DE2551152A1

DE2551152A1 - Hochphosphorylierte nukleotide, verfahren zu ihrer herstellung sowie ihre verwendung als chemotherapeutika

Info

Publication number: DE2551152A1
Application number: DE19752551152
Authority: DE
Inventors: Dietmar Dr Med Gericke; Hans-Juergen Prof Dr In Rhaese
Original assignee: Hoechst AG
Current assignee: Hoechst AG
Priority date: 1975-11-14
Filing date: 1975-11-14
Publication date: 1977-05-26
Also published as: FR2331350A1; BE848382A; JPS5278897A; NL7612615A

Description

HOECHST AKTIENGESELLSCHAFT

Aktenzeichen: HOE 75/F 285

Datum: I3. November 1975 Dr.HA/Rp

Hochphosphorylierte Nukleotide, Verfahren zu ihrer Herstellung sowie ihre Verwendung als Chemotherapeutika.

Nukleinsäuren, die in Form von Desoxyribonukleinsäuren die
materielle Grundlage der genetischen Information aller Organismen und Viren darstellen und in Form von Ribonukleinsäuren als Messenger-, Transfer- und ribosomale RNA (=Ribonucleinsäure) zv finden sind, sind seit langem bekannt. Ebenso kennt man die
Substrate für die Synthese dieser Substanzen, die Desoxy- bzw. Ribonukleosidtriphosphate und deren Derivate. Außer dem zyklischen AMP (=Adenosinmonophosphat), dem zyklischen GMP (--Guano-

709821/0821 ^/?'

-r-

sinmonophosphat) und dem Guanosin-tetra- und pentaphosphat waren jedoch bisher keine Nukleotide mit regulatorischen Punktionen in biologischen Systemen bekannt.

wir naDen

Nukleotide der· Formel I,

OH

^r- /J₀ ilJ

S⁵ I!² II¹

HO -P-B' -P-A-P-O-CH,

OH OH η

(	Y	-	OH
	OH		I
	I	-D-	P-
)	P-		Il
	Il		^Z6

HO-P-C-
Il
2
b

--D-P-rOH

■ü m

(D

in welcher X ein gegebenenfalls durch eine -NR' R' -gruppe, worin R'-j und RO Wasserstoff, eine Alkylgruppe mit 1-4 Kohlenstoffatomen, wobei -NRl RO auch Teil eines gegebenenfalls durch Sauerstoff substituierten heterocyclischen Ringes sein kann, oder eine Aralkylgruppe mit 7-9 C-Atomen ist, eine gegebenenfalls mit einem Alkanrest von 1-4 Kohlenstoffatomen verätherte Hydroxygruppe oder eine Mercaptogruppe substituiertes ein- oder mehrkerniges Ringsystem mit 5 bis 10 Kohlenstoffatomen, das bis zu 6 Stickstoffatome und daneben gegebenenfalls bis zu 3 Sauerstoffatome enthalten kann,

Y ein Wasserstoffatom, die Hydroxy-, Amino-Joder die -CH(CH^)OCpH_n,

Gruppe bedeutet und Z₁ bis Z,- jeweils beliebig ein Sauerstoff- oder Schwefelatom, A bis D jeweils beliebig ein Sauerstoffatom, die CHp- oder die NH-Gruppe und m und η die Zahlen 0 oder 1 bedeuten, wobei jedoch nicht gleichzeitig X = Guanin,

Y = OH, Z.bis Zf- und A bis C = Sauerstoff und m = 0 und η = 0 oder 1 sein können, speziell die Nukleotide Adenosin-5'~diphosphat-3^f -diphosphat, Adenosin-5' -triphosphat-3' -diphosphat sowie Adenosin-5'-triphosphat-3'-triphosphat,

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fermentativ und auch auf chemischen Wege hergestellt und gefunden, daß diese das Wachstum von Tumoren hemmen. Sie sind daher als Arzneimittel zur Krebsbehandlung geeignet.

Die vorliegende Erfindung bezieht sich daher auf Verbindungen der Formel I, ihre chemische und mikrobiologische Herstellung sowie ihre Verwendung zur Inhibition sowie Heilung von Tumorerkrankungen aller Art.

Unter den Verbindungen der Formel I sind bevorzugt solche, in denen die Reste A bis D beliebig jeweils ein Sauerstoffatom oder die CHp-Gruppe und die übrigen Reste wie. oben angegeben sind.

Besonders bevorzugt sind solche Verbindungen, in denen Z. - Zg ein Sauerstoffatom und A-D jeweils beliebig ein Sauerstoffatom oder die CH^-Gruppe bedeuten.

Von besonderem Interesse sind Verbindungen in denen X eine Purin- oder Pyrimidinbase, insbesondere eine natürliche Purin- oder Pyrimidinbase, Z. - Zg sowie A - D je ein Sauerstoffatom bedeuten.

Von ganz besonderem Interesse jedoch sind solche Verbindungen, in denen X einen Adeninrest, Z₁ - Zg sowie A - D je ein Sauerstoffatom und Y die Hydroxygruppe bedeuten.

