CS203115B2 - Process for preparing antibiotic - Google Patents

Description

(54) Způsob výroby antibiotika

Vynniez se týká způsobu výroby nového antibiotika mikrobiologicky z kmenů Actinoplanaceae. Toto antibioiiUm je vhodné k použití zejména jako antimikrobbální prostředek v lidském a veterinárním lékařství i jako prostředek k podpore růstu a zlepšenému -využití krmivá u zvířat.

Je známo, ie rada antibiotik původu má antimikrobbální účinky. Tato antibiotika v některých případech nemají dostatečně Široké spekrim účinnosti a mimoto maj často další nevýhody. AAtibiotika beta-lkkamnového typu jsou často inaktivována penicilinázou, chloramfenikol, tetracykliny a strepoomycin mají v mnoha případech závažné nežádoucí vedlejší účinky. (Walter, Heilmeyer, AAttbiotika Fibel, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, 3. vydání, 1969, str. 248, 278 ai 280 a 311 ai 319).

Nyní bylo zjištěno, ie je možno získat nové antibiotíkm tak, ie se pěstují kmeny AAtinoplanes SE 73 nebo SE 73/B jednotlivě nebo společně v ii-vném prostředí a nahromaděné antibiotíkm se pak z iivného prostředí izoluje známými způsoby.

Dále bylo zjištěno, ie nové гп^Ь^.^^ má silnou lntimikrobbální účinnost a mimoto tu vlastnost, ie podporuje růst zvířat a zlepšuje vyuuití krmivá.

Nové antibioiíum je noino charakterizovat následujícími vlastnostmi:

1. Elemennární analýza pro je 50,8 % C, 7,2 % H.a 42 % 0. Je samozřejmé, ie při tak velké ’ mooekule nedovoouje chyba ‘elementání analýzy (+ 0,8 stanovit přesný sumární vzorec (R. B. Woodward, Angea, Chem. 69 str. 50 ai 51 /1957/). Shora uvedený sumární vzorec může proto obsahovat určitou chybu.

2. Molekulová váha: 1 340 až 1 390, s největší pravděpodobností 1 370.

3. Spektrum v ultrafia^svvém světle je znázorněno oa obr. 1 je znázor- n^ěno na obr. 2 s^pektrim v lo^f*raδervonés svět].e neznázorněno na obr. 3 a 'H-NM-speíktrim je znázorněno na obr. 4. ·

4. A^t^ibi^otk^im je rozpustné ve vodě, alkoholech o 1 až 4 atomech uhlíku, v clhLorofor-“ mu a acetonu, těžce rozpustné je v diethyletheru, petroletheru a cyklohexanu, středně rozpustné je v ethylesteru kyseliny octové.

5. Chaaakterisiickým znakem mooekuly je citlivost na kyselinu. R4 pH 2 a při teplotě až 22 °C poklesne antibioti^á účinnost v průběhu 1 hodiny na 0. Stejně mizí i charakteristický pás v ultrafίlSvéém světle při 267 nm. V alCalickém prostředí rovněž dochází k pok^lesu ^účin^(^£^t^{i p}odle vynálezu* ^při zal^ái^ v ^0,1 N hydroxid sodněm na 100 °C na 30 minut vzniká sloučenina, která v rltrαfiaSovV oblasti má již pouze koncovou absorpci. Oproti původnímu antibiotiku má sníženou, přece však značnou účinnost in vitro proti gram-«

-negativním bakteriím·. Ί.

6. An0ibtstCkm podle vynálezu je neutrální sloučenina, která se přielektroforéze nevzdaluje od počátku. ИЧ kyselé hydrolýze, ' například kyselinou sírovou o ksnceeOraci 10v váhových % při 80 °C se odštěpují redukující cukry.

Z tohoto důvodu je snadno možné zbarvit antibioikuím při tenkovrstevné dhrommaoorraii na si^kar^ové desce běžnými kyselými reakčními činidly na cukry, například směsí anisaldehydu a kyseliny sírové, smmsí benzidinu a kyseliny trichlorsitsvV nebosmésí thymolu a kyseliny sírové. P4 postřiku 10% kyselinou sírovou se po 10minuOovVm zalhátí na 80 °C objeví modrošedé zbarvení desky. Toto reakční činidlo bylo již navrhováno ke zjišlování makrolidních antibiotik. (E< Stáhl, Dιunnchacht-Chrsmmiogrαphie, 2. vyddnn, 1967, str. 546).

Hodnoty Rf antibiotika podle vynálezu na stlCkαgelovýia deskách (firma Merek Darmssadt,

NSR) při pouuití různých směsí rozpu^iás! jsou uvedena v následnicí tabulce 1. ,

T a b u 1 k a I ,

Směs rozpu^tiJe! (objemové díly) Rf

methanol	+	chloroform
5	+	95	0,025
4	+	1	0,49
50	+	50	0,755
100	+	0	0,715

n-butanol + ledová kyselina octová + voda + 20 + 20 0,470 ♦

Při odlišení antibiotika podle vynálezu od dosud známých antibiotik je možno vyloučit antibiotika, která obsáhlí dusík, arossiicкá antibiotika a antibiotika, nerozpustná v chloroformu, protože aotibiolCUm podle vynálezu sestává pouze z uhlíku, vodíku a kyslíku a neobsahuje dusík. Obsah hydrolyzovatelných reduk^ících cukrů, rozpustnost a moSnost zbarvení _f

10% kyselinou sírovou ukazují na podobnost s ssakoltdoísi antibiotiky, z nichž je známo několik málo sloučenin, které neobsahuj dusík.

Maakroidní antibiotika se však na rozdíl od antibiotika podle vynálezu vzhledem ke své účin^<^£^ti užívají s výhodou proti rrαs-posi0ivnís a nikoli proti gram-negativním mikroorganismům. (Keeler-Sciaerleio, Foossciaitte der Chemie srraniscaer Noaurstoffe £0, str. 314 /1973/)· Mimoto není dosud známo žádné makrolidní antibiotikum, které absorbuje ultrafialové světlo při 267 nm. (Gottlieb, Shaw, Antibiotics II /1967/ str 159).

Je překvapující, že antibiotikum, získané ze shora uvedených kmenů Actinoplanes je možno ze živného prostředí získat v dobrém výtěžku při současné vysoké antimikrobiální, zejméne antibakteriální účinnosti, a to zvláště proti gram-negativním mikroorganismům. Mimoto je antibiotikum prosté běžných nevýhod známých antibiotik. Antibiotikum podle vynálezu má také schopnost podporovat růst zvířat a zvýšit využití krmiv. Antibiotikum podle vynálezu proto znamená významné obohacení farmacie a známého stavu techniky.

Při provádění způsobu podle vynálezu je možno užít nových kmenů Actinoplanes SE 73 a SE 73/B.

Kmeny SE 73 a SE 73/B, kterých je možno využít při provádění způsobu podle vynálezu patří do třídy Schizomycet, řádu Actinomycetolen, čeledi Actinoplanaceae rodu Actinoplanes.

< Kmen SE 73 byl izolován z půdy, kmen SE 73/B byl získán jako spontánní mutanta kmene SE 73.

