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DE1904544C3 - Verfahren zur mikrobiologischen Umwandlung von 3 ß-Hydroxy-5,6- epoxysteroiden in 6-Hydroxy-3-KetoA<·4 -Steroide - Google Patents

Verfahren zur mikrobiologischen Umwandlung von 3 ß-Hydroxy-5,6- epoxysteroiden in 6-Hydroxy-3-KetoA<·4 -Steroide

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DE1904544C3
DE1904544C3 DE1904544A DE1904544A DE1904544C3 DE 1904544 C3 DE1904544 C3 DE 1904544C3 DE 1904544 A DE1904544 A DE 1904544A DE 1904544 A DE1904544 A DE 1904544A DE 1904544 C3 DE1904544 C3 DE 1904544C3
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Germany
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hydroxy
steroids
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epoxy
dione
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Klaus Dr. 1000 Berlin Kieslich
Wolfgang Dr. 6100 Darmstadt Koch
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Bayer Pharma AG
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Schering AG
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    • C12P33/00—Preparation of steroids
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Description

Die Erfindung betrifft ein mikrobiologisches Verfahren zur Herstellung von 6-Hydroxy-3-K.eto-4''4-Steroiden der Pregnan- und Androstanreihe, dadurch gekennzeichnet, daß man ein im Α-Ring gesättigtes 3/J-Hydroxy- bzw. 3/J-Acyloxy-5,6-epoxysteroid der Pregnan- oder Androstanreihe mit Mikroorganismen der Gattung Bacillus, Mycobacterium oder Arthrobacter oder mit deren Enzymen fermentiert Besonders vorteilhaft anwendbar sind Mikroorganismen der Species Bacillus lentus, Bacillus sphaerius, Mycobacterium phlei, Mycobacterium smegmatis und Arthorobacter simplex.
Chemische Verfahren zur Herstellung von 6-Hydroxy-3-Keto-d'-4-Steroiden aus im Α-Ring gesättigten 5,6-Epoxysteroiden sind bekannt (Litteil und S. Bernstein, J. Org. Chem, 27, 2544 [1962]). Diese bekannten Verfahren sind vielstufige Synthesen, bei denen Ausbeuten von weniger als 10% erzielt werden.
Demgegenüber kann man bei dem erfindungsgemäßen Verfahren Ausbeuten von über 50% erzielen.
Für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist allein erforderlich, daß die angewandten Ausgangssteroide die 30-Hydroxy- bzw. 3/?-Acyloxy-5,6-epoxy-Gruppierung, wobei der 5,6-Epoxyring <x- oder ^-ständig sein kann, besitzen. Darüber hinaus kann das Ausgangssteroid beliebige weitere Substituenten, wie beispielsweise freie oder funktionell abgewandelte Hydroxylgruppen, z. B. in la-, 110-, 14«-, 15λ-, 16-, 17- und/oder 21-Stellung, vorzugsweise niedere Alky!gruppen, z. B. in la-, 2«-, 7«-, 16- und/oder 18-Stellung, freie oder funktionell abgewandelte Ketogruppen, z. B. in 11 und/oder 17- oder 21-Stellung, Halogenatome, vorzugsweise Chlor und Fluor, z. B. in 16-Stellung enthalten. Auch zusätzliche Doppelbindungen, z.B. in 7-, 9(11)-, 14(15)- und/oder 16-Stellung, kann das angewandte Ausgangssteroid enthalten.
Die Durchführung der erfindungsgemäßen mikrobiologischen Umwandlung erfolgt nach den dem Fachmann dafür bekannten Arbeitsmethoden. So werden in allgemein üblichen Vorversuchen die günstigsten Reaktionsbedingungen für die aerobe, submerse Fermentation ermittelt. Die Umwandlung des als Lösung oder Suspension zugesetzten Substrats wird zweckmäßigerweise durch dünnschichtchromatographische Analyse von Probeextraktraten verfolgt. Nach beendeter Fermentation wird das Verfahrensprodukt mit einem geeigneten mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel aus der Kulturbrühe extrahiert und aus dem Extrakt, z. B. durch Eindampfen und weitere bekannte Aufarbeitungsmethoden, beispielsweise durch Umkristallisieren und/oder Chromatographie an Silicagel gereinigt.