Die Verbindungen der Formel I können folgendermaßen hergestellt werden:

Man kann ausgehen von Verbindungen der Formel II,

Λ 709821/0821

-jr-

Z₁

II¹

HO-P-O-CHp

0 Y

HO-P-OH

wobei X ein gegebenenfalls durch eine -NR1 R_?-gruppe, worin R^ und R₂ Wasserstoff, eine Alkylgruppe mit 1-4 Kohlenstoffatomen, wobei -NRlR'p auch Teil eines gegebenenfalls durch Sauerstoff substituierten heterocyclischen Ringes sein kann, oder eine Aralkylgruppe mit 7-9 C-Atomen ist, eine gegebenenfalls mit einem Alkanrest von 1 - 4 Kohlenstoffatomen verätherte Hydroxygruppe oder eine Mercaptogruppe substituiertes ein- oder mehrkerniges Ringsystem mit 5 bis 10 Kohlenstoffatomen, das bis zu 6 Stickstoffatome und daneben gegebenenfalls bis zu 3 Sauerstoffatome enthalten kann, und Y die Hydroxygruppe darstellt und Z₁ und Z_? beliebig je ein Sauerstoff- oder Schwefelatom bedeuten, in_üem man sie nach dem Verfahren von Simoncsits und Tomasz. Biochim. Biophys. Acta 340 (1974), 509 - 515 mit Vihyläthylather zu Verbindungen II mit Y = -CH(CH₅)OC₂H₅ umsetzt.

Diese können dann als Tri-n-octyl-ammoniumsalze in einem geeigneten Lösungsmittel, vorzugsweise wasserfreiem Dioxan, mit Tri-noctylamin und einem Phosphorylierungsmittel der Formel III

Z ■

(RO)₂P-HaI (III)

wobei Z ein Sauerstoff- oder Schwefelatom, Hai ein Halogenatom und R eine gegebenenfalls durch eine Alkylgruppe mit 1 - 4 C-Atomen, eine Alkoxygruppe mit 1-4 C-Atomen, ein Halogenatom, die Trifluormethyl- oder Nitrogruppe mono- oder mit diesen Resten

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in beliebiger Kombination disubstituierte Phenylgruppe ist, vorzugsweise Chlorphosphorsäure-diphenylester, bei Temperaturen zwischen 10⁰C und dem Siedepunkt des Lösungsmittel, vorzugsweise Raumtemperatur, innerhalb von 1 - 10 h, vorzugsweise 2 Stunden zu Verbindungen der Formel I umgesetzt werden, wobei X ein gegebenenfalls durch eine -NRlR' -gruppe, worin R' und R' Wasserstoff, eine Alkylgruppe mit 1-4 Kohlenstoffatomen, wobei -NRiR' auch Teil eines gegebenenfalls durch Sauerstoff substituierten heterocyclischen Ringes sein kann, oder eine Aralkylgruppe mit 7-9 C-Atomen ist, eine gegebenenfalls mit einem Alkanrest von 1-4 Kohlenstoffatomen verätherte Hydroxygruppe oder eine Mercaptogruppe substituiertes ein- oder mehrkerniges Ringsystem mit 5-10 Kohlenstoffatomen, das bis zu 6 Stickstoffatome und daneben gegebenenfalls bis zu > Sauerstoffatome enthalten kann, Z₁ - Zg jeweils beliebig ein Sauerstoff oder ein Schwefelatom, A und C ein Sauerstoffatom, Y die -CH(CH^)OCpH₁--Gruppe und η = m = 0 ist. Die Reste R können durch Behandeln mit Mono-tri-n-butylammoniumphosphat bei Raumtemperatur entfernt werden. Die Rohprodukte können nach Verdampfen des Lösungsmittels unmittelbar weiter verarbeitet werden.

Durch saure Hydrolyse wird aus diesen Verbindungen die -CH(CH,)-OCgH^-Gruppe abgespalten, wobei Y = OH wird. Nach Neutralisation und Wasserzugabe wird mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel extrahiert und durch Säulenchromatographie gereinigt.

Um Verbindungen der Formel I mit η = m = 1 und Y = OH zu erhalten, geht man von Verbindungen der Formel I mit η = m = 0 und Y = -CH(CH^)OCpH₁- aus, deren Rohprodukte in Wasser aufgenommen und mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel extrahiert, zur Trockene gebracht und wie oben beschrieben weiter phosphoryliert werden. Nach saurer Hydrolyse und Säulenchromatographie werden Verbindungen der Formel I mit η = m = 1 und Y = OH erhalten.

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Eine weitere Möglichkeit zur Herstellung von Verbindungen der Formel I besteht in der Umsetzung von Verbindungen der Formel II mit Y = -CH(CH^)OCpHt- mit einem Carbodiimide vorzugsweise Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) und einem Amin der Formel IV

ην (rv )

^R2

mit R₁, R_? = H, C₁ ^-Alkyl oder Aralkyl wobei R₁ und Rp zusammen einen Alkylenrest bilden können, der durch Sauerstoff substituiert sein kann, vorzugsweise Morpholin, in einem geeigneten Lösungsmittel, vorzugsweise t-Butanol, bei einer Temperatur zwischen Raumtemperatur und dem Siedepunkt des Lösungsmittels innerhalb von 2 bis 20 Stunden zu Verbindungen der Formel v, ■ "

