DE2545986C2

DE2545986C2 - Kosmetika auf der Basis von Enzymen

Info

Publication number: DE2545986C2
Application number: DE2545986A
Authority: DE
Inventors: Bernard Antony Jacquet; Grégoire Neuilly-sur-Seine Kalopissis; Gérard Deuil-la-Barre Lang
Original assignee: LOreal SA
Current assignee: LOreal SA
Priority date: 1974-10-15
Filing date: 1975-10-14
Publication date: 1992-07-02
Also published as: IT1048236B; JPS5163949A; CH609862A5; US4129644A; GB1497950A; BE834483A; CA1063028A; LU71110A1; FR2287899A1; DE2545986A1; JPS5910324B2; FR2287899B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft kosmetische Mittel enthaltend Superoxid-Dismutase sowie ihre Verwendung in der Kosmetik.
Die Erfindung betrifft genauer die Verwendung von Superoxiddismutasen im kosmetischen Bereich und im besonderen die Verwendung dieser Enzyme zur Herstellung von kosmetischen Zubereitungen zur Behandlung der Haut und der Haare.
Es ist bekannt, daß die Superoxid-Dismutasen Enzyme sind, die geeignet sind, die Dismutation von Superoxidionen einzuleiten nach der folgenden Reaktion:
2 O&sub2; + 2 H&spplus; → H&sub2;O&sub2; + O&sub2;
Bisher beschrieben sind Superoxid-Dismutasenextrakte von Rindererythrozyten (Markovitz, J. Biol. Chem. 234, Seite 40, 1959) und Superoxid-Dismutasenextrakte von Escherichia coli (Keele und Fridovich, J. Biol. Chem., 245, Seite 6176, 1970).
In der DE-OS 24 17 508 sind neue Superoxid-Dismutasenextrakte von Meer-(Marine-)-Bakterienstämmen sowie Verfahren zu ihrer Herstellung beschrieben. Die Herstellung dieser Enzyme führte zu Erkenntnissen, die in der DE-OS 24 17 508 niedergelegt sind und die nicht Gegenstand der vorliegenden Anmeldung sind.
Das angegebene Verfahren besteht darin, daß man in Wasser, wobei man die Temperatur auf etwa 4°C hält, eine Meerbakterienkultur dispergiert, danach den pH-Wert des Mediums auf 6,5-8 und vorzugsweise etwa 7 einstellt, das Gemisch während einiger Minuten auf 50-60°C bringt, es auf etwa 4°C abkühlen läßt und es bei dieser Temperatur zentrifugiert, auf der überstehenden Schicht eine erste fraktionierte Ausfällung mit Hilfe neutraler Salze bewirkt, von neuem zentrifugiert und auf der überstehenden Schicht eine zweite fraktionierte Ausfällung mit neutralen Salzen bewirkt und nochmals zentrifugiert. Man kann auch dieses Verfahren durch eine Reinigungsstufe beenden, die vorteilhafterweise darin besteht, daß man den bei der letzten Zentrifugierung gesammelten Niederschlag in Phosphatpuffer bei pH 7,8 zur Auflösung bringt und eine Dialyse der so erhaltenen Lösung gegen den gleichen Phosphatpuffer bei pH 7,8 bewirkt. Man kann auch den Enzymextrakt der Bakterienkultur in der Weise reinigen, daß man nach Aufnahme des Produkts der letzten Zentrifugierung mit Phosphatpuffer bei pH 7,8 und Dialyse gegen denselben Puffer, eine Chromatographie durchführt, die vorzugsweise eine Säulenchromatographie und im besonderen eine Chromatographie über drei nacheinander angeordneten Säulen ist, wobei eine erste Säule vom Gel Sephadex® G 200, eine Säule von Diäthylaminoäthyl Sephadex (DEAE-Sephadex® A-50) und eine zweite Säule vom Gel Sephadex® G 200 gebildet ist. Um den pH-Wert der Dispersion der Bakterien in Wasser als erste Stufe des beschriebenen Verfahrens auf pH 6,5-8 einzustellen, verwendet man beispielsweise 2N Ammoniak und gibt danach Kaliumchlorid, vorzugsweise 3M KCl zu.