Oba kmeny SE 73 a SE 73/B mají následující vlastnosti:

Mycelium je široké 0,3 až 1,3a je rozvětvené. Sporangia mají nepravidelný tvar, • v průřezu jsou téměř kulovitá nebo s nepravidelným povrchem při velikosti 5 až 18 дь Spory jsou kulovité až vejčité, opatřené bičíkem, rychle pohyblivé a průměrem 0,7 až 1,3 /д. Jsou uspořádány na sporangiích ve formě zahnutých nebo šroubovité uspořádaných řetězců.

Na různých živných půdách po 14 dnech pěstování při teplotě 20 až 30 °C mají takto získané kultury shora uvedených mikroorganismů následující vlastnosti:

Czapkův agar

W dobrý až velmi dobrý

SM oranžové

LP světle hnědožlutý

Spg·	’++, povrchová plocha mycelia	tence	rýhovaná
CPC (Czapkův agar	s casaminopeptonem)
W	dobrý až velmi dobrý
SM	oranžové až oranžově hnědé
LP	hnědý
Spg.	++, povrchová plocha mycelia	tence	rýhovaná
mléčný agar
W	dobrý až velmi dobrý
SM	oranžové
LP	zlatohnědý
Spg.	++, povrchová plocha mycelia	tence	rýhovaná, dochází

к peptonizaci kaseinu agar s tyrosinem

W	mírný až dobrý hnědé hnědý
	SM LP
•	Spg.	-, povrchová plocha njycelia částečně tence rýhovaná krystaly tyrosinu se nerozpouštějí

tvorba melaninu : pozitivní peptonizace mléka: pozitivní

w	=	růst
SM	=	substrátové míliům
LP	=	rozpustný pigment
Spg.	-	tvorba sporangií
-	-	jev není příoomen
+	=	jev je zřetelně příoomen
++	-	jev je velmi vyjádřen

Kmen SE 73/B se liší od kmene SE 73 vyšší produkcí antibiotika podle vynálezu.

Způsob podle vynálezu je možno provádět při použiti pevného, polotuhého nebo kapalného živného prostředí, s výhodou při kapalného vodného živného prostředí.

Předmětem vynálezu · . je tedy způsob výroby antibiotika s účinností proti gram-pooitivním a gram-negativním. .bakteriím, · .vyznačující se tím, že se pěstuje kmen Antinoplanes SE 73 (ATCC 31058) a/nebb/SE.73/B'-(ATCC .31060) za aerobních podmínek v kapalném živném prostředí obsah^ící vyujitelný.zdrzj. ..nebo zdroje uhlíku, dusíku a anorganických solí při teplotě ¹ až 40 °C · a pM ···.6 · až . 8,,. .·načež · se antibioiiuím ze živného prostředí a/nebo media izoluje a popřípadě čistí. .

Při očkování·' ’ živného ., prostředí., se užívá běžných způsobů, postupuje se například přes * šikmý agar nebo’ · kul fůry ·· v· ^baňkách. ;

‘ Pěstování se provádí?··ža..·._!aerzbních podmínek běžným způsobem, jde tedy například o třepací kultury . například · vitřepacích (Lahvích, provzdušněné kultury nebo submerzní kultury. S výhodou se postup provádí.-jako · aerobní submeesní kultura v provzdušněných fermentorech, jak jsou například běžně užívány pro ostatní submerzní fermentace. Postup je možno provádět kontinuálně nebo disksntiajálaě, s výhodou se provádí po jednotlivých vsátkách.

K^utivaci je možno provádět na všech živných prostředích, vhodných ke kultivaci mikroorganismů řádu Aationzmeeeačes. Živné prostředí musí obsahovat alespoň jeden vyujitelaý zdroj uhlíku a dusíku, a anorganické soli, přičemž tyto látky je možno dodat jako definované jednotlivé složky nebo také ve formě konvexních směěs, zejména biologických produktů různého původu. Ze zdrojů uhlíku padají v úvahu všechny vhodné zdroje, například šrouby, mee.asa, sušená syrovátka, dextrin, cukry jako satharzza, maatoza, glukóza, laktoza, sorbit a glycerin.

Ze zdrojů dusíku padají v úvahu všechny běžné organické i anorganické zdroje dusíku, například sojová moi^a, mouka z bavlníkových semen, z čočky, burských oříšků, rozpustné a nerozpustné rostlinné bílkoviny, kukuřičný výluh, extrakt z kvasnic peptin a extrakt z masa i amonné soli a dusičnany, například chlorid amooný, síran amorný, dusičnan sodný a draselný. Anorganické soli, které mejí být obsaženy v živném prostředí jsou zdrojem například následnících iontů:

Mg**, Na*, K*, Ca**, NH4+, Cl, S04, PO4* a NO₃, jakož i ionty běžných stopových prvků, například ionty mmdi, železa, manganu, moZybdenu, » zinku, kobaltu·á niklu. V případě, že zdroje uhLíku a dusíků, popřípadě pouuitá voda neobsahují tyto soli . a stopové prvky, je účelné doplnát živné prostředí .těmito látkami. Jinak se může složení živného prostředí měrnt v širokém rozm^eí. Typ a složení tohoto prostředí se mění · v · z^\^vj^loí^ti na tom, které jeho složky jsou zvláště příznivé k loujití. ‘

Při provádění způsobu podle vynálezu může být výhodné ze začátku pouMt při pěstování kmenů Actiaoplaaes jen nízkých konce^TaM složek živného prostředí a pak v průběhu prvních tří dnů kultivace tyto složky dále přidávat ve formě sterilních, poměrně koncentrovaných roztoků těchto složek frakc0anovιaým způsobem.

Živné prostředí u rostoucích kultur má mít s výhodou pH 6 až 8, s výhodou 6,5 až 7,5. rychlý pokles pH v kyselém prostředí je možno zamezit přidáváním organické nebo anorganické zásady, s výhodou uhličitanu vápenatého. Tak jak je to běžné při farmentacích, je možno pH řídit také automaticky tak, že se přidává sterilní roztok organické nebo anorganické kyseliny, například kyseliny sírové nebo sterilní roztok zásady, například hydroxidu sodného v různých časových odstupech do živného prostředí.

*

Je úč.elné zajistit., aby mikroorganismus byl dostatečně zásoben kyslíkem a byl také přiváděn do styku s čerstvým živným prostředím. Z tohoto důvodu se běžným způsobem kultura míchá nebo protřepává.

Teplota živného prostředí při pěstování se pohybuje v rozmezí 20 až 40 °C, s výhodou v rozmezí 25 až 35 °C, nejvýhodnějsi teplotou je 28 °C. Doba pěstování se může měnit v širokém rozmezí, přičemž tato doba závisí na složení živného pro-středí a na teplotě pěstování. Nejoρtimálnijší podmínky může snadno stanová každý odborník v mikrooiooogii.

Bylo zjištěno, že mužství antibiotika, které se hromadí v živném, prostředí dosahuje svého maxima·po 2 až 12 dnech, obvykle však po 5 až 8 dnech pěstování. .

Jak je to při mikrobiologických postupech obvyklé, je nutno zabránit infekci živného prostředí. K tomuto účelu se užívá běžných opatření, jako je sterilizace živného prostředí, nádob, v nichž se pěstování provádí a vzduchu, užívaného provzduŠnování. Ke sterilizaci příslušného zařízení je možno užít sterilizace v páře nebo za sucha.