Die erfindungsgemäß eingeführte 6-Hydroxylgruppe im Verfahrensprodukt ist je nach der Stellung des
5,6-Epoxydringes im Ausgangssteroid x- oderß-ständig.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist ein technisch
einfaches Verfahren zur Herstellung von 6-Hydroxy-3-kettwi'^-Steroiden der Pregnan- oder Androstanreihe, die wichtige Zwischenprodukte zur Herstellung von hormonwirksamen Steroiden sind oder teilweise selbst schon als Arzneimittelwirkstoffe verwandt werden können. Der glatte Reaktionsverlauf unter Erzielung technisch brauchbarer Ausbeuten an gewünschtem Verfahrensprodukt war überraschend, weil aufgrund der Untersuchungen von S.S. Lee und Ch. J. Shi (Biochem. 3 1267 [1964]) erwartet werden mußte, daß die Einwirkung von Mikroorganismen auf Substrate mit 3/?-Hydroxy-5,6-epoxy-Gruppierung überwiegend zu Verfahrensprodukten mit 9,10-seco-Struktur führen würden.
Die für das erfindungsgemäße Verfahren notwendigen 3/J-Hydroxy- bzw. 3jJ-Acetoxy-5,6-epoxysteroide werden hergestellt aus den entsprechenden 3/J-Hydroxy- bzw. 3/J-Acyloxy-J5-Steroiden durch Epoxydierung der d5-Doppelbindung in an sich bekannter Weise,
z. B. mittels Persäuren. Am Beispiel des 3ß- Hydroxy-21 -acetoxy-16«-methyl-5-pregnen-20-on soll die Herstellung des Ausgangssteroids näher
*5 erläutert werden:
60 g 3)3-Hydroxy-21-acetoxy-16«-methyl-5-pregnen-20-on werden in 1,81 trockenem Methylenchlorid gelöst und mit 12 g Natriumacetat (geschmolzen) und 40 g Natriumsulfat (sicc.) versetzt Bei +20C werden innerhalb einer halben Stunde unter Rühren 36 ml Peroxyessigsäure zugetropft, dann nochmals 12 g Natriumacetat und 40 g Natriumsulfat zugesetzt und in gleicher Zeit weitere 36 ml Peroxyessigsäure zugetropft Es wird nachgerührt, wobei innerhalb von 2 Stunden die Reaktionslösung sich auf Raumtemperatur erwärmt. Nach Neutralisieren mit 1 1 5%iger NaHCCh-Lösung unter Ruhren wird die Methylenchloridlösung abgetrennt, mit Wasser, FeSOvLösung und Wasser gewaschen, über Na2SO4 getrocknet und im Vacuum bei 40°C eingeengt. Der Rückstand wird aus Essigester umkristallisiert, F. 177-179°C (Ausbeuten bis 85% *-Epoxyd).
Die gewünschten 3-Acetate werden durch Epoxydierung der analogen /J5-3-Acetate erhalten oder auch durch nachträgliche Acetylierung der 30-Hydroxy-5«,6«-epoxyde.
Die Verfahrensprodukte sind wertvolle Zwischenprodukte zur Herstellung pharmakologisch wertvoller 110-Hydroxysteroidverbindungen.
