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DE2642321A1 - Methode zur bestimmung der alkalischen phosphatase in koerperfluessigkeiten - Google Patents

Methode zur bestimmung der alkalischen phosphatase in koerperfluessigkeiten

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Publication number
DE2642321A1
DE2642321A1 DE19762642321 DE2642321A DE2642321A1 DE 2642321 A1 DE2642321 A1 DE 2642321A1 DE 19762642321 DE19762642321 DE 19762642321 DE 2642321 A DE2642321 A DE 2642321A DE 2642321 A1 DE2642321 A1 DE 2642321A1
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
buffer
molarity
alkaline phosphatase
monophosphate
oxygenase
Prior art date
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Withdrawn
Application number
DE19762642321
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English (en)
Inventor
Barry Clifford Axcell
Cyril Donninger
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Chembro Holdings Pty Ltd
Original Assignee
Chembro Holdings Pty Ltd
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Filing date
Publication date
Application filed by Chembro Holdings Pty Ltd filed Critical Chembro Holdings Pty Ltd
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Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/42—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving phosphatase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2334/00—O-linked chromogens for determinations of hydrolase enzymes, e.g. glycosidases, phosphatases, esterases
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
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  • General Health & Medical Sciences (AREA)
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  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Description

VON KREISLER SCHÖNWALD MEYER EISHOLD FUES VON KREISLER KELLER SELTING
PATENTANWÄLTE Dr.-Ing. von Kreisler + 1973
Dr.-Ing. K. Schönwald, Köln Dr.-Ing. Th. Meyer, Köln Dr.-Ing. K. W. Eishold, Bad Soden Dr. J. F. Fues, Köln Dipl.-Chem. Alek von Kreisler, Köln Dipl.-Chem. Carola Keller, Köln Dipl.-Ing. G. Selting, Köln
AvK/AX
5KOLN1 2O.9.1976
DEICHMANNHAUS AM HAUPTBAHNHOF
Chembro Holdings (Proprietary) Limited,
105 Quartz Street, Hillbrow, Johannesburg, Südafrikanische Republik
Methode zur Bestimmung der alkalischen Phosphatase in Körperflüssigkeiten
Die Erfindung betrifft eine Methode zur Messung der Konzentrationen von alkalischer Phosphatase im Serum, Plasma und in anderen Körperflüssigkeiten und die bei dieser Methode verwendeten Reagentien. Die Bestimmung der alkalischen Phosphatase in Körperflüssigkeiten, insbesondere im Serum und Plasma, ist als nützliches und wichtiges Mittel bei der Diagnose gewisser pathologischer Zustände, z.B. Rachitis, Osteomalazie, Hyperparathyreoidismus, Osteitis deformans und Knochentumore, allgemein eingeführt und gut gesichert. Diese Bestimmungen werden häufig im pathologischen Laboratorium von Krankenhäusern durchgeführt.
Bekannt sind die folgenden Methoden zur Bestimmung der Konzentration der alkalischen Phosphatase in Körperflüssigkeiten: Kay (J.Biol.Chem.89 (1930) 235, 249) beschreibt die Verwendung von Glycerinphosphat als Substrat für die Bestimmung der alkalischen Plasmaphosphatase. Diese Methode erfordert nur 1 ml Plasma, das mit Glycerinphosphat 48 Stunden bei 37°C inkubiert wird.
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Telefon: (0221) 23 45 41-4 · Telex: 8882307 dopa d - Telu-tjromm; Dompulent Köln
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Gemessen wird das freie Phosphat, das durch die Hydrolyse frei wird. Ein Kontrollversuch unter Verwendung von einem weiteren Milliliter Plasma ist notwendig. Jenner und Kay (Brit. J. exp Path 13 (1932) 22) verbesserten die Kay'Methode durch Verkürzung der Inkubationszeit auf 3 Stunden durch Verwendung von Glycinpuffer bei pH 8,8.
Bodansky (J.Biol.Chem.101 (1933) 93) beschreibt eine ähnliche Methode, bei der ein Barbitonpuffer bei pH 8,6 mit einer Inkubationszeit von 1 Stunde verwendet wird.