Man bringt danach das so gebildete Gemisch auf eine Temperatur von 50-60°C, wenigstens während einiger Minuten und vorzugsweise während 3-4 Minuten. Man kühlt danach das Gemisch auf etwa 4°C, wobei man bei dieser Temperatur alle nachfolgenden Stufen des Verfahrens nach der Erfindung durchführt.
Jede der fraktionierten Ausfällungen, die die Stufen dieses Verfahrens bilden, bewirkt man, wie oben ausgeführt, mit Hilfe neutraler Salze in wäßriger Lösung und vorzugsweise mit Hilfe von Ammoniumsulfat.
In einer anderen vorteilhaften Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung bewirkt man die erste fraktionierte Ausfällung mit Hilfe von Ammoniumsulfat, das in einer solchen Menge zugegeben wird, daß das Gemisch oder der behandelte enzymatische Extrakt auf diese Weise auf eine Endkonzentration von etwa 30-35% der Sättigung bei 4°C gebracht wird. Es ist in jedem Falle festzuhalten, daß man das gesamte oder einen Teil des Ammoniumsulfats durch ein oder mehrere andere geeignete Salze ersetzen kann und daß man dann als Gesamtmenge der angegebenen Salze eine äquivalente und geeignete Menge verwendet, um damit das Gemisch auf eine Endkonzentration von etwa 30-35% der Sättigung bei 4°C zu bringen.
In einer anderen Ausführungsform kann man ein Ultrafiltriersystem verwenden, wie beispielsweise ein System unter Verwendung eines porösen Mittels, wie poröser Röhren, und im besonderen eines Systems bei dem man eine erste zurückhaltende poröse Röhre unter Konzentrierung der Moleküle, die ein Molekulargewicht über 40 000 aufweisen und eine zweite poröse Röhre verwendet, die die gewünschten Enzymmoleküle durchlaufen läßt, aber die verbliebenen Bakterien zurückhält und auf diese Weise einen sterilen enzymatischen Extrakt liefert.
Gleichfalls führt man vorteilhafterweise die zweite fraktionierte Ausfällung mit Hilfe von Ammoniumsulfat (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; durch, das in einer solchen Menge zugegeben wird, daß das behandelte enzymatische Gemisch oder der Extrakt auf diese Weise auf eine Endkonzentration von etwa 70-75% der Sättigung bei 4°C gebracht wird.
Die erhaltenen Superoxid-Dismutasen, die man von verschiedenen Meerbakterienstämmen nach dem vorausgehend beschriebenen Verfahren erhält, sind insgesamt Superoxid-Dismutasen, die Nicht-Haematin-Eisen enthalten, während die Enzyme, die eine Superoxid-Dismutasenaktivität aufweisen und in der voraus angegebenen Literatur beschrieben sind, d. h. Erythrocuprein und der Enzymextrakt von Escherichia coli, zweiwertige Kationen aufweisen, die entsprechend Kupfer und Zink bei dem ersten und Mangan bei dem zweiten sind.
Die Feststellung der Gegenwart eines Metalls in den in Betracht kommenden Superoxid-Dismutasen kann mittels einer spektrographischen Analyse der Atomabsorption festgestellt werden.
Man kann aber ebenso eine colorimetrische Untersuchung durchführen, die im vorliegenden Falle darin besteht, ein der elektrophoretischen Wanderung unterliegendes Gel einer Enzymaufbereitung mit Hilfe eines spezifischen Farbstoffs, der zweiwertiges Eisen Fe²⁺ enthält, den Bathophenanthrolin, gegebenenfalls in Gegenwart eines Reduktionsmittels wie Hydrazin, zu färben. Zu dieser Untersuchung schneidet man das Gel in zwei Teile der Länge nach auf und gibt einen der beiden Teile in "Coomassie"-blau und den anderen Teil in Bathophenanthrolin. Die Untersuchung ist positiv wenn man im letzteren Falle einen rosaroten Ring in der Höhe der Proteinbande erhält. Folglich kann, wie es bekannt ist, ein solches Auftreten eines rosaroten Ringes als Kennzeichen für die Gegenwart von zweiwertigem Eisen angesehen werden, im gegebenen Falle in dem Superoxid-Dismutaseprotein.
Man kann weiterhin radioaktives Eisen verwenden, um das Protein zu markieren und auf diese Weise die Stöchiometrie zu bestimmen, soweit sie das vorhandene zweiwertige Metallkation betrifft.
