DE2652636A1 - Verfahren zur stabilisierung von proteinen und verwandten verbindungen waehrend ihrer reinigung, isolierung und lagerung - Google Patents

Description

• Verfahren zur Staoilisierung von Proteinen und verwandten
• Verbindungen während ihrer Reinigung, Isolierung und Lagerung Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Stabillsierung empfindlicher Proteine und verwandter Verbindungen (insbesondere Lipoproteine und Glycoproteine) während ihrer Reinigung, Isolierung und Lagerung durch Zusatz stabilisierender Schutzsubstanzen mit amphiphiler Struktur.
• Die Reinigung vieler Proteine (incl. Proteide) erfolgt heute mit Hilfe weitverbreiteter Verfahren, wie z. B.
• der shromatographie oder der fraktionierten Fällung. Zahlreiche Proteine, besonders solche mit einem hydrophoben Oberflächenanteil £z. B. Membranproteine), lassen sich jedoch mit den herkömmlichen Methoden der Proteintrennung nicht isolieren, da sie während des Trenprozesses partiell oder total denatiert werden. Verschiedene Membranenzyme werden auf diese Weise inaktivert (vgl. dazu R. L. JULIANO, Biochim. Biophys.
• Acta 300 (1973) 341 - 378).
• Die Ursache für die erwähnte Inaktivierung liebt in der spezifischen Struktur der Proteine und der sich hieraus ergebenden Verhaltensweisen in wäßrigen Medien Der Kontakt ihrer hydrophoben Oberfläche, die nach der Ablösung der Detreffenden Proteine von der Membran freigelegt wird, mit wäßrigen Medien führt zu einer häufig irreversiblen Strukturumwandlung (Konfortmationsänderung), in deren Verlauf die biologischen Aktivitäten der Proteine - also ihre wesentlichen.
• Eigenschaften - meist verlorengehen.
• Prinzipiell ist ein Schutz vor Inaktivierung dann möglich, wenn die empfindlicher Oberflächenanteile der betreffenden Proteine durch Zusatz spezieller Stabilisatoren vor dein Kontakt mit der wässrigen Phase geschützt werden. Hierfür kommen amphiphile Substanzen in Frage.
• deren Molekül einen hydrophoben und einen hydrophilen Toll besitzen, wie es bei vielen Detergentien der Fall ist.
• Im wäßrigen Medium ist eine Stabilisierung von Membranproteinen durch den Zusatz von Phospholipiden möglich, die als wesentliche Bestandteile der Membranen die natürliche Umgebung dieser Proteinklasse darstellen. Dieser sehr wirksame stabilisierende Zusatz erlaubt jedoch wegen der Bildung relativ großer Protein-Lipid-Komplexe (Teilchengewicht > 2 x 106 Dalton) keine Auftrennung von Proteingemischen, d. l die Isolierung einzelner Proteine ist meistens nicht möglich (vgl. dazu Ch. TANFORD und J.
• A. REYNOLDS, Biochim. Biophys. Acta 457 (T976) 135 sowie H. U. WOLF, Habilitationsschrift, Mainz, 1976).
• Andererseits führt der Zusatz von Detergentien zu wäßrigen Medien, die als Aeguilibrierflüssigkeiten z. B. für Gelchromatographiesäulen eingesetzt werden, zwar in vielen Fällen zu guten Trennergebnissen, jedoch häufig auch zu irreversiblen Veränderungen (Inaktivierung) der nativen Enzyme (A. HELENIUS und K. SIMOMB, Biochim.
• Biophys.- Acta 415 t1975) 29; H. U. WOLF, Habilitationsschrift, Mainz, 1976).
• Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, die zu isolierenden Proteine durch den Zusatz spezieller Stabilisatoren vor partieller oder totaler Denaturierung und damit vor Verlust ihrer biologischen Eigenschaften zu schützen und gleichzeitig eine Auftrennung dieser Proteingemische zu ermöglichen.
• Diese Stabilisierung bei erhaltener Trennbarkeit der Proteine erreicht man dadurch, daß den für die Trennung der Proteine verwendeten Medien Gemische aus verschiedenen amphiphilen Substanzen zugesetzt werden, z. b. Gemische aus Phospholipiden und nichtonischen Detergentien.
• Die für die Wirksamkeit dieser Gemische erforderliche homogene Dispersion wird durch Ultrabeschallung des Gemiscns erreicht.
• Als Anwendungesbeispiel für die bes-chriebene Methode -sei die Isolierung und Stabilisierung der high-affinity 2+-Adenosintriphosphatase (Ca2+-ATPase)-der Human erythrocytenmembran gegeben (vgl. dazu lI U. WOLF, Habilitationsschrift, Mainz, 1976). Die Isolierung dieses Enzyms erfolgt mit Hilfe der Gelchromatographie auf Sepharose CL-GB oder CL-4B.
• Der Schutz dieses Membranenzyms vor Inaktivierung erfolgt während des chromatographischen Trennprozesses dadurcn, das die gesamte Trennsäule (6o - loo cm Länge, 2,6 cm Innendurchmesser) vor der Aufgabe des Trennguts mit einem Medium äquilibriert wird, das außer den für das Enzym essentiellen Ionen o.5 g Lecithin (aus Hühnereigelb) und 6.85 g Tween 20/Liter Aequilibrierlösung enthält.
• Mit Hilfe einer 30 min. langen Ultrabescnallung dieses Mediums bei OOC unter Stickstoffbegasung werden aus dem Gemisch amphiphiler Substanzen gemischte Micellen erzeugt, deren Vorhandensein für den Erfolg der Trennung notwendig ist. Die Zusammensetzung des Elutionemedluins ist identisch mit derjenigen des Aequilibiermediums.
• Andere Bedingungen für eine erfolgreiche Isolierung unter gleichzeitiger Stabilisierung der oben erwähnten Ca2+-ATPase sind 0.5 g Lecithin (aus Hühnereigelb) und 1.0 g Triton X-100/Liter Lequilibrier- bzw. Elutionsmedium.
• Der mit Hilfe dieser Methode erzielbare Trennerfolg hängt im wesentlichen vom Verhältnis [Lipid]/[Detergens] ab. Das beruht auf der Tatsache, dalS durch-tie Aenderung dieses Verhältnisses die Elutionsvolumina der zu trennenden Proteine in unterschiedlich großem Ausmaß zu beeinflussen sind. Hierdurch besteht die Möglichkeit, daß Proteintrennungen, die in einem einzigen chromatographischen Schritt nicht durchführbar sind, weil die Differenzen zwischen den Elutionsvolumina einzelner Komponenten zu gering sind., durch die Wahl eines anderen Verhältnisses [Lipid]/[Detergens] doch noch erreichbar sind. Eine Aenderuhig der Trennbedingungen kann zusätzlich durch einen Wechsel des Detergens erfolgen, das zrr Bildung der genischten icellen eingesetzt wird.
• Die Stabilität der oben erwähnten Ca2+-ATPase wird durch die genannten Zusätze an amphiphilen Substanzen entscheidend erhöht: während für das von der Membran abgelöste Enzym bei 0 - 20C Halbwertszeiten für die Inaktivierung von ca. 7 Stunden gemessen werden, liegt die Halbwert.sseit nach Zusatz der genannten amphiphilen Substanzen (d. h. nach dei gelchromatographischen Reinigung) bei mehr als 400 Stunden. Die Ausbeute an enzymatischer Aktivität beträgt nach der oben beschriebenen Gelchromatographie im allgemeinen 80 - loo % der zur Chromatographie eingesetzten Aktivität, während sie ohne amphiphile Substanzen oder bei Zusatz von Detergens allein auf 2 - 5 % abfällt (H. U. WODF, Habilitationsschrift, Mainz, 1976).
• Die Anwendung amphiphiler Substanzen oder von Gemischen derselben zur Stabilisierung von Proteinen beschränkt sich nicht auf die Reinigung durch Gelchromatographie, sondern ist gleichermaßen auch bei anderen Proteiiitrenn- crua -isolierungsmethoden anwendbar, so z. B.
• bei der Ionenaustauschchromatographie und der Fraktionie rung durch Ammoniumsulfat.
• Unter Anwendung aller Variationsmöglichkeiten, die diese Methode bietet, wie Variation des Verhältnisses [Lipid]/[Detergens], der Absolutkonzentration der amphiphilen Substanzen sowie der Wahl der geeigneten Lipid-und Detergenskomponente(n) sollte es möglich sein, für praktisch jedes Protein optimale Bedingungen sowohl hinsichtlich seiner Stabilisierung als auch seiner Isolierung zu finaen.

