NO148960B - Fremgangsmaate ved in vitro-bestemmelse av den biologiske aktiviteten til faktor xa-inhibitor i blodplasma - Google Patents
Fremgangsmaate ved in vitro-bestemmelse av den biologiske aktiviteten til faktor xa-inhibitor i blodplasma Download PDFInfo
- Publication number
- NO148960B NO148960B NO764081A NO764081A NO148960B NO 148960 B NO148960 B NO 148960B NO 764081 A NO764081 A NO 764081A NO 764081 A NO764081 A NO 764081A NO 148960 B NO148960 B NO 148960B
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- factor
- inhibitor
- heparin
- sulfate
- blood plasma
- Prior art date
Links
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 title claims abstract description 23
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 21
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 title claims abstract description 9
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 title claims abstract description 6
- 229940123583 Factor Xa inhibitor Drugs 0.000 title claims abstract description 4
- 108010074860 Factor Xa Proteins 0.000 claims description 17
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 17
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 claims description 16
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 claims description 16
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 claims description 16
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 claims description 11
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 claims description 11
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L sulfate group Chemical group S(=O)(=O)([O-])[O-] QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 9
- 229960000633 dextran sulfate Drugs 0.000 claims description 8
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims description 6
- 230000002429 anti-coagulating effect Effects 0.000 claims description 5
- 229920000045 Dermatan sulfate Polymers 0.000 claims description 3
- AVJBPWGFOQAPRH-FWMKGIEWSA-L dermatan sulfate Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@H](OS([O-])(=O)=O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](C([O-])=O)O1 AVJBPWGFOQAPRH-FWMKGIEWSA-L 0.000 claims description 3
- 229940051593 dermatan sulfate Drugs 0.000 claims description 3
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 claims description 3
- 229920002971 Heparan sulfate Polymers 0.000 claims description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 claims description 2
- 125000001483 monosaccharide substituent group Chemical group 0.000 claims 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 8
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 6
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 5
- 150000002772 monosaccharides Chemical group 0.000 description 5
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 4
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 3
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 3
- 229940127234 oral contraceptive Drugs 0.000 description 3
- 239000003539 oral contraceptive agent Substances 0.000 description 3
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 201000005665 thrombophilia Diseases 0.000 description 3
- 102000004411 Antithrombin III Human genes 0.000 description 2
- 108090000935 Antithrombin III Proteins 0.000 description 2
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 108010014173 Factor X Proteins 0.000 description 2
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 229960005348 antithrombin iii Drugs 0.000 description 2
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 2
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 2
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 2
- 239000002532 enzyme inhibitor Substances 0.000 description 2
- 229940125532 enzyme inhibitor Drugs 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CFWRDBDJAOHXSH-SECBINFHSA-N 2-azaniumylethyl [(2r)-2,3-diacetyloxypropyl] phosphate Chemical compound CC(=O)OC[C@@H](OC(C)=O)COP(O)(=O)OCCN CFWRDBDJAOHXSH-SECBINFHSA-N 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M Bromide Chemical class [Br-] CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 206010010356 Congenital anomaly Diseases 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N DEAE-cellulose Chemical compound OC1C(O)C(O)C(CO)O[C@H]1O[C@@H]1C(CO)OC(O)C(O)C1O GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N 0.000 description 1
- 206010051055 Deep vein thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 108090000371 Esterases Proteins 0.000 description 1
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 description 1
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 description 1
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 description 1
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 229920000209 Hexadimethrine bromide Chemical class 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 206010020608 Hypercoagulation Diseases 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 108090000778 Platelet factor 4 Proteins 0.000 description 1
- 102000004211 Platelet factor 4 Human genes 0.000 description 1
- 108010007568 Protamines Chemical class 0.000 description 1
- 102000007327 Protamines Human genes 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 208000001435 Thromboembolism Diseases 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 206010047249 Venous thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 230000003024 amidolytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 1