Protože při kultivaci obvykle vzniká nežádoucí množív! pěny, je možno už£t běžných chemických prostředků, které snižují tvorbu této pěny, jako je například kapalný olej nebo oleje, emiuze oleje ve vodě, parafiny, vyšší alkoholy jako oktadekaiol, silikonové oleje, polyoxyethylenové ,, a polyoxypropylenové sloučeniny. Tvorbu pěny je možno snížit také použitím mechanických zařízení, které vyuužvají například odstředivé síly.

Aniiiiotikm, , vyrobené způsobem podle vynálezu je možno z ^cceia a/nebo živného prostředí izolovat běžnými fyzikálně chemickými metodami. Izolace se provádí například běžnou extrakcí, srážením a/nebo chromaaooraficky. Izolované antibioUkim je možno použitím shora uvedených způsobů také·čistit. V mnoha případech však není nutné vysoké čištění, protože inečistjninc, příooniné v antibiotiku nijak neovlivňují jeho účinnost. Při všech izolacích a čistících postupech je nutno dbát toho, aby bylo udrženo pH 7,0 nebo vyšší, s výhodou 7,0 až 9,0. Ke zvýšení pH je možno použžt anorganické i organické · zásady jako je □monak, hydroxidy alkalických kovů a kovů alkalických zemin, uhličitany alkalických kovů a kovů alkalických zemin, mimoto kyselé udičKany, jde tedy například o hydroxid draselný, hydroxid sodný, uhičitan sodný, kyselý uhličitan sodný, uhličitan vápenatý, · triaikclminc, ·například tri etlyrl amin, ooí^c^o.íí a pyridin.

Ke zjištění frakcí při izolačních a čistících postupech, v nichž se aitiiioiikuo nachází v nejvyšší konceenraci nebo s největší čistotou je možno užít běžně fyzikálně chemické metody, například měření absorbce v ul0rafalktvéo světle při 307 nm, hodnoty Rf nebo zkoumání na antioikrobiálií účinnost. Zvváště výhodné je v daném případě zjištění aitioiirkbiální účinnost proti Eschheichis cooi, například Eschheichis coli ATCC 9, 6, 3 a 7 pomocí běžných zkoušek na plotnách (P. Klein, .Beakeriologische Brundlagen der chemokOheapeetischen L^t^b^oe^toiriu^p^re^a^iis, Springeř-Verlag, Gcotingen /1957//, str. 86 ff).

Izolace a čištění antibiotika podle vynálezu je možno provádět například v případě, že se užije vhodného živného prostředí následujícím způsobem.

K živnému prostředí včetně myceia se přidá s vodou mísitelné · organické rozpouštědlo a,směs se důkladně promíchá, přičemž se na jedné straně extrahuje účinná látka z mycJia a na druhé straně se dosáhne vyčeření Živného prostředí.

Z rozpouštědel je možno užít například alkylalkoholy o 1 až 4 atomech uhlíku, jako methanol, ethonol, n-isopropanol nebo t-butanol, dále dimethylformamid, tetratyrdrofuran, zejména aceton. Mmožtví použitého rozpouštědla se může pohybovat v širokém rozmezí s výhodou se užije přibližně téhož objemu, jako živného prostředí. Po důkladném promíšení se nerozpustný podíl, například medium a · vysrážené bílkoviny oddělí filtrací, odstředěním, usazením apod. .

Směs vody a organického rozpouštědla se pak s výhodou odpaří ve vakuu například na objem původně užitého živného prostředí. .

Pak·se popřípadě použitím shora uvedených zásad, s výhodou hydroxidu sodného upraví pH na hodnotu vyšší než 7,0, například na hodnotu 9,0. Takto získaný roztok bude dále označován jako roztok 1.

Z roztoku 1 je možno izolovat antibioiikm podle vynálezu běžnou extrakcí, srážením a/nebo chromaaograficky a popřípadě je čistit. Cta?oniatogrrfie může být prováděna jako sloupcová chromat-ografie ne^bo ja^ko preparatl-vní te^ovrstvá c^lalmato^lrr^tie. ^Z a^bsor^bčních ^pro- * středků je možno.užít všech běžných anorganických i organických absorbčních prostředků, které nemaaí kyselou povahu, jako je například kysličník hlinitý, silikarel, křemičitan horečnatý, aktivní uhhí, celulóza, deriváty celulózy, ^mié pryskyřice, jako polyamidy, deriváty polyamidů apod., například acetylovaný polyamid nebo dextranové gely,

Ze směsí rozpouštědel při preparativní tenkovrstevné chromatoogrtfi je možno užít nejrůznějšího rozpouštědla, v nichž je altibioiik^m podle vynálezu rozpustné, zvláště výhodná je směs chloroformu a methanolu, například v objemovém poměru 5:1. Jako rozpouštědla při sloupcové je možno užít takové rozpouštědlo nebo směs rozpc^u^utt^c^ee,' v nichž je anti-bicikum podle ·vynálezu rozpustné, například tetrachloraethtn, aetthlenc^horie, s výhodou chloroform.

Výhodným postupem k izolaci antibiotika podle vynálezu je extrakce, popřípadě · v kombinaci s chroImtigraafí a srážením. Při provádění extrakce je nutno dbát toho, aby po jejím provedení se tntibioiikm nacházelo buj ve vodné nebo v organické fázi, takže je nutno volit extrakční činidlo tak, aby v něm bylo antibioikuím nerozpustné nebo velmi snadno rozpustné.

Extrakci je možno provádět například následujícím způsobem:

Roztok 1 se extrahuje s vodou nemísitelým organickým rozpouštědlem běžným způsobem, například prlOřepáválía, paltirgkulovým dělením apod. Rozpouštědlem může být například ester, jako ethylacetát nebo butylacetát, vyšší · alkoholy, jako tmlalkoholy, například n-aml-alkoholy, s vodou nemlíS-telné ketony, jako aetthУ.islbutylketll, chlorované nižší uhlovodíky, jako chloroform, aetthrlenchhorid a tttrachloraethalol. Výhodným rozpouštědlem je tthlltcetát a butylacetát, zvláště tOhlltcetáO.

V případě, že se při extrakci roztoku 1 užije ethylacetát a/nebo butylacetát, odloží se organická fáze, protože se tnOibioiiU^m podle vynálezu nachází ve vodné fázi.

i

Vodná fáze se pak sytí vhodnou anorganickou solí, jako chloridem sodným nebo draseným, síranem sodným a/nebo· hořečnatým k usnadnění následnicí extrakce. Mnoství soli není kritické, závvsí na množtví roztoku a rozpus^no^i soli a lze jej snadno stanovit. Roztok se pak extrahuje s vodou ^mís^íeným rozpouštědlem, v němž je altibioiikιm rozpustné, tak jak * je to shora popsáno pro extrakci roztoku 1. Vodná fáze se odloží a rozpouštědlo organické fáze · se odpaří na 1/10 až 1/30 původního objemu. Pak se tltibiotiklLm sráží rozpouštědlem, v němž je nesnadno rozpustné, například eiethyléterea nebo nasycenými uhlovodíky s přímým, rozvětve^m nebo cyklickým řetězcem, napříkadď petnl-eterem, n-hexanem nebo cyklohexanem běžným způsobem. Sraženina se čistí novým rozpouštěním ve vodě a surové tl0ibioiiUιm se získá odpařením · vody a popřípadě lllfiliztcí.

