DE2643213C2

DE2643213C2 - Verfahren zum Abschwächen oder Inaktivieren von Mikroorganismen

Info

Publication number: DE2643213C2
Application number: DE2643213A
Authority: DE
Inventors: Otto Christian Dr. 7902 Blaubeuren Straub
Original assignee: Bayer AG
Current assignee: Bayer AG
Priority date: 1976-09-25
Filing date: 1976-09-25
Publication date: 1985-02-21
Also published as: GB1552726A; BE858992A; DK421477A; US4188375A; JPS5341419A; IT1087527B; ES462588A1; FR2365632A1; FR2365632B1; DK144479C; DE2643213A1; CH637422A5; DK144479B

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Abschwächen oder Inaktivieren von Mikroorganismen, die zu Impfstoffen aufgearbeitet werden sollen.

Es ist bereits bekanntgeworden, daß man Mikroorganismen, insbesondere Bakterien und Viren, durch eine Anzahl von Passagen (Gewebekulturen bzw. lebende Tiere oder Organe usw.) abschwächen kann, wobei diese so attenuierten Viren und Bakterien zwar noch vermehrungsfähig sind, jedoch ihre Pathogenität verloren haben. Solche attenuierten Viren haben ihre Immunogenität noch beibehalten (Lebendimpfstoffe). Der Nachteil dieser in der Literatur vielfach beschriebenen Attenuierungsverfahren (siehe z. B. deutsche Offenlegungsschrift 20 33 946) ist vor allem der enorme Zeit- und Arbeitsaufwand, welcher notwendig ist, bis der gewünschte Attenuierungsgrad durch Passagicrung erreicht worden ist. So kann man bei einer Attenuierung über z. B. 100 Gewebekulturpassagen mit einer Attenuierungsdauer von cirka einem Jahr rechnen.

Weiterhin ist bekanntgeworden, daß man Mikroorganismen, vorzugsweise Bakterien und Viren, mit Hilfe chemischer Agentien (sog. »Inaktivierungsmittel«) inaktivieren kann. Als Inaktivierungsmittel kommen eine Reihe verschiedener chemischer Stoffe und Stoffklassen in Frage, beispielsweise Formaldehyd, Äthylenimin und dessen Derivate Glutaraldehyd./y-Propiolacton, Phenol, Wasserstoffperoxid und verschiedene andere.

Die bekannten Verfahren sind jedoch nicht immer jeweils auf alle Mikroorganismen anwendbar, die Inaktivierungsdauer mit verschiedenen Inaktivierungsmittel (z. B. Formaldehyd) ist z. T. lang.

Weiterhin ist bekanntgeworden, daß z. B. durch Einwirkung von Wärme oder ultraviolettem Licht eine Inaktivierung von Mikroorganismen durchgeführt werden kann.

Bisher bekannte Inaktivierungsverfahren haben zum Teil verschiedene Nachteile, so wird zum Teil der antigene Aufbau von Mikroorganismen, beispielsweise Viren, zu weitgehend zerstört. Weiterhin ist es manchmal schwierig, eine vollkommene Zerstörung der infektiösen Eigenschaften der Mikroorganismen herbeizuführen und gleichzeitig die antigenen Eigenschaften beizubehalten. Zum Teil ist es möglich, daß unter Umständen bestimmte inaktivierte Mikroorganismen ihre infektiösen Eigenschaften wiedererhalten. Außerdem besteht beispielsweise bei Durchführung der Inaktivierung mit Formaldehyd oder bei Einwirkung von ultraviolettem Licht die Gefahr der Aggregat-Bildung, vobci unter Umständen unbehandeltc Teile der infektiösen Mikroorganismen zurückgehalten werden.

Es wurde ein Verfahren zum Abschwachen oder Inaktivieren von Mikroorganismen, die zu Lebend- oder Totimpfstoffen formuliert werden, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Mikroorganismensuspension gegebenenfalls in Gegenwart eines Kulturmediums unter sterilen Bedingungen einem elektrischen Wechselstromfeld vorgegebener Netzspannung (Wechselstromspannung 110. 220 oder 330 V, Stromstärke 200-30OmA. Edelmetallelektrot'.en) für die zur Ab-Schwächung oder Inaktivierung ausreichende Zeil aussetzt, gefunden.