^Z1

HO-P-O-CH

worin X, Y, Z₁ und Z-, wie zu Formel II definiert sind, umsetzt. Das Lösungsmittel wird entfernt, der Rückstand nach Zugabe von V/asser mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel extrahiert, zur Trockene gebracht, in einem geeigneten Lösungsmittel, z.B. Methanol gelöst und durch Fällung gereinigt. Nach mehrmaligem Abdampfen mit einem trockenen Lösungsmittel, vorzugsweise Pyridin, zur vollständigen Entfernung von Wasser, wird mit Pyridiniumsalzen von Phosphorsäure oder Phosphorsäureestern oder Verbindungen der Formel VI,

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- Γ-

ι ι

R¹O-P-A-P-OR¹ VI

OR' OR¹

mit Z'^ lind Ζ'₂ = Sauerstoff oder Schwefel, A = Sauerstoff, oder NH, R¹ = gegebenenfalls substituiertes Phenyl in einem

Lösungsmittel, vorzugsweise trockenem Pyridin, mehrere Stunden bei 10⁰C oder einer Temperatur bis zum Siedepunkt des Lösungsmittels, vorzugsweise Raumtemperatur, behandelt. Nach Entfernen des Lösungsmittels wird entweder sofort sauer hydrolysiert oder bei Verwendung von Phosphorsäureestern zuvor mit Mono-tri-nbutylammoniumphosphat behandelt und nach Neutralisation und Säulenchromatographie werden Verbindungen der Formel I erhalten, wobei η und m gleich 0 oder 1 sind.

Falls Verbindungen der Formel I mit η = 1, m = 0 oder η = 0, m = 1 hergestellt werden sollten, wird eine Verbindung der Formel VII mit einem Gemisch aus Phosphorsäure oder Phosphorsäureestern und Verbindungen VI umgesetzt und die erhaltenen Gemische durch Säulenchromatographie gereinigt.

Verbindungen der Formel I können jedoch auch auf mikrobiologischem Wege hergestellt werden. Als Mikroorganismen kommen in Frage Bazillen, z.B. B. subtilis oder B. cereus und andere differenzierende Organismen, wie z.B. Dictiostelium discoidium. Jedoch können auch tierische oder menschliche Zellen in Zellkulturen dazu verwendet werden.

Dazu können die Organismen in verschiedenen Nährmedien, die meist Glukose als Kohlenstoffquelle enthalten, gezüchtet werden. Die erwünschten Verbindungen der Formel I treten in der Regel gegen Ende des logarithmischen Wuchses oder anfangs der stationären Phase auf. Der Zeitpunkt der maximalen Bildung kann chromatographisch bestimmt werden. Wenn die maximale Menge entstanden ist, wird, vorzugsweise mit Ameisensäure, auf pH 3 - ²^ vorzugsweise 3,¹J, angesäuert, die Biomasse durch Zentrifugieren entfernt und die erfindungsgemäßen Verbindungen durch Säulen-

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Chromatographie abgetrennt und gereinigt. Die Reinigung kann vorgenommen werden wie in Rhaese, Grade und Dichtelmüller, Europ. J. Biochem. jj6, 385 - 392 (1975) beschrieben.

Weiterhin können die erfindungsgemäßen Verbindungen mit Hilfe von Membranen oder Membranvesikeln der erwähnten Mikroorganismen hergestellt werden. Die Membranvesikeln können nach R. Kaback, Methods in Enzymology _22, 99 (197"I) gewonnen werden. Die Membranen können beispielsweise gewonnen werden durch Behandeln der Mikroorganismen mit Lysozym und einem Detergens, das Magnesiumsulfat enthalten kann. Nach Sedimentation der Membranen werden diese durch mehrmaliges Zentrifugieren in 20 $iger Sucrose gereinigt.

Die Herstellung der Verbindungen der Formel I mit Hilfe von Membranen oder Membranvesikeln erfolgt in einem Reakticnsansatz der folgendermaßen zusammengesetzt sein kann: Aus einem Puffer, bevorzugt Tris-(hydroxymethyl)amino-methan ("Trispuffer" ), Magnesium-, Ammonium- und Kaliumsalzen, bevorzugt als Acetate, einem Antioxydans, z.B. Mercaptoäthanol oder Dithiothreitol, sowie einem Nukleosidtriphosphat, vorzugsweise ATP oder deren Analoga, falls A - D oder Z₁ - Zg nicht Sauerstoff sind. Der pH kann zwischen 5 und 8 vorzugsweise 7,8, die Temperatur zwischen 5 - 55°C, vorzugsweise 37°* betragen und die Reaktionsdauer kann innerhalb weiter Grenzen variieren, liegt jedoch vorzugsweise bei 5 Stunden. Ebenso können die gewünschten Verbindungen diskontinuierlich oder kontinuierlich hergestellt werden.

Die Fermentation wird durch Ansäuern, vorzugsweise mit Ameisensäure, beendet. Die Membranen werden durch Zentrifugieren abgetrennt und die Verbindungen der Formel I, wobei η und m = 0 oder 1 sein können, durch Chromatographie gereinigt.