Surové antibiotikim je možno čistit až na vysokou čistotu dělením podle Greiga nebo popřípadě běžným chrommtografickým způsobem, jako je sloupcová chrommtograaie, ' preparativní teniovrstevná chrgmatogrrt'ie, přičemž jako absorbční činidlo se užívá shora uvedených anorganických a organických činidel, která nemmaí kyselou povahu, jako je například kysličník hlinitý, siliitrel, křemičitan horečnatý, aktivní uhh-í, celulóza, deriváty celulózy, umělé pryskyřice jako polyamidy nebo deriváty polyamidů, například acetylovamý polyamid, dextranové gely, iontoměniče apod.

V případě, žs se k extrakci roztoku 1 neužívá ethylacetát nebo butylacetát, ale jiné rozpouštědlo, například OetrachlormeOhtn_J odloží se vodná fáze, protože se antibioikum podle vynálezu nachází v organické fázi. I v tomto případě se organický roztok odpaří s výhodou na 1/10 až 1/30 původního objemu a pak se аnOibioliUιm vysráží přidáním vhodného organického rozpouštědla, v němž je anOibioiiklm podle vynálezu těžce rozpustné, například diethyletheru nebo nasycených uhlovodíků s přímým, rozvětverým nebo cyklickým řetězcem jako je petrolether, n-hexan nebo cyklohexan běžným způsobem. Sraženina se rozpustí ve vodě a roztok se lyofilizuje.

é

Získaný surový produkt se popřípadě čistí například extrakcí ethylacetáeem nebo butylacetátem, v nichž většinou nežádoucí balastní látky nejsou rozpustné, čištění je možno provádět také ehrommtograt'ieiy, jako sloupcovou chromatograaií, preparativní Oenkovrstevnou » chromatograα.íí při pouuití shora uvedených absorbčních činidel nebo paotiagkugvvým dělením.

Čištění je možno provádět také tak, že se surový produkt v roztoku v organickém rozpouštědle jako etrachlormetanu, chloroformu nebo meeylenchloridu sráží pomoci organických rozpouštědel, v nichž je antibioikuím těžce rozpustné, například přidáním diethyletheru, nasycených uhlovodíků s přímým, rozvětveiým nebo cyklickým řetězcem, jako je petaoleOhea, n-hexan nebo cyklohexan. ,

Nové kmeny Actinoplanes s laboratorním označením SE 73 ' a SE 73/B byly uloženy ve veřejných sbírkách s následujícím označením.

a) SE 73
ATCC -	č. 3>058	(2. 8. 74)
CBS -	č. 432.74	(12. 8. 74)
FRJ -	č. 2669	(9. 8. 74)

b) SE 73/B

ATCC	- Č.	31060	(2.	8.	74)
CBS	- Č.	434.74	(12.	. 8	. 74)
FRJ	- č. 2671	(9.	8.	74)

ATCC = A^mrřcan Type Cuuture Coolestion, 12301 Parklawn Drive, Rookkvlle, Maayland

20852, USA.

CBS = Cennrtlbkaeak voor Schiшlmlcektkres,· Maarn, Niederlande.

FRJ = Fermeenation Research Institute, Tokyo, 'Japan. _x \

AAnibiotkum podle vynálezu je možno zpracovat na farmaceutické přípravky, které obsahují kromě účinné látky podle vynálezu ještě netoxické farmaceutické nosiče nebo obsaHnuí jen účinnou látku. ’

Farmmacutické přípravky s obsahem účinné látky podle vynálezu mohou být zpracovány do nejrůznějších lékových forem, jako jsou například tablety, dražé, kapsle, pilulky, čípky a am^v^kr, v nichž popřípadě je možno obsah účinné látky snížit i na zlomek jednotlivé dávky nebo zvýýit na několikanásobek jednotlivé dávky. Znamená to, že jedna jednotka může obsahovat například 1, 2, 3 nebo 4 jednotlivé dávky nebo 1/2, l/^nebo 1/4 jednotlivé dávky. S výhodou však obsahuje léková forma takové moožtvi účinné látky, která je nutná pro' ' jedno po203115 dání, popřípadě n- je například tableta dělena tak, aby její zlomek obsahoval polovinu, třetinu nebo čtvrtinu denní dávky.

Z netoxických, z farmaceutického hlediska vhodných nosičů, padají v úvahu pevné, polo tuhé nebo kapalné ředicí prostředky, plnidla a látky, usnadňující výrobu prostředku.

Výhodným farmaceutickým přípravkem je tableta, dražé, kapsle, pilulka, granulát, čípek, roztok, suspenze a emulze, pasta, mast, želé, krém lotion, pudr a spray.

Tablety, dražé, kapsle, pilulky a granuláty mohou kromě účinné látky a běžného nosiče obsahovat ještě a) plnidlo, například škrob, mléčný cukr, třtinový cukr, glukózu, mannit a kyselinu křemičitou, b) pojivá, jako karboxymethylcelulózu, algináty, želatinu nebo polyvinylpyrrolidon, c) činidla, udržující obsah vody, například glycerin, d) bobtnavé látky, například agar-agar, uhličitan vápenatý a uhličitan sodný, e) látky, znesnadňující rozpouštění jako parafin a f) látky, usnadňující vstřebávání například kvartérní amoniové sloučeniny, g) zesítňující látky, jako cetylalkohol nebo glycerinnonostearát, h) absorpční činidla jako kaolin a bentonit a i) kluzné látky, například mastek, stearan vápenatý a ho- é řečnátý a pevné pólyethylenglykoly nebo směsi látek, uvedených za a) až za i).

Tablety, dražé, kapsle, pilulky a granuláty mohou být opatřeny potahy a obaly a mohou mít takové složení, že se účinná látka uvolňuje pouze nebo převážně v určité části zaživa- · cí soustavy, popřípadě zpomaleně, přičemž se užívá zvláštních prostředků, zpomalujících toto uvolňování, jako jsou polymerní látky a vosky.

Účinná látka může být zpracována za použití jednoho nebo většího počtu nosičů také na mikrokapsle.

Čípky mohou obsahovat mimo účinnou látku ještě běžné, ve vodě rozpustné nebo nerozpustné nosiče, například polyethylen, glykoly, tuky, jako kakaové máslo a vyšší estery, například estery alkoholů se 14 atorný uhlíku s alifatickou kyselinou se 16 atomy uhlíku nebo směsi těchto látek.

Masti, pasty, krémy a želé mohou kromě účinné látky obsahovat ještě běžné nosiče, například živočišné a rostlinné tuky, vosky parafiny, škroby, tragant, deriváty celulózy, pólyethylenglykoly, silikony, bentonit, kyselinu křemičitou, mastek a kysličník zinečnatý nebo směsi těchto látek.

Pudry a spraye mohou také obsahovat kromě účinné látky běžné nosiče, například mléčný cukr, mastek, kyselinu křemičitou, hydroxid hlinitý, křemičitan vápenatý, práškovaný polyamid nebo směsi těchto látek. Spraye mohou být připraveny při použití běžného hnacího prostředku, jako chlorovaných a fluorovaných uhlovodíků.