King und Armstrong (Canad.med.Ass.J.31 (1934) 376) beschreiben die Verwendung von Phenylphosphat als Substrat und messen die Menge des freigesetzten Phenols. Bei einer Modifikation dieser Methode, bei der eine Inkubationszeit von 30 Minuten angewandt wird, führten King und Wootton (Micro-analysis in Medical Biochemistry 3.Auflage, London, J. und A. Churchill) eine Phenylphosphat-Methode ein, die eine Inkubationszeit von 15 Minuten erfordert. Nitrophenylphosphat wird an Stelle von Phenylphosphat verwendet (Ohmori, Enzymologia 4 (1937) 217; King und Delory, Biochem.J.33 (1939) 1185; Bessey, Lowry und Brock, J.Biol .Chen1. 164 (1946) 321). Das freigesetzte Nitrophenol wird nach spektrophotometrischen Methoden bestimmt.
Phenolphthaleinphosphat wird ebenfalls zur Bestimmung von alkalischer Phosphatase verwendet. Durch Hydrolyse in einem alkalischen Medium wird ein farbiges Produkt gebildet, das spektrophotometrisch gemessen werden kann. (Huggins und Talalay, J.Biol.Chem.159, 399).
Gegenstand der Erfindung ist die Bestimmung der alkalischen Phosphatase in einer Körperflüssigkeit nach einem Verfahren, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man überschüssigen Monophosphatester, der in einem geeigneten Puffer gelöst ist, durch Einwirkung der alkalischen Phosphatase in einem vorbestimmten Volumen der Körperflüssig—
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keit hydrolysiert und hierdurch ein oxydierbares Substrat bildet, das Substrat mit überschüssigem molekularem Sauerstoff in Gegenwart von überschüssiger Oxygenase oxydiert und die Geschwindigkeit des Sauerstoffverbrauchs misst.
Die Geschwindigkeit des SauerstoffVerbrauchs ist proportional der Konzentration der alkalischen Phosphatase, d.h. der Aktivität, in der Körperflüssigkeit. Aus der Geschwindigkeit des Sauerstoffverbrauchs läßt sich leicht die Aktivität der im Probenvolumen vorhandenen alkalischen Phosphatase und damit die Aktivität der alkalischen Phosphatase in internationalen Einheiten CuMol/ Minute/l) berechnen, weil ein vorbestimmtes Volumen der Körperflüssigkeit verwendet wird.
Die Geschwindigkeit des SauerstoffVerbrauchs kann spektrophotometrisch gemessen werden, wenn der Monophosphatester so gewählt wird, daß ein Substrat freigesetzt wird, daß durch Oxydation mit molekularem Sauerstoff ein Produkt mit geeigneten Absorptionseigenschaften ergibt.
Als Alternative wird die Geschwindigkeit des Sauerstoffverl~rauchs vorzugsweise mit Hilfe einer Sauerstoffelektrode gemessen. Die Verwendung einer Sauerstoffelektrode bietet eine Anzahl entschiedener Vorteile. Eine Sauerstoff elektrode ist verhältnismäßig billig und mit Sicherheit bei weitem billiger als ein Spektrophotometer. Sie ermöglicht eine schnelle Bestimmung des Sauerstoffverbrauchs in sehr trüben oder farbigen Lösungen. Die Sauerstoffelektrode ist eine polarographische Vorrichtung zur Messung der Konzentration von Sauerstoff, der in einem gegebenen Medium gelöst ist. Ihre Wirkunq beruht auf der Elektrolyse von gelöstem Sauerstoff an einer schwach negativen Elektrode. Die Sauerstoffelektrode ist seit Beginn dieses Jahrhunderts bekannt. Die Elektrode wurde 1956 von Clark durch Verwendung einer sauerstoff—
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durchlässigen, nicht-leitenden Membran zur Isolierung der Elektrolysezelle von der Probe, an der die Bestimmung
vorgenommen wird, verbessert. (L.C. Clark, Trans. Am.
Soc. Art. Int. Org. 2 (1956) 41). Sauerstoffelektroden
sind im Handel erhältlich. Die Sauerstoffelektrode kann in bekannter Weise mit einem üblichen Registriergerät,
z.Beinern Registriergerät "Cimatic Cimapot T5", kombiniert werden, um die Geschwindigkeit des SauerstoffVerbrauchs zu verfolgen und zu registrieren.