- 230000000507 anthelmentic effect Effects 0.000 description 1
- 229940019748 antifibrinolytic proteinase inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical group 0.000 description 1
- 238000001311 chemical methods and process Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 229960002086 dextran Drugs 0.000 description 1
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 description 1
- 229940011871 estrogen Drugs 0.000 description 1
- 239000000262 estrogen Substances 0.000 description 1
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 description 1
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 description 1
- 239000000282 fibrinogen degradation product Substances 0.000 description 1
- 230000003027 hypercoagulation Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-N maleic acid Chemical compound OC(=O)\C=C/C(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-N 0.000 description 1
- 210000005171 mammalian brain Anatomy 0.000 description 1
- IZXGZAJMDLJLMF-UHFFFAOYSA-N methylaminomethanol Chemical compound CNCO IZXGZAJMDLJLMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000008447 perception Effects 0.000 description 1
- 230000002980 postoperative effect Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 229940048914 protamine Drugs 0.000 description 1
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000011477 surgical intervention Methods 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 230000003558 thrombophilic effect Effects 0.000 description 1
- VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N trans-butenedioic acid Natural products OC(=O)C=CC(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 239000002753 trypsin inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000002435 venom Substances 0.000 description 1
- 210000001048 venom Anatomy 0.000 description 1
- 231100000611 venom Toxicity 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/86—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood coagulating time or factors, or their receptors
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/81—Protease inhibitors
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
- G01N2333/914—Hydrolases (3)
- G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- G01N2333/95—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99)
- G01N2333/964—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue
- G01N2333/96425—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals
- G01N2333/96427—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general
- G01N2333/9643—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general with EC number
- G01N2333/96433—Serine endopeptidases (3.4.21)
- G01N2333/96441—Serine endopeptidases (3.4.21) with definite EC number
- G01N2333/96444—Factor X (3.4.21.6)
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2400/00—Assays, e.g. immunoassays or enzyme assays, involving carbohydrates
- G01N2400/10—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
- G01N2400/38—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence, e.g. gluco- or galactomannans, Konjac gum, Locust bean gum or Guar gum
- G01N2400/40—Glycosaminoglycans, i.e. GAG or mucopolysaccharides, e.g. chondroitin sulfate, dermatan sulfate, hyaluronic acid, heparin, heparan sulfate, and related sulfated polysaccharides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Fremgangsmåte ved in vitro-bestemmelse av den biologiske aktiviteten til faktor Xa-inhibitor i blodplasma.
Description
Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte ved in vitro-bestemmelse av den biologiske aktiviteten til faktor Xa-inhibitor (Xal) i blodplasma ved å inkubere blodplasma med faktor Xa i en forutbestemt ' tidsperiode. Aktivert faktor X (Xal), er et ^-globulin med molekyl-
vekt 58 000 - 65 000, og har blitt betegnet på forskjellige måter som antitrombin III, heparinkofaktor og a2-antitrypsin.
Det foreligger for tiden ingen tilfredsstillende bio-
kjemisk teknikk for tidlig diagnose av begynneride trom-
botisk tilstand hos mennesker eller dyr. Tromboembolisk sykdom begynner å bli en stadig mer betydelig invalidi-
tets- og dødsårsak, alt etter som fremskritt innen kirurg-
ien åpner veien for mer omfattende kirurgiske inngrep og østrogenholdige forbindelser anvendes i større utstrek-
ning som orale preventive midler.
I senere år er det i litteraturen dukket opp mange eksperi-mentelle data både in vitro og in vivo, som foreslår at virkningen av Xal som en naturlig forekommende antLko-
agulant ved blodkoagulering beror mer på dets inaktivering av initialt fremkalt faktor Xa og derved motvirkning av trombindannelse snarere enn å hindre trombin fra å angripe fibrinogen. Denne oppfatning forsterkes særlig ved rapport
om at spormengder av heparin i merkbar grad skulle kunne
øke inhiberingen av faktor Xa ved hjelp av Xal.
Visse indisier taler sterkt for at under og etter kirurgi skapes hos visse pasienter en tidligere ikke merkbar så-
kalt "hyperkoaguleringstilstand". Men denne hyperkoaguleringstilstand kommer til å forbli ikke trombosefrem-
kallende så lenge som hastigheten i avsetning av faktor Xa med Xal overstiger den hos faktor Xa-dannelsen. Det
har også vært hevdet at kvinner som tar orale prevensjonsmidler er mer utsatt for trombose etter skader på grunn
av senkningen av Xal i blodet.
