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DE2637671C3 - Verfahren zur Herstellung von Kreatinin-Desimidase auf mikrobiologischem Wege - Google Patents

Verfahren zur Herstellung von Kreatinin-Desimidase auf mikrobiologischem Wege

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Publication number
DE2637671C3
DE2637671C3 DE2637671A DE2637671A DE2637671C3 DE 2637671 C3 DE2637671 C3 DE 2637671C3 DE 2637671 A DE2637671 A DE 2637671A DE 2637671 A DE2637671 A DE 2637671A DE 2637671 C3 DE2637671 C3 DE 2637671C3
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
creatinine
atcc
desimidase
enzyme
phosphate buffer
Prior art date
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Expired
Application number
DE2637671A
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English (en)
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DE2637671B2 (de
DE2637671A1 (de
Inventor
Osamu Terada
Takayuki Uwajima
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
KH Neochem Co Ltd
Original Assignee
Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from JP10347375A external-priority patent/JPS5228391A/ja
Priority claimed from JP10945275A external-priority patent/JPS5234976A/ja
Application filed by Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd filed Critical Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Publication of DE2637671A1 publication Critical patent/DE2637671A1/de
Publication of DE2637671B2 publication Critical patent/DE2637671B2/de
Application granted granted Critical
Publication of DE2637671C3 publication Critical patent/DE2637671C3/de
Expired legal-status Critical Current

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Description

Kreatinin ist ein Stoffwechselabfallprodukt, das durch nichtenzymatische Entwässerung von Kreatin gebildet wird. Kreatin entsteht aus Kreatinphosphorsäure, einer der Energiequellen für die Muskelkontraktion.
Kreatin wird in vivo nicht verwertet, sondern als Stoffwechselendprodukt mit dem Urin ausgeschieden. Kreatinin tritt im Blut in einer Normalkonzentration von etwa 0,7 bis 1,5 mg/100 ml Serum auf. Die Kreatinin-Bestimmung im Blut und im Urin ist ein wertvolles diagnostisches Hilfsmittel zur Erkennung von Nierenkrankheiten, wie akute und chronische Nephritis und andere Störungen, z. B. Obstruktion der Urethra, Quecksilbervergiftung und Naphrose.
J. Szulmajster, J. Bacteriology, Bd. 75 (1958), Seite 633 und Biochimica Biophysica Acta, Bd. 30 (1958), Seile 154, hat über das Auftreten von Kreatinin-Desimidase (EC 3.5.4.21) in Mikroorganismenzellen von Clostridium paraputrificum berichtet. Das Enzym ist katalysiert die hydrolytische Spaltung von Kreatinin zu N-Methylhydantoin und Ammoniak.
Mikroorganismen der Gattung Clostridium sind jedoch anaerob, so daß zur Herstellung dieses Enzyms lange Fermentationszeiten erforderlich sind und das Mikroorganismenwachstum und somit die Enzymausbeuten nur gering sind. Es war daher bis jetzt nicht möglich, die Herstellung von Kreatinin-Desimidase im großtechnischen Maßstab durchzuführen.
Es wurde auch berichtet, daß Stämme von aeroben Mikroorganismen der Gattung Pseudomonas eine Spaltung von Kreatinin bewirken können. Jedoch sind bisher keine derartigen Mikroorganismen bekannt, die in der Lage sind, ein Enzym zu bilden, das die Hydrolyse von Kreatinin zu N-Methylhydantoin und Ammoniak katalysiert. Ferner ist es bisher nicht gelungen, ein spezielles Enzym, das die vorgenannte Reaktion katalysiert, zu isolieren.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein leistungsfähiges neues Verfahren zur Herstellung von Kreatinin-Desimidase auf mikrobiologischem Wege zu schaffen. Diese Aufgabe wird gemäß den vorslehenden Patentansprüchen gelöst
Die erfindungsgemäß hergestellte Kreatinin-Desimidase läßt sich gut für automatisierte, quantitative Kreatininbestimmungen verwenden. Die Kreatininmenge in einer Probe läßt sich leicht und rasch bestimmen, ίο indem man die Menge an N-Methylhydantoin oder Ammoniak, die durch die katalytische Wirkung des Enzyms gebildet worden ist, mißt.
