DE2654189C3

DE2654189C3 - Verfahren zur in-vitro-Bestimmung der biologischen Aktivität von Faktor Xa-Inhibitor im Blut

Info

Publication number: DE2654189C3
Application number: DE2654189A
Authority: DE
Inventors: Oddvar Uppsala Tangen
Original assignee: Pharmacia AB
Current assignee: Pfizer Health AB
Priority date: 1975-12-01
Filing date: 1976-11-30
Publication date: 1985-10-03
Also published as: NL7613376A; NO764081L; JPS5297792A; FR2334109B1; AU2006176A; DE2654189A1; FI763446A; NO148960C; DE2654189B2; SE7513495L; AU508343B2; NO148960B; US4139415A; BE848932A; SE419871B; JPS5915640B2; FI63494B; DK537676A; ATA891076A; CA1060324A

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren für die in-vitro-Bestimmung der biologischen Aktivität von Faktor Xa-Inhibitor (XaI) im Blut. Der Plasmainhibitor für aktivierten Faktor X (XaI) ist ein «-2-Globulin mit einem Molekulargewicht von 58(XK) bis 65 000 und wurde unterschiedlich als Antithrombin UI, Heparin-Cofaktor und Λ-2-Antitrypsin bezeichnet.

Für die zeitige Erkennung des Anfangsstadiums eines offenkundigen thrombotischen Zustande bei Menschen oder Tieren gibt es zur Zeit kein zufriedenstellendes biochemisches Verfahren. Thromboembolische Erkrankungen sind eine zunehmend wichtige Ursache für Arbeitsunfähigkeit und Tod, da die Fortschritte in den chirurgischen Verfahren kompliziertere Operationen ermöglichen und, bedingt durch die vielfache Verwendung von östrogen enthaltenden Verbindungen, als orale, konzeptionsverhütende Mittel.

In den vergangenen Jahren wurden in der Literatur viele Ergebnisse von Versuchen beschrieben sowohl in vitro als auch in vivo, aus denen hervorgeht, daß die Wirksamkeit von XaI als natürlich vorkommendes Antikoagulans während der Blutkoagulation stärker von der Inaktivierung des zuerst gebildeten Faktors Xa, wodurch die Thrombinbildung verhindert wird, abhängt als davon, daß man verhindert, daß Thrombin Fibrinogen angreift. Diese Ansicht wird besonders durch den Bericht untermauert, daß Spurenmengen an Heparin die Inhibierung des Faktors Xa durch XaI merklich verstärken.

Aus bestimmten Erscheinungen kann man fast sicher folgern, daß bei einigen Patienten vor und nach der Operation 'in sogenannter zuvor nicht vorhandener »Hyper-Cogerinnungsfähigkeits- bzw. Hyper-Koagulierbarkeitszustand« erzeugt wird. Dieser hyper-koagulierbare Zustand wird nicht thrombonisch bleiben, solange die Rate der Faktor Xa-Entfernung durch XaI die der Faktor Xa-Bildung überschreitet. Man hat

weiterhin angenommen, daß Frauen, die orale Antiovuiationsmittel einnehmen, bei Verletzungen anfälliger gegenüber Thrombose sind, da die Konzentration an XaI in ihrem Blut erniedrigt ist

Dieses Wissen hat die Möglichkeit eröffnet, daß niedrige Gehalte an XaI eine Hyperkoagulierbarkeit andeuten bzw. bedeuten. Man kann daher vermuten, daß die Plasma Xal-Aktivität ein praktisches Zeichen für einen hyper-koagulierbaren Zustand sein könnte. Diese

ίο Hypothese wird durch die folgenden Beobachtungen weiter untermauert:

(a) Patienten die ererbt Mangel an Antithrombin III (XaI) besitzen, sind thrombophil bzw. besitzen eine Neigung zur Thrombusbildung;

(b) Frauen, die oral konzeptionsverhütende Mittel einnehmen und die eine niedrige Xal-Aktivität in ihrem Plasma besitzen, zeigen als Gruppe ein höheres Vorkommen von postoperativer tiefer

_2Ü Venenthrombose als solche Frauen, die keine »Pille« nehmen.

Es besteht daher ein großer Bedarf nach spezifischen Verfahren zur Bestimmung der biologischen Aktivität von XaI im Blutplasma, bei denen das mögliche Vorhandensein einer menschlichen Plasmakomponente mit Inhibitorwirkung auf den Neutralisationsmechanismus von Xa durch den Xa-Inhibitor überwunden wird.