Denne opplysning har fremkalt ideen at lave innhold av
Xal kan gjenspeile hyperkoagulasjonstilstanden. Derfor
kan det være sannsynlig at Xal-aktiviteten.i plasma skulle
kunne være en praktisk indikasjon på hyperkoagulasjons-■ J tilstand. Denne hypotesen forsterkes ytterligere ved føl-gende iakttagelser: (a) pasienter med medfodt mangel på antitrombin III (Xal) er
trombofile,
(b) kvinner som tar orale prevensjonsmidler, og som har lav Xal-aktivitet i plasma, har som gruppe en ho<y>ere frekvens av postoperativ dypvenetrombose enn de som ikke tar sådanne midler.
Det eksisterer derfor et stort behov for en spesifikk metode for å bestemme den biologiske aktiviteten av Xal i blodplasma.
Det foreligger visse metoder som tilstreber å bestemme Xal-aktiviteten. De mest anvendte metodene baseres på immuno-logisk bestemmelse og inhiberingen av trombin. Imidlertid, har disse teknikkene mange ulemper. Således angir ikke den immunologiske metoden, selv om den kommer til å påvise antigenet c^-globulin, denne inhibitors biologiske aktivitet. Det er oppgitt at blodet fra visse pasienter, som medfødt hadde mangel på denne inhibitors biologiske aktivitet, ikke viste noen svikt når målingen ble gjort med immunometoden. (Sas et al, Thromb. Diath. Haemorrh..32.
(1974) side 105).
Trombinmetoden for denne inhibitoren er ikke spesifikk etter som den på samme tid måler aktiviteten hos andre serum-proteinaseinhibitorer. (Wigham et al Thromb. Diath. Haemorrh.
34 (1975) side 365). Dessuten er den bmfintlig for meget små
mengder heparin og heparinlignende substanser og fibrinogen-nedbrytningsprodukter som er tilstede i blodplasmaet.
Nå er det helt overraskende funnet at den biologiske akti-vitetens Xal i blod kan bestemmes in vitro uten disse ulemper under anvendelse av fremqangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse, hvilken fremgangsmåte er karakterisert ved at det tilsettes et polysakkaridpolysulfat med 0,1 - 3,0 sulfatgrupper pr'", monosakkaridenhet som
(a) 'nøytraliserer den inhiberende virkningen som human-plasmakomponenter øver på Xa-inhibitors nøytralisa-
sjon av Xa,
(b) har en svak heparinliknende aktivitet,
(c) har en synergistisk virkning på antikoagulasjonseffek-ten hos spormengder av heparin,
og at deretter den gjenværende mengden av faktor Xa-aktivitet bestemmes på i og for seg kjent måte.
Den gjenværende mengden av faktor Xa.kan bestemmes ved anvendelse av fibrindannelse som sluttpunkt (måling av koagu-lasjonstiden) ifølge den innen teknikken velkjente metode. Den kan også bestemmes ved måling av esterase- eller amido-lytiske aktiviteter ved anvendelse av andre egnede sub-strater.
Når man anvender dextransulfat som polysakkaridpolysulfat, er substitusjonsgraden av sulfatgrupper fortrinnsvis 0,90 - 3,0 per monosakkaridenhet. Ved anvendelse av dermatansulfat eller heparinsulfat er substitusjonsgraden med sulfatgrupper 0,45 - 2,0 per monosakkaridenhet.
Den midlere molekylvekten til polysakkaridpolysulfatet er ikke kritisk. Således kan vannløselige polysakkaridpolysulfater med en molekylvekt på fra 1 000 opptil 10 000 000 anvendes. Det er også mulig å anvende vannløselige og
-uløselige tverrbundne polysakkaridpolysulfater. Om det er ønsket, kan polysakkaridpolysulfatet kobles til en vann-uløselig bærer som et tverrbundet dextran. Det er også
mulig å koble polysakkaridpolysulfatet til tilsvarende usubstituerte polysakkarid. I så tilfelle er substitusjonsgraden av sulfatgrupper beregnet på den substituerte delen av et slikt produkt.
Når man utforer fremgangsmåten ifolge oppfinnelsen er det formålstjenelig å fortynne proven med fysiologisk koksaltlosning eller med en buffer. En fortynning på mer enn 1/10, fortrinnsvis mer enn 1/30 anvendes da. Derved eliminieres på effektiv måte forstyrrelsen fra midlet som er kjent for å påvirke koagu-leringssystemet negativt.