Beispiel 1
Ein 21 Erlenmeyerkolben — gefüllt mit 500 ml eines sterilisierten wäßrigen Mediums, enthaltend 0,1%' Hefeextrakt, 0,5% Cornsteep liquor und 0,05% Stärkezucker, eingestellt auf pH 7,0 — wird mit einer Lyophilkultur von Arthrobacter simplex beimpft und 48 Stunden bei 300C und 145 U/Min, geschüttelt Mit 250 ml der Bakteriensuspension wird ein 201 Glasfermenter — beschickt mit 14,751 sterilisierter Nährlösung gleicher Zusammensetzung — inokuliert und 24 Stunden bei 290C, mit einer Belüftung von 1650 l/U mit 220 U/Min, gerührt. Aus dieser Vorfermentation werden 0,9 I in einen 201 Glasfermenter überführt, der mit 14,1 I sterilisierten Mediums gleicher Zusammensetzung beschickt ist. Zur Hauptfermentation werden die gleichen technischen Bedingungen wie bei der Vorfermentation angewendet. Dabei wird der pH-Wert während der Hauptfermentation zwischen 6—7 gehal-
tea Nach 6 Stunden Anwachsphase werden 3,75 g 3^-Hydroxy-5o,6a-epoxy-testok)lacton in 80 ml Dimethylformamid zugegeben und fermentiert Der Reaktionsverlauf wird durch dünnschichtchromatographische Analyse von Methylisobutylketonextrakten einzel- s ner Kulturproben verfolgt Nach etwa 34 Stunden ist das Ausgangsmaterial vollständig umgewandelt zu einer neuen Verbindung (Rf 0,23 System Chloroform/Methanol 95 :5). Die Kulturbrühe wird mit einmal mit 7,51 und weitere zweimal mit je 51 Methylisobutylketon ausgerührt Die vereinigten Exktrakte werden in einem Umlaufverdampfer im Vakuum bei 30—35° C konzentriert und im Rotationsverdampfer bei maximal 40° C Badtemperatur im Vakuum zur Trockne eingeengt Der Rückstand wird mit wenig kaltem Hexan von Anti- is schaummitteln (Siliconöl) freigewaschen und ergibt nach Trocknen 3,2 g fcx-Hydroxy-l-dehydro-testololacton, das — aus Methanol umkristallisiert — bei 297—299° C schmilzt; Rf: 0,6 (Chloroform/Methanol 9:1);ε24ΐ = 15 820.
Beispiel 2
Dieses Beispiel unterscheidet sich von Beispiel 1 nur durch Einsatz einer Lyophilkultur von Bacillus lentus (anstatt Arthrobacter simplex) und der Verwendung eines auf pH 7 eingestellten wäßrigen Anzuchtmediums, enthaltend 1,5% Pepton, 1,2% Cornsteep liquor, 0,2% MgSO4 (anstatt des Hefeextrakt-Cornsteep-Stärkezuckermediums). Für Vor- und Hauptfermentation wird wieder das Medium von Beispiel 1 benutzt
Die Umwandlung ist nach 28 Stunden Kontaktzeit beendet. Man erhält 3,1 g Rohprodukt und nach Umkristallisieren aus Methanol 2,2 g 6«-Hydroxy-l-dehydrotestololacton; F. 293—295°C; Rf. 0,12 (Benzol/Essigester 1 :4).
Im Spektrenvergleich und nach Mischschmelzpunkt ist die Verbindung identisch mit dem nach Beispiel 1 erhaltenen Reaktionsprodukt
Beispiel 3
40
Analog Beispiel 2 werden 3,75 g 3/?-Hydroxy-5«,6«- epoxyandrostan-17-on in 80 ml Dimethylformamid in 151 Kulturbrühe mit Bacillus lentus fermentiert. Nach 28 4s Stunden ist das Ausgangsmaterial (Rf 0,53) vollständig zu dem Produkt mit Rf 0,38 (Chloroform/Methanol 95 :5) umgewandelt Das erhaltene Rohprodukt (3,4 g) wird aus Methanol umkristallisiert Man erhält so 2A g 6<%-Hydroxy-l,4-androstadien-3,17-dion; F.255-258°C; Rf: 0,77 (Chloroform/MeOH 9 :1), 0,27 (Benzol/Essigester 1 : 4); 8242 =15 100.