Als Mikroorganismen, die Kreatinin-Desimidase bilden, werden im erfindungsgemäßen Verfahren folgende Stämme verwendet:
(1) Brevibacterium ammoniagenes KY 3462,
(2) Brevibacterium divaricatum KY 3810,
(3) Corynebacterium lilium KY 3509,
(4) Corynebacterium glutamicum KY 3801,
(5) Pseudomonas ovalis KY 4651,
(6) Pseudomonas cruciviae KY 3961,
(7) Arthrobacter ureafaciens KY 3152,
(8) Arthrobacter histidinolovorans KY 3158.
r> Die mikrobiologischen Eigenschaften der Spezies (1), (6) und (7) sind in Bergeys Manual of Determinative Bacteriology, 7. Auflage, Seite 499, 114 bzw. 610 beschrieben. Die mikrobiologischen Eigenschaften der Spezies (2) finden sich in der Japanischen Patent-
JO Veröffentlichung 20 294/63 und die der Spezies (3) in der US-PS 30 87 863. Ferner sind die mikrobiologischen Eigenschaften der Spezies (4) in J. Gen. Appl. Microbiol., Bd. 13, (1967), Seite 279-301, die der Spezies (5) in Bergeys Manual of Determinative Bac-
)-. teriology, 8. Auflage, Seite 222, und die der Spezies (8) in J. Bioi. Chem., Bd. 209, (1954), Seite 829, beschrieben.
Die vorerwähnten Stämme sind beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Tokyo, Japan, unter den Hinterlegungsnummern FERM-P 3207, 3208, 3209, 3210, 3211, 3212, 3213 bzw. 3214 hinterlegt.
Ferner sind diese Stämme bei der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, V. St. A., unter den Hinterlegungsnummern ATCC 31 169, 14020, 15990,31 170,31 171,31 172, 7562 bzw. 11442 hinterlegt.
Zur Züchtung der erfindungsgemäß verwendeten Mikroorganismen können synthetische oder natürliche Medien verwendet werden, die Kohlenstoff- und Stickstoffquellen, anorganische Salze und andere Nährstoffe, die von dem jeweiligen Stamm verwertet werden können, enthalten.
Beispiele für Kohlenstoffquellen sind Kohlenhydrate, wie Glucose, Fructose, Saccharose, Maltose, Mannose, Stärke, Stärkehydrolysatflüssigkeit und Melassen, Zuckeralkohole, wie Glycerin, Sorbit und Mannit, organische Säuren, wie Essigsäure, Milchsäure, Brenztraubensäure, Fumarsäure und Citronensäure,
bo Alkohole, wie Methanol und Äthanol, Glykole, wie Äthylenglykol und Propylenglykol, Aminosäuren und Kohlenwasserstoffe, wie n-Hexadecan.
Beispiele für Stickstoffquellen sind Ammoniak, anorganische und organische Ammoniumsalze, wie Am-
hr) moniumchlorid, Ammoniumcarbonat, Ammoniumphosphat, Ammoniumnitrat und Ammoniumacetat, Harnstoff, Aminosäuren und andere stickstoffhaltige Verbindungen sowie stickstoffhaltige organische Ma-
terialien, wie Pepton, Fleischextrakt, Maisquellflüssigkeit, Caseinhydrolysat, Chrysalishydrolysat, Fischmehl, angedautes Fischmehl, entfettete Sojabohnen und das entsprechende angedaute Produkt.
Beispiele für anorganische Salze sind Kaliumdi- > hydrogenphosphat, Dikaliumhydrogenphosphat, Kaliumchlorid, Magnesiumsulfat, Mangansulfat, Eisen(II)-sulfat, Natriumchlorid und Calciumcarbonat.