Einige Verfahren sind verfügbar, mit denen eine Bestimmung der Xal-Aktivität versucht wird. Die am häufigsten verwendeten Verfahren basieren auf der immunologischen Bestimmung und der Inhibierung von Thrombin. Diese Verfahren besitzen jedoch verschiedene Nachteile. Das immunologische Verfahren zeigt, obgleich es das Antigen «₂-Globulin feststellt, nicht die biologische Aktivität des Inhibitors an. Man hat berichtet, daß das Blut bestimmter Patienten, die erheblich an der biologischen Aktivität dieses Inhibitors Mangel haben, keinen Mangel zeigt, wenn die Messungen nach dem Immuno-Verfahren erfolgten

[Sas et al, Thromb. Diath. Haemorrh. 32 (1974), Seite 105].

Für diesen Inhibitor ist das Thrombin-Verfahren nicht spezifisch, da bei diesem Verfahren gleichzeitig die Aktivität anderer Serumproteinase-Inhibitoren bestimmt wird [Whigham et al, Thromb. Diath. Haemorrh. 34 (1975), Seite 365J Es ist weiterhin gegenüber sehr geringen Mengen an Heparin und heparinähnlichen Substanzen und Fibrinogen-Abbauprodukten, die im Blutplasma vorhanden sind, empfindlieh.

Überraschenderweise wurde gefunden, daß die biologische Aktivität von XaI im Blut in vitro ohne diese Nachteile unter Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens bestimmt werden kann. Erfindungsgemäß wird eine Blutplasmaprobe mit einem Polysaccharid-polysulfat, welches ein Dextransulfat mit 0,10 bis 3,0 Sulfatgruppen/Monosaccharideinheit oder ein Dermatansulfat mit 0,45 bis 2,0 Sulfatgruppen/Monosaccharideinheit oder ein Heparansuifat mit 0,45 bis 2,0 Sulfatgruppen/

Mi Monosaccharideinheit ist, und mit Faktor Xa während einer vorbestimmten Zeitdauer inkubiert, und danach wird die Restmenge an Faktor Xa-Aktivität in an sich bekannter Weise bestimmt.

Die Restmenge an Faktor Xa kann unter Verwen-

dung der Fibrinbildung als Endpunkt (Bestimmung der Koagulierungszeit) in an sich bekannter Weise erfolgen. Sie kann ebenfalls durch Messung der Esterase-Aktivität oder amidolytischen Aktivität unter Verwendung

geeignetti- Substrate bestimmt werden.

Das durchschnittliche Molekulargewicht des PoIysachharid-polysulfats ist nicht kritisch. Man kann so wasserlösliche Polysaccharid-polysulfate mit einem Molekulargewicht von etwa 1000 bis zu mindestens 10 000 000 verwenden. Man kann ebenfalls wasserlösliche und wasserunlösliche vernetzte Polysaccharid-polysulfate verwenden.

Gegebenenfalls kann das Polysaccharid-polysulfat an einen wasserunlöslichen Träger wie ein vernetztes Dextran gekuppelt bzw. gebunden sein. Man kann das Polysaccharid-polysulfat ebenfalls an das entsprechende unsubsituierte Polysaccharid kuppeln bzw. binden. In einem solchen Fall wird der Substitutionsgrad der Sulfatgruppen auf Grundlage des substituierten Teils eines solchen Produktes berechnet

Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es bevorzugt, die Probe mit Salzlösung oder mit einem Puffer zu verdünnen. Eine Verdünnung von mehr als etwa 1/10, bevorzugt mehr als 1/30, wird dann verwendet. Die Störung durch Mittel, die ein Koagulationssystem nachteilig beeinflussen, wird vermieden.

Die angewendete Inkubationszeit hängt von den Konzentrationen der Reaktionsteilnehmer in der Inkubationslösung und ebenfalls von der Inkubationstemperatur ab. Die optimale Zeit kann für jeden Fall leicht bestimmt werden. Die Inkubationstemperatur kann im Bereich von etwa 20 bis etwa 37° C liegen.

Bei dem Verfahren ist es bevorzugt, bei einem pH-Wert von etwa 7,0 bis 8,0 zu arbeiten. Die Mengen an Polysaccharid-polysulfat und aktiviertem Faktor X (Xa) sind nicht kritisch. Zweckmäßigerweise werden 1 bis 20^X^g/ml Polysaccharid-polysulfat und 1 bis 10 Einheiten Xa/ml verwendet. Die optimalen Konzentrationen können leicht für jeden Fall bestimmt werden.

