DE2510161C2 - Antibioticum, ein Verfahren zu seiner Herstellung sowie seine Verwendung als Mittel zur Förderung des Wachstums und der Steigerung der Futterverwertung bei Tieren - Google Patents

Description

2. Verfahren zur Herstellung des Antibioticums nach Anspruch I, dadurch gekennzeichnet, daß man die Actinoplanes-Stämme CBS 432.74 und/oder CBS 4ΓΪ4.74 unter aeroben Bedingungen in einem üblichen

is Kulturmedium züchtet und das gebildete Antibioticum nach üblichen Verfahren aus der Kulturbrühe und/

oder dem Mycel isoliert und reinigt.

3. Verwendung des Antibioticums nach Anspruch I zur Förderung des Wachstums und zur Verbesserung der Futterverwertung bei Tieren.

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Antibioticum, ein mikrobiologisches Verfahren zu seiner Herstellung aus Actinoplanaceen-Stämmen sowie seine Verwendung zur Förderung des Wachstums und der Steigerung der Futterverwertung bei Tieren (vgl. die Patentansprüche I bis 3).

Es ist bereits bekanntgeworden, daß eine Reihe von Antibiotics mikrobieller Herkunft antimikrobielle Wirkungen besitzen. Diese Antibiotica sind teilweise in ihren Wirkungsspektren nicht voll befriedigend. Sie weisen häufig noch weitere Nachteile auf./i-I.actamaniibiotica werden oft durch Pcnicillinase inaktiviert, Chloramphenicol, Tetracycline und Streptomycin zeigen in vielen Fällen erhebliche unerwünschte Nebenwirkungen (vgl. jo Walter. Heilmeyer. Antibiotica Fibel. Georg Thicme Verlag, Stuttgart. 3. Aufluge. 1969. Seiten 248,278—280 und 311-319).

Es wurde nun gcfundnn, daß --"an ein neues Antibioticum erhält, wenn man die Actinoplanes-Stämme

SE 73 oder SE 73/B

einzeln oder gemeinsam in einem Nührmcdium züchtet und das Antibioticum nach bekannten Methoden aus dem Nährmedium isoliert.

Weiterhin wurde gefunden, daß das neue Antibioticum eine starke antimikrobiell Wirkcd^ aufweist und außerdem die Eigenschaft besitzt, bei Tieren das Wachstum zu beschleunigen bzw. zu fördern und die Futterverwertung zu verbessern.

Das neue Antibioticum kann durch die folgenden Eigenschaften charakterisiert werden:

(1) Die ElemcniaranalyscC50,8%; H 7,2%:O —42% ergibt folgende empirische Summenformcl:CwH-wOjh.Ks muß hier darauf hingewiesen werden, daß bei so großen Molekülen die Fchlcrbrcitc der F.lemenlaranalysc (±0,8%) es nicht immer erlaubt, eine genaue Summcnformel aufzustellen (R. B. Woodward, Angcw. Chcm. 69, S. 50—51 [1957]). Die genannte Summcnformel kann daher einen gewissen Fehler aufweisen.

(2) Ermitteltes Molekulargewicht: 1340 bis 1390. sehr wahrscheinlich 1370.

(3) Ultraviolettspektrum: Fig. 1; "C-NMR-Spektrum: Fig.2: IR-Spektrum: Fig.3: 'H-NMR-Spcktrum: so F i g. 4.

(4) Das Antibioticum ist löslich in Wasser, den niederen Alkoholen (Ci-C4), Chloroform, Aceton; schwer löslich in Diäthyläther, Petroläther.Cyclohexan; mäßig löslich in Essigester.

(5) Charakteristisch für das Molekül ist die Säurcempfindlichkcit. Bei pH 2 und Raumtemperatur 18 bis 22"C geht die anlibiolischc Aktivität innerhalb 1 Stunde auf den Nullwert zurück. Gleichzeitig verschwindet die charakteristische Bande im UV-Spektrum bei 267 nm. Auch durch Alkali wird das erfindungsgemäßc Antibioticum abgebaut. Beim Erhitzen in n/10 Natronlauge auf 100⁰C über 30 Minuten entsteht eine Verbindung, die im ultraviolttlcn Gebiet nur noch Endabsorption zeigt. Sie hat eine gegenüber dem eingesetzten Antibioticum verminderte, jedoch noch deutliche in-viiro-Wirkung gegenüber grammncgaliven Bakterien.

6Q (6) Das erfindungsgemäße Antibioticum ist ein Neutralstoff, der bei der Elektrophorese nicht wandert. Bei der sauren Hydrolyse (/. B. mit wäßriger 10% [Gewicht] Schwefelsäure bei 8O⁰C) werden reduzierende Zucker abgespalten. Dadurch ist es leicht möglich, das Antibioticum bei der Dünnschicht-Chromatographic auf einer Kiesclgelplattc mit sauren Zuckcrrcagcnlicn wie z. B. Anisaldchyd-Schwefclsäure oder Bcn/.idin-Trichloressigsäure oder Thymol-Schwcfclsäurc sichtbar zu machen. Auch Besprühen mit IO%iger Schwcfcl-

bi säure und /chnniinütiges Erhitzen auf 8O⁰C ergibt eine blaugrauc Anfärbung auf der Platte. Das letztgenannte Reagens wurde zum charakteristischen Nachweis von Makrolid-Anlibiotie» vorgeschlagen (E.Stahl. Dünnschichi-Chromalographic.2. Aufl.. 1967.S. 54b).

Die K|.-Werte des erfindungsgemäßen Anlibiolicums auf Kicselgclplaiicn (Fa. Merck. Darmstadt, Bundesrepublik Deutschland) mit verschiedenen Laufmitteln gibt Tabelle 1 wieder.

Tabelle 1

	a)
'f	b)
	c)
	d)
	c)

Uiufmitlel(Volumcntoile) Ri-Wert

Methanol + Chloroform

5 + 95 0,025

4+1 . 0,49

50 + 50 0,755

100+0 0,715 n-Butanol + Eisessig + Wasser

60 + 20 + 20 0.470

Bei der Abgrenzung des erfindungsgemäßen Antibioticums gegenüber bereits bekannten Antibiotica kann man die Stickstoff-haltigen, aromatischen und Chloroform-unlöslichen außer Betracht lassen, da daß erfindungsgemäöe Antibioticum nur aus Kohlenstoff, Wasserstoff und Sauerstoff besteht und keinen Stickstoff enthält. Der Gehalt an abhydrolysierbaren reduzierbaren Zuckern, die Löslichkeit und die Anfärbung mit I0%iger Schwefelsäure deuten auf eine gewisse Ähnlichkeit zu den Macrolid-Antibioi'ica hin. von denen einige vonige Stickstoff- ?s> freie Vertreter bekannt sind. Die Macrolide sind jedoch im Gegensatz /.um erfindungsgemäSen Antibioticum vorzugsweise gegen grampositive OrganirTien wirksam und nicht gegen gramnegative (Keller-Schierlein, Fortschritte der Chemie organischer Naturstoffe 30. S. 314 [1973]). Weiterhin ist bisher kein Macrolid-Antibioticum bekanntgeworden, das bei 267 nm absorbiert (Gottlieb, Shaw, Antibiotics I! [1967], S. 159).

Gegenstand der Erfindung ist demgemäß das Antibioticum, das durch folgende Parameter gekennzeichnet ist:

löslich in Wasser, niederen Alkoholen (Ci-C₄), Chloroform und Aceton und schwerlöslich in Diethylether.