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Beispiel 1

Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der Formel I auf biologischem Wege

1. Isolierung von Membranvesikeln

Die Isolierung erfolgt in Analogie zu einer Methode von R. Kaback (Methods in Enzymology, 22, 99, 1971). B. subtilis Feuchtmasse (1 g) wird in 80 ml 0.1 M KHPO₂^, pH 7.3, 20 % Sucrose suspendiert und bei J53°C mit 0.5 mg/ml Lysozym 6o min. inkubiert. Sodann wird bei 25.000 χ g bei Raumtemperatur zentrifugiert. Das Sediment wird in 1 ml 0.1 M KHPO₂,, pH 6.6, 20 % Sucrose, 20 mM Mg SO₂, aufgenommen. Die Suspension wird in 400 ml 50 mM KHPO₂^, pH 6.6 bei 27°C eingerührt. Nach 15 min. bei'j57°C werden 4 ml 1 M EDTA hinzugegeben und 15 min. weiter inkubiert. Danach werden noch 4 ml 1.5 M MgSO₂, zugegeben und wieder 15 min. inkubiert.

Nach Zentrifugation bei 25000 χ g wird das Sediment in 50 ml 0.1 M KHPO₂^, pH 6.6, 10 mM EDTA suspendiert. Bei 4°C wird nun 5 min. bei 400 χ g zentrifugiert, das Sediment verworfen und der Überstand erneut bei 30.000 χ g , 20 min. zentrifugiert. Das Sediment wird in 50 ml 0.1 M KHPO₂,, pH 6.6 aufgenommen, 2 χ mit 0.1 M KHPO₂,, pH 6.6 gewaschen und schließlich in einer Konzentration von 200-240 mg/ml in KHPO₂,, pH 6.6 bei -80° aufbewahrt.

2. Isolierung von Membranen

B. subtilis Feuchtmasse (1.0 g) werden in 20 ml 0.1 M Tris, 10 % Sucrose, pH 8.0 suspendiert und bei 37°C mit 0.5 mg/ml Lysozym in 0.05 M EDTA (Kthylendiaminotetraessigsäure) inkubiert. Nach 60 min. werden 20 ml 20 % Brij, 0.05 M MgSO₂^ zugegeben und ca. 5-10 min. bei Raumtemperatur stehen gelassen, bis Klärung erfolgt ist. Nach Zentrifugation bei 25.000 χ g, 10 min., wird das Sediment in 80 ml 20 mM Tris, 15 mM MgSO₂^, pH 8.0 suspendiert, je 20 ml auf 2 ml 20 %

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Sucrose in 20 mM Tris, 15 mM MgSO₂J_-, pH 8.0 gegeben und bei 40.000 χ g 15 min. zentrifugiert. Das Sediment wird in je 2 ml 20 mM Tris, 15 mM MgSO₂^, pH 8.0 resuspendiert, vereinigt und nochmals bei 40.000 χ g zentrifugiert. Das Sediment wird 2 χ mit 0,1 M Tris-Acetat, pH 7.8 gewaschen und in einer Konzentration von 200-250 mg/ml in Tris-Acetat, 0.1 M, pH 7.8 bei -8o°C aufbewahrt.

3. Reaktionsansatz

Die Reaktion wurde in einem Gesamtvolumen von 5O₇Ul angesetzt. Es enthält folgende Komponenten: Tris/Acetat, pH 7·8 (42 mM), Mgacetat (11.4 mM), NEL-acetat (27 mM), K-acetat (10 mM), Dithiothreitol (1.4 mM), ATP (2mM), Membranen (50 mg/ml), H₂O ad 50/Al.

Der Ansatz wird 5 Stunden oder länger bei 37°Q unter leichtem Schütteln inkubiert.

Die Reaktion wird durch Zugabe von 1 μΐ 98 $iger Ameisensäure beendet, bei 4°C 15 min. inkubiert und die Lösung durch Zentrifugation bei 10.000 χ g geklärt. Der Überstand wird bei -80⁰C bis zur Reinigung durch Chromatographie aufbewahrt. Die Ausbeuten betragen etwa 5 - 30 %.

a) Variante des Inkubationsansatzes

Obige Salze werden in 10 fächer Konzentration verwendet.

b). Kontinuierliche Synthese

Obiger Reaktionsansat ζ (10 fache Menge) wird in einen Dialyseschlauch gefüllt. Dieser wird in 100 ml obiger Reaktionslösung (10 fache Salzkonzentration) gehängt und die Dialyselösung bei Raumtemperatur oder 37°C gerührt. Je nach Portschreiten der Reaktion wird die Lösung durch frische ersetzt oder der Dialyseschlauch mit frischer Reaktionslösung gefüllt. Man kann auch in einem Dialysegerät (z.B. von Amicon) arbeiten.

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λ*

4. Herstellung von Analoga mit Hilfe von Membranen

4.1 Wenn im Reaktionsansatz ATP durch 1 mM oo,ß-Methylen-ADP und 1 mM ATP ersetzt werden, wird die Verbindung der Formel I erhalten, wobei X = Adenin, A = CH₂, C = Z₁^ = Sauerstoff, η = m = 0 und Y = OH ist.

4.2 Mit 2 mM ß,<f-Methylen-ATP statt ATP wird die Verbindung der Formel I erhalten, worin X = Adenin, A = C = ^z-j_4 = Sauerstoff, B=D= CHp, Y = OH und η = m = 1 ist.

4.3 Mit 2 mM iT-Thio-ATP statt ATP wird die Verbindung der Formel I mit X = Adenin, Y = OH, A- D = Z_1-^ = Sauerstoff, Z₅ = Zg = Schwefel und η = m = 1 erhalten.