Ein Überschuss von Monophosphatester, molekularem Sauerstoff und Oxygenase wird verwendet, um sicherzustellen, daß die Geschwindigkeit des SauerstoffVerbrauchs proportional der Konzentration der alkalischen Phosphatase
in der Probe der zu bestimmenden Körperflüssigkeit ist. Es kann gewährleistet werden, daß dieser Überschuss der Reagentien vorhanden ist, weil der Bereich wahrscheinlicher Konzentrationen der alkalischen Phosphatase in
Körperflüssigkeiten bekannt ist.
Allgemein dient die Erfindung dazu, die Konzentrationen der alkalischen Phosphatase im Serum oder Plasma zu bestimmen. Die Erfindung eignet sich jedoch auch zur Bestimmung der alkalischen Phosphatase in anderen Körperflüssigkeiten, z.B. Ergüssen. Die Körperflüssigkeit kann dem Menschen oder Tier nach beliebigen bekannten Methoden entnommen werden.
Verwendet wird ein Monophosphatester, der durch Einwirkung der alkalischen Phosphatase hydrolysierbar ist und hierbei ein Substrat bildet, das mit molekularem Sauerstoff in Gegenwart einer Oxygenase oxydierbar ist. Bevor-
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zugt als Monophosphatester wird Catechinmonophosphat, das einen oder mehrere andere Ringsubstituenten enthalten kann, vorausgesetzt natürlich, daß die Substituenten es nicht ungeeignet für die Reaktion machen.
Geeignet sind Puffer, die keine der beiden stattfindenden Reaktionen, d.h. Hydrolyse und Oxydation, hemmen. Der pH-Wert und die Molarität des Puffers für ein bestimmtes System müssen so gewählt werden, daß jede Hemmung dieser Reaktionen vermieden wird. Der Puffer kann genügend Magnesiumionen oder andere geeignete Ionen enthalten, die als Aktivator für die alkalische Phosphatase dienen.
Geeignete Oxygenasen, die die Oxydation katalysieren, sind bekannt. Als Beispiele geeigneter Oxygenasen im Falle des Catechinmonophosphatesters sind Polyphenoloxidase, Catechin-1,2-dioxygenase, Catechin-2,3-dioxyge— nase und Catechinoxydase (dimerisierend) zu nennen.
Im allgemeinen werden die Oxygenase, die Probe der Körperflüssigkeit, der Puffer und die Aktivatorionen zuerst in das Reaktionsgefaß gegeben, worauf die Reaktion durch Zugabe des Monophosphatesters ausgelöst wird.
Wie bereits erwähnt, wird Catechinmonophosphat als Monophosphatester bevorzugt. Bei Verwendung dieses Esters wird als Puffer ein Diäthanolamin-HCl-Puffer mit einer Molarität von 0,1 bis 4,0 und einem pH-Wert von 8>6 bis 10,8 bevorzugt. Es hat sich gezeigt, daß mit diesem Puffer eine optimale Geschwindigkeit des Sauerstoffverbrauchs erreicht wird, so daß die Bestimmung schnell durchgeführt werden kann. Bevorzugt wird eine Molarität von 2,0 bis 2,5 M und ein pH-Wert von 9,8 bis 9,9. Als Aktivator für die alkalische Phosphatase enthält das Reaktionsmedium vorzugsweise Magnesiumionen im Bereich von 100 bis 1000 uMol, insbesondere 500 uHol.
Wie bereits erwähnt, muß die Oxygenase im Überschuss vor-
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liegen. Vorzugsweise ist die Oxygenase in einer solchen Menge vorhanden, daß sie wenigstens die 500-fache Aktivität der alkalischen Phosphatase hat. Bevorzugt als Oxygenase wird Polyphenoloxydase, die in einem Tris-(hydroxymethyl)aminomethan-HCl-Puffer mit einem pH-Wert von etwa 7,5 aufbewahrt werden kann. Die Molarität dieses Puffers ist sehr viel geringer, z.B. nicht größer als 1%, als die Molarität von Diäthanolamin-HCl, so daß die Oxygenase bei Zugabe zur Reaktionszelle keinen wesentlichen Einfluß auf den pH-Wert des Diäthanolamin-HCl-Puffers hat.
Gemäß einem weiteren Merkmal umfaßt die Erfindung somit ein Reagens für die Verwendung bei der vorstehend beschriebenen Methode. Dieses Reagens besteht aus einem Diäthanolamin-HCl-Puffer, der einen pH-Wert und eine Molarität in den oben genannten Bereichen aufweist und Magnesiumionen in einer Konzentration von 100 bis 1000 LiMoI, vorzugsweise 500 ajMoI , und einem Überschuss von Oxygenase, vorzugsweise Polyphenoloxydase, besteht.