Petrolether und Cyclohexan;

ein Neutralstoff und bei der Elektrophorese nicht wandernd;

bei der sauren Hydrolyse reduzierende Zucker abspaltend; die in F i g. I bis 4 angegebenen UV-, IR- und NMR-Spektren besitzend:

die empirische Summenformel CwH-wO«.-

Überraschenderweise wird das erfindungsgemäße Antibioticum durch die obengenannten Actinoplanes-Stämmc gebildet und kann aus dem Kulturmedium in guter Ausbeute isoliert werden. Weiterhin ist es überrasehend, daß das erfindungsgemäße Antibioticum eine starke antimikrobielle, insbesondere antibakterielle Wirkung, auch gegenüber gramnegaliven Erregern aufweist, ohne die oben dargelegten Nachteile bekannter Anlibiotica zu zeigen. Das neue Antibioticum weist auch überraschenderweise die Eigenschaft auf, bei Tieren das Wachstum zu fördern und die Futterverwertung zu verbessern. Die vorliegende Erfindung stellt daher eine Bereicherung der Pharmazie und der Technik dar.

Für das erfindungsgemäße Verfahren können die neuen Acinoplanes-Stümme

SE 73
SE 73/B

45 eingesetzt werden.

Die erfindungsgemüB verwendbaren Stämme Actinoplanes species SF.-73 und SE-73/B gehören der Klasse der Schizomyceten, der Ordnung der Actinomycetales, der Familie der Actinoplanaccac und der Gattung Actinoplanes an. Der Stamm SE-73 wurde aus Erde isoliert. Der Stamm SE-73/B wurde als Spontanmutante des Stammes SE-73 erhalten. Die Stämme SE-73 und SE-73/B haben die folgenden Merkmale:

Das Myccl ist 0,3 bis IJ μπ\ breit und ist verzweigt. Die Sporangicn sind von unregelmäßiger Gestalt, im Umriß meist annähernd kugelig, aber mit buckeliger Oberfläche und einem Durchmesser von 5 bis 18 μίτι. Die Sporen sind kugelig bis ellipsoid, begeißelt, schnell beweglich Tivl haben einen Durchmesser von 0,7 bis 1.3 μπι. Sie sind im Sporangium in Form von gekrümmten und geknäueltcn Ketten angeordnet.

Die Kulturmerkmale auf verschiedenen Nährböden (nach 14 Tagen bei ti;ier Waehstumstemperai-jr von 20 bis 30⁰C beobachtet) gehen aus der nachstehenden Aufstellung hervor:

Czapek-Agar	gut bis sehr gut
W	orange
SM	schwach bräunlich-gelb
LP	Mycelobcrfläche dünn bereift
Spg. +

C PCfCasamino-P'ipton-Czapck-Agur)

W gut bis sehr gut _h5

SM orange bi.s orange-braun

LP braun

Spg. ++ Mycoloborfläfchedürin bereifi

Tyrosin-Agar	müßig bis gut
W	braun
SM	braun
LP	Mycelobcrfliichc zum Teil dünn bereift
Spg. -	nicht aufgelöst
Tyrosinkristallc
Mclaninbildung
positiv

W	- Wachstum
SM	= Substratmyecl
LP	= ■ Lösliches Pigment
Spg.	«· Bildung von Sporangien
	= Fehlen
+	— ausgeprägtes Vorhandensein
+ +	- sehr ausgeprägtes Vorhandensein

Milch-Agar

W gut bis sehr gut

SM orange

LP goldbraun

Spg. + + Mycclobcrfiächc dünn bereift

Casein pcptonisiert

Milch-Peptonisierung

pGStJV 20

—

Der Stamm SE-73/B unterscheidet sich vom Stamm SF.-7J durch eine erhöhte Erzeugung des crfindungsge-

jo mäßen Antibiotikums.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann mit Hilfe fester, halbfcster oder flüssiger Niihrmedien durchgeführt werden. Bevorzugt werden wäßrig flüssige Nährmedien verwendet.

Die Beimpfung der Nährmedien erfolgt nach allgemein üblichen Methoden. /.. U. über Schrägmhrchcn oder Kolbenkulturen.

j5 Die Kultur erfolgt unter aeroben Bedingungen und kann gemäß den allgemein üblichen Methoden wie unter Verwendung von Schüttelkulturen /. B. in Schüttelkolben, von luftbewegten Kulturen oder von Submerskulturen durchgeführt werden. Bevorzug! erfolg! die Kultivierung \rr, aeroben .Subfficr>veriahreri in belüfieicn Fermentern, z. B. in üblichen Submcrsfcrmentationstanks. Es ist möglich, die Kultur kontinuierlich oder diskontinuierlich durchzuführen. Vorzugsweise wird diskontinuierlich gcarbcilct.

■to Die Kultur kann in allen Nährmedien durchgeführt werden, welche bekannterweise zur Kultivierung von Mikroorganismen der Ordnung der Actinomycetales verwendet werden. Das Nährmedium muß eine oder mehrere assimilierbare Kohlcnstoffqucllcn und Stickstoffqucllen sowie Mineralsalze enthalten, wobei diese Produkte in Form von definierten FJnzelbesiandtcilcn, aber auch in Form von komplexen Gemischen, wie insbesondere biologische Produkte verschiedenen Ursprungs darstellen, vorliegen können. Als Kohlcnstoffquellen kommen alle üblichen Kohlcnstofiquellcn in Frage. Beispielsweise seien Stärke, Melasse. Molkepulver. Dextrin, Zucker, wie Saccharose. Maltrose. Glucose. Lactose, Sorbit und Glycerin genannt. Als Stickstoffquellcn kommen alle üblichen organischen und anorganischen Slickstoffqucllcn in Frage. Beispielsweise seien Sojabohnenmehl, Baumwollsamcnmehl, Linsenmehl, F.rbsenmehl, lösliche und unlösliche pflanzliche Proteine. Maisquellwasser, Hefeextrakt. Peptone und Fleischextrakt sowie Ammoniumsalze und Nitrate, z. B. NH4CI, (NH₄J₂SO*.

NaNOj und KNOj aufgeführt. Die Mineralsalze, welche im Nährmedium enthalten sein sollten, liefern 7 8. folgende Ionen:

Mg⁺ \Na\K\Ca» \NH4\a.SO4-.PO4- - und NO,

sowie Ionen der üblichen Spurenelemente wie Cu, Fe, Mn. Mo, Zn, Co und Ni. Falls die Kohlenstoff- oder Stickstoffqueüen bzw. das verwendete Wasser nicht ausreichend diese Salze bzw. Spurenelemente enthält, ist es zweckmäßig, das Nährmedium entsprechend zu ergänzen. Die Zusammensetzung der Nährmedien kann in weiten Bereichen variiert werden. Art und Zusammensetzung der Nährmedien werden im allgemeinen davon abhängig sein, welche Bestandteile jeweils besonders günstig zur Verfugung stehen.

Bei der Durchführung des Verfahrens kann es günstig sein, zu Beginn der Kultivierung der Aciinoplanes-Stämme nur relativ geringe Konzentrationen der löslichen Nährlösungsbestandtcile zu verwenden und dann im Laufe der ersten drei Kullivierungstagc durch häufigere Zusätze diese Bestandteile in Form steriler, relativ konzentrierter Lösung dem Kulturansatz fraktioniert zuzufüttcrn. — Der pH-Wert der wachsenden Kulturen sollte vorzugsweise zwischen etwa 6 und etwa 8, insbesondere /wischen 6,5 und 7.5 gehalten werden. Ein zu

!-.5 starker pH-Abfall in den sauren Bereich kann durch Zusai/e einer organischen oder anorganischen Base, vorzugsweise von CaC'Oj, vermieden werden. Wie in der Fermentationstechnologie üblich, kann auch eine automatische pH-Regulierung durchgeführt werden, bei der sterile organische oder anorganische Säure, z. B. H2SO4, oder sterile Lauge, 7. B. NaOH. in Abständen in die Kulturlösung eingespritzt wird.