Bei den Untersuchungen für die vorliegende Erfindung wurde gezeigt, daß die erfindungsgemäß verwendeten Polysaccharid-polysulfate bei der Blutkoagulation drei Haupteigenschaften besitzen:

(a) die Fähigkeit, die Inhibitorwirkung einer menschlichen Plasmakomponente bei dem Neutralisationsmechanismus von Xa durch den Xa-Inhibitor zu überwinden, '

(b) eine schwache heparinähnliche Aktivität,

(c) eine synergistische Wirkung auf die antikoagulierende Aktivität von Spurenmengen an Heparin.

Bei der erfindungsgemäßen Bestimmung des Xa-Inhibitors kann es zweckmäßig sein, die heparinartige Aktivität des Polysaccharid-polysulfats durch Zugabe eines Heparin-Neutralisationsmittels wie Hexadimethrinbromid (Polybrene® der Abbott Laboratories, USA) oder Protaminsalze zu dem Substratplasma zu neutralisieren. Sonst werden die Koagulationszeiten unverhältnismäßig lang sein.

Unter Anwendung des synergistischen Effekts der Polysaccharid-polysulfate auf die Antikoagulationsaktivität von Spurenmengen an Heparin kann das erfindungsgemäße Verfahren als ultraempfindlicher Heparintest verwendet werden. Eine geringe Menge an erl'indungsgemäß zu verwendendem Polysaccharid-polysulfat, die zu dem Testplasma gegeben wird, welche Menge selbst keine meßbare heparinartige Antikoagulationsaktivität besitzt, verstärkt die Heparin-Antikoagulationsaktivität um das Mehrfache.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung. Beispiel 1

Für die Bestimmung der XaI biologischen Aktivität im Blutplasma werden die folgenden Reagentien hergestellt

(a) Aktivierter Faktor X (Faktor Xa) aus Rinderplasma

Dieses Reagens kann nach irgendeinem in der Literatur beschriebenen Verfahren hergestellt werdea Im allgemeinen wird eine an Faktor X reiche Fraktion aus Rinderplasma, das als BaSO₄-Eluat bekannt ist, das dann entweder mit Russeis Viperngift oder Trypsin in Anwesenheit von Calciumchlorid behandelt wird, hergestellt Der Faktor X wird dann zum Faktor Xa aktiviert Das aktivierte Gemisch wird dann an einer Ionenaustauschsäule (z.B. DEAE-Cellulose) entsprechend Yi η et al. in J. BbI. Chem. 243 (1968), Seite 112, zur Isolierung des von anderen Substanzen, insbesondere dem Schlangengift freien Faktor Xa chromatographiert Der isolierte Faktor Xa wird dann in kristallisiertem Rinderserumalbumin gemäß Y i η et al in J. Lab. Clin. Med. 81 (1973), Seite 298 (Ref. 1), stabilisiert.

(b) Antikoagulans-freies Rinderplasma (AFBP), hergestellt gemäß Yin et al (Ref. 1) wird mit Cephalin (Säunetierhirn oder Sojabohnen-phosphatiden) vermischt. Dieses Gemisch wird anschließend als AFBP-Cephalin bezeichnet.

(c) Puffer-Mono-tris (hydroxymethyl)-aminomethanmaleat

Eine Konzentration von 0,02 M, ph 7,5, wird bei diesem Versuch verwendet.

0,5 ml Citrat enthaltendes, menschliches Plasma werden mit Salzlösung (z. B. 0,9% NaCl) auf 1 :50 verdünnt. Es wird dann in ein Reagenzglas, das 0,4 ml Natriumsah: einer Lösung aus Dextransulfat (Moleku-

4(i largewicht = 20 000, Substitutionsgrad= 1,15 SuIfatgruppen/Mcnosaccharid-Einheit) in dem Puffer enthält, gegeben. Die Konzentration an Dextransulfat beträgt

ι 50μg/m! in diesem Inkubationsgemisch. Dieses Gemisch wird dann in einem 37° C Wasserbad 1 min vorerwärmt, dann wird 0,1 ml Faktor Xa zugegeben und dann wird eine erste Stoppuhr angestellt.

see nach der Zugabe von Xa wird 0,1 ml des Inkubationsgemisches in ein zweites, sauberes, in einem 37° C Wasserbad vorerwärmtes Reagenzglas gegeben.

Nach 110 see auf der ersten Stoppuhr wird 0,1 ml0,03M CaCI₂ in das zweite Reagenzglas gegeben. Nach genau see auf der ersten Stoppuhr werden 0,2 ml des AFBP-Cephalin-Gemisches kraftvoll in das zweite Reagenzglas geblasen und eine zweite Stoppuhr wird

gleichzeitig angestellt. Die Zeit (in Sekunden), die für die Bildung eines festen Koagulats erforderlich ist, wird dann gemessen. Eine Xal-Aktivität-Eichkurve wird dann aufgestellt, indem man Reihendoppelverdünnungen der Plasmaprobe unter Verwendung der 1 :50

6ü Anfangsverdünnung als 100% Aktivität (Tabelle I) herstellt.