Roztoky a emulze mohou rovněž obsahovat kromě účinné látky běžné nosiče jako rozpouštědla, látky usnadňující rozpouštění a emulgátory, například vodu, ethylalkohol, isopropylalkohol, ethylkarbonát, ethylacetát, benzylalkohol, benzylbenzoát, propylenglykol, 1,3-butylenglykol dimethylformamid, oleje, zejména olej z bavlníkových semen, podzemnicový olej, olej z kukuřičných klíčků, olivový olej, ricinový olej,a sezamový olej, glycerin, glycerinfor- « mal, tetrahydrofurfurylalkohol, polyethylenglykoly a estery alifatických kyselin se sorbitaném nebo směsi svrchu uvedených látek.

К parenterálnímu podání je možno vyrobit tytéž roztoky a emulze také ve sterilní a * s krví izotonické formě.

Suspenze mohou obsahovat kromě účinné látky běžné nosiče, například kapalná ředidla jako jsou voda, ethylakohol, propylenglykol, činidla, usnadňující vznik suspenze jako ethoxylovaný isostearylalkohol, estery polyoxyethylensorbitu a sorbitanu, mikrokrystalická ce9 203115 lulóza, metatydroxid WLinitý, bentoěnt, agar. a tragant nebo směsi těchto látek. Shora uvedené lékové formy mohou obsahovat také barviva, konzervační látky a sloučeniny, zlepšující chul a vůnn, například mátový olej a eukalyptový olej nebo sladidla, například- sacharin.

Terapeuticky účinná složka má být ve shora uvedených farmaceutických přípravcích přítomna s výhodou v končen iraci 0,1 ež 99,5, . s výhodou 0,5 až 95 váhových celkové sm^ě^iL.

Shora uvedené farmaceutické přípravky mohou obsahovat mimo účinné látky podle vynálezu ještě další účinné složky.

Shora uvedené farmaceutické. přípravky se vyrábí známým . způsobem, například smísením účinných látek s jedním nebo několika nosiči. ,

Přípravky podle vynálezu se užívají v lidském i veterinárním lékařství k prevenci, zlepšení a/nebo vyléčení onemocněn, způsobených svrchu uvedenými mikroorganismy.

Přípravky podle vynálezu je možno podávat místně, perorálně, perenterálně, intraperitoneálně a/nebo rektálně, s výhodou perorálně nebo parenterálně a to zejména nitrcsvalcvě, popřípadě ve formě dlouhodobé kapací infuse.

Bylo zjištěno, ^že v lidkkém i. veterinárním l^eřství je výtodné podávat ^účinmou látlu podle vynálezu při perorálěím nebo parenterálním podání v celkovém minožtví 10 až 1 000, s výhodou 50 až 600 m;/kg váhy za 24 hodin, popřípadě rozděleně ' v několika jednotlivých dávkách k dosažení žádoucího účinku. Jednotlivá dávka v tomto případě obsahuje účinnou látku podle vynálezu s výhodou v mLnožtví 50 až 300, zejména 100 až 200 m;/kg váhy. Může být nutné se od shora uvedeného dávkování odclhlit a to v závislosti na druhu živočicha, na jeho tělesné váze, na typu a závažěooti onnmocniní, na druhu přípravku a na cestě podání a popřípadě také na době nebo intervalu, v němž dochází k po<^i^j^:í jedno tlivých dávek. Z tohoto důvodu může v některých případech být dostatečná nižší než shora uvedená dávka účinné látky, kdežto v jiných případech je nutno shora uvedenou dávku účinné látky překrodt. Stanovení optimální dávky a cesty podání stanoví v jednotlivých případech·snadno příslušný odborník.

Aniibictikum>pcdln vynálezu má při nízké toxicitě silnou anti-mikrobiální účinnost. Tyto vlastnosti umcožují jeho použžtí k chemoCherapeuticlým účelům v lékařství i ke konzervačním účelům pro argynické materiály různého původu, například polymery, mmaadla, barvy, vlákna, kůže, papír a dřevo, potraviny a vodu.

AniibictSkιm podle vynálezu je účinné proti širokému spektru mikroorganismů. S jeho pomocí je možno potlačit růst gram-negaUvních nebo gram-ppostiiních bakkeerí, jakož i mikroorganismů, . které jsou bakteriím podobné a rovněž zabránnt vzniku onemocněn, které jsou těmito mikroorganismy způsobena a tato onemocnění zlepšit a/nebo vyléčit.

Zvláště účinná je účinná látka podle vynálezu proti bateriím a miSгccrganimπlům, které jaou bakteriím podobné. Je proto zvláště účelné využívat k profyladi a ·cherniterapii lokálních a slsteminkýnh infekcí v lidkkém i veterinárním lékařství, přičemž jde o infekce vy* vdané shora uvedenými původci.

Je například možno léčit místní a/nebo ystemická onemocněn, která jsou způsobena následujícími původci jednotlivě nebo ve větším mLnožtví.

Micrococacese, SttρhylcScSy, například Slap^to^cc^ sureus, Staph. epidermidia, Staph. am^nes a Gaffyka tetragena.

Lactobaaceriaceace, jako streptokoky, například Step^^cus pyogeěes, alfa- nebo beta-hemdytické streptokoky, inhemoCylZjící game^-streptokoky, Str. i iridia, Str. faecalis (Enterokoky), Str. alalactiae, Str. lactis, Str. equi, Str. anaerobis a Diplococcus pneumoniae Cpneumokoky),

Neesseriaceae, jako neisserie, například Neesseria gonorrhoeae (gonokoty), N. mennngitidie (meningokoky)., N-ccaarrhalis a N. ilava,

Cooynneaaceriaceae, jako corynebaaterie, například Corynebacteritm diphthaer iae, C. pyogenes, C. diphtheroides, C. acnes, C. parvum, C. bovia, C. renale, C,. ovis, C. muuisepticum, Listeria, například · Listeria monnoynogenes, Erysipelothrix, například Erysioelo thrix insidiosa, Kuuthia, například Kuuthla zopPii, ‘

MyncoacCeeřaeae, jako původci mC:kOakteeióz, například mncobacterim tuberciuLosis,' lí . bovis, У. avium, tak zvaná atypická mykobateela skupin Runyon I, II, 111 a IV, M. leprae,.

Enterybaacreriaceae, například bakterie skupiny Escheeichia cooi, například E. Cooi,

Enterohaater, například E. aerogenes, E. cloacea, Klebsieila, například K. pneumooiae,

K. Ozaenae, Erwinňse, například Erwinia spec., Serratia, například Seratia marceacena, Próteus, například Próteus vulgaris, Pr. m^ganU, Pr. rettgerri, Pr. miiaaiiis, Providencia, například Provedeno: a sp. ,

Salmoneleae, Salmooneia, například Salmoonlla pyratyphi A a B, S. typhi, S. enneritidis, S. cholera suis. S. typhimurii.m, Shhgeeia, například Shigela dysenneriae, Sh. amblgua, Sh. · ilexneri, Sh. aoydii, Sh. sonei,

Spprillaceae, Vibrio, například Vibrio cholerae, V. proteus, V. ietus, Spirillm, například SpiriHum minus,

Baaillaceae, například aerobní tyčinky, tvoříčí spory, například Baadlus anthracis, B. subttlis, B. cerreus, anaerobní tyčinky, tvořící spory, jako Cloosridie, například Clostrdduím periringens, Cl. septieim, Cl. oedemmaiens, Cl. histo^icum, Cl. tetani, Cl. botuli mm,

УynkyPэsmmaa, například Mycoplasma pirumoyiae, M. horninna, M. suis pirumoyiae_J M. galliapicuím, M. úcoř'henis.