Ks ist zweckmäßig sichcr/.iisicllcn, daß ilic Mikroorganismen ausreichend mit Sauerstoff sowie den Nährstoffen in Kontakt gebracht werden. Dies kann nach den allgemein üblichen Methoden wie Schütteln und Rühren erfolgen.

Die Züchtungstcmpcratiir kann /wischen etwa 20 und etwa 40"C. vorzugsweise zwischen 25 und 35"C liegen, besonders bevorzugt liegt sie bei eiwa 28"C. Die Dauer der Züchtung kann stark variiert werden, wobei z. B. die Zusammensetzung des Nährmediums und die Züchtungstemperatur eine Rolle spielen. Die jeweiligen optimalen Bedingungen können von jedem Kachmann auf dem mikrobiologischen Gebiet leicht festgelegt werden.

lis hat sich herausgestellt, daß die Menge des sich in der Kulturbrühe anreichernden Anlibioticums im allgemeinen ihr Maximum etwa 2 bis 12, vorzugsweise 5 bis 8 Tage nach Züchtungsbeginn erreicht.

Wie allgemein bei mikrobiologischen Verfuhren sollten rremdinfeklionen der Kulturmedien vermieden werden. Hierzu werden die üblichen Vorkehrungen getroffen, wie Sterilisation der Nährmedien, der Kulturgefäße sowie der für die Belüftung noiwendigen Luft. Zur Sterilisation der Vorrichtungen können ■/.. B. die Dampf- als auch die Trockensterilisation verwendet werden.

Falls bei der Kultivierung in unerwünschter Menge Schaum entsteht, können die üblichen chemischen Schaumdämpfungsmittel, z. B. flüssige Kette und öle, Öl-Wasser-Kmulsionen. Paraffine, höhere Alkohole, wie π Octodccanol, Siliconöle, Polyoxyäthylen- bzw. Polyoxypropylcnverbindungcn, zugesetzt werden. Schaum kann auch mit Hilfe der üblichen mechanischen Vorrichtungen (welche z. B. Zentrifugalkräfte benutzen) gedämpft oder beseitigt werden.

Das crhndungsgcmäüc Antibioticum kann aus dem Myccl und/oder uns dem Kulturmedium nach allgemein üblichen physikalisch-chemischen Methoden isoliert werden. Die Isolierung kann z. B. gemäß den üblichen Kxtraktionsverfahrcn, Fällungsverfahren und/oder Chronialographicverfahrcn erfolgen. Das isolierte Antibioticum kann mit Hilfe der genannten Methoden auch feingcrcinigt werden. Für viele Fälle ist jedoch eine Feinreinigung nicht erforderlich, da die gegebenenfalls vorhandenen Verunreinigungen die Wirksamkeit des Antibioticums nicht nachteilig beeinflussen. Bei allen Isolierungs- und Reinigungsoperationen ist darauf zu achten, daß pH-Werte von 7,0 oder mehr, vorzugsweise zwischen 7,0 bis 9.0, eingehalten werden. Zur Erhöhung des pH-Wertes können anorganische und organische Basen verwendet werden, z. B. Ammoniak, Alkali· und Erdalkalihydroxidc, Alkali- und Erdalkalicarbonatc und Hydrogcncarbonate. z. B. KOH, NaOH. NajCOj, NaHCOj. CaCOi, Trialkylamine. wie Triäthylamin, Morpholin und Pyridin. Um bei den obengenannten Isolierungs- und Rcinigungsmethoden die Fraktionen herauszufinden, in welchen das erfindungsgemäße Antibioticum in hochs'cr Konzentration bzw. Reinheit vorliegt, können die üblichen physikalisch-chemischen Methoden, z. B. Messen jo der UV-Bande bei 267 nm. der R^-Werte oder vorzugsweise die Untersuchung der aniimikrobiellcn Aktivität herangezogen werden. Besonders günstig ist im vorliegenden Falle die Untersuchung der Aktivität gegen Escherichia coli (wie Escherichia coli ATCC %37) mit Hilfe des üblichen Plattentests (vgl. zum Beispiel P. Klein, Bakteriologische Grundlagen der chemotherapeutischen Laboratoriumspraxis, Springer-Verlag. Göttingen [1957]. Seiten 86 folgende). J5

Die isolierung und Reinigung des erfindungsgemäßen Antibioticums kann z. B. im Falle, daß ein flüssiges wäßriges Nährmcdium verwendet wird, wie foigi vorgenommen werden:

Zur Kulturbrühe einschließlich Mycelium wird ein mit Wasser mischbares organisches Lösungsmittel gegeben und gut vermischt, wodurch einerseits Wirkstoff aus dem Mycelium extrahiert wird und andererseits in vielen Fällen auch eine Klärung der Kulturbrühe erreicht wird.

Als Lösungsmittel können z. B.niedere Alkylalkoholc(Ci-C₁). wie Methanol. Äthanol, n- und i-Propanoloder t.-Butanol, Dimethylformamid, Tetrahydrofuran und besonders bevorzugt Aceton verwendet werden. Die Menge des Lösungsmittels kann in weiten Grenzen variiert werden. Bevorzugt wird etwa das gleiche Volumen wie es die Kulturbrühc hat, zugesetzt. Anschließend werden die nicht gelösten Bestandteile (Mycelium, ausgefällte Proteine usw.) durch Filtration, Zentrifugation, Absetzen lassen usw. abgetrennt.

Die wäßrig-organische Lösung wird zweckmäßigerweise im Vakuum z. B. auf das Volumen des eingesetzten Kulturmediums eingeengt.

Gegebenenfalls wird mit einer Base (vgl. oben), vorzugsweise mit NaOH, ein pH-Wert von über 7,0, z. B. ein pH-Wert von 9,0, eingestellt. Die so erhaltene Lösung soll im folgenden als »Lösung I« bezeichnet werden.

Aus der »Lösung I« kann das erfindungsgemäße Antibioticum mit Hilfe von üblichen Extraktionsverfahren, Fällungsverfahren und/oder Chromatographieverfahren isoliert und gegebenenfalls gereinigt werden. Die Chromatographie kann in Form der Säulenchromatographie oder der präparativen Dünnschichtchromatographie durchgeführt werden. Ais Adsorptionsmittel können alle üblichen (nicht sauren) anorganischen oder organischen Adsorptionsmittel eingesetzt werden, wie z. B. Aluminiumoxid, Kieselgel, Magnesiumsilikat. Aktivkohle, Cellulose, Cellulosederivate, vernetzte Dextranderivate, Kunstharze wie Polyamide. Derivate von Poly- amiden usw, zum Beispiel acetyliertes Polyamid. Als Laufmitte! bei der präparativen Dünnschichtehromatographie können die verschiedensten Losungsmitte! oder Lösungsmittelgemische verwendet werden, in welchen das erfindungsgemäße Antibioticum löslich ist. Bevorzugt wird ein Gemisch aus Chloroform und Methanol (z. B. 5 :1 Volumenteile) eingesetzt. Auch als Laufmittel für die Säulenchromatographie können Lösungsmittel bzw. Lösungsmittelgemische verwendet werden, in welchen das erfindungsgemäße Antibioticum löslich ist. Beispiel- μ haft seien Tetrachlorkohlenstoff, Methylenchlorid und bevorzugt Chloroform genannt.