Bei der Herstellung von Lebend- oder Totimpfstoffen nach dem erfindungsgemäßen Verfahren werden die oben geschilderten Nachteile der bisher bekanntgewordenen Attenuierungs- bzw. Inaktivierungsverfahren vermieden. Das erfindungsgemäße Verfahren stellt somit einen großen und überraschenden Fortschritt auf dem Gebiet der Human- und Veterinärmedizin dar.
Das erfindungsgernäße Verfahren wird in einem ReaktionsgefäD unter sterilen Bedingungen durchgeführt. Als zweckmäßig hat sich dabei die aus der Figur ersichtliche Apparatur herausgestellt. Die Apparatur besteht aus einer flachen Flasche aus Glas mit drei öffnungen. Die Öffnung am Flaschenhals (©) ist durch einen Stopfen, enthaltend ein Anlaßrohr mit Ventil, verschlossen, die anderen beiden Öffnungen sind ebenfalls durch Stopfen verschlossen, durch welche die Elektroden aus Edelmetall (beispielsweise Gold, Ptesin oder Silber, vorzugsweise Silber, aber auch Edelmetallegierungen sind

jo möglich) geführt werden, welche an eine elektrische Wechselstromspannungsquelle angeschlossen sind ©, ©. Zur Kontrolle ist in der Flasche ein Thermometer angebracht©.

Im Glasgefäß befindet sich die mit dem elektrischen Wechselstrom zu behandelnde Mikroorganismensuspension. Die zu wählenden Versuchsbedingungen (Temperatur, Dauer der Behandlung mit elektrischem Wechselstrom, Wechselstromspannung, Stromstärke, pH-Wert usw.) sind von der Beschaffenheit des zu behandelnden Mikroorganismus und den durch das erfindungsgemäße Verfahren beabsichtigten Effekt (zum Beispiel Anenuierung zum Lebendimpfstoff bzw. Inaktivierung zum Totimpfstoff) abhängig. Außerdem ist die Wirkung der einzelnen Faktoren zum Teil miteinander gekoppelt, so daß man eine niedrigere Stromstärke beispielsweise durch eine längere Einwirkungszeit des Wechselstroms ausgleichen kann.

Man kann zur Erreichung höherer Spannungs- und Stromstärkewerte das Gefäß auch mit einem Kühlmantel versehen.

Als Mikroorganismen kann man beim erfindungsgemäßen Verfahren alle Stoffe einsetzen, die sonst auch durch Attenuierung über Gewebekultur- oder Tierpassagen bzw. durch Inaktivierung mit Hilfe chemischer und physikalischer Methoden in Lebend- bzw. Totimpfstoffen übergeführt werden können.
Beispielhaft seien aufgeführt:

RNS-Viren folgender Gruppen:

bo stabförmige Pflanzenviren, Picornviren, Encepha-Io-Viren, Rhabdoviren, Leukoviren, Myxoviren. Paramyxoviren, doppelstrangige RNS-Viren.

DNS-Vircn folgenderGruppen:

kleine DNS-Phagen, Parvoviren, Adenoviren. Papovaviren, Phagen mittlerer Größe, große Phagen. Herpcsviren, irisierende Viren, paravakzinalc Viren, Pockenviren, Adeno-Bcgleitviren. sowie Com-

na- und Rotaviren.
Als in Frage kommende Bakterien seien genannt:

Bakterien der Ordnung Eubacteriales (unverzweigte Bakterien), vorzugsweise der Gattungen Neisseria. Streptococcus, Leuconostcc, Pseudomonas, Escherichia, Serratia, Proteus. Salmonella. Pasteurella, Brucella, Haemophilus. Corynebacterium, Clostridium. Bakterien der Ordnung Actinomycetales, vorzugsweise der Gattung Streptomyces Bakterien der Ordnung Spirochaetales vorzugsweise der Gattung Leptospira.

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Falls man attenuierte, d. h. nicht pathogene, aber noch voll immunogene, lebende Mikroorganismen in Form von Lebendimpfstoffen herstellen will, haben sich in Abhängigkeit vom eingesetzten Mikroorganismus folgende Verfahrensbedingungen als zweckmäßig erwiesen:

Wechselstromspannung

Im allgemeinen arbeitet man zweckmäßigerweise mit der vorliegenden Netzspannung, welche bei den im Rahmen der vorliegenden Anmeldung durchgeführten Versuchen 220 V betrug, natürlich kann man auch mit anderen Spannungswerten beispielsweise 110 oder 330 V arbeiten. In einem solchen Falle sind die anderen Reaktionsbedingungen auszugleichen.