4.4 Mit 2 mM S'-Adenylylimidodiphosphat statt ATP wird die Verbindung der Formel I mit X = Adenin, A= C= Z₁ ^= Sauerstoff, B=D= NH, η = m = 1 erhalten.

Weiterhin können durch Ersatz des ATP durch ATP-7-N-Oxid, ATP-1-N-Oxid oder auch andere Derivate des ATP wie das N-6-Methyl-, das N-6-Dimethyl-, Benzyl- oder Benzoylderivate ebenso wie die entsprechenden Thioverbindungen des ATP die entsprechenden Verbindungen der Formel I erhalten werden.

5. Reinigung über DEAE-Sephadex G25®

Das unter 3. erhaltene Rohprodukt wird 1 : 10 verdünnt und auf eine DEAE-Sephadexsäule (dem Reaktionsvolumen größenordnungsmäßig angepaßt) gegeben. Nach dem Waschen mit 0.01 M KHPOh pH J>A wird überschüssiges ATP mit 0.3 M KHPO,., pH 3.4 entfernt. Danach wird das Produkt mit einer geringen Menge an Tris/HCl, pH 6.5 eluiert und bei -80°C aufbewahrt. Die Ausbeuten betragen zwischen etwa 5 und etwa 30 % bezogen auf das eingesetzte Triphosphat.

6. Isolierung von Verbindungen der Formel I (X = Adenin, Z₁_g =

A-D= Sauerstoff, η = m = 0 oder 1 oder η - 1 und m = 0.) aus Mikroorganismen

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Sporulierende Bazillen, wie z.B. B. subtilis oder B. cereus und andere, bilden am Ende der logarithmischen Wuchsphase höher phosphorylierte Nukleotide der Formel I, wobei die Reste die Bedeutung haben, wie in der Überschrift angegeben« Diese Nukleotide können aus der Kultur isoliert werden, insbesondere durch Adsorption an einem Ionenaustauscher mit anschließender Elution mit einem Salzgradienten. Bei der Isolierung von z.B. Verbindungen der Formel I mit X = Adenin, Y = OH, Z, - Zg und A-D= Sauerstoff und η = m = 1 wird die Kultur zum Zeitpunkt der maximalen Bildung, der Je nach verwendetem Organismus zwischen T (Ende des logarithmisehen Wuchses) und Tp (zwei Stunden danach) liegen kann, abgeerntet. Im Falle von B. subtilis wurde etwa bei T. so viel reine Ameisensäure bei 0°C zugefügt, bis der pH 3.4 war. Nach ca. 1 Stunde bei 0 wurde zentrifugiert, der Überstand 1 : 10 mit HpO verdünnt und über QAE-Sephadex® fließen gelassen. Das Sephadex wurde in eine Säule gefüllt und so lange mit 0.01 M KHPO₂J., pH 3.4 gewaschen, bis die braune Farbe verschwunden war. Durch fraktionierte Elution mit einem linearen Salzgradienten konnten dann die gewünschten Nukleotide in verschiedenen Fraktionen rein isoliert werden.

Die gewünschte Fraktion wurde 1 : 5 verdünnt, an DEAE-Sephadex® adsorbiert, mit 0.01 M Tris/HCl. pH 7.0 gewaschen und dann mit 1 M Triäthylaminbicarbonat oder anderen Puffern eluiert. Bei Verwendung flüchtiger Puffer wurde lyophilisiert,

7. Verwendbare Organismen

In analoger Weise wie unter 1. bis 6. beschrieben kann die Isolierung von Membranvesikeln und Membranen auch aus an- · deren sporulierenden Mikroorganismen, z.B. B. eereus oder B. megaterium, vorgenommen werden. Da auch tierische und mensch-liehe Zellen in Zellkultur diese Nukleotide bilden,können auch mit Hilfe dieser Organismen bzw. Organe mit einer der obigen Methoden Verbindungen der Formel I gewonnen werden.

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Herstellung von Verbindungen der Formel I auf chemischem Weg. Beispiel 2

Verbindungen der Formel I mit X = Adenin, Y = OH, Z.._r und A-D = Sauerstoff sowie η = m = 0 oder 1 (Schema 1: Verbindung XI, X = Adenin und Verbindung XII, X = Adenin)

2.1 Adenosin-3^f, 5^f-diphosphat (VII, X = Adenin)

Die Herstellung ist beschrieben in J. Am. Chem. Soc. 8j5, 66} (1961).

2.2 2^f -0-(1"-A'thoxyäthyl')-adenosin-3', 5' -diphosphat (IX, X = Adenin)-

Verbindung VII wird analog dem in Biochim. Biophys. Acta ^40, 509 (1974) beschriebenen Verfahren zu IX umgesetzt. Die spektroskopisch bestimmte Ausbeute beträgt 20 - J>0 %. Das Produkt ist chromatographisch rein. R^,-Wert: s. Tabelle 1. UV-Spektrum: gleicht dem von Verbindung VII.