Bevorzugt werden zur Isolierung des erfindungsgemäßen Antibioticums Extraktionsverfahren, gegebenenfalls in Kombination mit Chromatographie-Verfahren und Fällungsverfahren verwendet. Bei der Durchführung der Extraktionsschriue ist darauf zu achten, daß je nachdem, ob das erfindungsgemäße Antibioticum in der wäßrigen oder organischen Phase vorhanden sein soii, die Extraktionsmiitci so gewählt werden, daß in ihnen das b5 Antibioticum schwer bzw. leicht löslich ist

Das Extraktionsverfahren kann z. B. wie folgt durchgeführt werden: Die »l-ösung I« wird mit in Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmitteln nach üblichen Methoden

LsJ IV IUl

(Schütteln. Gcgcnstromvcrfahrcn usw.) extrahiert. Als Lösungsmittel können die üblichen Extraktionsmittcl, z. B. Ester, wie Äthylacelat und Butylacetat, höhere Alkohole, wie Amylalkohole. /.. B. n-Amyl-Alkohol. in Wasser nicht mischbare Ketone. /. Ii. Mcthylisobutylkcton, chlorierte niedere Kohlenwasserstoffe, z. B. Chloroform, Methylcnchlorid und Tetrachlorkohlenstoff, eingesetzt werden. Bevorzugt werden Äthylacetat und Butylacetal, insbesondere Äthylacetat, verwendet.

Wenn bei Her Extraktion der »Lösung I« Äthylacctal (und/oder Butylacctal) eingesetzt werden, wird die organische Phase verworfen, da sich das crfindtingsgemäße Antibioticum in der wäßrigen Phase befindet. Die wäßrige Phuse wird anschließend zwcckmäßigerwcisc mit einem für solche Zwecke üblicherweise verwendeten inerten anorganischen Salz. /.. B. NaCl, KCI, NajSOj und/oder MgS(X, gesättigt, um die nachfolgende Extraktion ίο zu erleichtern. Die Menge des zuzufügenden Salzes ist unkritisch. Sie hängt verständlicherweise von der Menge der Lösung und von der Löslichkeit der Salze ab und kann leicht ermittelt werden. Diese Lösung wird mit einem in Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel, in welchem das erfindungsgemäßc Antibioticum löslich ist. wie sie oben bei der allgemeinen Erklärung der Extraktion der »Lösung I« aufgeführt werden, wobei jedoch keine Ester verwendet werden können, extrahiert. Die wäßrige Phase wird verworfen und das Lösungsmittel der organisehen Phase, z. B. auf etwa 1/10 bis 1/30 des ursprünglichen Volumens eingeengt. Anschließend wird das ^; erfindungsgemäßc Antibioticum durch die Zugabe eines organischen Fällungsmittels (Lösungsmittel), in welchem das erfindungsgemäße Antibioticum schwer löslich ist. z. B. von Diäthyläthcr oder von gesattigten geradkettigen oder verzweigten oder cyclischen Kohlenwasserstoffen, z. B. Pctroläthern. η-Hexan, oder Cyclohexan,

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;.' 20 rohe erfindungsgemäße Antibioticum durch Verdampfen des Wassers, vorzugsweise durch Gefriertrocknung.

'·. erhalten werden. Das rohe Antibioticum kann gewünschlenfalls nach den üblichen chromaiographischen Mc-

'.] thoden (Säulenchromatographie, präparativc Dünnschichtchromalographic) feingereinigt werden, wobei als

Adsorptionsmittel, wie bereits erwähnt, die üblichen nicht sauren anorganischen und organischen Adsorptionsmittel verwendet werden können, z. B. Aluminiumoxid. Kicselgcl. Magnesiumsilikat. Aktivkohle. Cellulose. κ= 25 Cellulosederivate, Kunstharze wie Polyamide, Derivate von Polyamiden, z. B. acetylicrtes Polyamid, usw.

-H Wenn bei der Extraktion der »Lösung I« nicht Äthylacetat oder Butylacetat. sondern ein anderes Lösungsmittel, z. B. CCU. verwendet wird, wird die wäßrige Phase verworfen, da sich das crfindungsgeinäße Antibioticum in |i der organischen Phase befindet. In diesem Falle wird das organische Lösungsmittel vorzugsweise auf etwa 1/10

r· bis 1/30 des ursprünglichen Volumens eingeengt und durch die Zugabe eines geeigneten organischen Fällungs-

\'- jo mittels, in welchem das erfindungsgemäßc Antibioticum schwer löslich ist, z. B. von Diäthyläthcr oder von

fj gesättigten geradkettigcn oder verzweigten oder cyclischen Kohlenwasserstoffen, z. B. Petroläthcr, n-Hexan

R oder Cyclohexan, nach den üblichen Methoden gefällt. Der Niederschlag wird in Wasser aufgelöst und die

|j Lösung gefriergetrocknet. Das erhaltene Rohprodukt kann, gegebenenfalls nach Extraktion mit Äthylacetat

oder Butylacetat, worin unerwünschte Begleitstoffe löslich sind und wobei die organische Lösung verworfen

!? J5 wird, nach den üblichen chromatographischen Methoden, z. B. durch Säulenchromatographie, präpcrativc

£ Dünnschichtchromatographie mit Hilfe der üblichen Adsorptionsmittel (vgl. auch die obigen Ausführungen)

Ik gereinigt werden. Zur Reinigung kann auch, wie bereits oben erwähnt, aus einer l^ösiing des Rohprodukts in

einem organischen Lösungsmittel (z. B. Aceton. Tetrachlorkohlenstoff. Chloroform und Methylenchlorid) das

H erfindungsgemäßc Antibioticum mit Hilfe eines geeigneten organischen Fällungsmittcls. in welchem das erfin-

i| 40 dungsgemäßc Antibioticum schwer löslich ist. z. B. von Diälhyläther. gesättigten geradkettigen oder vcrzweig-

ti ten oder cyclischen Kohlenwasserstoffen, z. B. Pctroläthcr. η-Hexan und Cyclohexan. fraktioniert ausgefällt

f werden.

Die neuen Actinoplanes-Stämmc mit den l.aborbezeichnungen SE 73 und SE 73/B wurden unter den folgenden Nummern hinterlegt:

a) SE 73:

j CBS-Nr.432.74(l2.8.74)

b) SE 73/B:

C BS-Nr. 434.74 (12. 8. 74) 50

CBS = Centralbureau voor Schimmelcultures, Baarn. Niederlande.

Der erfindungsgemäße Wirkstoff weist bei geringer Toxizität eine starke antimikrobielle Wirksamkeit auf. Diese Eigenschaften ermöglichen seine Verwendung als chemotherapeutischen Wirkstoff in der Medizin sowie als Stoff zur Konservierung von anorganischen und organischen Materialien, insbesondere von organischen Materialien aller Art. z. B. Polymeren. Schmiermitteln, Farben. Fasern. Leder, Papier und Holz, von Lebensmitteln und von Wasser.

Der erfindungsgemäßc Wirkstoff ist gegen ein sehr breites Spektrum von Mikroorganismen wirksam. Mit seiner Hilfe können gramnegative und grampositive Bakterien, bakterienähnliche Mikroorganismen, bekämpft to sowie die durch diese Erreger hervorgerufenen Erkrankungen verhindert, gebessert und/oder geheilt werden.

Besonders wirksam ist der erfindungsgemäßc Wirkstoff gegen Bakterien und bakterienähnliche Mikroorganismen. Er ist daher besonders gut zur Prophylaxe und Chemotherapie von lokalen und systemischen Infektionen in der Human- und Tiermedizin geeignet, die durch diese Erreger hervorgerufen werden.