Es wurde festgestellt, daß es sich bei der Kreatinin-Desimidase um ein adaptives Enzym handelt Infolgedessen läßt sich die Ausbeute an Kreatinin-Desimidase beim erfindungsgemäßen Verfahren beträchtlich steigern, indem man Kreatinin oder ein kreatininhaltiges natürliches Material, wie Fischextrakt, oder Rinderextrakt, dem Medium als Enzyminduktor zusetzt. Be- i·-, sonders gute Ergebnisse erhält man durch Zusatz von Kreatinin in einer Menge von 0,05 bis 2% (Uewicht/Vo.'umen) zum Medium.
Im allgemeinen wird die Züchtung bei Temperaturen von 28 bis 33 (durchgeführt. Während der Züchtung _'« wird ein pH-Wert von 6,5 bis 8,5 aufrechterhalten. Die Züchtung wird so lange fortgesetzt, bis sich das Enzym gebildet hat und in der Gärflüssigkeit nachzuweisen ist Im allgemeinen beträgt die Züchtungsdauer 20 bis 30Stunden. Unter diesen Bedingungen > > reichert sich in der Gärflüssigkeit und/oder in den Mikroorganismenzellen eine beträchtliche Menge an Krealinin-Desimidase an.
Zur Gewinnung des Enzyms werden die Mikroorganismenzellen nach üblichen Verfahren unter Bildung j» eines Zellextrakts aufgebrochen, beispielsweise durch Ultraschallzcrkleincrung, Zcrmahlcn, mechanischen Druck oder Autolyse. Die Extraktion der Kreatinin-Desimidase aus der Gärflüssigkeit und dem Zellextrakt wird auf folgende Weise durchgeführt: Zunächst wird π durch Zusatz von Salzen, wie Ammoniumsulfat oder Natriumsulfat, oder Lösungsmitteln, wie Aceton, Methanol, oder Äthanol, ein Niederschlag gebildet. Bei der Verwendung von Ammoniumsulfat wird der Anteil, der bei 40prozentiger Ammoniumsuifatsättigung gelöst ist und bei 70prozentiger Sättigung ausfällt, gewonnen. Bei der Verwendung von Aceton wird der Anteil gewonnen, der bei einer 60prozentigen Acetonkonzentration ausfällt.
Der auf diese Weise erhaltene Niederschlag wird -n anschließend der Dialyse oder der Gelfiltration unterworfen, um das im Niederschlag enthaltene Salz oder Lösungsmittel zu entfernen. Für die Dialyse wird eine entsprechende Dialysemembran, wie eine aus regenerierter Cellulose bestehende Folie, Blasenmembran >o oder Kollodiummembran, verwendet. Eine bevorzugte Dialyscflüssigkeit besteht aus 0,01-m Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,0. Für die Gelfiltration wird vorzugsweise ein mit Epichlorhydrin vernetztes Dextran Typ G-25 oder G-50 (vgl. Firmenprospekt Sephadex, Gel- r>-> filtration in theory and practice, 1975) zusammen mit 0,01 m Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,0 verwendet.
Zur Entfernung der Nucleinsäuren aus der Membran wird eine wäßrige Protaminlusung (mit einem Protamingehalt, der etwa Vm des Proteingehalts der Flüssig- -,n keit innerhalb der Membran entspricht) tropfenweise unter Rühren zugesetzt. Das erhaltene Gemisch wird zur Bildung eines Niederschlags etwa 30 Minuten bei 0 bis 4 ( stehengelassen. Der entstandene Niederschlag wird abzentrifugierl (10 000 g, 20 min), und der r> Überstand wird gewonnen.