Die Erfindung umfaßt ferner einen Reagentiensatz für die Verwendung bei der erfindungsgemäßen Methode. Dieser Satz umfaßt
a) ein Gefäß, das den Diäthanolamin-HCl-Puffer enthält, der einen pH-Wert von 8,6 bis 10,8 und eine Molarität von 0,1 bis 4,0 M hat und 100 bis 1000 uMol Magnesiumionen enthält,
b) ein Gefäß, das Polyphenoloxidase in einem Tris(hyhydroxymethyl)aminomethan-HCl-Puffer von pH 7,5 und einer Molarität, die nicht höher ist als 1% der Molarität des Puffers von (a), enthält,
c) ein Gefäß, das ein Salz von Catechinmonophosphat enthält, und
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d) ein Gefäß, das Tris(hydroxymethyl)aminomethan-HCl-Puffer enthält, der einen pH-Wert von 7,0 und eine Molarität hat, die nicht höher ist als 1% der Molarität des Puffers von (a).
Der Puffer (a) hat vorzugsweise den oben genannten bevorzugten pH-wert und die oben genannte bevorzugte Molarität.
Das Salz des Catechinmonophosphatesters kann ein beliebiges bekanntes Salz, z.B. das Diammonium- oder Dinatriumsalz, sein.
Die Erfindung wird nachstehend an Hand eines Beispiels beschrieben. Bei diesem Versuch wurden die folgenden Reagentien verwendet:
1) Monophosphatester: Als Monophosphat wurde Catechinmonophosphat verwendet, das in 10 mMol Tris(hydroxymethyl) aminomethan-HCl-Puffer gelöst war, der einen pH-Wert von 7,0 hatte und 0,4 Vol.-% Chloroform enthielt. Hierdurch wird Catechin bei der Hydrolyse durch Einwirkung der alkalischen Phosphatase gebildet.
2) Oxygenase: Als Oxygenase wurde Polyphenoloxidase verwendet (bezogen von Worthington Biochemical Corp., Freehold, New Jersey, USA). Diese Oxygenase hat eine spezifische Aktivität von 636 Einheiten pro mg (eine Einheit verursacht einen Anstieg der Absorption (a4A) bei 28Onm von 0,001/Minute bei 25°C und pH 6,5 mit Tyrosin als Substrat). Die Oxygenase befand sich in einer Lösung, die 200 Einheiten/100 juI in 500'mMol Tris(hydroxymethyl)aminomethan-HCl-Puffer von pH 7,5 enthielt.
3) Alkalische Phosphatase: Die Alkaliphosphatase wurde von Miles-Seravac, Kapstadt, bezogen. Die Phosphatase wurde aus Kalbsdarm hergestellt und hatte eine
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spezifische Aktivität von 2,2 Einheiten (eine Einheit ist die Enzymmenge, die die Freisetzung von 1 uMol Phenol pro Minute bei pH 8,8 und 25°C bei Verwendung von Phenylphosphat als Substrat katalysiert). Die Phosphatase wurde in 100 mMol Diäthanolamin-HCl-Puffer von pH 9,8 mit einer Aktivität von 0,75 Einheiten/ml bezogen.
4) Puffer: Als Puffer wurde 2,0-molarer Diäthanolamin-HCl-Puffer von pH 9,8 verwendet.
Der Sauerstoffverbrauch einer Anzahl von Proben von alkalischer Phosphatase mit bekannter Konzentration wurde unter Verwendung einer Sauerstoffelektrode und der oben genannten Reagentien gemessen. (Lieferant der Sauerstoffelektrode: Clinical Sciences and Manufacturing Laboratories, Johannesburg.) Die Sauerstoffelektrode wurde an ein bei 37°C gehaltenes Bad von umgewälztem Wasser angeschlossen. Die Elektrode wurde mit einer 12,7 mm dicken Membran aus Polytetrafluoräthylen bedeckt. Das Volumen der Zelle wurde bei 1,5 ml gehalten. Das Ausgangssignal wurde mit einem Aufnahmegerät "Cimatic Cimapot T5" registriert.