Die Superoxid-Dismutasenextrakte von Meerbakterienzellen enthalten nicht haematisches Eisen, haben ein Molekulargewicht von etwa 40 000±2500, einen isoelektrischen Punkt von etwa 4 bis 7 und weisen ein enzymatisches Aktivitätsmaximum bei einem pH-Wert von etwa 8,5-10 mit einem Optimum bei etwa pH 9,5 auf.
Man kann das Enzym über eine längere Zeit aktiv erhalten, wenn man es in einer 70-80%igen neutralen Ammoniumsulfatlösung bei 4°C lagert.
Um die Aktivität der Superoxid-Diamutasenprodukte der Erfindung zu messen, kann man die Inhibierung durch diese Dismutasen der Chemolumineszenzreaktion messen, die durch das enzymatische Sauerstoff/Hypoxanthin/Xanthinoxidase/Luminolsystem hervorgerufen wird, wie dies noch später gezeigt wird. Dieses enzymatische Umsetzungssystem bewirkt die Freisetzung von O&sub2;-Ionen, die eine Chemolumineszenzreaktion mit dem Luminol eingehen können. Die Zugabe von Superoxid-Dimutasen zu diesem System fängt tatsächlich die O&sub2;-Ionen ein und bewirkt auf diese Weise eine Intensitätsverringerung des in dieser Reaktion emittierten Lichtes.
Die Superoxid-Dismutasen katalysieren tatsächlich die Reaktion
2 O&sub2; + 2 H&spplus; → H&sub2;O&sub2; + O&sub2;
Wenn man demgemäß als Substrate in dieser Reaktion die Superoxidionenprodukte der enzymatischen Reaktion mittels Xanthinoxidase und Xanthin- oder Hypoxanthinoxidase verwendet, sind die so erhaltenen Superoxidionenprodukte sehr instabil und emittieren sofort das Licht. Diese letzte Eigenschaft ist jedoch sehr schwach und die Messungen haben keine ausreichende Reproduzierbarkeit ergeben.
Deshalb vervollständigt man in der Praxis die analytische Anzeige, wozu man zur Kenntlichmachung der Menge der gebildeten Superoxidionen eine chemolumineszierende Substanz, nämlich Luminol (5-Amino-1,2,3,4-tetrahydrophthalazin-1,4-dion) oder 5-Amino-2,3- dihydro-1,4-phthalazindion verwendet
Luminol + O&sub2; → Lichtemission und Oxidationsprodukt
Nach dem in der DE-OS 24 17 508 beschriebenen Verfahren mißt man die Aktivität der Superoxiddismutasen mit Hilfe von Superoxidionen bildenden Systemen, katalytischen Systemen, die geeignet sind, die Oxidation des Luminols zu bewirken und die gebildet sind von durch Fe²⁺-, Ni²⁺- oder Co²⁺-Ionen in wäßrigen Lösungen molekularen Sauerstoffs in Gegenwart bestimmter Liganden.
Die in das System eingeführte Superoxid-Dismutase verringert die O&sub2;-Ionenmenge und demzufolge die Bildung von Licht.
Man bestimmt die Dosis unter Verwendung des folgenden Reaktionsgemischs °=c:70&udf54;&udf53;vu10&udf54;@I&udf53;zl10&udf54;@1Luminol@210°H^3°hM@30,3¤ml&udf50;@1Phosphatpuffer@210°H^3°hM¤p°TH°t7,8@30,3¤ml&udf50;@1EDTA@210°H^3°hM@30,3¤ml&udf50;@1Wasser@2qsp@32¤ml&udf50;@1+¤50¤Ól Xanthin-Oxidase (1,05¤ml einer LÐsung mit&udf50;@11¤mg/ml Xanthin-Oxidase.&udf53;zl&udf54;@0&udf53;vu10&udf54;
Man gibt dieses Gemisch in einen versilberten Behälter, vor einem Photomultiplier. Man leitet die Reaktion in dem Behälter dadurch ein, daß man das Substrat: 1 ml einer Lösung, die 0,3 µMol Hypoxanthin enthält, einspeist.
Es bildet sich danach eine Emission eines Photonenflusses, der unter der Einwirkung des Photomultipliers einen Strom entstehen läßt, dessen Intensität durch einen Pikoamperemeter gemessen und registriert wird. Wenn man in das Reaktionsgemisch zur Bewertung 5 µl Superoxidase-Dismutase vor Einleitung der Reaktion einführt, erzielt man eine Inhibierung dieser Lichtemission.
