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(Zusatz zur P. 1644.00) la-Hydroxysteroide-Zusatz zur Patentanmeldung
P 24 50 106.2 In der deutschen Patentanmeldung P 24 50 106.2 werden la-Hydroxysteroide
der allgemeinen Formel I
beschrieben, worin eine Methylgruppe oder eine Äthylgruppe, R2 und R Wasserstoffatome
oder Alkanoylgruppen mit bis zu 3 -8 Kohlenstoffatomen und ein Wasserstoffatom oder
einen Kohlenwasserstoffrest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen bedeuten.
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Die Gruppen R2 und R3 können gleich oder voneinander verschieden sein.
Als geeignete Alkanoylgruppen R2 und R3 seien beispielsweise genannt: Die Formylgruppe,
die Acetylgruppe, die Propionylgruppe, die Butyrylgruppe, die Pentanoylgruppe, die
Hexanoylgruppe, die Heptanoylgruppe und die Octanoylgruppe.
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Unter einem Kohlenwasserstoffrest R4 soll beispielsweise eine Methylgruppe,
eine Äthylgruppe, eine Vinylgruppe oder eine Äthinylgrupi>e verstanden werden.
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Die la-Hydroxysteroide der allgemeinen Formel I sind stark gestagen
wirksame Verbindungen mit einer sehr geringen androgenen Nebenwirkung.
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Die Herstellung der la-Hydroxysteroide der allgemeinen Formel I erfolgt
gemäß Hauptpatent . . . . . . (Patentanmeldung P 24 50 106.2) dadurch, daß man eine
Verbindung der allgemeinen Formel II
worin R1 und R die obengenannte Bedeutung besitzen, mit 4 einer
Pilzkultur der Gattungen Rhizoctonia, Sclerotium, Galonectria oder Glomeralla fermentiert
und gewünschtenfalls freie Hydroxygruppen verestert.
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Es-wurde nun gefunden, daß außer den oben angegebenen noch die Pilzkulturen
folgender Gattungen tür die la-Hydroxylierung geeignet sind: Aspergillus, Corticium,
Septomyxa, Mucor-, Isaria, Irpex und Fusarium.
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Somit betrifft die vorliegende Erfindung eine Weiterentwicklung des
Verfahrens gemäß Hauptpatent ......... (Patentanmeldung P 24 50 106.2) zur Herstellung
von la-Hydroxysterniden der allgemeinen Formel I, dadurch gekennzeichnet, daß man
eine Verbindung der allgemeinen Formel II mit einer Pilzkultur der Gattungen Aspergillus,
Corticium, Septomyxa, Mucor, Isaria, Irpex oder Fusarium fermentiert und gewünschtenfalls
freie Hydroxygruppen verestert.
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Die erfindungsgemäße l«-Hydroxylieruilg läßt sich zum Beispiel unter
Verwendung folgender Pilzstämme durchführen: Aspergillus lavatus (ATCC 9598) Aspergillus
fumigatus (CBS 11046) mut. helvola Aspergillus carneus (CBS 49465) Aspergillus terreus
(ATCC 10020)
Aspergillus conicus (IFO 4047) Corticium sasakii (Univ.
Tokio 9005) Septomyxa affinis (ATCC 6737) Mucor griseocyanus (ATCC 1207b) Mucor
spinosus (CBS 29563) Mucor genevensis (ATCC 8976) Isaria farinosa (ouT 4098) Irpex
lacteus (IFO 5567) Fusarium ciliatum (CBS 13235) Bevorzugt geeignet sind Aspergillus
clavatus und Mucor spinosus Die Durchführung der Hydroxylierung erfolgt nach Methoden,
welche man üblicherweise zur mikrobiologischen Hydroxylierung von Steroiden mit
Pilzkulturen anwendet.
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So werden zunächst in allgemein üblichen Vorversuchen die günstigsten
Fermentationsbedingungen, wie zum Beispiel Auswahl des günstigsten Nährmediums,
des geeigneten Substratlösngsmittels, der Substratskonzentration, der technischen
Bedingungen - wie Temperatur, Belüftung, pH- und der optimalen
Zeiten
für Germination, Substratzugabe und Substratkontakt am Enzym des Mikroorganismus
analytisch, insbesondere dünnschichtchromatographisch, ermittelt.
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Dabei hat sich gezeigt, daß es zweckmäßig ist, Konzentrationen von
etwa 50 - 1000 mg Substrat pro Liter Nährmedium einzusetzen.