Stromstärke

Als zweckmäßig hat sich bei einer Wechselspannung von 220 V eine Stromstärke von 200 bis 300 mA erwiesen. Natürlich sind in Abhängigkeit von der Stromspannung und der Beschaffenheit der Lösung auch andere Stromstärkewerte möglich.

Temperaturen

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Die Behandlung mit dem elektrischen Wechselstrom wird im allgemeinen bei Temperaturen von 4 bis 6O⁰C. vorzugsweise bei 20 bis 40⁰C und insbesondere bei 37°C bis 39°C (physiologischer Temperaturbereich) durchgeführt. Die angewandte Temperatur iit beispielsweise abhängig von der Thermostabilität des eingesetzten Mikroorganismus.

Man kann die Temperatur der zu behandelnden Mikroorganismen bzw. -suspensionen bei gleichbleibender Stromspannung einstellen, in dem man die Stromstärke in dem Maße variiert, daß ein konstanter Temperaturwert in der zu behandelnden Mikroorganismensuspension vorliegt.

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Dauer der Behandlung mit dem
elektrischen Wechselstrom

Bei der Behandlung zwecks Herstellung von Lebendvakzinen auf der Basis attenuierter Mikroorganismen e>0 (vorzugsweise Bakterien und Viren) hat sich eine Behandlungszeit von 5 bis 300 Minuten, insbesondere von 30 bis 240 Minuten als zweckmäßig erwiesen. Es sind aber in Abhängigkeit von der Natur des eingesetzten Mikroorganismen und der angewandten anderen Ver- b5 Suchsbedingungen (wie z. B. Temperatur. Suspensionsmittel. Stromspannung und Stromstärke) Zeitwerte innerhalb 5 bzw. oberhalb 300 Minuten möglich.

Außerdem ist es von Bedeutung, welcher Attenuierungsgrad, meßbar durch an sich bekannte tierexperimentelle Methoden erreicht werden seil.

Falls man mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens inaktivierte Mikroorganismen zur Verwendung in Totimpfstoffen herstellen möchte, gelten die gleichen bezüglich Wechselstromspannung, Stromstärke und Temperaturen bei der Herstellung von attenuierten Mikroorganismen zur Verwendung in Lebendimpfstoffen gemachten Aussagen.

Das Verfahren der Behandlung von Mikroorganismen mit elektrische.τι Wechselstrom ist also bei der Inaktivierung von Mikroorganismen das gleiche wie bei der Attenuierung von Mikroorganismen.

Die Inaktivierung nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erfordert aber im allgemeinen einen größeren Zeitaufwand.

So dauert der Inaktivierungsprozeß nach dem erfindungsgemäßen Verfahren im allgemeinen 10 bis 72 und vorzugsweise 15 bis 48 Stunden. Es sind aber in Abhängigkeit von der Natur des eingesetzten Mikroorganismus und der angewandten anderen Versuchsbedingungen (wie z. B. Temperatur. Suspensionsmittel. Stromspannung und Stromstärke) Werte unterhalb ΊΟ und über 72 Stunden möglich.

Als Ausgangsmaterialien werden beim erfindungsgemäßen Verfahren im allgemeinen wäßrige Suspensionen der obengenannten Mikroorganismen eingesetzt. Vorzugsweise werden diejenigen Medien verwendet, in welchen die zu behandelnden Mikroorganismen gezüchtet werden, wie z. B. Earle-Medium, gegebenenfalls unter Zusatz von Lactalbumin-Hydrolysat oder folgenden anderen Medien: Eagle's Medium. Hanks Medium Medium PM-13(Serva). VM-3a Medium MEM-Medium etc.

Die nach der Behandlung mit elektrischem Wechselstrom anfallenden Endprodukte, welche attenuierte oder inaktivierte Mikroorganismen enthalten, werden entweder als solche in steriler Form appliziert oder nach an sich bekannten und üblichen Methoden zur Lebendoder Totimpfstoffen formuliert und als Lösung Sirup, Emulsion, Suspension, Spray. Salbe. Paste. Creme. Lotion, Aerosol, Tabletten usw. verabreicht.