Den anvendte inkuberingstiden er avhengig av konsentrajonene av reaktantene i inkuberingsløsningen og også av inkuberingstemperaturen. Det er for fagmannen lett å bestemme den optimale tiden i hvert tilfelle. Inkuberingstemperaturen kan gjerne varieres fra 20°C til 37°C.
Ved fremgangsmåten er det formålstjenelig å anvende en
pH på 7,0 - 8,0. Mengdene av polysakkaridpolysulfat og aktivert faktor X (Xa) er ikke kritiske. Således er det mulig å anvende fra 1-2 000 ug/ml av polysakkaridpolysulfat og fra 1-10 enheter av Xa/ml. Det er for fagmannen lett å bestemme de optimale konsentrasjonene i hvert tilfelle.
Ved gjennomførelsen av bestemmelsen av Xa-inhibitor ifølge foreliggende oppfinnelse kan det være. formålstjenelig å nøytralisere den heparinlignende effekten hos polysakkaridpolysulfatet ved tilsetning av passende mengder av et hepa-rinnøytraliserende stoff som heksadimetrinbromid, polybrene eller protaminsalter til substratplasmaet. Ellers blir koaguleringstidcne unødig lange.
Under utnyttelse av den synergistiske effekten til polysakka-ridpolysulf at på antikoagulanteffekten fra spormengder av heparin kan. fremgangsmåten ifblge forel iggende oppfinnelse anvendes for en ultrafolsom heparintest. En liten mengde av et polysakkaridpolysulfat tilsatt i testplasma, hvor mengden selv ikke har noen målbar heparinlignende antikoagulanteffekt,
oker heparinets antikoaguleringsvirkning flere ganger. Oppfinnelsen skal nå beskrives mer detaljert under henvis-ning til følgende konkrete utførelseseksempler.
Eksempel 1
For bestemmelse av den biologiske aktiviteten av Xal i blodplasma ble folgende reagenser fremstilt.
a) Aktivert faktor X ( faktor Xa) fra bovinplasma
Dette reagenset kan fremstilles ifblge hvilken som helst
metode som beskrives i litteraturen. En fraksjon rik på faktor X fremstilles fra bovinplasma kjent som Baso^-eluat, som siden behandles med antigen Russels ormegift eller tryp-sin i nærvær av kalsiumklorid. Faktoren X aktiveres derpå til faktor Xa. Etterpå kromatograferes den aktiverte blandingen på en anionbytterkolonne (f.eks. DEAE-cellulose)
ifblge Yin et al. i J. Biol. Chem. 243 (1968) side 112 for isolering av faktor Xa som er fri for andre substanser, spesielt ormegiften. Den isolerte faktoren Xa stabiliseres derpå i krystallisert bovinserumalbumin ifblge Yin et al. i J. Lab. Clin. Med. 81 (1973) side 298 (Ref. 1). b) Antikoagulantfritt bovinplasma (AFBP) fremstilt ifblge Yin et al. (Ref.l) og blandet med cefalin (fra pattedyrs-hjerne, eller soyabbnnefosfatider). Denne blandingen kal-les i fortsettelsen AFBP-cefalin. c) Buffer-monotris (hydroksymetyl)-aminometanmaleat. En konsentrasjon på 0,02 M, pH 7,5 anvendes ved forsbket.
0,5 ml av fortynnet humantcitratplasma (fortynnet med fysiologisk koksaltlosning (0,9 % NaCl) til 1:50) settes til et reagensrbr inneholdende 0,4 ml av en lbsning av natriumsaltet av dextransulfat (Mw = 20 000 substitusjonsgrad = 1,15 sulfatgrupper per monosakkaridenhet) i bufferen. Konsentra-sjonen av dextransulfat var 50 ug/ml av denne inkubasjons-blandingen. Denne blandingen oppvarmes siden i 1 min. i et 37°C vannbad, hvoretter 0,1 ml av faktor Xa ble tilsatt og et fbrste stoppeur startet.