Svrchu uvedený počet možiných původců byl · uveden pouze jako příklad a nemá nikterak sloužit k ommzení . vynálezu.

Z onemocnění^ . ...jimXi je moho předjít nebo která je možno zlepšit a/nebo vyléčit · je možno uvést následnicí onemocnění:

onemocnění dýchacích cest a nosní dutiny, zánět středního ucha, zánět nosohltanu, zápal plic, zánět pybaiSnicr, zánět pánviček ledvinných, zánět močového m^^ře, zánět nitroblány srdeční, · systémové infekce, zánět průdušek, zánět kloubů, místní záněty a kožní infekce.

«

Aniibiytik^m podle vynálezu je možno užít také u zvířat jako prostředek k podpoře růstu a ke zlepšení vyuuití potravin u zdravých i nemocích zvvřat.

Úči-irnost antiHoUka ^podle vynálezu je do · znač^ mír^y nezávislá na touhu a ^řú-aví * zvířete. Zvláště cenné je aitibiotilm podle vynálezu při · šlechtění a chovu dadých zvvřat a zvířat na žír. Ze zvvřat, u nichž je možno pouuit účinnou látku podle vynálezu ke zrndúLrní a zlepšení růstu a ke zvýšenému vyuuití krmivá je možno užít například následující užitková a chovná zvvřata.

1

Teplokrevná zvířata jako je skot, vepř, kůň, ovce, koza, kočka, pes, králík, kožešinová zvířata, například norek a činčila, drůbež jako slepice, husy, kachny, krocani, .holubi, papoušci a kanáři i studenokrevná zvířata, jako ryby, například kapři a plazi, například hadi.

Mnoožtví antibiotika podle vynálezu, které je možno aplikovat zvířatm při dosažení žádaného účinku se polhybuje v širokém rozmezí. Výhodné rozmezí je 5 až 600, zejména 10 až 300 mg/kg váhy a den. Dobja podávání se může pochybovat od několika hodin nebo dnů až do .několika let. Vhodná dávka a vhodná doba podávání účinné . látky závisí zejména na druhu zvířete, jeho stáří, pohlaví, zdravotním stavu a účelu, pro který se zvíře chová a stanoví ji snadno odborník.

Účinná látka podle vynálezu se podává zvířatům běžným způsobem. Cesta podání závisí zejména na druhu zvířete, jeho chování a zdravotním stavu. Účinnou látku je možno podávat jednou nebo vícekrát denně v pravidelných nebo nepravidelných intervalech perorálně nebo parenterálně. Pro účelnost se účinná látka většinou podává perorálně, a to zejména s potravou a/nebo pitnou vodou.

účinná látka podle vynálezu se podává v čisté formě nebo ve formě přípravku, například ve sm£^:i s netoxickými inertními nosiči různého původu, například s týmiž nosiči a v téže formě, jaká byla popsána pro farmaceutické přípravky.

Účinná látka podle vynálezu se podává také spolu s dalšími farmaceutickými účinnými látkami, anorganickými solemi, stopovými prvky, vitamíny, bílkovinami, tuky, barvivý a/nebo chuto.vými látkami.

Nejednodušší je peroná^í podaní spolu s krmivém a/nebo pitnou vodou, přičemž podle koncentrace se přidává účinná látka jen k části krmivá a/nebo vody nebo k celkovému množství .

Účinná látka podle vynálezu se mísí v čisté formě, s výhodou v jemně rozptýlené formě s poživatelrými netoxickými nosiči, popřípadě je možno . ji s těmito látkemi také ve formě předběžné smmsi nebokonocerráty a pak ji včlenit do krmivá a/nebo pitné vody.

Krmivo a/nebo pitná voda mohou obsahovat účinnou látku podle vynálezu například v koncentraci 5 až 500 s výhodou 10 až 100 ppm. Optimmi.ní koncentrace účinné látky v krmivu a/ nebo pitné vodě je zvláště závislé na mnnžžsví, které v průběhu dne zvíře přijímá a je možno je snadno ji stanovit.

Povaha krmivá a jeho celkové složení nemá žádný Vliv na účinnou látku podle vynálezu. K uvedenému účelu je možno u^jít všech běžných nebo zvláštních druhů krmiv, které s výhodou obsahují jednotlivé živiny v požadované rovnováze tak, aby dodávala energii i stavební látky, včetně vitamínů a anorganických látek. Chodné krmivo sestává například z látek rostlinného původu jako je seno, řepa, obilí, obilné produkty, živočišného původu, jako je maso, tuk, kostní moučka, rybí produkty, z vitamínů, například vitamínu A, B-komplexu a D-komplexu, bílkovin, aminoOkSsZio, jako je DL-mmehionin a anorganických látek, jako je uhličitan vápenatý a chlorid sodný.

Konoce0ráty obsahují účinnou látku podle vynálezu spolu s dalšími látkami jako jsou žitná mouka, kukuřičná mouka, mouka ze sojových bobů nebo uHičitan vápenatý, popřípadě s dalšími živnými a stavebními látkami jako jsou bílkoviny, anorganické soli a vitamíny. Tato krmivá je možno vyrobit běžným způsobem.

Předběžné směsi a koncentráty mohou obsahovat účinnou látku podle vynálezu také ve .formě, v níž je účinná látka na povrchu chráněna například netoxickými vosky nebo želatinou před vlivem vzduchu, světla a/nebo vHkooti.

Jako příklad složení krmné směsi pro kuřata je možno uvést krmivo s obsahem účinné látky následujícího složení:

200	g	pšenice
340	g	kukuřice
361	g	sojového šrotu
60	g	hovězího loje
15	g	středního fosforečnanu vápenatého
10	g	uhličitanu vápenatého
4	g	jodované kuchyňské soli
7,	5 g	směsi vitamínu a anorgan. solí
2,	5 g	účinné látky
1	kg	krmivá
Směs vitamínu z	i minerálních látek sestává z následujících složek:
6 000 mezinárodních jednotek	vitamínu A, 1 000 mezinárodních jednotek vitamínu Dp
10 mg vitamínu E, I	mg vitamínu K.	, 3 mg Riboflavihu, 2 mg pyridoxinu, 20 mcg vitamínu B12,
5 mg pantotenátu vápenatého, 30 mg	kyseliny nikotinové, 200 mg cholinchloridu, 200 mg
MnSo^ x HgO, 140 mg	ZnSO4 x ZH2O,	.100 mg FeSO^ χ ΪΗ^Ο a 20 mg CuSO^ x бН^О.
Předběžná směs	s obsahem účinné látky obsahuje tuto látku v žádaném množství například
20 mg a mimoto obsahuje 1 g DL-methioninu a tolik sojové mouky, aby vzniklo 2,5 g předběžné
směsi.
Příkladem vhodného krmivá pro	vepře s obsahem účinné látky podle vynálezu může být
krmivo následujícího	i složení.
630	g	krmného obilného šrotu z 200 g kukuřice,
		150 g ječného Šroutu, 150 g ovesného a
		130 g pšeničného šrotu,
80	g	rybí moučky,
60	g	sojového šrotu,
60	g	tapiokové mouky,
33	g	pivovarských kvasnic,
50	8	směsi vitamínů a anorganických látek,
30	8	moučky z lněných pokrutin,
30	8	kukuřičné mouky,
10	8	sojového oleje,
10	8	melasy a
2	8	předběžné směsi s obsahem účinné látky
		shora uvedeného složení
1	kg	krmivá

Shora uvedené krmné směsi jsou zvláště vhodné к chovu kuřat a vepřů, přesto je možno je užít i к chovu jiných zvířat.