Die Formulierungen werden in an sich bekannter Weise hergestellt, z. B. durch Verdünnung der erfindungsgemäß attenuierten oder inaktivierten Mikroorganismen mit geeigneten Lösungsmitteln und/oder inerten nichttoxischen, festen, halbfesten oder flüssigen Trägerstoffen, gegebenenfalls unter Verwendung von Emulgier- und/oder Dispergier-, Sprüh- und Treibmitteln und unter Verwendung von geeigneten Stabilisatoren.

Als Lösungsmittel, Trägerstoffe, Emulgier- bzw. Dispergiermittel seien hier genannt:

Wasser, nichttoxische organische Lösungsmittel bzw. Verdünnungsmittel wie Paraffine (z. B. Erdölfraktionen), pflanzliche öle (z. B. Erdnuß-/Sesamöl). mehrwertige Alkohole wie z. B. Glycerin. GIycole (z.B. Propylenglycol. Polyäthylenglycol) und Wasser: feste Trägerstoffe wie z. B. natürliche Gesteinsmehle (z. B. hochdisperse Kieselsäure. Silikate). Zucker (z. B. Rohr-, Milch- und Traubenzukker); Emulgiermittel, wie nichtionogene und anionische Emulgatoren (z. B. Polyoxyäthylen-Fettsäure-Ester. Polyoxyät hy len-Fettalkohol-Äther. Alkylsulfonate und Alkylsulfonate). Dispergiermittel (z. B. Lignin. Methylcelliilosc. Starke und Polyvinylpyr-

rolidon) und Gleitmittel (ζ. B. Magnesiumsiearat. Talkum, Stearinsäure und Natriumlaurylsulfat).

Als Stabilisatoren seien aufgeführt:

Aminosäuren, Zucker, Proteine, Polysaccharide. Polyalkylcnglycolc.

Diese Stabilisatoren können sowohl in wäßriger Lösung als auch im lyophilisierten Zustand zugesetzt werden.

Die erfindungsgemäß attenuierten Viren und Bakterien bzw. die aus diesem erfindungsgemäß erhaltenen Arzneimittel können in üblicher Weise angewendet werden, z. B. oral, intramuskulär, subcutan, lokal, insbesondere an allen Schleimhäuten des menschlichen und tierischen Körpers.

Die Applikationsmenge bei der Behandlung des menschlichen und tierischen Organismus müssen von Fall zu Fall ermittelt werden. Sie entsprechen jedoch in der Regel den nach dem klassischen Verfahren hergestellten Mengen (z. B. 10⁵KIDaO pro ml bzw. g) des Impfstoffes.

Die in den folgenden Beispielen gebrauchten Abkürzungen haben folgende Bedeutung:

IBR/TPV-Viren: Infektiöse bovine Rhinotracheitis/ Infektiöse pustulöse VuI ovagenitis

Pl-3-Virus: Parainfluenza-3-Virus

MD-VD-Virus: Mucosal-Disease-V'rus. diarrhoe-Virus

HAH: Hämagglutinationshemmend

Beispiel 1

Virulentes IBR/IPV Virus isoliert aus dem Respirationstrakt eines erkrankten Tieres wurden auf einer Kälbernierenzellkultur im Earle-Medium unter Zusatz von Lactalbumin-Hydrolysat bei 37"C über 48 Stunden kultiviert. Die so erhaltene IBR/IPV-Virussuspension wurde durch Zentrifugaiion bei 4°C und 2000 g von den Zellrückständen befreit und anschließend bei 22⁰C einem elektrischen Wechselstromfeld (220 V Wechselstromspannung, Stromstärke 260 mA Silberelektroden) in dem in der Figur skizzierten Reaktionsgefäß 1 Stunde lang ausgesetzt.

Eine gleiche Menge IBR/IPV-Virus im Kulturmedium (Earle-Medium) wird zur Kontrolle bei 22°C aufbewahrt.

Im Anschluß daran wurden mit beiden Suspensionen je vier Rinder im Isolierstall infiziert.

Ergebnis

Während die Kontrolltiere sämtliche Erscheinungen der Rhinotracheitis zeigten, waren bei den mit der wie oben behandelten Suspension infizierten Rindern keinerlei Krankheitssymptome festzustellen. In der Gewebekultur konnte gezeigt werden, daß

1) sowohl die mit elektrischem Wechselstrom behandelte, als auch die als Kontrolle dienende unbehandelte Virussuspension einen cytopathogenen Effekt zeigte, und daß

2) beide Gruppen von Tieren vier Wochen später spezifische neutralisierende Antikörper im Serum aufwiesen.