Analog wird eine andere Xal-Aktivilät-Eichkurve aufgestellt, indem man unterschiedliche Anfangsplasmaverdünnungen und Konzentrationen an Dextransulfat

(o verwendet (Tabelle I).

Tabelle I Plasmaverdünnung bei einer % XaI-

100%igen Xal-Aktivität Aktivität

unter Verwendung von 50ag
Dextransylfat/ml Inkubationsgemisch

unter Verwendung von 33jxg

Dextransulfat/ml Inkubations-

semisch

100
50
25
12,5

6,75

100
50

25
12,5
0

Koagulationszeit

(see)

79,5
53.0
38,5
31,0
27,0
24,5

58
39

32

27,5

24 werden kann. 10 μ§ Dextransulfat zeigen selbst keine meßbare heparinartige Antikoagulationsaktivität bei diesem Untersuchungssystem.

Aus dieser Tabelle geht eindeutig hervor, daß eine Enzym-lnhibitor(Xa-XaI)-Zwischenwirkung mit hoher Sensitivität gemessen werden kann.

Beispiel 2

Das Verfahren von Beispiel 1 wird unter Verwendung einer Lösung des Natriumsalzes von Dermatansulfat ä7_w=30 0OG bis 50 000, Substitutionsgrad = 1,0 Sulfatgruppe/Disaccharid-Einheit) anstelle des Dextransulfats wiederholt. Man erhält die folgenden Ergebnisse.

Tabelle II

PlasmaverüUnnung bei einer	% Xal-	Koagula
lOOVoigcn Xal-Aktivität	Aktivität	tionszeit
		(see)
A 00	100	57,5
unter Verwendung von 15μ^	50	40,0
Dermatansulfat/ml Inkubations	25	27,5
gemisch	12,5	23,0
	0	17,4

Aus dieser Tabelle geht eindeutig hervor, daß eine Enzym-lnhibitor(Xa — Xal)-Zwischenwirkung mit hoher Empfindlichkeit gemessen werden kann.

Beispiel 3

Zur Erläuterung der möglichen Bestimmung von niedrigen Heparin-Konzentrationen nach dem erfindungsgemäßen Verfahren wird das Verfahren von Beispiel 1 mit den folgenden Ausnahmen wiederholt:

(a) Unverdünntes Plasma wird in dem Inkubationsgemisch verwendet;

(b) das Plasma enthält Heparin in einer bekannten Konzentration von 0,006 Einheiten/ml.

Die Zugabe des Natriumsalzes von Dextransulfat C^/».-20 000, Substitutionsgrad = 1,15 Sulfatgruppen/ Monosaccharid-Einheit) bis zu einer Endkonzentration von 10 μg/ml in dem Inkubationsgemisch ermöglicht die Feststellung einer heparinartigen Aktivität entsprechend 0,05 Einheiten/ml. Dies beweist, daß die Empfindlichkeil bei dem Heparintest entsprechend diesen Grundsätzen ungefähr um den Faktor 10 erhöht

Claims

Patentansprüche:

!. Verfahren für die in-vitro-Bestimmung der biologischen Aktivität von Faktor Xa-Inhibitor (XaI) im Blut, bei dem eine Blutplasmaprobe mit einem PoIysaccharid-polysulfat unu mit Faktor Xa während einer vorbestimmten Zeitdauer inkubiert und danach die Restmenge an Faktor Xa-Aktivität bestimmt wird, dadurch gekennzeichnet, daß man als Polysaccharid-polysulfat ein Dextransulfat mit 0,10 bis 3,0 Sulfatgruppen/Monosaccharideinheit oder ein Dermatansulfat mit 0,45 bis 2,0 Sulfatgruppen/Monosaccharideinheit oder ein Heparansuifat mit 0,45 bis 2,0 Sulfatgruppen/Monosaccharideinheit verwendet
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Restmenge an Faktor Xa-Aktivität unter Anwendung der Fibrinbildung als Endpunkt bestimmt wird..
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Restmenge an Faktor Xa-Aktivität durch Messung seiner Esterase-Aktivität oder der amidolytischen Aktivität bestimmt wird.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Polysaccharid-polysulfat an einen wasserunlöslichen Träger gebunden bzw. gekuppelt ist.