Beispiel 4
55
Unter den Bedingungen von Beispiel 2 werden 2,7 g 3ß,\ 50-Dihydroxy-5<x,6«-epoxy-16«-methy 1-11,20-dion in 30 ml Dimethylformamid in 151 Kulturbrühe von Bacillus lentus fermentiert Nach 27 Stunden Kontaktzeit ist das Ausgangsmaterial umgesetzt Nach Aufarbeitung erhält man 2,2 g 6a,15/?-Dihydroxy-16«-methyll,4-pregnadien-3,ll,20-trion, das — aus Essigester umkristallisiert - bei 263-267°C schmilzt: Rf 0,57 (Chloroform/MeOH 9 :1);e2»= 14 100.
Eine Probe wird in Pyridin/Acetanhydrid bei Raumtemperatur acetyliert, wobei das entsprechende 6<x,\5ß-Diacetat entsteht; F. 202-204°C; Rf: 0,66 (Benzol/Essigester 1 :4); 6235= 14 800.
Beispiel 5
Nach den Bedingungen des Beispiels 2 werden 3,75 g 3/?- Hydroxy-21 -3CCtOXy-Sa1OA-CpOXy-16a-methyl-pregnan-20-on in 151 Kulturbrühe mit Bacillus lentus 27 Stunden fermentiert (Kontaktzeit 21 Stunden) und aufgearbeitet Durch Säulenchromatographie und Umkristallisieren aus Aceton/Isopropyläther erhält man 6o^21-Dihydroxy-16«-inethyl-l,4-pregnadien-3,20-dion, F. 207—209°C; 624i -15 400; Rf: 0,43 (Benzol/Essigester 1:4).
Beispiel 6
Nach den Bedingungen des Beispiels 2 werden 3,0 g 30-Hydroxy-21 -acetoxy-5«,6«-epoxy-pregnan-20-on in 121 Kulturbrühe mit Bacillus lentus 30 Stunden fermentiert (Kontaktzeit 24 Stunden) und aufgearbeitet Durch Säulenchromatographie und Umkristallisieren aus Aceton/Isopropyläther erhält man 6«,21 -Dihydroxyl,4-pregnadien-3,20-dion; F. 187 —189°C; £2«= 15 700; Rf: 033 (Benzol/Essigester 1 :4).
Beispiel 7
Nach den Bedingungen von Beispiel 2 werden 3,75 g 3/J-Hydroxy-5flt,6«-epoxy-16-methyI-pregnan-20-on in 151 Kulturbrühe mit Bacillus lentus 28 Stunden fermentiert (22 Stunden Kontaktzeit) und aufgearbeitet. Nach Säulenchromatographie und Umkristallisieren aus Aceton/Hexan erhält man 6«-Hydroxy-16Ä-methyl-l,4-pregnadien-3,20-dion; F. 178-180°C; 6241 = 14 100; Rf: 0,67.
Beispiel 8
Nach den Bedingungen von Beispiel 2 werden 2 1 Schüttelkolben, die mit 500 ml Medienfüllung als Fermentationsgefäß benutzt werden, je 125 mg 3j3,17«- Dihydroxy-5«,6»-epoxy-pregnan-20-on mit Bacillus lentus fermentiert Die Umwandlung war nach 30 Stunden beendet. Üblid.e Aufarbeitung und Umkristallisation aus Aceton/Hexan ergeben 6«,17<x-Dihydroxy-l,4-pregnadien-3,20-dion; Rf: 0,67 (System Chloroform/Methanol : I);e24i= 14 000.