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Der pH-W'ert wird vorzugsweise auf einen Wert im Bereich von 5 bis
7 eingestellt. Die Züchtungstemperatur liegt im Bereich von 20bis 400 C, vorzugsweise
von 25 bis 350C. Zur Belüftung werden etwa 1 Liter Luft pro Minute pro Liter Kulturbrühe
zugeführt. Die Umwandlung des Substrats wird zweckmäßigerweise durch dünnschichtchromatographische
Analyse von Probeextrakten verfolgt. Im allgemeinen haben sich nach 20 bis 120 Stunden
ausreichende Mengen an hydroxyliertem Steroid gebildet.
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Bei der mikrobiologischen Hydroxylierung werden oft neben den erfindungsgemäßen
la-Hydroxysteroiden der allgemeinen Formel I auch noch die isomeren lß-Hydroxysteroide
gebildet.
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Die Isolierung und Reinigung der Verfahrensprodukte erfolgt in an
sich bekannter Weise. Beispielsweise kann man die Verfahrensprodukte mit einem organischen
Lösungsmittel, wie Methylisobutylketon, extrahieren, den Extrakt eindampfen und
die Verfahrensprodukte durch Säulenchromatographie trennen und reinigen.
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Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens lassen sich beispielsweise
folgende la,l7ß-Dihydroxysteroide der allgemeinen
Formel I herstellen:
das la,l7ß-Dihydroxy-4-östren-on, das 1α,17ß-Dihydroxy-18-methyl-4-östren-3-on
das 1α,17ß-Dihydroxy-17α-methyl-4-östren-3-on, das la,l7ß-Dihydroxy-17a,18-dimethyl-4-östren-3-on,
das 1α,17ß-Dihydroxy-17α-äthinyl-4-östren-3-on und das la-17ß-Dihydroxy-18-methyl-17a-äthinyl-4-östren-3-on.
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Die sich gegebenenfalls anschließende Veresterung der freien Hydroxygruppen
erfolgt nach den Methoden, die man üblicherweise in der Steroid-Chemie zur Veresterung
sekundärer und tertiärer Hydroxygruppen verwendet. Als geeignete Veresterungsmethode
sei beispielsweise die Umsetzung der Steroide mit Säureanhydriden oder Säurechloriden
in Gegenwart basischer Katalysatoren - wie Natriumhydrogencarbonat, Kaliumhydrogencarbonat,
Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Pyridin, Lutidin, Collidin oder 4-Dimethylhminopyridin
- genannt.
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Beispiel 1 Ein 2 1 Erlenmeyerkolben, der 500 ml einer 30 Minuten bei
1200C im Autoklaven sterilisierten Nährlösung aus 3,0 % Glukose, 1,0 % Cornsteep,
0,2 % NaNO3, 0,1 % KH2P04, 0,2 % K2HP04, 0,05 % Mg04, 0,002 % FeS04 und 0,05 % KC1
enthält, wird mit einer Lyophilkultur des Stammes Aspergillus clavatus (ATCC 9598)
beimpft und 2 Tage bei 30 C auf einem Rotationsschüttler geschüttelt. Mit dieser
Vorkultur wird ein 50 l-Fermenter, der mit 30 1 eines bei 1210C und 1,1 atü sterilisierten
Mediums der gleichen Zusammensetzung wie die Vorkultur gefüllt ist, beimpft. Unter
Zugabe von Silicon SH als Antischaummittel wird bei 290 C unter Belüftung und Rühren
72 Stunden germiniert.
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900 ml der Kulturbrühe werden unter sterilen Bedingungen in 14 1 eines
wie oben sterilisierten Nährmediums gleicher Zusammensetzung überführt und unter
gleichen Bedingungen angezüchtet. Nach 24 Stunden wird eine in Gegenwart von wässrigem
Tween 80 feinstgemahlene, sterilisierte Suspension von 7,5 g 17a-thinyl-17ß-hydroxy-18-methyl-4-östren-3-on
in destilliertem Wasser zugegeben und weiter germiniert.
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Der Ablauf der Umwandlung wird durch dünnschichtchromatographische
Analyse der Methylisobutylketon-Extrakte von Fermenterproben verfolgt. Nach etwa
90 Stunden Kontaktzeit ist die Umwandlung vollständig. Das Pilzmycel wird abfiltriert
und das Kultur filtrat zweimal mit je 10 1 Methylisobutylketon extrahiert. Parallel
dasu wird das abfiltrierte Mycel mehrmals mit einer Mischung aus Methylisobutylketon,
Aceton
und Wasser gerührt und hierbei extrahiert.
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Die organischen Extraktlösungen werden vereinigt und im Vakuum bei
einer Badtemperatur von 500 C zur Trockne eingedampft. Den verbliebenen Rückstand
wäscht man mehrmals mit Hexan und chromatographiert schließlich über eine Kieselgelsäule.
Zur weiteren Reinigung kristallisiert man das Proedukt aus Methylenchlorid/Benzol
und fällt das Benzol-Solvat zur Entfernung des Benzols noch einmal aus Xthanol/Wasser
um.