Anschließend wird der Überstand auf eine mit DEAE-Cellulosc gepackte Säule, die vorher mit 0,01-m Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,0 äquilibriert worden ist, gegeben. Sodann wird die Säule zur Elution von unreinem Protein mit 0,01-m Phosphatpuffer versetzt Die Elution wird unter Anwendung eines Konzentrationsgradienten durchgeführt, wobei zunächst 0,01-m Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,0 und am Schluß 0,01-m Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,0 mit 0,3-m NaCI verwendet wird. Das Eluat wird in Fraktionen aufgefangen. Die Kreatinin-Desimidase-Aktivität in den einzelnen Fraktionen wird auf die nachstehend beschriebene Weise gemessen. Die aktiven Fraktionen werden vereinigt. Die vereinigte Lösung wird zur Bildung eines Niederschlags mit der doppelten Volumenmenge Aceton versetzt. Der Niederschlag wird abzentrifugiert und der Dialyse unterworfen. Die im Innern der Membran befindliche Flüssigkeit wird gefriergetrocknet. Man erhält gereinigte Kreatinin-Desimidase in Pulverform.
Die enzymatische Aktivität der Kreatinin-Desimidase wird berechnet, nachdem man die bei Verwendung von Kreatinin als Substrat gebildete und gemäß dem Indophenol-Verfahren bestimmte Ammoniakmenge ermittelt hat. Dazu werden beispielsweise 0,5 ml einer lprozentigen wäßrigen Kreatinin-hydrochlorid-Lösung, 0,5 ml eines 0,1-m Phosphatpuffers vom pH-Wert 7,5, 0,4 ml Wasser und 0,1ml einer Enzymlösung vermischt und zehn Minuten bei 37 C inkubiert. Das Gemisch wird mit 1 ml Phenol-Lösung (hergestellt durch Lösen von 5,0 g Phenol und 25 mg Nitroprussidnatrium in Wasser bei einem Gesamtvolumen von 500 ml) versetzt. Das erhaltene Gemisch wird gerührt. Dieses Gemisch wird mit 1 ml einer alkalischen Natriumhypochloritlösung (hergestellt durch Lösen von 2,5 g Natriumhydroxid in etwa 300 ml Wasser, Versetzen mit 1,25 ml Natriumhypochlorit mit einem Gehalt an 10 Prozent wirksamem Chlor und Verdünnen des Gemisches auf ein Gesamtvolumen von 500 ml) versetzt. Das Gemisch wird gerührt und sodann 20 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen. Die Absorption bei 630 nm wird mit Hilfe eines photoelektrischen Kolorimeters gemessen. Zur Kontrolle wird der gleiche Vorgang unter Verwendung einer Enzymlösung, die vorher 5 Minuten auf 100 C erwärmt worden ist, wiederholt. Die Absorption der Konlrollösung bei 630nm wird von der Absorption der zu untersuchenden Lösung bei 630 nm abgezogen. Getrennt davon wird eine Eichkurve für die Ammoniak-Konzentration und die Absorption bei 630 nm hergestellt. Aus der Differenz der Absorptionswerte ergibt sich die Menge an gebildetem Ammoniak. Daraus läßt sich wiederum die enzymatische Aktivität der Probe berechnen.
Als 1 Einheit der enzymatischen Aktivität ist die Enzymmenge definiert, die bei 37 C und einem pH-Wert von 7,5 innerhalb einer Minute 1 uMol Kreatinin zersetzt.
Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltene Kreatinin-Desimidase zeigt eine charakteristische Reaktion mit Kreatinin und katalysiert die Spaltung von Kreatinin zu N-Methylhydantoin und Ammoniak. Das Enzym reagiert nicht mit Kreatin, Kreatininphosphorsäure, Harnstoff, Arginin, Glutaminsäure, Canavanin, Glutamin, Cytosin und Guanin.
Bei der Gelfiltration (vgl. Biochemical Journal, Bd. 96 (1965), Seite 595) unter Verwendung von mit Epichlorhydrin vernetzten! Dextran Typ G-200 ergibt sich für die Krealinin-Desimidase ein Molekulargewicht von etwa 200 000.