2.3 2' -0- (1 "-äthoxyäthyl )-adenosin-3'.. 5' -dipyrophosphat (Verbindung X, X= Adenin)

Das Tetrakis-tri-n-oxtylammoniumsalz der Verbindung II (aus 20 /imol des Bis-triäthylammoniumsalzes hergestellt) wird mit 72 /unolen Chlorphosphorsäure-diphenylester und 47 Tri-n-octylamin in wasserfreiem Dioxan bei 25⁰C stehen gelassen. Nach ca. 1 Stunde wird eine Lösung von 0.5 M Monotri-n-butylammoniumphosphat in 0.4 ml Pyridin zugegeben und weitere 30 Minuten bei 25 C stehen gelassen. Die Lösung wird zur Trockne eingedampft und das zurückbleibende Öl mehrmals mit absolutem Pyridin zur Trockne eingedampft. Dieses Rohprodukt wird für die folgenden Synthesen weiterverwendet.

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At

2.4 Adenosin-3',5^f-diphyrophosphat (XI, X = Adenin)

Das Rohprodukt von Verbindung X wird mit 1 ml 10 ^iger Essigsäure bei 25°C 30 Minuten behandelt. Nach Neutralisation mit verd. NHj₁OH wird bis zu einem Volumen von 30 ml dest. HpO zugegeben und diese Lösung mit Äther mehrmals extrahiert. Die Lösung wird auf eine DEAE-Säule (1 χ 16 cm) gegeben, mit HpO gewaschen und Verbindung XI mit einem linearen Gradienten von 0 - 0.5 M Triäthylammoniumbicarbonat pH 7-5 eluiert. Durch Dünnschichtchromatographie werden die Verbindung XI enthaltenen Fraktionen bestimmt. Diese werden vereinigt, zur Trockene eingeengt, in Methanol aufgenommen (1 ml) und mit ml trockenem Äther ausgefällt. Die Ausbeute liegt bei 10 % (spektrophotometrisch bestimmt). Das Produkt ist chromatographisch rein. .

2.5 Adenosin-3' -triphosphat-5' -tr'iphosphat (XII, X = Adenin)

Das Rohprodukt von Verbindung XI wird in ca. JO ml H_p0 aufgenommen und mehrmals mit Äthex* extrahiert. Die Lösung wird zur Trockne eingedampft mit Chlorphosphorsäurediphenylester (70/umol), Tri-n-octylamin (4θ/ΐηιο1) und 5 - 10 ml wasserfreiem Dioxan versetzt und 6o Minuten bei 25°C stehen gelassen. Danach werden 0.4 ml einer 0.5 M Lösung von Monotri-n-butylammoniumphosphat in 0.4 ml Pyridin zugegeben und JO Minuten bei 25°C stehen gelassen. Sodann wird zur Trockne eingeengt, mit 1 ml 10 ^iger Essigsäure versetzt und weitere 30 Minuten bei 25°C stehen gelassen. Danach wird mit ΝΗ^ΟΗ neutralisiert und auf 30 ml mit dest. HpO aufgefüllt. Nach Extraktion mit Äther wird die wäßrige Lösung auf eine DEAE-Säule (Carbonatform, 1 χ 16 crn) gegeben, diese mit HgO gewaschen und die Reaktionsprodukte mit einem linearen Gradienten von 0 -1.0 M Triäthylammoniumbicarbonat aufgetrennt. Durch Dünnschicht Chromatographie werden die Verbindung XII enthaltenden Fraktionen bestimmt, diese vereinigt und zur Trockne eingeengt. Nach Aufnehmen in 1 ml Methanol wird Verbindung XII mit 10 ml Äther ausgefällt. Das Produkt ist un-

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- ΊβΓ-

beständig und muß bei etwa -20⁰C aufbewahrt werden. Zur Stabilisierung eignet sich die Zugabe von 10 - 30 % ATP. Die Ausbeute an Verbindung XII beträgt etwa 10 % bezogen auf das eingesetzte Rohprodukt der Verbindung XI (spektrophotometeiseh bestimmt).

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- JtT-

a.0

Schema 1

f ?

HO-P-O-P-O-P-O-CH
OH OH OH

OH
OH OH

ΓΟΗ.

HO-ir'-O-CH

O=P-OH 0-C_oH

1

OH

O-CH-CH-

HO-P-O-P-O-P-OH Il Il Il 0 0

XII

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Beispiel 3

Verbindung der Formel I mit X = Adenin, Y = OH, Z* 5 = ^A -D= Sauerstoff sowie η = m = 0 (Schema 2; Verbindung XI^ X = Adenin).

J>. 1 2^f-0-(1" -Ä'thoxyäthyl) -adenosin-3 *, 5' -diphosphomorpholidat (XIII, X = Adenin)

2¹-0-(i"-äthoxyäthyl)-adenosin-3^l,5'-diphosphat (X) wird in das Morpholiniumsalz überführt, wie bei J. G. Moffat und H. G. Khorana, J. Am. Chem. Soc. 8j5, 67^ (I96I) beschrieben. Diese Verbindung (1 mmol) wird in einer Mischung aus 10 ml HpO, 25 ml t-Butylalkohol und 0.7 ml (8 mmol) Morpholin gelöst und danach 10 mmol Dicyclohexylcarbodiimid zugegeben. Nach dreistündigem Kochen unter Rückfluß wird der t-Butylalkohol abgedampft, die zurückbleibende wäßrige Lösung auf 25 ml mit HpO aufgefüllt und mehrmals mit Kther extrahiert. Dann wird im Vakuum zur Trockne eingeengt. Der Rückstand wird in einem Minimum an Methanol gelöst, und die Lösung im Vakuum vorsichtig bis auf ca. 4 ml eingeengt_t Sodann wird abs. A'ther zugefügt. Der entstandene Niederschlag wird filtriert und nach Waschen mit Äther erhält man in ca. 90 % Ausbeute 2'~0-(1"-äthoxyäthyl)-adenosin-3',5'diphosphomorpholidat (XIII).