Beispiel 9
Unter den Bedingungen des Beispiels 2 werden 1,87 g 30,1 lj3-21-Trihydroxy-5«,6«-epoxy-pregnan-20-on in 151 Kulturbrühe von Arthrobacter simplex 20 Stunden fermentiert (Kontaktzeit 14 Stunden) und aufgearbeitet. Durch Säulenchromatographie des Rohproduktes und Umkristallisation aus Essigester/Isopropyläther erhält man 6<%,ll/?,21-Trihydroxy-l,4-pregnadien-3,2-dion; Rf: 0,30;E24o=14 200.
Beispiel 10
Unter den Bedingungen des Beispiels 1 werden 1,87 g 30,11 ߣ 1 -Trihydroxy-Sa.eat-epoxy-16«-methy 1-pregnan-20-on in 151 Kulturbrühe von Arthrobacter simplex 27 Stunden fermentiert (Kontaktzeit 21 Stunden) und aufgearbeitet Durch Säulenchromatographie wird das Rohprodukt aufgetrennt und gereinigt. Nach Umkristallisieren aus Aceton/Isopropyläther erhält man 6<x,110,21-Trihydroxy-16«-methyl-l,4-pregnadien-3,20-dion; F. 211-212°C; Rf: 0,31 (Benzol/Essigester 1 :4);e242=14 600.
Beispiel 11
Nach den Bedingungen des Beispiel 1 werden 2 g 30-Hydroxy-5/?,6ß-epoxy-testolacton in 50 ml Dirne-
thylformamid in 81 Kulturbrühe mit Arthrobacter simplex fermentiert Nach 56 Stunden Fermentationszeit (=50 Stunden Kontaktzeit) entstehen nach DC-Analyse zwei UV-aktive Produkte mit den Rf-Werten von 03 (identisch mit 60-Hydroxy-testolacton aus s Beispiel 2) und 0,53 (Chloroform/Methanol 9:1). Das durch übliche Aufarbeitung erhaltene ölige Rohprodukt (14 g) wird durch Säulenchrcmatographie an Silicagei aufgetrennt Die Fraktion (Rf 043) wird aus Essigester/ Isopropyläther umkristallisiert Man erhält so 60-Hydroxy-J -dehydro-testolacton vom Schmelzpunkt 254-258°C; E243=IeOOO; Rf 0,67 (Chloroform/Methanol 9:1).
Beispiel 12
Nach den Bedingungen des Beispiels 2 werden 3,75 g 3/?-Hydroxy-5«,6«-16a,l 7«-diepoxy-pregnan-20-on in 151 Kulturbrühe Bacillus lentus fermentiert Nach 29 Stunden ist das Ausgangsmaterial vollständig umgewandelt Und eine Hauptzone (Rf 0,43) entstanden. Das durch übliche Aufarbeitung erhaltene Rohprodukt (2,93 g) wird aus Essigester umkristallisiert und ergibt 6«-Hydroxy-15«,17«-epoxy-l,4-pregnadien-3,20-dion; F. 227-2300C; Rf 0,47 (Benzol/Essigester 1 :4); 6242=14 500.
Beispiel 13
Nach den Bedingungen des Beispiels 2 werden 3,75 g 3 β - Hydroxy - 21 - acetoxy - 5«, 6«, 16<x, 17<x-diepoxy-pregnan-20-on in 151 Kulturbrühe Bacillus lentus fermentiert Nach 26 Stunden ist das Ausgangsmaterial vollständig umgewandelt und in 60%iger Ausbeute eine Hauptzone Rf 0,22 entstanden. Das durch übliche Aufarbeitung erhaltene Rohprodukt 3,3 g wird aus Essigester-lsopropyläther umkristallisiert und ergibt 6«,21 -Dihydroxy-16«,17«-epoxy-1,4-pregnadien-3,20-dion; F. 55—6O0C; Rf 0,23 (Benzol/Essigester 1 :4);4O 8241 = 13 900.