Das pH-Optimum des Enzyms nach zehnminütiger Behandlung bei 37 C liegt bei 8. Bei einer dreißigminütigen Behandlung bei 30 C ist das Enzym im pH-Bereich von 4,0 bis 9,0 stabil. Das Temperaturoptimum für eine zehnminütige Umsetzung beim pH-Wert 8,0 liegt nahe 50 C Das Enzym erweist sich bei einer dreißigminütigen Behandlung beim pH-Wert 7,0 bis zu 50 C als stabil und verliert bei 55 C etwa 20 Prozent seiner Aktivität.
Die Wirkung des erfindungsgemäßen Enzyms wird durch Schwernietallionen, wie Cu2+, Hg2+ und Ag+ und p-Chlormercuribenzoesäure in einer Konzentration von 1 millimoiar gehemmt Somit ist anzunehmen, daß eine SH-G»uppe an der Enzymwirkung beteiligt ist.
Die auf die vorstehende Weise erhaltene Kreatinin-Desimidase ist insbesondere zur quantitativen Bestimmung von Kreatinin geeignet Dazu wird beispielsweise eine kreatininhaltige Probe bei 30 bis 50 C etwa 10 bis 30 min mit einem Phospha^puffer, der 0,1 bis 1,0 mg/ml K reatinin-Desimidase enthält, umgesetzt Dabei wird das Kreatinin zu N-Methylhydantoin und Ammoniak hydrolysiert. Die Menge an gebildetem N-Methylhydantoin oder gebildetem Ammoniak wird gemessen.
Die Beispiele erläutern das erfindungsgemäße Verfahren.
Beispiel 1
Eine Kultur von Brevibacterium ammoniagenes KY 3462, FERM-P Nr. 3207, ATCC 31 169. wird in 10 Liter Nährmedium, das sich in einem 30 Liter fassenden Glasfermenter befindet, überimpft. Das Nährmedium enthält 2 g/dl Glucose, 0,5 g/dl Kreatinin-hydrochlorid, 0,1 g/dl K2HPO4,0,05 g/dl MgSO4 · 7H2O, 0,05 g/dl KCl und 0,1 g/dl Hefeextrakt und weist einen pH-Wert von 7,5 auf. Die Züchtung wird 24 Stunden unter Belüftung und unter Rühren bei 30 C durchgeführt. Anschließend werden 10 Liter der Gärflüssigkeit in einer kontinuierlich arbeitenden Zentrifuge zentrifugiert. Dabei werden etwa 100 g Mikroorganismenzellen gewonnen. Die Zellen werden mit 5 Liter 0,01-m Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,0 gewaschen und sodann in 2 Liter 0,01-m Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,0 suspendiert. Die Zellsuspension wird gemahlen. Nach dem Zermahlen wird das Produkt 20 Minuten bei 20 000 g in einer Kühlzentrifuge zentrifugiert. Bei der Ammoniumsulfatfällung erhält man aus dem Überstand bei 40- bis 70prozentiger Sättigung etwa 30 g Niederschlag. Die Ausbeute in bezug auf die Aktivität an Kreatinin-Desimidase im Niederschlag beträgt 80%. Die spezifische Aktivität istaufdas 3fache erhöht. Der Niederschlag wird anschließend in 500 ml 0,01-m Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,0 gelöst. Die Lösung wird 48 Stunden in einem Schlauch aus regenerierter Cellulose gegen 20 Liter 0,01-m Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,0 dialysiert, wobei die Dialysefiüssigkeit jeweils nach 12 Stunden gewechselt wird. Anschließend versetzt man zur Entfernung von Nucleinsäuren jeweils 1 Liter des Dialysats unter Rühren allmählich mit 100 ml piner 3prozentigen wäßrigen Protaminlösung. Das erhaltene Gemisch wird zur Bildung eines Niederschlags 30 Minuten bei 0 bis 4 C