Dobrá antimikrobiální účinnost antibiotika podle vynálezu byla prokázána následujícími pokusy:

a) Pokusy in vitro

II

Antibiotikum podle vynálezu bylo ředěno při použití Muller-Hintonová živného prostředí s přídavkem 1% glukózy na obsah 200 jag účinné látky v 1 ml. V užitém živném prostředí

5 se nacházelo 1x10 až 2 x 10 bakterií v 1 m. Zkumavky s uvedeným obsahem byly inkubovány 18 hodin a·byl stanoven stupen zakalení jejich obsahu. V případě, že nedoělo k zakalení, bylo antibiotikum plně účinné. Př dávce 200 ^g/mL nebylo možno pozorovat zákal v žádné z následujících bakteriálních kultur:

Eschheichia coli 14,

Escheeichia cooi C 165,

Próteus vulgaris 1017,

Klebbíalla K 10, >

Kebbiella 63, ..

Salmoneeia sp·,

Shigella sp.,

Entembacter sp.,

Serratia sp.,

Próteus indolnegativ, sp.,

Próteus iedolponitiv, sp., > , Pasteuiella pseudooukbecukoois,

Staphylococcus sureus 133,

Neesseris sp., ‘

Diplococcus pneumoiiiae sp., * Streptococcus pyogenes W,

Enterococcus sp.,

Lactobacdlus sp.,

Conynebacceeriumdiphtheriae gravis,

Cyronebactecium pyogenes M,

Clostridim botuinntm,

Clostridiím tetoni,

Pseudomonas neruginoae sp.,

Aeromonas hydropnéHa sp., Myopiasma sp.

b) Pokusy in vivo

Z následnicí tabulky 1 je zřejmá účinnost antibiotika proti · řadě bakterií u bílých. mrší jmene CFp které byly infikovány ietrαnerinoeeáLLeě.

T a b u 1 k a 1'

Pokus na bílých m^ch

Stanovení ED^₀ po 24 hodinách

Mikroorganismus Dávka antibiotika v · m^g

Escherichia coli 165 1 x 400

Stаphylnconcui aureus 1 x 200 ‘ f Terapie: antibioitkm je podáno 30 minut po infekci podkožně.

EDfjO je dávka, po jejímž podání přežívá po 24 hodinách ještě 50 % infikovaných zvířat.

> Dobrou účinnost antibiotika podle vynálezu jako prostředku k podpoře růstu je možno prokázat následujícím pokusem:

Při krmných pokusech se αntibioitkm smísí s krmivém a podává se·kuřatům v dávce 10 až ppm. Výsledky se srovnávej s negativní kontrolou (krmivo bez antibiotika) pokus trvá.

dní.

Pokus	Počet zvířat	Průměrná váha v g	Váha v %
negativní : kontrola	24	358,2	100
antibiotikm 10 ppm	24	372,5	104,0
podle vynálezu 25 ppm	24	383,7	107,1

VyssOěltní obr. 1 až 4

Obr. δ.

Osa úseček vlnová dálka v nm δ v ppm vlnočet v cm δ v ppm

Osa pořadnic % absorbce % absorpce

1. Obr. 1: Absorbční spektrum v _: ultrafiEÚovém·světle

Spektrum antibiotika v uLtrafialovém světle je znázorněno na obr. 1. ^Smax = ²65 nm ⁽c = 0^09¹ % v metheaio^ou), [e^{1 1} 265 nm => ^4.

cm

2. Obr. 2 ^{1 3}C-jadernV resonanční spektrum je měřeno v roztoku antibiotika v deut^ei^c^i^ín^V^m metanolu při pooUití te tramě tlhy-silanu jako vnitřního standardu v tomtéž roztoku na přístroji XL-100-spektrometr (15) fimiy Varian AssooCates, : Paolo Alto, Kalifornie při 25,2 MHz.

3. Obr. 3: Absorpční spektrum v infratevtoném světle
Absorpční spektrum antibiotika podle vynálezu v	inlilaδeotoném	světle je provedeno v pe-
letách s KBr. Absorpční pásy v	cm“ se οιο№Ζ6^ při následnících	fr esencích:
Frekvence cm-'	Intenzita	Provence cm-'	Intenzita
3 440	s	1	290	w
2 960	m	1	200	m
· 2 920	m	1	060	s
3 440	s	1	290	w
2 960	m	1 :	200	m
2 920	m	1	060	s
2 850	m	1 :	020	s
1 630	m		985	m
1 570	s		940	m
1 445	m		905	m
1 405	m		780	m ,	4
1 375	m		750	m
1 310	w

Intenzita pásu v inflatevtoném světle je označena i, a aj. Pás označený £ má alespoň

2/3 intenzity oejsilnějšího pásu ve spektru, pás, označený 3 má intenzitu v rozmezí 1/3 ai

2/3 nejsilnějěího pásu, pás, označený : má méně než 1/3 intenzity : oejsilnějšího pásu. Toto stanovení bylo provedeno na základě propustnoosi v %.

4. Obr. 4

H-jaderné resonanční spektrum bylo provedeno při 220 MHz v roztoku antibiotika v deuteranovém methanolu při použití tetramethylsilanu jako vnitřního standardu na přístrojích HR-SC-spktrometr firmy Varian Associates, Paolo AIto, Kalifornie.

Výroba antibiotika podle vynálezu bude osvětlena v následujících příkladech. Údaje v % se vztahují, není-li uvedeno jinak, na váhová %.

Příklad 1

Vytvořené mycelium kmene Actinoplanes SE 73/B, vypěstované na šikmém agaru následujícího složení (váhová %):

pepton	0,25.%
kyselý hydrolyzát kaseinu	0,25	%
K2HPO4 x .	3H2O, p. a.	0,1	%
KC1, p. a		0,05	%
MgSO4, p.	a.	0,05	%
FeSO4, p.	a.	0,01	%
třitonový	cukr	3,0	%
agar		2,0	%
voda	do	100	%

se přeoČkuje do 140 ml sterilního, živného prostředí, které se nachází v Erlenmeyerových baňkách o obsahu 1 litr a má následující složení: (roztok A) sojová mouka zbavená tuku

3,0 %

čistý glycerin	3,0 %
CaCOp p. a.		0,2 %
voda	do	100 %

Ke snížení tvorby pěny se přidává neutrální polyol s obsahem hydroxylových skupin, například přípravek Niax Polyol LHT 67 (Union Carbide Belg. N. V.) v množství 1 kapka na 140 ml živného prostředí. Po 8denní kultivaci uvedeného kmene na rotační třepačce při teplotě 28 °C se vzorky kultury odstředí, čirý supernatant se zkouší na agarových plotnách s otvory proti Escherichia coli ATCC 9637* Antibiotikum podle vynálezu způsobí zóny s omezeným růstem o průměru 17 mm. Antibiotika se ze živného prostředí získá způsobem, který bude dále popsán v příkladu 3.