Beispielhaft können lokale und/oder sysiemische Erkrankungen behandelt und/oder verhindert werden, die h5 durch die folgenden Erreger oder durch Mischungen der iolgenden Erreger verursacht werden:

Micrococaceae, wie Staphylokokken, z. B. Staphylococcus aurcus, Staph. epidermidis, Staph. aerogenes und Gaffyka tetragena (Staph. = Staphylococcus);

Lactobacteriaceae, wie Streptokokken. /. B. Streptococcus pyogcncs, λ· bzw. //-hämolysicrende Streptokokken, nicht (/-)-hämolysierende Streptokokken, Str. viridans, Str. faccalis (Entcrokokken), Str. alalacliac, Si.-, laciis,Str.equi.Str. anaerobisund Diplococcus pneumoiae(Pneumokokken)(Str. « Streptococcus); Ncisscriaceac, wie Neisscricn, z. B. Neiss^riii gonorrhocae (Gonokokken), N. ineningilidis (Meningokokken), N.catarrhalis und N.flavu(N. = Neisseria); ^r>

Corynebacteriaceae, wie Corynebukteiit-n, /. I). Corynebactcriuni diphthcriiic, C. pyogfies, C. diphthcroides, C. ncncs, C. parvum, C. bovis, C. renale, C. ovis, C. miirisepticum, Listeria-Bakiericn. /.B. Listsria nionocytogcnes, Erysipclothrix-Baklcricn, /.. B. (vrysipelolhrix insidiosa, Kurthia-Baktericn. /.. B. Kurthia zopfii (C «- Corynebacterium);

Mycobacteriaceae, wie Erreger von Mykobakteriosen, ι. B. Mycobacterium tuberculosis, M. bovis, M. avium, sogenannte atypische Mykobakicrien der Runyon-Gruppen I. II, III und IV, M. leprae (M. = Mycobacterium);

Enterobacteriaceae, wie Eseherichieac-Bakterien, Escherichia-Bakierien, z. B. Escherichia coli, Enterabacter-Bakterien, z. B. E. aerogenes. E. cloaciic, KlcbsicJ'a-Baktericn, /.. B. K. pneumoniae. K. ozacnac, Erwiniae, z. B. Erwiniaspec. Serratia, z. B. Scrratia marcescens(E. - Entcrabacter), (K. — Klebsiclla), Proteac-Baklerien der Proteus-Gruppe: Proteus, ζ. B. Proteus vulgaris, Pr. morganii, Pr. rettgeri, Pr. mirabilis, Providcncia, z. B. Providencia sp. (Pr. - Proteus), Salmonellcae: Salinonella-Baktcricn, /.. B. Salmonella oaratyphi A und B, S. typhi, S. cnteritidis, S. cholera suis, S. typhimurium (S. - Salmonella), Shigella-Bakierien, z. B. Shigella dysenleriac, Sh. nmbigua, Sh. "cxncri, Sh. boydn, Sn. sonrici (Sh. *· Shigeiia); Spinilaceae, wie Vibrio-Bakterien, /.. B. Vibrio cholerac, V. proteus, V. fetus (V. = Vibrio), Spirillum-Bakteriet, z. B. Spirillum minus;

ßacillaceae, wie aerobe Sporenbildner, z. B. Bacillus anthracis (B. sublilis, B. cereus). (B. = Bacillus), anaerobe Sporenbildner Clostridien, t. B. Clostridium perfringens, Cl. septicum. Cl. ocdcmatiens, Cl. histolyticuni, Cl. tetani.CI. botulinum(CI. - Clostridium);

Mykoplasmen, wie /.. B. Mycoplasma pneumoniac. M. hominis, M. sui.s pneumoniae, M. galiiscpticum, M. hyorhinis(M. — Mycoplasma).

Dieobrige Aufzählung von Erregern ist lediglich beispielhaft.

Der erfindungsgemäße Wirkstoff kann in allen Bereichen der Tierzucht und Tierhaltung als Mittel zur Förderung und Beschleunigung des Wachstums und zur Verbesserung der Futterverwertung bei gesunden und kranken Tieren verwendet werden.

Die Wirksamkeit des erfindungsgemäßen Wirkstoffes ist hierbei weitgehend unabhängig von der Art und dem Geschlecht der Tiere. Besonders wertvoll erweist sich der erfindungsgemäüe Wirkstoff bei der Aufzucht und Haltung von Jung- und Masttieren. Als Tiere, bei denen der erfindungsgemäße Wirkstoff zur Förderung und Beschleunigung des Wachstums und zur Verbesserung der Futterverwertung eingesetzt werden kann, seien beispielsweise folgende Nutz- und Ziertiere genannt:

Warmblüter wie Rinder Schweine, Pferde, Schafe, Ziegen, Kai/.ers, Hüüiic·. Kaninchen, Pei/.iicfe, /.. B. Nerze und Chinchilla, Geflügel, z. B. Hühner, Gänse, Enten, Truthähne, Tauben, Papageien und Kanarienvögel und Kaltblüter wie Fische, z. B. Karpfen und Reptilien, z. B. Schlangen.

Die Menge des erfindungsgemäßen Wirkstoffes, die den Tieren zur Erreichung des gewünschten Effektes verabreicht wird, kann wegen der günstigen Eigenschaften des Wirkstoffes weitgehend variiert werden. Sie liegt vorzugsweise bei etwa 5 bis 600, insbesondere 10 bis 300 mg/kg Körpergewicht pro Tag. Die Dauer der Verabreichung kann von wenigen Stunden oder Tagen bis zu mehreren Jahren betragen. Die passende Menge Wirkstoff sowie die passende Dauer der Verabreichung hängen insbesondere von der Art, dem Alter, dem Geschlecht, dem Gesundheitszustand und der Art der Haltung der Tiere ab und sind durch jeden Fachmann leicht zu ermitteln.

Der crfindungsgemäße Wirkstoff wird den Tieren nach den üblichen Methoden verabreicht. Die Art der Verabreichung hängt insbesondere von der Art, dem Verhalten und dem Gesundheitszustand der Tiere ab. So kann die Verabreichung einmal oder mehrmals täglich in regelmäßigen oder unregelmäßigen Abständen oral oder parenteral erfolgen. Aus Zweckmäßigkeitsgründen ist in den meisten Fällen eine orale Verabreichung, insbesondere im Rhytmus der Nahrungs- und/oder Getränkeaufnahme der Tiere, vorzuziehen.

Der erfindungsgemäße Wirkstoff kann als reiner Stoff oder in formulierter Form, also in Mischung mit nichttoxischen inerten Trägerstoffen beliebiger Art, z. B. mit Trägers!offen und in Formulierungen, wie sie nachstehend beschrieben sind, verabreicht werden.

Unter nichttoxischen, inerten pharmazeutisch geeigneten Trägerstoffen sind feste, halbfeste oder flüssige Verdünnungsmittel, Füllstoffe und Formulierungshilfsmiticl jeder Art zu verstehen.

Als Zubereitungen seien Tabletten, Dragees, Kapseln, Pillen, Granulate, Lösungen, Suspensionen und Emulsionen genannt.

Tabletten. Dragees, Kapseln, Pillen und Granulate können den oder die Wirkstoffe neben den üblichen Trägerstoffen enthalten, wie (a) Füll- und Streckmittel, z. B. Stärken, Milchzucker. Rohrzucker, Glukose, Mannit μ und Kieselsäure, (b) Bindemittel, z. B. Carboxymethylcellulose, Alginate, Gelatine, Polyvinylpyrrolidon, (c) Feuch.thaltemittel, z. B. Glycerin, (d) Sprengmittel, z. B. Agar-Agar, Calciumcarbonai und Natriumcarbonat, (e) Lösungsverzögerer, z. B. Paraffin und (f) Resorptionsbschleuniger, z. B. quaternäre Ammoniumverbindungen,(g) Netzmittel, z. B. Cetylalkohol, Glycerinmonostcarat, (h) Adsorptionsmittel, z. B. Kaolin und Bentonit und (i) Gleitmittel, z. B. Talkum, Calcium- und Magncsiumsiearat und fesie Polyäihyiengiykoie oder Gemische der b5 unter (a) bis (i) aufgeführten Stoffe.