90 sek. etter tilsetningen av Xa ble 0,1 ml av inkubasjons-blandingen overfort til et annet rent reagensrbr som var opp-varmet i 37°C i vannbadet. Ved 110 sek. på det fbrste stoppeuret ble 0,1 ml av 0,03 M CaCl2 tilsatt til det andre reagensrøret. Ved noyaktig 120 sek. på det forste stoppeuret ble 0,2'ml av AFBP-cefalinblandingen blåst kraftig inn i det andre reagensroret og et annet stoppeur startet samtidig. Tiden (i sek.) frem til dannelse av et fast koagulat ble deretter notert. En kalibreringskurve over Xal-aktiviteten ble deretter konstruert ved å gjore en serie dobbelt-for-tynninger av plasmaproven under anvendelse av den opprinnelige fortynningen 1:50 som 100% aktivitet. (Tabell 1).
Analogt oppnås en annen kalibreringskurve over Xal-aktiviteten ved å anvende en annen utgangsplasmafortynning og konsentrasjon av dextransulfat. (Tabell 1).
Denne tabellen angir klart at en enzym-inhibitor (Xa - Xal) innvirkning måles med hoy fblsomhet.
Eksempel 2
Fremgangsmåten ifblge eksempel 1 gjentas under anvendesle av en ren lbsning av natriumsaltet av et dermatansulfat M w=
30 000 - 50 000 substitusjonsgrad =1,0 sulfatgruppe per di-* sakkaridenhet i stedet for dextransulfatet. Fblgende resultat erholdes:
Denne tabell angir klart at en enzym-inhibitor (Xa - Xal) innvirkning måles med hoy folsomhet.
Eksempel 3
For å belyse muligheten for å bestemme- lave konsentrasjoner
av heparin ved hjelp av metoden i folge foreliggende oppfinnelse gjentas forsoket ifblge eksempel 1 med folgende endringer:
a) Fortynnet plasma ble anvendt i inkuberingsblandingen
b) Plasma inneholdt heparin i en kjent konsentrasjon på
0,006 enheter/ml.
Tilsetninqen av natriumsaltet av dextransulfat (M = 20 000, substitusjonsgrad 1,15 sulfatgrupper per monosakkaridenhet) til en sluttkonsentrasjon på 10 ug/ml i inkuberingsblandingen resulterte i påvisningen av en heparinlignende aktivitet sva-rende til 0,05 enheter/ml. Dette viser at folsomheten til en. heparintest ifblge disse prinsipper kunne bkes approksimativt med en faktor på ti. 10 ug dextransulfat har i seg selv ingen målbar heparinlignende effekt i dette testsystemet.
Claims (3)
1. Fremgangsmåte ved in vitro-bestemmelse av den biologiske aktiviteten til faktor Xa-inhibitor (Xal) i blodplasma ved å inkubere blodplasma med faktor Xa i en forutbestemt tidsperiode, karakterisert ved at det tilsettes et polysakkaridpolysufat med 0,1 - 3,0 sulfatgrupper pr. monosakkaridenhet som (a) nøytraliserer den inhiberende virkningen som human-plasmakomponenter øver på Xa-inhibitors nøytralisasjon av Xa, (b) har en svak heparinliknende aktivitet, (c) har en synergistisk virkning på antikoagulasjonseffek-ten hos spormengder av heparin,
og at deretter den gjenværende mengden av faktor Xa-aktivitet bestemmes på i og for seg kjent måte.
2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at man som polysakkaridpolysulfat anvender et dextran-sulf at.