5.2 Adenosin-3^T,5'-dipyrophosphat (XI, X = Adenin)

Verbindung XIII (0.2 mmol) wird durch mehrmaliges Einengen mit abs. Pyridin getrocknet, ebenso 0.6 mmol des Pyridinsalzes der Phosphorsäure (hergestellt mit Hilfe von Dowex 50®, Pyridinform). Beide Verbindungen werden vereinigt, nochmals mit abs. Pyridin versetzt und zur Trockne eingeengt und schließlich in abs. Pyridin (10 ml) gelöst. Nach 15 Stunden bei Raumtemperatur wird zur Trockne eingeengt. Durch mehrmaliges Abdampfen im Vakuum mit HpO wird das Pyridin entfernt. Danach wird 10 ^ige Essigsäure zugegeben, nach JO Minuten bei Raumtemperatur wird neutralisiert, auf 30 ml

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3,V

aufgefüllt imd die Lösung auf eine DEAE-Sephadex®-Säule (1 era χ 15 cm) gegeben. Nach Waschen mit HpO wird mit einem linearen Gradienten von 0 bis 0.5 M Triäthylaminbicarbonat eluiert.

Durch Dünnschichtchromatographie werden die Verbindung XI enthaltenden Fraktionen festgestellt, vereinigt und aufbereitet, wie oben beschrieben. Die Ausbeute beträgt etwa 30 %. .

Die Synthese von Analoga kann wie oben beschrieben durchgeführt werden, wenn an Stelle von Phosphorsäure Thiophosphorsäure oder ähnliche Verbindungen verwendet werden.

Beispiel 4

Verbindung der Formel I mit X = Adenin, Y = OB, Z. ^=A-D = Sauerstoff, η = m = 1 (Schema 2: Verbindung XII, X = Adenin)

Adenosin-^-triphosphat-5'-triphosphat (XII, X= Adenin)

Verbindung XIII wird, wie unter 3.2 beschrieben, wasserfrei gemacht, ebenso das Pyridiniumsalz der· Pyrophosphorsäure«, Beide werden vereinigt und wie unter 3.2 beschrieben behandelt. Die Aufbereitung erfolgt ebenfalls wie dort mit der Ausnahme jedoch, daß ein linearer Gradient von 0.0 bis 1.0 M Triäthylaminbicarbonat verwendet wird. Das Produkt, das mit ca. 10 20 °/> Ausbeute erhältlich ist, wird durch dünnschichtchromatographische Analyse identifiziert. Adenosin~3^!-triphosphat-5'-triphosphat ist labil und sollte nur bei etwa -30°C aufbewahrt werden. Die Reinigung durch Säulenchromatographie erfolgt zweckmäßig bei etwa 4 C. · Durch Verwendung von Methylenpyrophosphat oder Dithiopyrophosphat können die entsprechenden Analoga in Ausbeuter, zwischen 10 und 30 % erhalten werden.

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- y. 3.1

Schema 2

HO-P-O-i:

CH.

DCC

•Η

O O-CH-CH, O=P-OH OC₂H₅ OH

XI

HO-P-O-CH,

0 0-CH-CH₃

O=P-OH OC₀H₁-"

1 2 5

XIl

XIII

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/20

Tabelle
R -Werte der Verbindungen

Verbindung ■ R

Guanosin-5'-triphosphat 0.50

Adenosin-5'-triphosphat 0.68

Adenosin-jJ'iS'-diphosphat 0.61

2»-o-(1"-äthoxyäthyl)-adenosin 0.76

^!,5^f-diphosphat

Adenosin-^'^'-dipyrophosphat 0.44

Adenosin-jJ'^'-ditriphosphat 0.01

2^l-o-(1"-äthoxyäthyl)-adenosin-3^l,5¹- 0.95 diphosphomorpholidat

Lösungsmittelsystem: 1.5 M Phosphatpuffer pH J.4 Dünnschichtchromatogramme auf Macherey und Nagel Düren/Rheinland, Bundesrepublik Deutschland (MN 500, Polygram) Polyäthylenimin-Cellulose

/21

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Claims

PATENTANSPRÜCHE:
[ ■ V, Verbindungen der Formel I,

OH
I

D-P-

OH

in welcher X ein gegebenenfalls durch eine -NR'R'-gruppe, worin Rl und P' Wasserstoff, eine Alkylgruppe mit 1-4 Kohlenstoffatomen, wobei -NRlR' auch Teil eines gegebenenfalls durch Sauerstoff substituierten heterocyclischen Ringes sein kann, oder eine Aralkylgruppe mit 7-9 C-Atomen ist, eine gegebenenfalls mit einem Alkanrest von 1-4 Kohlenstoffatomen verätherte Hydroxygruppe oder eine Mercaptogruppe substituiertes ein- oder mehrkerniges Ringsystem mit 5 bis 10 Kohlenstoffatomen, das bis zu 6 Stickstoffatome und daneben gegebenenfalls bis zu J> Sauerstoffatome enthalten kann, Y ein Wasserstoffatom, die Hydroxy-, Amino- oder die "CH(CH,)0C₂H₅-Gruppe bedeutet und Z₁ bis Zg jeweils beliebig ein Sauerstoff- oder Schwefelatom, A bis D jeweils beliebig ein Sauerstoffatom, die CH₂- oder die NH-Gruppe und m und η die Zahlen 0 oder 1 bedeuten, wobei jedoch nicht gleichzeitig X = Guanin, Y = OH, Z^ bis Z^ und A bis C = Sauerstoff und m = 0 und η = 0 oder 1 sein können.

2. Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der Formel I in Anspruch 1, wobei jedoch auch gleichzeitig X = Guanin, Y =

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OH, Z. - Z,- land A-C Sauerstoff und m = 0 und η = 0 oder 1 sein können, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Verbindung der Formel II

HO-P-O-OH₅,

¹¹ - ί

worin X sowie Z, und Z₂ die in Anspruch 1 angegebene Bedeutung haben und Y die Hydroxygruppe darstellt, mit Äthylvinyläther zu einer Verbindung der Formel II umsetzt, wobei X, Z, und Zo oben definiert sind und Y = -CH(GH^)OCpH₁- ist, und diese mit einer Verbindung der Formel III,

Z
(RO)₂P-HaI (III)

worin Z ein Sauerstoff- oder Schwefelatom, Hal ein Halogenatom und R eine gegebenenfalls durch eine Alkyl gruppe mit 1 ~ 4 C-Atomen, eine Alkoxygruppe mit 1-4 C-Atomen, ein Halogenatom, die Trifluormethyi- oder Nitrogruppe mono- oder disubstituierte Phenylgruppe ist, zu einer Verbindung der Formel I umsetzt, wobei X die in Anspruch 1 angegebene Bedeutung hat, Y die -CH₂(CH₅)OC₂H₅-GrUpPe, A und C jeweils beliebig ein Sauerstoff- oder Schwefelatom und η = rn = 0 ist, und su Verbindungen der Formel I, worin η = m = 0 ist und die übrigen Reste die Bedeutungen haben, wie am Anfang dieses Anspruchs angegeben, hydrolysiert oder nochmals mit einer Verbindung der Formel III mit den oben angegebenen Definitionen der Reste Z, Hai und R zu Verbindungen der Formel I umsetzt, wobei die Reste die zu Formel II angegebene Bedeutung haben, jedoch Y =

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-CH(CH₅)OC₂H₅ ist, und hydrolysiert, wobei jedoch falls Y in Formel II ein Wasserstoffatom bedeutet, eine Verbindung der Formel II unmittelbar mit einer Verbindung der Formel III umgesetzt wird, oder indem man Verbindungen der Formel II, in welcher X sowie Z.. und Z₂ die oben angegebene Bedeutung haben und Y = -CH(CH₅)OC₂H₅ ist, mit einem Carbodiimide vorzugsweise Dicyclohexylcarbodiiraid und einem sekundären Amin der Formel IV,

/1
HN (IV)

mit PL, R₂ = H, C, j^-Alkyl oder Aralkyl, wobei R.. und Rp zusammen einen Alkylenrest bilden können, der durch Sauerstoff substituiert sein kann, vorzugsweise Morpholin, zu einer Verbindung der Formel V,

HO-P-O-CHp

I²O X (γ)

worin X sowie Z* und Z₅ die in Anspruch 1 genannte Bedeutung haben, Y die -CH(CH₅)OC₂H₅-GrUPPe ist und R₁ und R₂ die Bedeutungen wie zu Formel IV angegeben haben, umsetzt und diese entweder mit einer Verbindung der Formel VI

Z A Zo

Il ' I ²
R¹O-P-A-P-OR' (VI)

OR' OR'

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HOE 75/F 285

mit Z¹ ^ und Z'₂ = Sauerstoff oder Schwefel, A = Sauerstoff, CHp oder NH, R' = H oder gegebenenfalls substituiertes Phenyl wobei ein R¹ Wasserstoff sein, muß, zu Verbindungen der Formel I, wobei die Reste die Bedeutung wie in Anspruch 1 haben, jedoch η = m = 1 ist, oder mit Phosphorsäure oder Thiophosphorsäure zu Verbindungen der Formel I, wobei die Reste die Bedeutung wie in Anspruch 1 haben, jedoch η = m = 0 ist und A sowie C nicht die/-CHp- oder -NH-Gruppe sein können, umsetzt.

5. Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der Formel I in Anspruch 1, wobei jedoch auchi gleichzeitig X = Guanin, Y = OH, Z- - Z₁- und A-C Sauerstoff und m = 0 und η = 0 oder 1 sein können, dadurch gekennzeichnet, daß die Herstellung mit Hilfe von Mikroorganismen oder Teilen von solchen, beispielsweise Membranen, Membr.anvesikeln oder Ribosomen, in Gegenwart von Puffern, Salzen, Nukleosidtriphosphaten oder deren Analoga erfolgt.

4. Arzneimittel bestehend aus oder enthaltend eine Verbindung der Formel I in Anspruch 1, worin X, Y, Z₁ bis Zg, A bis D sowie m und η die dort angegebene Bedeutung haben, wobei jedoch auch gleichzeitig X = Guanin, Y = OH, Z. - Z₁- und A-C Sauerstoff und m = 0 und η = 0 oder 1 sein können.

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