Die folgenden Reagentien wurden in die Zelle gegeben: 2 bis 40 ul der Lösung der alkalischen Phosphatase, 100 ul t-olyphenoloxidaselösung, 30 ul 250 mMol Magnesiumsulfatlösung und genügend Diäthanolamin-HCl-Puffer, um das Volumen der Zelle auf 1,5 ml zu bringen. Gute Ergebnisse wurden bei Verwendung von 100 ul der PoIyphenoloxidaselösung erhalten, mit der eine Aktivität von 200 Einheiten erhalten wurde. Es wurde gefunden, daß zur Erzielung befriedigender Ergebnisse die Aktivität der Polyphenoloxidase von 100 bis 500 Einheiten pro 1,5 ml Zellenvolumen variieren konnte. Die endogene Geschwindigkeit des SauerstoffVerbrauchs wurde in Abwesenheit des Substrats gemessen. Hierbei wurde die Reaktion durch Zugabe von 50 ul der Lösung von Catechinmonophosphat
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ausgelöst. Die Geschwindigkeit des SauerstoffVerbrauchs stieg linear mit der Zeit, und die Reaktionsgeschwindigkeit wurde der Einfachheit halber während des Anfangsteils der Steigung der Kurve gemessen. In dieser Weise wurden Ergebnisse innerhalb einer Minute nach Zugabe des Substrats erhalten. Die Sauerstoffkonzentration in luftgesättigten Lösungen wurde nach der Methode von Glasstone berechnet (S.Glasstone, Elements of Physical Chemistry, 1.Auflage 1946, Seite 343-344, D.Van Nostrand Co. Inc., New York). Das Registriergerät wurde unter Verwendung von luftgesättigtem Wasser geeicht.
Unter Anwendung dieser Methode wurden Versuche unter Verwendung von alkalischer Phosphatase in einem Bereich von 2 bis 40 ul, d.h. mit Aktivitäten von 0,0015 bis 0,030 Einheiten durchgeführt. Die Geschwindigkeit des Sauerstoffverbrauchs wurde in jedem Fall aufgezeichnet und nach Abzug eines Blindversuchs mit dem Substrat in Abhängigkeit von der Konzentration der Lösung der alkalischen Phosphatase graphisch dargestellt. Die erhaltene Kurve ist in Fig.l dargestellt. In dieser graphischen Darstellung ist die Geschwindigkeit des SauerstoffVerbrauchs in uMol/Minute als Ordinate und die Menge der alkalischen Phosphataselösung in ul als Abszisse aufgetragen. Eine lineare Regressionsanalyse beschreibt die Beziehung zwischen der Geschwindigkeit des Sauerstoffverbrauchs -dO~ und der Konzentration der alka-
{ dt }
lischen Phosphatase durch die Gleichung
-dO alkalische Phosphatase = 192,6 ( ) - 0,64
mit einem Korrelationskoeffizienten von 0,990.
Unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Reagentien und Methoden ist es möglich, die Konzentration der alkalischen Phosphatase in jeder gegebenen Serumprobe,
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-yf- ;
.die im allgemeinen eine Größe von 50 bis 100 ul hat, zu bestimmen. Die Serumprobe mit bekanntem Volumen wird genommen/und unter Verwendung der vorstehend genannten Reagentien und Methoden wird die Geschwindigkeit des SauerstoffVerbrauchs in uMol/Minute gemessen. Aus dieser · Geschwindigkeit kann direkt die Aktivität der alkalischen Phosphatase im Probenvolumen durch Multiplikation des Sauerstoffverbrauchswerts mit dem entsprechenden Faktor/ um ihn auf plol/Minute/1 zu bringen, bestimmt werden.
Das vorstehend beschriebene Verfahren ermöglicht eine schnelle, genaue, reproduzierbare Bestimmung der alkalischen Phosphatase mit einem Plasma- oder Serumvolumen bis hinab z-u 50 ul. Da der endogene Sauerstoffverbrauch vor der Zugabe des Substrats registriert wird, ist keine Probe für die Blindbestimmung erforderlich. Die Bestimmungen können in sehr trüben und farbigen Lösungen vorgenommen und die Ergebnisse innerhalb einer Minute erhalten werden.
Die Methode gemäß der Erfindung wurde mit der Methode von Bessey und Lowry zur Bestimmung von alkalischer Serumphosphatase verglichen. Die Ergebnisse in internationalen Einheiten wurden gegen die Ergebnisse, die nach der Methode gemäß der Erfindung an 24 willkürlich ausgewählten Serumproben erhalten wurden, graphisch dargestellt. Die erhaltene graphische Darstellung hatte einen 'Korrelationskoeffizienten von 0,967.