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Das reine l7a-Ä.thinyl-la ,l7ß-dihydroxy-l8-methyl-4-östren-3-on schmilzt
bei 1800 C.
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Beispiel 2 500 mg 17a-Äthinyl-la,17ß-dihydroxy-18-methyl-4-östren-3-on
werden in 10 ml Pyridin gelöst, 0,5 ml Acetanhydrid zugegeben und 30 Stunden im
Kühlschrank stehengelassen. Zur Vervpllständigung der Reaktion rührt man anschließend
noch einige Stunden bei Raumtemperatur. Danach wird die Reaktionsmischung im Hochvakuum
eingedampft, der Rückstand in Essigester aufgenommen und mit dest. Wasser neutralgewaschen.
Nach dem Trocknen über Natriumsulfat und Einengen der Essigesterlösung erhält man
la-Acetoxy-17a-äthinyl-17ß-hydroxy-18-methyl-4-östren-3-on.
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Beispiel 3 650 mg l?a-Ä.thinylla,l7ß-dihydroxy-l8-methyl-4-östren-3-0
werden
in 15 ml Pyridin aufgenommen, 2 ml onanthsäureanhydrid zugesetzt und 16 Stunden
bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend engt man die Mischung im Hochvakuum en,
nimmt den Rückstand in Essigester auf und wäscht mit dest. Wasser neutral. Nach
dem Einengen der getrockneten Essigesterphase hinterbleibt 17a-Äthinyl-lcr-heptanoyloxy-l7ß-hydroxy-18-methyl-4-östren-3-on
als schwach gelbliches (31.
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Beispiel 4 300 mg 17α-Äthinyl-1α,17ß-dihydroxy-4-östren-3-on
werden mit 10 ml Pyridin und i,5 ml Acetanhydrid versetzt und 4 Tage bei Raumtemperatur
unter Stickstoff gerührt. Danach wird die Reaktionsmischung im Hochvakuum eingedampft,
der Rückstand in Essigester aufgenommen und mit dest. Wasser neutralgewaschen. Nach
dem Trocknen über Natriumsulfat und Einengen der Essigesterlösung im Vakuum -erhält
man 17«-thinyl-1«,17ß-diacetoxy-4-östren-3-on.
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Analog erhält man l?a-Äthinyl-la ,l7ß-diacetoxy-18-methyl-4-östren
3-on aus 17a-Athinyl-la ,l7ß-dihydroxy-18-methyl-4-östren-3-on.
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Beispiel 5 Ein 2 1 Erlenmeyerkolben, der 500 ml einer 30 Minuten bei
1200C im Autoklaven sterilisierten Nährlösung aus 5 % Glukose, 0,5 % Corn-steep-liquor,
0,2 % Natriumnitrat, 0,1 % Kaliumdihydrogenphosphat, G,05 % Kaliumchlorid, 0,05
% Magnesiumsulfat und 0,002 % Eisen(II)-sulfat enthält'wird mit einer Lyophilkultur
von Mucor spinosus (CBS 29563) beimpft und 3 Tage bei 300C auf einem Rotationsschüttler
geschüttelt. Mit dieser Vorkultur wird dann ein 20 l-Fermenter, der mit 15 1 eines
bei 1210C und 1,1 atü sterilisierten Mediums der gleichen Zusammensetzung wie die
Vorkultur gefüllt ist, beimpft. Unter Zugabe von Silicon SH als Antischaummittel
wird bei 290C unter Belüftung und Rühren 24 Stunden germiniert. 1 Liter der Kulturbrühe
wird unter sterilen Bedingungen in 14 1 eines wie oben sterilisierten Nährmediums
gleicher Zusammensetzung überführt und unter gleichen Bedingungen angezüchtet. Nach
12 Stunden wird eine sterilfiltrierte Lösung von 7,5 g 17ß-Hydroxy-17a-äthinyl-4-östren-3-on
in 75 ml Dimethylformamid zugegeben und weiter incubiert.
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Nach vollständiger Umwandlung des eingesetzten Substrates (68 Stunden
Kontaktzeit) wird der Fermenterinhalt zweimal mt je 10 1 Methylisobutylketon ausgerührt
und der Extrakt bei 500C Badtemperatur im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wird
zur Entferrung des Antischaummittels mehrmals mit Hexan gewaschen und schließlich
über eine Kieselgelsäule mittels des Gradienten Methylenchlorid -
Methylenchlorid/Aceton
8+2 chromatographiert. Nach Kristallisation aus Aceto^/Isopropyläther erhält man
das la,l7B-Dihydroxy-17a-äthinyl-4-östren-3-on vom Schmelzpunkt 207 bis 208°C.