Es liegt also im Falle der mit elektrischem Wechselstrom behandelten Virussuspension ein Lebend-Impfstoff vor. welche apathogcncs IBR/IPV-Virus enthält.

Beispiel 2

Ein Parainfluenza-3-Virusstamm wurde aus dein Respirationstrakt eines erkrankten Rindes isoliert und auf sekundären Kälbernierenzellen i.. Earle's-Mediuin mit Zusatz von 0,5% Lacialbumin-Hydrolysat und 3% aniikörperfreiem. inaktiviertem Kälbcrscrum vermehrt. Nach Abzentrifugation des Zelldebris wurde die aktive Plj-Virus-Suspension 1 Stunde bei 37°C einem elektrischen Wechselstromfeld (220 V Wechselstromspannung, Stromstärke 255 mA. Silberelektroden) ausgesetzt.

Mit Hilfe der Gcwebekulturtechnik kann anschließend festgestellt werden, daß vermehrungsfähiges Virus in der Suspension vorhanden ist (Vorliegen eines sogenannten »Lebendimpfstoffes«).

Der tiercxperimentelle Versuch mit dem erfindungsgemäß behandelten PI-3-Virus-Stamm zeigte die gleichen Ergebnisse wie bei Beispiel 1 beschrieben, d. h. der cytopathogene Effekt war nachzuweisen, außerdem konnten spezifische neutralisierende bzw. HAH-R-Antikörper im Blutserum der behandelten Tiere nachgewiesen werden.

Beispiel 3

In Analogie zu der in Beispiel 1 beschriebenen Methodik wird eine wäßrige Suspension von virulantem IBR/IPV-Virus bei 37⁰C 24 Stunden lang einem elektrischen Wechselstromfeld (220 V Wechselstromspan-

J5 nung, 250 mA Stromstärke, Silberelektroden) ausgesetzt. Anschließend liegt ein I BR/lPV-Totimpfstoff vor. Die so erhaltene Virussuspension wurde auf eine Kälbernierenkultur gebracht und bis zu 5 Tagen bei 37°C bebrütet. Dabei konnte kein cythopathogener Effekt mehr beobachtet werden.

Beispiel 4

85 ml der nach Beispiel 3 erhaltenen Virussuspension werden mit 15 ml einer 3%igen Al(OH)j-Suspension vermischt. Je 10 ml des so erhaltenen Impfstoffes werden je 3 IBR-lPV-Antikörperfreien Rindern subkutan verabreicht.

Nach 20 Tagen konnte bei allen 3 Rindern IBRlPV-Antikörper im Blutserum nachgewiesen werden.

Am 21. Tag wurden die 3 geimpften Rinder und ein

nichtgeimpftes Kontroiitier mit je 2 mi der im Beispiel 1 beschriebenen, nicht dem elektrischen Wechselstrom ausgesetzten, aktiven !BR/IPV-Virus-Suspension intranasal infiziert.

Während das Kontrolltier alle Erscheinungen einer akuten Rhinotracheitis aufwies, konnte bei den 3 geimpften Rindern keinerlei Krankheitssymptome festgestellt werden.

Beispiel 5

Analog Beispiel 1 wurde eine Suspension von virulentem MD-VD-Virus in Eagie's-Medium bei 37°C einem elektrischen Wechselstromfeld (220 V Wechselstromspannung, Stromstärke 260 mA, Silberelektroden) 32 Stunden lang ausgesetzt

Die so erhaltene MD-VD-Virussuspension erwies

sich als voiikommen inaktiviert, d. h. es war kein cythoputhogener Effekt nachweisbar.

Die immunogenen Eigenschaften blieben jedoch erhalten (spezifische Antikörperbildung, Identität im Doppeldiffusionstest).

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

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Claims

Patentanspruch:

Verfahren zum Abschwächen oder Inaktivieren von Mikroorganismen, die zu Lebend- oder Totimpfstoffen formuliert werden, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Mikroorganismensuspension gegebenenfalls in Gegenwart eines Kulturmediums unter sterilen Bedingungen einem elektrischen Wechselstromfeld vorgegebener Netzspannung (Wechselstromspannung 110. 220 oder 330 V. Stromstärke 200-30OmA Edelmetallelektroden) für die zur Abschwächung oder Inaktivierung ausreichende Zeit aussetzt.