Příklad 2

Vždy 8 litrů živného roztoku následujícího složení (váhová %)

dextrin		0,4 %
glycerin		0,2 %
extrakt z kvasnic		0,2 %
CaCO^		0,2 %
voda z vodovodu	do	100 %

3,0 ml neutrálního polyolu s obsahem hydroxylových skupin, například přípravku Niax polyol LHT 67 firmy Union Carbid Belg. N. V. má 8 litrů živného roztoku se vlije do skleněného fermentoru, opatřeného míchadlem a provzdušňovacím zařízením, pH se upraví na 6,8 hydroxidem sodným a prostředí se sterilizuje při 120 °C. Po zchlazení roztoku se fermentory očkují vždy 240 ml (3 % objemu) třepací kulturou, pěstované 3 dny v živném

203115 16 roztoku A (kmen Actlonoplenes SE 73). Kultura se provzdušnuje 4 litry vzduchu za minutu při 60 otéčkác^h múchadla za mnutu a udržuje se na ^plotS ²⁸ °C. ¹⁷ a ²⁴ todin po začáttu ^ku-^- ti vece se do každého fermentoru přidá 0,4 % dextrinu, 0,2 % glycerinu a 0,3 % extraktu z kvasnic .a po 30, 41, 48 a 54 hodinách se přidá vždy 0,4 % dextrinu, 0,2 % glycerinu a

0,4 % extraktu z kvasnic ve formě koncentrované smési těchto složek živného prostředí v objemu 200 ml při jednom přidáván. Stoupnutí objemu po přidání se vyrovná odpařováním vody. Celkové ranžssví složek živného prostředí je tedy pro dextrin 2,8 %, pro glycerin 1,4 %, pro extrakt z kvasnic 2,4 % a pro Cs 0,2 %. Kultivace se přeruší po 120 hodinách.

Příklad 3

Živné prostředí z ' pěti skleněných fermentorů (5x8 litrů), získané způsobem podle přikladu 2 se slije^, přidá se 48 , litrů acetonu a směs se hodinu míc^há při teploté 25 °C a pak se odstředí. Čirý, extrahovaného m^ceia zbavený supernatant se odpaří při teplotě 20 a^{ž 35} °C ve va^kuu na objem ³⁵ Htrů, ^pH se upraví na 9 hydroxidem sodným a směs se extrahuje 18 litry ethylacetátu. Organická fáze se odloží, vodná fáze se sytí chlorddem sodným, pH se upraví na 8,5 hydroxidem sodným a pak se dvakrát extrahuje 9 litry ethylacetátu. Vodná fáze se . odloží a · organický roztok se odppaí ve vakuu na objem 1 litr. Z tohoto roztoku se surové antibiotium sráží 3 litry n-hexanu. Sraženina se odddlí odsátím, promne se malýfa .imoožtvím etheru a za stálého míchání se sTsí s vodou, přiěemž se pH udržuje na hodnotě 7,3 přidáváním 10% roztoku uh.iěitanu sodného. Z tohoto roztoku se lyofilizací získá 10,5 g surového antibiotika podle vynálezu, které obsahuje ještě malé rninossví uiličiaanu sodného.

PPíklad 4

Čištění шιtibiuttit podle vynálezu prepaDti^í tenkovrstevrnou chromatoggaaií

Při analytické tenkovrstevné clh?omatografii surového antibiuttit, získaného způsobem podle příkladu · 3 zůstávaj barviva na počátku, ^^iti^bi^^tkkim podle vynálezu se nachází v horní zóně. Jako směsi rozp^^del se užije směs chloroformu a methanolu v poměru 5:1 (objemový poměr), chromaato^afie se provádí na tilitageOovýcl deskách F 254 firmy Merck, Darmstadt NSR.

1,00 g surového antibiotika se podrobí preparativní tenkovrstevné chromrtografii na 20 . tilia½elovýcl deskách Měrek F 254 o · tloušíce 2 mm při pouužtí sm^ě^^ chloroformu a metanolu v objemovém poměru 5:1. Izoluje se horní zóna, zjištěná ozářením kltгaftaUvvýr světlem. Výtěžek antibiotika je 344 mg· Annibiotická účinnost antibiotika při pokusu na plotnách proti ΕθοΙι^ΙοΙΙι cooi ATCC 9637 je 152 %, vztaženo na surový výchozí materá!.

PPíklad 5 čištění antibiotika podle vynálezu sloupcovou clh)omrtourafií· .

g surového antibiotika, získaného podle příkladu 3 se rozpustí v 600 ml dvakrát destilované vody a fiDruje se acetylovaým polykaprolaktrmem, například přípravkem MN-polyamid SC - 6 Ac (frma Macherey, -agel a Co., Duřen, -SR) ve sloupci o délce 70 cm a průměru 5 cm. ShrumrtSákjcí se frakce, ^θΟ^^Ιοί při 267 nm. HLavní frakce se extrahuje dUoauformcm^, diloroformový roztok se odpptfí a oharek se suší při ^{0,01 t}uaa^{k 4} dny ¹ při ⁶⁰ · °C. Výtěžek antibiotika je 5,2 g. AnttLbiotická účinnost při pokusu na plotnách oppooi Eschueichia cCi ATCC 9637 je 148 % vztaženo na výchozí materá!.

PPíklad 6

Čištění frakcU<tmovarýr - - srážením

1,00 g surového antibiotika, získaného podle příkladu 3 se rozpusSí ve 100 mL acetonu. Odstředivý roztok se po částech smísí s cyklohexanem a vytvořený sediment se odddlí odstředěním.

Mnc>oství cyklohexanu v mi	Sraženina v mg	% účinnosti st)
+ 10	43	69
+ 28	125	119
+ 17	182	135
+ 25	157	109
+ 60	120	115

st) Na plotnách pro 1ti Escheeichia coli ATCC 9637·

Tato fraicionačtí metoda přináší velmi dobré výsledky zejména při zlepšení změnami rozpouutědel.

Čidtlné antibiotkUm má následnicí analytické hodnoty: 50,8 % C, 7,2 % H, 42,0 % 0, AAtayttcké hodnoty jsou zatíženy chybou + 1 %.

Difúzní test na plotnách se provádí následujícím způsobem: (P. Klein, Baaieriotogiscee Griundlagen der ChemoOhenraenUischen Lаboo^,аtortumsppаais, Springer-Verlag, G^ďti^n^gen (1957) str. 86 a da^š).

V agarové plotně, infikované Eschenichia coli ATCC 9637 se vytvoří otvory, do nichž se nanese vodný roztok zkoumané látky. Po inkubaci 16 hodin při 37 °C jsou zóny tteibice mírou účinnooti proti uiiéému mkroorganismu. Z velikosti těchto zon je možno souddt na obsah antibiotika podle vynálezu.

Claims (1)

1. PŘEDMĚT VYNÁLEZU

   Způsob výroby antibiotika s účinnootí proti gram-pooitivním a gram-negativním bakteriím, vyznnauuící se tím, ie se pěstuje kmen Actinoplanes SE 73 (ATCC '31058) a/nebo SE 73/B (ATCC 31060) za aerobních podmínek v kapalném živném prostředí obj^j^ř^u^uj-c^í vyuuitelný zdroj nebo zdroje uhlíku, dusíku a anorganických solí při teplotě 20 iž 40 °C a pM 6 ai 8, naUež se antibioiíum ze živného prostředí a/nebo mc^ia izoluje a popřípadě čistí.