Die Tabletten, Dragees, Kapseln, Pillen und Granulate können mit den üblichen gegebenenfalls Opakisie- I

rungsmittei enthaltenden Überzügen und Hüllen versehen sein und auch so zusammeneesetzt spin Haft «ie Hp_n I

Wirkstoff nur oder bevorzugt in einem bestimmten Teil des Intcstinallraktes, gegebenenfalls verzögert abgeben, wobei als Einbettungsmassen z. B. Polymersubstanzen und Wachse verwendet werden können.

Der Wirkstoff kann gegebenenfalls mit einen» oder mehreren der oben angegebenen Trägerstoffen auch in mikroverkapselter Form vorliegen.

Lösungen und Emulsionen können neben dem Wirkstoff die üblichen Trägerstoffe wie Lösungsmittel, Lösungsvermittler und Emulgatoren, z. B. Wasser. Äthylalkohol, Isopropylalkohol, Äthylcarbonat, Äthylacetal. Benzylalkohol. Benzylbenzoat. Propylenglykol. 1,3-Butylenglykol. Dimethylformamid, Öle. insbesondere Baumwollsaatöl. Erdnußöl. Maiskcimöl, Olivenöl, Ricinusöl und Sesamöl. Glycerin, Glycerinformal. Tetrahydrofurfurylalkohol, Polyäthylenglykole und Fettsäureester des Sorbitans oder Gemische dieser Stoffe enthalten, ίο Zur parenteralen Applikation können die Lösungen und Emulsionen auch in steriler und blutisotonischer Form vorliegen.

Suspensionen können neben dem Wirkstoff die üblichen Trägerstoffe wie flüssige Verdünnungsmittel, z. B. Wasser. Äthylalkohol, Propylenglykol. Suspendiermittel, z. B. äthoxylierte Isostearylalkohole. Polyoxyäthylensorbit- und Sorbitanester, mikrokristalline Cellulose, Aluminiummetahydroxid, Bentonit, Agar-Agar und Tragant oder Gemische dieser Stoffe enthalten.

Die genannten Formulierungsformen können auch Färbemittel. Konservierungsstoffe sowie geruchs- und geschmtcksverbessernde Zusätze, z. B. Pfcfferminzöl und Eukalyptusöl und Süßmittel.z. B.Saccharin enthalten. Der erfindungsgemäße Wirkstoff kann gegebenenfalls in formulierter Form auch zusammen mit pharmazeutischen Wirkstoffen, Mineralsalzen. Spurenelementen, Vitaminen, Eiweißstoffen, Fetten, Farbstoffen und/oder Geschmacksstoffen in geeigneter Form verabreicht werden.

Empfehlenswert ist die öraie Verabreichung zusammen mit dem Fuller und/oder Trinkwasser, wobei je nach Bedarf die Wirkstoffe der Gesamtmenge oder nur Teilen des Futters und/oder Trinkwassers zugegeben werden. Der erfindungsgemäße Wirkstoff kann nach üblichen Methoden durch einfaches Mischen als reiner Stoff.

vorzugsweise in fein verteilter Form oder in formulierter Form in Mischung mit eßbaren nichttoxischen Trägcr stoffen, gegebenenfalls auch in Form eines Pracmix oder eines Fuitcrkonzcntrates. dem Futter und/oder dem

Trinkwasser beigefügt werden.

Das Futter und/oder Trinkwasser kann beispielsweise den erfindungsgemäßen Wirkstoff in einer Konzentration von etwa 5 bis 500. insbesondere 10 bis 100 ppm (Gewicht) enthalten. Die optimale Höhe der Konzentration des Wirkstoffs im Futter und/oder Trinkwasser ist insbesondere abhängig von der Menge der Futter und/oder to Trinkwasseraufnahme der Tiere und kann durch jeden Fachmann leicht ermittelt werden.

Die Art des Futters und seine Zusammensetzung ist hierbei ohne Belang. Es können alle gebräuchlichen, handelsüblichen oder speziellen Fulterzusammensetzungen verwendet werden, die vorzugsweise das übliche, für eine ausgewogene Ernährung notwendige Gleichgewicht aus Energie- und Aufbaustoffen einschließlich Vitaminen und Mineralstoffen enthalten. Das Futter kann sich beispielsweise zusammensetzen aus pflanzlichen Stoffen, z. B. Heu. Rüben, Getreide. Getreidenebenprodukten, tierischen Stoffen, z. B. Fleisch, Fetten, Knochenmehl, Fischprodukten, Vitaminen, z. B. Vitamin A, D-Komplex und B-Komplcx. Proteinen, Aminosäuren, z. B. DL-Methionin und anorganischen Stoffen, z. B. Kalk und Kochsalz.

Futterkonzentratc enthalten den erfindungsgemäßen Wirkstoff neben eßbaren Stoffen, z. B. Roggcnmchl. Maismehl, Sojabohnenmehl oder Kalk, gegebenenfalls mit weiteren Nähr- und Aufbaustoffen sowie Proteinen, Mineralsalzen und Vitaminen. Sie können nach den üblichen Mischmethoden hergestellt werden.

Vorzugsweise in Pracmixen und Futterkonzentraten kann der Wirkstoff gegebenenfalls auch durch seine Oberfläche bedeckenden geeigneten Mittel, z. B. mit nichitoxischcn Wachsen oder Gelatine vor Luft, Licht und/oder Feuchtigkeit geschützt werden.

Beispiel für die Zusammensetzung eines Kükenfutters, das den crCindungsgemäßen Wirkstoff enthält: 200 g Weizen, 340 g Mais, 361 g Sojaschrot, 60 g Rindertalg. 15 g Dicalciumphosphat, 10 g Calciumcarbonal. 4 g jodiertes Kochsalz, 7,5 g Vitamin-Mineral-Mischung und 25 g Wirkstoff-Pracmix ergeben nach sorgfältigem Mischen 1 kg Futter.

Die Vitamin-Mineral-Mischung besteht aus:

6000 I.E. Vitamin A, 1000 I.E. Vitamin Di, 10 mg Vitamin E, I mg Vitamin K₃.3 mg Riboflavin, 2 mg Pyridoxin. % 20 meg Vitamin Bi₂. 5 mg Calciumpaniothenat, 30 mg Nikotinsäure, 200 mg Cholinchlorid. 200 mg MnSO₄ χ HjO. 140 mg ZnSO₄ χ 7 H₁0.100 mg FcSO₄ χ 7 I I;O und 20 mg CuSO₄ χ 5 H₂O.

Der Wirkstoff-Praemix enthält den erfindungsgemäßen Wirkstoff in der gewünschten Menge, z. B. 20 mg und zusätzlich I g DL-Methionin sowie so viel Sojabohnenmchl.daü 2.2 g Pracmix entstehen.

Beispiel für die Zusammensetzung eines Schweincaufzuchtfutters, das den erfindungsgemäßen Wirkstoff enthält:

630 g Futtergetreideschrot (zusammengesetzt aus 200 g Mais, 150 g Gerste-. 150 g Hafer- und 130 g Weizenschrot), 80 g Fischmehl. 60 g Sojaschrot. 60 g Tapiokamchl, 38 g Bierhefe. 50 g Vitamin-Mincral-Mischung für Schweine (Zusammensetzung z. B. wie beim Kükcnfuticr), 30 g Leinkuchenmehl, 30 g Maisklcberfuttcr, 10 g Sojaöl, 10g Zuckcrrohrmelasse und 2 g Wirkstoff-Praemix (Zusammensetzung z. B. wie beim Kükenfutter) ergeben nach sorgfältigem Mischen I kg Futter.