Beispiel 14
Eine Lyophilkultur von Bacillus sphaericus ATCC45 7055 wird in 500 ml eines auf pH 7 eingestellten, sterilen, wäßrigen Mediums, enthaltend 0,1% Pepton, 0,2% Cornsteep liquor, 0,5% Glucose, 0,5% Hefeextrakt eingebracht und 48 Stunden bei 300C geschüttelt 50 ml der Bakteriensuspension werden dann überführt in einen 21 Erlenmeyerkolben, der mit 500 ml des gleichen Mediums gefüllt ist Nach 24 Stunden werden 2 ml der Kulturbrühe überführt in einen 100 ml Erlenmcyerkolben gefüllt mit 30 ml des gleichen Mediums. Nach 6 Stunden Anschütteln werden 0,2 ml einer sterilfiltrierten Lösung von 400 mg 3/3-Hydroxy-5«,6«-epoxy-androstan-17-on in 20 ml Dimethylformamid zugegeben und weitere 42 Stunden bei 300C geschüttelt Danach wird die Fermentationsbrühe mit 4 ml Methylisobutylketon ausgeschüttelt
Eine aliquote Menge des Extrakts wird gegen eine Vergleichsmenge einer Standardsubstanz 6a-Hydroxy-1,4-androstadien-3,l 7-dion dünnschichtchromatographisch untersucht; Rf Ο37 (Benzol/Essigester 1 :4). Danach wird der Extrakt, der etwa 70 bis 80% Umwandlungsprodukt enthält, in üblicher Weise durch Säulenchromatographie aufgearbeitet und das isolierte Rohrprodukt aus Aceton/Isopropyläther umkristallisiert Man erhält so 275 mg 6«-Hydroxy-l,4-androstadien-3,17-dion vom Schmelzpunkt 257—259° C
Beispiel 15
Eine Lyophilkultur von Mycobacterium phlei wird analog Beispiel 14 angezüchtet und fermentiert Als Substrat werden wiederum 400 mg 3/?-Hydrox/-5«,6aepoxy-androstan-17-on eingesetzt Fermentaiionszeit 42 Stunden, wobei nach dünnschichtchromatographischer Analyse wiederum etwa 70—80% 6a-Hydroxyl,4-androstadien-3,l 7-dion entstehen (Rf 037 Benzol/ Essigester 1 : f. Nach üblicher Aufarbeitung des Reaktionsp"..iisches erhält man 260 mg 6<x-Hydroxyl,4-androstadien-3,l 7-dion vom Schmelzpunkt 255-259° C.
Beispiel 16
Eine Lyophilkultur von Mycobacterium smegmatis ATCC 14 468 wird analog Beispiel 14 angezüchtet. Als Substrat werden wiederum 400 mg"3/?-Hydroxy-5«,6«- epoxy-androstan-17-on eingesetzt; Fermentationszeit 64 Stunden. Nach dünnschichtchromatographischer Analyse sind etwa 50% 6«-Hydroxy-l,4-androstadien-3,17-dion entstanden. Nach Aufarbeitung in üblicher Weise erhält man 180 mg 6«-Hydroxy-l,4-androstadien-3,17-dion vom Schmelzpunkt 254—257°C.

Claims (1)

  1. Patentanspruch:
    Verfahren zur Herstellung von 6-Hydroxy-3-keuwl'^-Steroiden der Pregnan- und Androstanreihe, dadurch gekennzeichnet, daß man ein im Α-Ring gesättigtes 3/J-Hydroxy- bzw. 3/?-Acyloxy-5,6-epoxysteroid der Pregnan- oder Androstanreihe mit Bakterien der Gattung Bacillus, Mycobacterium oder Arthrobacter oder mit deren Enzymen fermentiert
DE1904544A 1969-01-27 1969-01-27 Verfahren zur mikrobiologischen Umwandlung von 3 ß-Hydroxy-5,6- epoxysteroiden in 6-Hydroxy-3-KetoA<·4 -Steroide Expired DE1904544C3 (de)

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