stehengelassen. Derauf diese Weise gebildete Niederschlag wird 20 Minuten bei 10000g abzentrifugiert. Die Ausbeute in bezug auf die im Überstand enthaltene Kreatinin-Desimidase beträgt 90%, und die spezifische Aktivität wird auf das 2fache gesteigert. Der Überstand wird über eine mit 1 kg DEAE-Cellulose gepackte Säule, die vorher mit 0,01-m Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,0 behandelt worden ist, gegeben, um die Kreatinin-Desimidase zu adsorbieren. Die Säule wird sodann mit 0,01-m vor.i Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,0 gewaschen, um unreine Proteine zu entfernen. Anschließend wird die Säule mit Phosphatpuffer unter Anwendung eines Konzentrationsgradienten von 0,01-m Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,0 bis 0,1-m Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,0 mit einem
ίο Gehalt an 0,3-m NaCl eluiert Die Fraktionen mit einer Aktivität an Kreatinin-Desimidase werden in einem einzigen Maximum eluiert Die aktiven Fraktionen werden vereinigt und zur Bildung eines Niederschlags mit der 2fachen Volumenmenge Aceton versetzt. Der Niederschlag wird 20Minuten bei 10000g abzentrifugiert und in 100 ml vollentsalztem Wasser gelöst. Die Lösung wird in einem Schlauch aus regenerierter Cellulose gegen 0,01-m Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,0 dialysiert Das Dialysat wird gefriergetrocknet Man erhält etwa 1 g gereinigte Kreatinin-Desimidase mit einer spezifischen Aktivität von 2,5 Einheiten/mg. Die Gesamtausbeute in bezug auf die Aktivität an Kreatinin-Desimidase beträgt 56% und die Steigerung der spezifischen Aktivität etwa das 60fache.
Beispiel 2
Corynebacterium lilium KY 3509, FERM-P Nr. 3209, ATCC 15 990, wird in einem Nährmedium, das 3 ml/dl Fleischextrakt (mit einem Gehalt an etwa 3,3 g/dl Kreatinin) 0,5 g/dl Pepton und 0,5 g/dl Glucose enthält und einen pH-Wert von 7,5 aufweist, gezüchtet Die Züchtung wird auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 durchgeführt Man erhält etwa lSOgMikroorganismen-
r> zellen. Die Zellen werden gemäß Beispiel 1 extrahiert und gereinigt Man erhält 1,5 g gereinigte Kreatinin-Desimidase mit einer spezifischen Aktivität von 1,5 Einheiten/mg. Die Ausbeute beträgt 55 Prozent.
Beispiel 3
Pseudomonas ovalis KY 4651, FERM-P Nr. 3211, ATCC 31 171 wird in einem Nährmedium gezüchtet, das 3g/d! Fleischextrakt, 0,5 g/dl Pepton und 0,3 g/d! Glucose enthält und einen pH-Wert von 7,5 aufweist.
Die Züchtung wird gemäß Beispiel 1 durchgeführt Man erhält 180g Mikroorganismenzellen. Nach Extraktion und Reinigung gemäß Beispiel 1 erhält man 2 g gereinigte Kreatinin-Desimidase mit einer spezifischen Aktivität von 1,0 Einheiten/mg. Die Ausbeute beträgt 57 Prozent.
Beispiel 4
Arthrobacterureafaciens KY 3152, FLRM-PNr. 3213, ATCC 7562 wird gemäß Beispiel 1 gezüchtet. Man erhält 150 g Mikroorganismenzellen. Nach Extraktion und Reinigung gemäß Beispiel 1 erhält man 0,5 g gereinigte Kreatinin-Desimidase mit einer spezifischen Aktivität von 2,0 Einheiten/mg. Die Ausbeute beträgt 57 Prozent.
