomyces flavovirens.
8. Verfahren zur Herstellung der wasserunlöslichen, enzymatisch aktiven, immobilisierten Proteasenzusammensetzun- gen nach den Ansprüchen 1 bis 7»

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2 7 2.; ο ρ ι

dadurch gekennzeichnet, daß

enzymatisch aktive Proteasen, die von zur Gattung der Streptomyces gehörenden Bakterien erzeugt worden sind, mit einem wasserunlöslichen, makroporösen, hochporösen oder makro-retikulierten, anionenaustauschenden Kunstharz in Berührung gebracht werden, welches eine spezi-

fische Oberfläche von nicht weniger als 1 m /g und eine gesamte anionenaustauschende Kapazität von nicht weniger als 0,5 meq/g aufweist; oder die Proteasen mit einem wasserunlöslichen, anionenaustauschenden Polysaccharid in Berührung gebracht werden, welches eine gesamte anionenaustauschende Kapazität von nicht weniger als 0,5 meq/g aufweist; während die anionenaustauschenden Kunstharze aktiviert werden.
9. Verfahren nach Anspruch 8,
dadurch gekennzeichnet, daß

solche von den zur Gattung der Streptomyces gehörenden Bakterien erzeugte Proteasen ausgewählt werden, welche nicht-spezifische Proteasen darstellen mit einer Art von Chymotrypsin-ähnlicher Aktivität, mit einer Art von Trypsin-ähnlicher Aktivität und mit einer Art von EIastase-ähnlicher Aktivität.
10. Verfahren nach Anspruch 8,
dadurch gekennzeichnet,

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"ORIGINAL INSPECTED

daß solche von den zur Gattung der Streptomyces gehörenden Bakterien erzeugte Proteasen ausgewählt werden, welche Esterase-Aktivitäten und Amidase-Aktivitäten aufweisen.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 10, dadurch gekennzeichnet,

daß die von den zur Gattung der Streptomyces gehörenden Bakterien erzeugten Proteasen als Rohmaterial vorliegen.
12. Verfahren nach Anspruch 11,
dadurch gekennzeichnet,

daß die rohen Proteasen nach dem Verfahrensschritt der Immobilisierung in teilweise gereinigtem Zustand vorliegen; und

die immobilisierten Proteasen eine höhere spezifische Aktivität aufweisen, als die rohen Proteasen vor der Immobilisierung«

13· Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 11, dadurch gekennzeichnet,

daß die Gattung der Streptomyces aus der nachfolgenden Gruppe ausgewählt ist, nämlich aus Streptomyces griseus, Streptomyces fradiae, Streptomyces erythreus, Streptomyces rimosus und Streptomyces flavovirens.

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