3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at polysakkaridpolysulfatet er et dermatansulfat eller et heparansulfat med 0,45 - 2,0 sulfatgrupper pr. monosakkaridenhet.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SE7513495A SE419871B (sv) | 1975-12-01 | 1975-12-01 | Sett att bestemma aktiviteten hos faktor xa-inhibitor i blod |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NO764081L NO764081L (no) | 1977-06-02 |
| NO148960B true NO148960B (no) | 1983-10-10 |
| NO148960C NO148960C (no) | 1984-01-18 |
Family
ID=20326201
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO764081A NO148960C (no) | 1975-12-01 | 1976-11-30 | Fremgangsmaate ved in vitro-bestemmelse av den biologiske aktiviteten til faktor xa-inhibitor i blodplasma |
Country Status (15)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4139415A (no) |
| JP (1) | JPS5915640B2 (no) |
| AT (1) | AT348687B (no) |
| AU (1) | AU508343B2 (no) |
| BE (1) | BE848932A (no) |
| CA (1) | CA1060324A (no) |
| CH (1) | CH625052A5 (no) |
| DE (1) | DE2654189C3 (no) |
| DK (1) | DK537676A (no) |
| FI (1) | FI63494C (no) |
| FR (1) | FR2334109A1 (no) |
| GB (1) | GB1562808A (no) |
| NL (1) | NL7613376A (no) |
| NO (1) | NO148960C (no) |
| SE (1) | SE419871B (no) |
Families Citing this family (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE2757992A1 (de) | 1977-12-24 | 1979-06-28 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur prothrombin-bestimmung |
| US4302538A (en) * | 1978-03-27 | 1981-11-24 | Ortho Diagnostics Inc. | Buffer system in an anti-thrombin III test |
| SE422081B (sv) * | 1979-08-22 | 1982-02-15 | Ird Biomaterial Ab | Sett att pavisa proteolytiska enzymer |
| CA1161432A (en) * | 1980-02-12 | 1984-01-31 | Lars G. Svendsen | Tripeptide derivatives and their application in assaying enzymes |
| EP0049877B1 (de) * | 1980-10-09 | 1984-05-23 | Roche Diagnostics GmbH | Verfahren und Reagenz zur Bestimmung von Antithrombin-BM |
| US4753875A (en) * | 1981-11-02 | 1988-06-28 | Ryan James W | Method for assaying proteases with tagged proteinaceous inhibitors |
| US5221614A (en) * | 1988-03-03 | 1993-06-22 | Nippon Shoji Kabushiki Kaisha | Method and reagent for determining the biological activity of antithrombin III by measuring coagulation time |
| GB9602166D0 (en) * | 1996-02-02 | 1996-04-03 | Zeneca Ltd | Aminoheterocyclic derivatives |
| DE19634312A1 (de) * | 1996-08-24 | 1998-02-26 | Behringwerke Ag | Verfahren zur Herstellung von Faktor V-Mangelplasma und ein so erhaltenes Mangelplasma |
| US6432658B1 (en) | 2000-09-13 | 2002-08-13 | Affinity Biologicals, Inc. | Method for measuring antithrombin activity |
| EP2818871A1 (en) * | 2013-06-28 | 2014-12-31 | Roche Diagniostics GmbH | Means and methods for universal calibration of anti-Factor Xa tests |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SE380257B (sv) * | 1972-05-02 | 1975-11-03 | Bofors Ab | Nya diagnostiskt verksamma substrat med hog specificitet till trombin och andra proteolytiska enzymer av typen peptidyl-peptid-hydrolaser |
| US3985618A (en) * | 1975-05-02 | 1976-10-12 | Irving Innerfield | Method for detection of thrombosis and prethrombosis |
-
1975
- 1975-12-01 SE SE7513495A patent/SE419871B/xx unknown
-
1976
- 1976-11-23 US US05/744,227 patent/US4139415A/en not_active Expired - Lifetime
- 1976-11-29 AU AU20061/76A patent/AU508343B2/en not_active Expired
- 1976-11-29 GB GB49679/76A patent/GB1562808A/en not_active Expired
- 1976-11-30 BE BE172864A patent/BE848932A/xx not_active IP Right Cessation
- 1976-11-30 NO NO764081A patent/NO148960C/no unknown
- 1976-11-30 FI FI763446A patent/FI63494C/fi not_active IP Right Cessation
- 1976-11-30 DK DK537676A patent/DK537676A/da unknown
- 1976-11-30 CA CA266,874A patent/CA1060324A/en not_active Expired
- 1976-11-30 DE DE2654189A patent/DE2654189C3/de not_active Expired