Beispiel 5
Aus 10 Liter Gärfiüssigkeit, die durch Züchtung pemäß Beispiel 1 erhalten worden ist, werden durch kontinuierliche Zentrifugation 9,5 l.iu:r Überstand gewonnen. Der Überstand ergibt bei der Ammoniumsulfatfällung bei 40- bis 70prozentiger Sättigung 5 g Niederschlag. Die Ausbeute in be^ugaufdie im Niederschlag enthaltene K resünin-Desimidase beträgt 80 Pro-
zer.t. Die spezifische Aktivität ist auf das 3fache gesteigert. Der Niederschlag wird in 100 ml 0,01-m Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,0 gelöst. Die Lösung wird 48 Stunden in einem Schlauch aus regenerierter Cellulose gegen 20 Liter 0,01-m Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,0 dia)ysiert. Die Dialyseflüssigkeit wird jeweils nach 12 Stunden ausgewechselt. Anschließend werden 200 nil des Dialysats gemäß Beispiel 1 der Nucleinsäurefällung, Säulenchromatographie an DEAE-CeIIulose, Acetonfällung und Gefriertrocknung unterworfen. Man erhält etwa 120 mg gereinigte Kreatinin-Desimidase mit einer spezifischen Aktivität von 2,0 Einheiten/mg. Die Ausbeute beträgt 52%.
Beispiel 6
Die in der Tabelle angegebenen Stämme werden auf jeweils 50 ml eines Nährmediums der gleichen Zusammensetzung wie in Beispiel 1, das sich in 500-ml-Sakaguchi-Kolben befindet, überimpft und 24 Stunden unter Schütteln bei 30 C gezüchtet. Die Gärfiüssigkeiten werden jeweils 20 Minuten bei 10 000 g in einer Kühlzentrifuge zentrifugiert, und die Mikroorganismenzellen werden gewonnen. Jeweils 0,5 g der Zellen werden mit 50 ml 0,01-m Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,0 gewaschen und sodann in 10 ml 0,01-m Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,0 suspendiert. Die ZeIlsuspsnsionen werden jeweils 20 Minuten mit Hilfe einer Ultraschallvorrichtung behandelt und anschließend 20 Minuten bei 20000 g in einer Kühlzentrifuge zentrifugiert. Im Überstand wird jeweils die Aktivität an Kreatinin-Desimidase und die Proteinkonzentration gemessen.
Die Ergebnisse sind in der Tabelle zusammengestellt. Tabelle
5 Stämme Kreatinin-Desimidase- Einheiten/
Aktivitäl mg
Einheiten/ Zucht
mg masse*)
IU Protein 0,185
Brevibacterium 0,042 0,093
ammoniagenes KY 3462
15 Brevibacterium 0,012 0,175
divaricatum KY 3810
Corynebacterium lilium 0,040 0,073
KY 3509
20 Corynebacterium 0,010 0,112
glutamicum KY 3801
Pseudomonas ovalis 0,016 0,062
KY 4651
Pseudomonas cruciviae 0,011 0,120
25 KY 3961
Arthrobacter ureafaciens 0,025 0,060
KY 3152
Arthrobacter 0,020
JO histidinolovorans KY 3158
*) Aktivität/ml Zuchtmasse (Gärflüssigkeit plus Zellen).

Claims (3)

Patentansprüche:
1. Verfahren zur Herstellung von Kreatinin-Desimidase auf mikrobiologischem Wege, dadurch gekennzeichnet, i;.aß man Brevibacterium ammoniagenes ATCC 31 169, Brevibacterium divaricatum ATCC 14 020, Corynebacterium lilium ATCC 15 990, Corynebacterium glutamicum ATCC 31 170, Pseudomonas ovalis ATCC 31 171, Pseudomonas cruciviae ATCC 31 172, Arthrobacter ureafaciens ATCC 7562 oder Arthrobacter histidinolovorans ATCC 11442 in einem Kreatinin enthaltenden Nährmedium 20 bis 30 Stunden bei einer Temperatur von 28 bis 33 C und einem pH-Wert von 6,5 bis 8,5 züchtet und die entstandene Kreatinin-Desimidase aus den Zellen isoliert.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Kreatinin-Desimidase isoliert, indem man die Mikroorganismenzellen unter Bildung eines ZeJlextrakts aufbricht und das Zellextrakt unter Gewinnung eines gereinigten Enzyms der Fällung, Adsorption und Desorption unterwirft.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Kreatinin-Desimidase aus der Gärflüssigkeit durch Fällung, Adsorption und Desorption unter Gewinnung eines gereinigten Enzyms gewinnt.
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