Ein Reagentiensatz, der sich zur Messung der Konzentrationen der alkalischen Phosphatase in der oben beschriebenen Weise eignet, hat beispielsweise die folgende Zusammensetzung:
a) Eine Flasche mit Diammoniumcatechinmonophosphat.
b) Eine Flasche von 10 mMol Tris (hydr-oxymethyl) aminomethan-HCl-Puffer, pH 7,0.
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c) Eine Flasche mit der oben unter (2) beschriebenen Oxygenaselösung.
d) Eine Flasche mit dem oben unter (4) beschriebenen Puffer.
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Claims (14)

Patentansprüche
1) Verfahren zur Bestimmung der Konzentration der alkalischen Phosphatase in Körperflüssigkeiten, dadurch gekennzeichnet, daß man überschüssigen Monophosphatester, der in einem geeigneten Puffer gelöst ist, durch Einwirkung der alkalischen Phosphatase in einem vorbestimmten Volumen der Körperflüssigkeit hydrolysiert und hierdurch ein oxydierbares Substrat bildet, das Substrat mit überschüssigem molekularem Sauerstoff in Gegenwart von überschüssiger Oxygenase oxydiert und die Geschwindigkeit des Sauerstoffverbrauchs mißt.
2) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Geschwindigkeit des Sauerstoffverbrauchs unter Verwendung einer Sauerstoffelektrode mißt.
3) Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Oxygenase Polyphenoloxidase verwendet.
4) Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als Monophosphatester Catechinmonophosphat verwendet.
5) Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man als Puffer einen Diäthanolamin-HCl-Puffer mit einer Molarität von 0,1 bis 4,0 M, vorzugsweise von 2,0 bis 2,5 M, und einem pH-wert von 8,6 bis 10,8, vorzugsweise von 9,8 bis 9,9 verwendet.
6) Verfahren nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Puffer verwendet, der Magnesiumionen in einer Konzentration von 100 bis 1000 uMol enthält.
7) Reagens für das Verfahren nach Anspruch 1 bis 6, gekennzeichnet durch einen Diäthanolamin-HCl-Puffer, der eine Molarität von 0,1 bis 4,0 M und einen pH-Wert von 8,6 bis 10,8 hat und Magnesiumionen in einer Konzentration
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von 100 bis 1000 uMol enthält, und einen Überschuss von Oxygenase.
8) Reagens nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß der Puffer eine Molarität von 2,0 bis 2,5 M hat.
9) Reagens nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, daß der Puffer einen pH-Wert von 9,8 bis 9,9 hat.
10) Reagens nach Anspruch 7 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß es als Oxygenase Polyphenoloxidase enthält.
11) Reagens nach Anspruch 7 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß es außerdem Catechinmonophosphat enthält.
12) Reagentiensatz für das Verfahren nach Anspruch 1 bis 6, gekennzeichnet durch
a) ein Gefäß, das einen Diäthanolamin-HCl-Puffer enthält, der einen pH-Wert von 8,6 bis 10,8 und eine Molarität von 0,1 bis 4,0 M hat und 100 bis 1000 uMol Magnesiumionen enthält,
b) ein Gefäß, das Polyphenoloxydase in einem Tris-(hydroxymethyl)aminomethan-HCl-Puffer enthält, der einen pH-Wert von 7,5 und eine Molarität hat, die nicht höher ist als 1% der Molarität des Puffers (a),
c) ein Gefäß, das ein Salz von Catechinmonophosphat enthält, und
d) ein Gefäß, das einen Tris(hydroxymethyl)aminomethan-HCl-Puffer enthält, der einen pH-Wert von 7,0 und '< eine Molarität von nicht mehr als 1% der Molarität des Puffers (a) hat.
13) Reagentiensatz nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß der Puffer (a) eine Molarität von 2,0 bis 2,5 M hat.
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14) Reagentiensatz nach Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, daß der Puffer (a) einen pH-Wert von 9,8 bis 9,9 hat.
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DE19762642321 1975-09-22 1976-09-21 Methode zur bestimmung der alkalischen phosphatase in koerperfluessigkeiten Withdrawn DE2642321A1 (de)

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