- 1976-12-01 JP JP51143524A patent/JPS5915640B2/ja not_active Expired
- 1976-12-01 FR FR7636233A patent/FR2334109A1/fr active Granted
- 1976-12-01 CH CH1514576A patent/CH625052A5/de not_active IP Right Cessation
- 1976-12-01 NL NL7613376A patent/NL7613376A/xx unknown
- 1976-12-01 AT AT891076A patent/AT348687B/de not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| NL7613376A (nl) | 1977-06-03 |
| NO764081L (no) | 1977-06-02 |
| JPS5297792A (en) | 1977-08-16 |
| FR2334109B1 (no) | 1982-03-12 |
| AU2006176A (en) | 1978-06-08 |
| DE2654189A1 (de) | 1977-06-08 |
| FI763446A (no) | 1977-06-02 |
| NO148960C (no) | 1984-01-18 |
| DE2654189B2 (de) | 1979-03-08 |
| SE7513495L (sv) | 1977-06-02 |
| AU508343B2 (en) | 1980-03-20 |
| DE2654189C3 (de) | 1985-10-03 |
| US4139415A (en) | 1979-02-13 |
| BE848932A (fr) | 1977-05-31 |
| SE419871B (sv) | 1981-08-31 |
| JPS5915640B2 (ja) | 1984-04-10 |
| FI63494B (fi) | 1983-02-28 |
| DK537676A (da) | 1977-06-02 |
| ATA891076A (de) | 1978-07-15 |
| CA1060324A (en) | 1979-08-14 |
| AT348687B (de) | 1979-02-26 |
| CH625052A5 (no) | 1981-08-31 |
| GB1562808A (en) | 1980-03-19 |
| FR2334109A1 (fr) | 1977-07-01 |
| FI63494C (fi) | 1983-06-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Sas et al. | Abnormal antithrombin III (antithrombin III ‘Budapest’) as a cause of a familial thrombophilia | |
| Teitel et al. | Protection of factor Xa from neutralization by the heparin-antithrombin complex. | |
| Linhardt et al. | Differential anticoagulant activity of heparin fragments prepared using microbial heparinase. | |
| Kakkar et al. | Low-molecular-weight heparin and prevention of postoperative deep vein thrombosis. | |
| NO148960B (no) | Fremgangsmaate ved in vitro-bestemmelse av den biologiske aktiviteten til faktor xa-inhibitor i blodplasma | |
| NO148142B (no) | Fremgangsmaate ved fremstilling av et blodkoaguleringsfremmende preparat fra humant blodplasma | |
| Odegaard et al. | Protein C: an automated activity assay | |
| JP5118321B2 (ja) | ヘパリン修飾成分を用いた第Ｘａ因子に基づくヘパリンアッセイ | |
| Radoff et al. | Location on heparin of the oligosaccharide section essential for anticoagulant activity. | |
| De Smedt et al. | The technique of measuring thrombin generation with fluorogenic substrates: 3. The effects of sample dilution | |
| EP1230382B1 (en) | Monitoring the activity of factor xa inhibitors | |
| Hänsch et al. | Effect of aspirin on the complement system in vitro | |
| Spöttl et al. | A basic study on the global coagulation and fibrinolysis of hyperlipaemic and atherosclerotic patients: Part 2. Plasminogen activator, plasminogen, α2-Macroglobulin in atherosclerosis and endogenous hypertriglyceridaemia | |
| Cavari et al. | Endogenous heparinase-sensitive anticoagulant activity in human plasma | |
| Fischer et al. | Comparison between the effect of pentosan polysulphate heparin and antithrombin III injections in antithrombin III deficient patients | |
| Hirsh et al. | Guide to anticoagulant therapy, I: heparin | |
| Bigland et al. | Chicken prothrombin, thrombin, and fibrinogen | |
| Ferrara et al. | The association between the 4G/5G polymorphism in the promoter of the plasminogen activator inhibitor-1 gene and extension of postsurgical calf vein thrombosis | |
| CS226407B2 (en) | Method of determining mb creatinkinase | |
| Van den Besselaar et al. | Response of the activated partial thromboplastin time (APTT) to heparin is influenced by coagulometers | |
| JPH1090273A (ja) | 抗トロンビンｉｉｉ含有溶液中のグリコサミノグリカンを定量する方法 | |
| Scully | The use of an automated analyzer in the evaluation of antithrombin III and heparin | |
| EP0260707B1 (en) | Method for assaying plasma protein and measuring kit for the same | |
| Aiach et al. | Practical considerations on the measurement of low molecular weight heparin anti-Xa activity | |
| Buø et al. | The contact system in human malignant and benign ascites |