Die angegebenen Fuitcrgcmischc sind vorzugsweise zur Aufzucht und Mast von Küken bzw. Schweinen abgestimmt, sie können jedoch in gleicher oder ähnlicher Zusammensetzung auch zur Aufzucht und MaM andererTicrc verwendet werden.

Die gute antimikrobiellc Wirksamkeil des crfindiingsgemäUcn Anlibioticums kann durch die folgenden Versuhä ehe demonstriert werden:

a) In vitro-Versuche

Das erfindungsgemäBe Antibioticum wurde mit Müller-Hinton-Nährbrühe unter Zusatz von 1% Glucose auf einen Gehalt von 200 μg/ml verdQnnt In der Nährlösung befanden sich jeweils 1 χ 10⁵ bis 2x10'' Bakterien pro Millimeter. Die Röhrchen mit diesem Ansatz wurden jeweils 18 Stunden bebrütet und anschließend wurde der 5 Trübungsgrad bestimmt. Trübungsfreiheit gibt Wirkung an. Bei der Dosierung von 200 μg/ml waren die folgenden Bakterienkulturen trübungsfrei:

Escherichia coli 14; Escherichia coli C 165; Proteus vulgaris 1017; Klebsiella K 10; Klebsiella 63: Salmonella sp.; Shigella sp.; Enterobacter sp.; Serratia sp.; Proteus, indolnegativ, sp.; Proteus indolposiliv. sp.; Pasteurel- io la pseudo tuberculosis; Bruceila sp.; Bordetella bronchiseptica; Bacteroides sp.; Staphylococcus aureus 133; Neisseria catarrhalis sp.; Diplococcus pneumoniae sp.; Streptococcus pyogenes W; Enlerococcus sp.; Lactobacillus sp.; Corynebacterium diphteriae gravis; Corynebacterium pyogenes M; Clostridium botulinum; Clostridium tetani; Borrelia sp.; Pseudomonas aeruginosa sp.; Aeromonas hydrophila sp.: Mycoplasma sp. (Sp. — »species« — nicht näher identifizierte, jedoch charakteristische Stämme). is

b) In vivo-Versuche

Aus der folgenden Tabelle 1 geht die Wirkung des erfindungsgemäßen Antibioticums gegen eine Reihe von Bakterien im Tierversuch mit der weißen Maus hervor. Die weißen Mäuse vom Stamm CFj wurden intraperito- 20 neal mh der jeweils angegebenen Bakterienart infiziert.

Tabelle 1 Tierversuch mit der weißen Maus Bestimmung der ED50 nach 24 Stunden 25 Keim Dosis in mg des erfindungs·

gemäßen Antibioticum; pro kg Körpergewicht

Escherichia coli 165 Ix 400 Staphylococcus aureus 1 χ 200 Therapie: Einmalig 30 Minuten nach Infektion, subcutan. Die EDw ist die Dosis, bei der 50% der infizierten Tiere nach 24 Stunden noch überleben.

Die gute Wirksamkeit des erfindungsgcmäUen Antibiotikums als Mittel zur Förderung des Wachstums kann durch folgenden Versuch demonstriert werden:

Bei Fütlerungsvcrsuchcn wurde die Substanz dem Futter untergemischt und an Küken verfüttert. Die Dosis betrug 10 bzw. 25 ppm. Verglichen wurde gegen eine Negativkontrolie (Futter ohne Zusätze). Versuchsdauer: 14 40 Tage.

Versuch

Anzahl der Tiere Durchschnittsgewicht Gewicht 45

in g in %

Ncgativkontrolle 24 358,2 100 F.rfindungsgcmäßes 10 ppm 24 372.5 104,0 Antibioticum 25 ppm 24 383,7 107,1 50 Erläuterungen der Fig. I bis 4

l'ig. Nr. Abs/issc Ordinate

1 Wellenlänge (ninj % Absorption

2 όin ppm

3 WcIlCnZUhI(Cm-¹) % Absorption

4 iJinppm

I) Fig. liUltraviolctlabsorptionsspcktrum: Das UV-Spektrum des Antibioticums wird in Fig. I wiedergegeben

A_n,,, -265 niti (C-O₁(KWl % in Methanol)

[£^1%/_cir] 265 nm - 164.

2)

3)

Fig. 2:

Das ¹³C-Kernresonanzspektrum (Fig.2) wurde an einer Lösung des Antibioticums in deuterisiertem Methanol mit Tetramcthylsilan als innerem Standard an derselben Lösung auf einem XL-100-Spckirometer (15"; der Firma Varian Associates, Paolo Alto. Kalifornien bei 25.2 MHz unter Protonenrauschentkopplung gemessen.

F i g. 3: IR-Absorptionsspektrum:

Das IR-Absorptionsspekirum des Antibioticums wird in F i g. 3 wiedergegeben. Es zeigt, wenn die Substanz zu KBr-Preßlingen verpreßt wird, bei folgenden Wellenlängen (ausgedrückt in reziproken Zentime'ern) Absorptionsbanden:

Bandcnfrcqucn/	Inte
cm"1
3440	S
2960	m
2920	m
3440	S
2960	m
2920	m
2850	m
1630	m
1570	S
1445	m
1405	m
1375	m
1310	W

Bandenfrequenz	intensität
cm~'
1290	W
1200	m
1060	S
1290	W
1200	m
1060	S
1020	S
985	m
940	m
905	m
780	m
750	m

Die IR-Bandenintcnsitäten werden mit s, m und w bezeichnet. Eine s-Bandc weist mindestens ²/, der Intensität der stärksten Bande im Spektrum, eine m-Bande eine Intensität im Bereich zwischen Vj und ¹I\ der stärke.en Bande und eine w-Bande weniger als Vj der Intensität der stärksten Bande auf. Diese Schätzungen sind air? der B?.',is der prozentualen Durchlässigkeit gemacht.

4) Das in Fig.4 gezeigt«; 220 MH/. ' H-Kernresonanzspcktrum wurde an einer Lösung des Antibioticums in deuterisicrtcm Methanol mit Tciramethylsilan als innerem Standard auf einem HR-SC-Spcktromcter der Firma Varian Associates, Paolo Alio, Kalifornien aufgenommen.

Die Herstellung des erfindungsgemäßen Anlibioticums kann durch die folgenden Beispiele erläutert werden. Alle %-Angabcn beziehen sich, soweit nicht anders angegeben, auf Gewichtsprozente.

Beispiel 1
Auf Schrägagar der Zusammensetzung (Gewichtspi ozcnte)

Pepton

Casein-Hydrolysat, sauer

K₂H PO₄ x 3 H₂O. p.a.

KCI. p. a.

MgSO₄, p. a.

FeSO₄. p. a.

Rohrzucker

Agar

Wasser

0.25% 0.25% 0.1% 0.05% 0.05% 0,01% 3.0% 2.0% 100%

gewachsenes Mycel des Stammes Aclinoplanes SE-73/B wird auf je 140 ml steriler, in 1-Liter-Erlenmeycrkolbcn befindlicher Nährlösung (im folgenden »Nährlösung A« genannt) der Zusammensetzung:

Sojamehl, entfettet 3,0%

Glycerin, reinst 3,0%

CaCOj. p. a. 0,2%

Wasser ad 100%

Hydroxylgruppen enthaltendes neutrales Polyol,
1 Tropfen/140 ml Nährlösung zur Knischiiiimung

überimpft. Nach8tägiger Kultivierung des Stammes auf der P.undschüttcimaschinc bei 28°C werden Probender Kulturen zentrifugiert. Die klare, überstehende Lösung wird im Agar-Plattenlochtest gegen Eschcrichia coli ATCC 9637 getestet. Das in der Kulturlösung befindliche crfindungsgcmäßc Antibioticum verursacht Wuchstumshcmm/onen von etwa 17 mm Durchmesser. Die Isolierung des erfindungsgemiißen Antibiolicums aus den

Kulturbrühen geschieht wie in Beispiel 3 beschrieben.