Claims (8)

1. Patentansprüche 1. Verfahren zur Reinigung, Isolierung und Lagerung empfindlicher Proteine und verwandter Substanzen (insbes-ondere Lipoproteine und Glycoproteine), d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t, das zur Stabilisierung dieser Verbindungen Schutzsubstanzen mit amphiphiler Struktur verwendet werden.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, d a d u r c h g e k e n n -z e i c h n e t, datS die verwendeten Schutzsubstanzen mit amphiphiler Struktur Lipide (insbesondere Phospholipide), ionische oder nichtionsche Detergentien oder Mischungen derselben sind.
3. 3. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 2, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t, daß die verwendeten Schutzsubstanzen während mindestens einer Phase des Trenn- und Isolierungsvorgangs oder während des gesamten Trenn- und Isolierungsvorgangs in den bei den jeweiligen Prozessen eingesetzten Medien anwesend sind.
4. 4. Verfahren nach den Ansprüchen 1 - 3, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t, daß die verwendeten Schutzsubstanzen in geeigneter VIelse (besonders mit Hilfe von Ultraschall) in den bei den jeweiligen Trenn- und Isolierungsprozessen eingesetzten Medien dispergiert werden.
5. 5. Verfahren nach den Ansprüchen 1 - 4, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t, daß bei Anwendung chromatographischer Trenmethoden die entsprechenden Trennsäulen mit Medien äquilibriert werden, welche die Schutzsubstanzen enthalten.
6. b. Verfahren nach den Ansprüchen 1 - 4, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t, daX bei Anwendung chromatographischer Methoden mit Hilfe von Medien eluiert wird, welche die Schutzsubstanzen enthalten.
7. 7. Verfahren nach den Ansprüchen 1 - 4, d d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t, dalS bei Anwendung elektrophoretischer Trennmethoden dir verwendeten Schutzsubstanzen in den Elektrodenbädern sowie im Trägermaterial (z.

   B. in Gel) bzw. in der Trennkammer anwesend sind.
8. 8. Verfahren nach den Ansprüchen 1 - 4, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t, daX die genannten Schutzsubstanzen in geeigneter Dispersion während der Lagerung der Proteine (bzw. Proteide) - besonders im flüssigen gefrorenen oder gefriergetrockneten Zustand - anwesend sind.