Beispiel 2
Jc 8 Liter Nährlösung der Zusammensetzung (Gewichtsprozente)

Dextrin 0,4%

Glycerin 0.2%

Hereextrakt 0.2%

CaCO₃ 0.2% ίο

Leitungswasser ad 100%

3,0 ml hydroxylgruppenhaltiges neutrales
Polyol je 8 Liter Nährlösung

werden in Glasfermenter mit Rührwerk und Belüftungseinrichtung abgefüllt, mit Natronlauge auf pH 6,8 eingestellt und bei 120⁰C sterilisiert Nach Abkühlung der Lösungen werden die Fermenter mit je 240 ml (3,0% (Volumen)) von 3 Tage in »Nährlösung A« gewachsenen Schüttelkulturen des Actinoplanes-Stammes SE-73 beimpft, mit etwa 4 Litern Luft/Min, bei etwa 600 Umdrehungen des Rührwerkes pro Minute belüftet und bei einer Temperatur von 28°C gehalten. 17 und 24 Stunden nach Beginn der Kultivierung erhallen die Fermenter Zusätze von jeweils 0,4% Dextrin, 0.2% Glycerin und 0.3% Hefeextrakt und nach 30, 41, -it- und 54 Stunden Zusätze von jeweils 0,4% Dextrin. 0,2% G'ycerin und 0,4% Hefcextrakt in Form konzentrierter Gemische dieser Nährlösungskomponenten in einem Volumen von je 200 ml pro Zusatz. Ein Anstieg der Kulturvolumina durch diese Zugaben wird durch die aufgetretene Wasserverdunstung kompensiert. Das Gesamtangebot der Nahrlösungskomponenten beträgt für Dextrin 2,8%, für Glycerin 1,4%, für Hefeextrakt 2,4% und für CaCOj 0,2%. Nach 120 Stunden wird die Kultivierung beendet.

Beispiel 3

Die gemäß Beispiel 2 erhaltenen Kulturbrühen von 5 Glasfermentern (5x8 Ltr.) werden vereinigt, mit 48 Liter Aceton versetzt, bei ca. 25°C eine Stunde gerührt und anschließend zentrifugiert. Der klare, vom extrahierten Mycel befreite Überstand wird bei 20 bis 35°C im Vakuum auf etwa 35 Liter eingeengt, mit Natronlauge auf pH 9 eingestellt und mit 18 Litern Äthylacetat extrahiert. Die organische Phase wird verworfen, die wäßrige Lösung nach Sättigung mit Kochsalz mit Natronlauge auf pH 8.5 eingestellt und 2mal mit 9 Litern Äthylacetat extrahiert. Die wäßrige Phase wird verworfen, und die organische Lösung im Vakuum auf ca. 1 Liter eingeengt. Aus dieser Lösung wird das rohe Antibioticum mit 3 Liter η-Hexan ausgefällt. Der Niederschlag wird abgesaugt, mit wenig Äther gewaschen und unter Rühren in Wasser eingetragen, wobei mit 10%iger Sodalösung ein pH-Wert von 7,3 aufrechterhalten wird. Durch Lyophilisieren erhält man aus dieser Lösung 10,5 g des rohen (mwas Soda enthaltenden) erfindungsgemäßen Antibioticums.

Beispie! 4

Reindarstellung des erfindungsgemäßen Antibioiicums durch präparative Dürinschiehtchromatographie(DC)

Bei der analytischen DC des nach Beispiel 3 erhaltenen rohen Antibioiicums bleiben die Farbstoffe am Startpunkt, das erfindungsgemäße Antibioticum befindet sich in der obersten Zone (Fließmittel: Chloroform+Methanol =5+ I (Volumen), Kiesclgelplattcii F 254 der Firma Merck, Darmstadt).

1.00 g des rohen Aniibioticums werden auf 20 Kicsclgclplatten (Merck F 254. 2mm) einer präparativen DC unierworfeniFlicßminehChloroform + Mcthanol-S+ I (Volumen)).

Isoliert wird die unier der UV-Lampc erscheinende oberste Zone. Ausbeute: 344 mg.

Antihiotische Aktivität im Plattentesi gegen Escherichia coü ATCC 9637: 152%, bezogen auf das rohe Ausgangsmaterial.

B c i s ρ i e 1 5

Rcindarsicllung des erfindungsgemäßen Antibioticums durch Säulcnchromatographie

10 g des rohen, gemäß Beispiel 3 erhaltenen Antibioiicums werden in b(X/ ml aqua bidcst. gelöst und über ein acetylierles Polycaprolactam, das sich in einer Säule von 70 cm Länge und 5 cm Durchmesser befindet, filtriert. t,u Aufgefangen werden die bei 67 nm absorbierenden Fraktionen. Die Hauptfraktion wird mil Chloroform extrahier!, die Chloroform-Lösung eingedampft und der Rückstand bei 0,01 Torr 4 Tuge bei b0⁼C getrocknet. Ausbeute: 5,2 g.

Antibiotische Aktivität im Plattcntcst gegen lischcrichia coli ATCC 9637: 148%, bezogen auf Ausgangsmaie-

Beispiel 6
RcindurstellluMg durch fraktionierte Füllung

1,00 g des rohen, gemäß Beispiel 3 erhaltenen Antibioticum* wird in 100 ml Aceton gelöst. Die durcl Zentrifugieren geklärte Lösung wird portionsweise mil Cyclohexan versetzt und das entstehende .Scdimcn durch Zentrifugieren gewonnen.

Zusatz	Füllung	Vo
ml C'ylohuxan	in mg	Wirksamkeit*)
+ 10	43	Ö9
+ 28	125	11«)
+ 17	182	135
+ 25	157	109
+ 60	120	115

*) Im Plnllcntcsl gegen Eschcriehia cnli ATCC <ÄJ7.

²⁰ Diese Fraktionicrungsmcthode kann durch systematische Variation der Lösungsmittel weiter optimiert wer den.

Das gereinigte Antibioticum ergibt die folgenden Analysenwerte: C 50,8%; H 7,2%; O 42,0%. Die Analysen werte können jeweils um etwa ± I % Fehler enthalten.

Der in den Beispielen aufgeführte Plattcndiffusionstcst wird wie folgt vorgenommen (vgl. P. Klein, Baktcriolo ²⁵ gische Grundlagen der Chemotherapeutischen Laboratoriumspraxis, Springer-Verlag, Göttingen [1957], Sciter 86 folgende):

In eine durch Escherichia coli ATCC 9637 infizierte Agar-Plaf! werden Löcher gestanzt. Das zu prüfcndi Material wird als wäßrige Lösung in diese Löcher gegeben. Anschließend wird bei 37ⁿC ca. 16 Stunden bcbrülei Hemmhöfe zeigen Wirksamkeit gegen den verwendeten Keim. Aus der Größe der Hemmhöfe kann auf der ³⁰ Gehalt an dem eriindungsgemäßen Antibioticum geschlossen werden.

Hierzu 4 Blatt Zeichnungen

Claims (1)

1. Patentansprüche: !.Antibioticum, gekennzeichnet durch folgende Parameter:

   a) löslich in Wasser, niederen Alkoholen (Ci — Ci), Chloroform und Aceton und schwerlöslich in Diethylether. Petrolether und Cyclohcxan;

   b) ein Neutralstoff und bei der Elektrophorese nicht wandernd;

   c) bei der sauren Hydrolyse reduzierende Zucker abspaltend:

   d) die in Fig. I bis4 angegebenen UV-. IR- und NMR-Spektren besitzend, wobei diese Figuren Bestandteil ίο dieses Anspruchs sind;

   e) die empirische Summenformcl C