Man definiert danach in willkürlicher Weise die Superoxid-Dismutase-Enzymeinheit als eine Menge des Enzyms, das eine 50%ige Inhibierung der Lichtemission bewirkt. Diese Einheit ist demgemäß von der Enzymquelle und dem verwendeten Superoxid-Dismutaseenzym unabhängig.
Es ist jedoch festzustellen, daß man in gleicher Weise die Superoxid-Dismutasenaktivität nach der Erfindung dadurch bewerten kann, daß man die Inhibierung der gleichen oben erwähnten Reaktion dadurch hervorruft, daß man unmittelbar 1 ml einer Lösung der O&sub2;-Ionen, hergestellt durch elektrochemische Reduktion (J. M. Cord, I. Fridovitch, J. B. C. Band 244, 25 (1969), Seiten 6049-6055) in 2 ml einer Lösung einspeist, die 0,5 µMol Luminol und 0,17 µMol Phosphatpuffer pH 7,8 enthält.
In bestimmten Fällen kann es vorteilhaft sein, um die Wirksamkeit der Superoxid-Dismutasen in der vorgesehenen Verwendung über eine vernünftig lange Zeitdauer zu bewerten, die Oxidation der Materialien zu aktivieren. Um das zu erreichen, arbeitet man in der Praxis entweder mit Hilfe von Flavinen, die durch Strahlung bei 365 mµ reduziert sind oder mit einem enzymatischen System, beispielsweise dem Xanthin-Oxidase/Hypoxanthin/Sauerstoffsystem.
Wenn man die Oxidation durch reduzierte Flavine beschleunigt, bestrahlt man eine Lösung von Flavinmononucleotid (FMN) 10^-4M, von EDTA 10^-3M und Phosphatpuffer 10^-2M pH 7,0 in einem Quarzbehälter, den man in ein Spektrofluorimeter Zeiss, das ein Filter M 365 aufweist, einbringt. Man folgt der Photoreduktion, die schnell abläuft unter Beobachtung der Verringerung der Fluoreszenzintensität, die bei 530 mµ emittiert wird.
Am Ende der Reduktion nimmt man die Lösungen auf, um sie kräftig in Gegenwart von Luft zu rühren, wodurch man auf diese Weise ihre vollständige Reoxidation erzielt und Superoxidionen O&sub2; gebildet werden. Es ist darauf hinzuweisen, daß dieser Reduktions-Reoxidationszyklus von Flavinen mehrmals wiederholt werden kann, ohne daß dadurch die Struktur des Flavinmononucleotids geändert wird. Man kann aber auch die Lösungen, wie sie oben beschrieben wurden, bei 365 mµ mit Hilfe einer Lampe B 100 A der Ultraviolet Products Inc. unter fortdauerndem Rühren bestrahlen.
Wenn man die Oxidation durch das enzymatische Hypoxanthin/ Xanthinoxidase/Sauerstoffsystem zu beschleunigen wünscht, ist es vorteilhaft, eine Lösung zu verwenden, die 0,3 ml Hypoxanthin 10^-3M, 0,3 ml Phosphatpuffer 1M pH 7,8, 0,3 ml EDTA 10^-3M, 2,1 ml Wasser und 0,05 ml einer Lösung von Xanthinoxidase mit 1 mg/ml enthält.
Es wurde nunmehr gefunden, daß die Superoxid-Dismutasen Eigenschaften zum Schutz von Haut und Haaren aufweisen, die es ermöglichen, sie in der Kosmetik zu verwenden.
Die Superoxid-Dismutasen ermöglichen im besonderen Haut und Haare zu schützen, wobei sie die Integrität der natürlichen Keratinstruktur erhalten. Es ist möglich, daß dieser Schutz der Inhibierung der Oxidationsphänomene des Keratins zuzuschreiben ist. Die Superoxid-Dismutasen verbessern die Atmung der Hautzellen und erhalten oder verbessern die Eigenschaften der Haut: Nämlich ihrer Zartheit (beim Berühren), Geschmeidigkeit und Elastizität. Ihre Gegenwart in haarkosmetischen Zubereitungen ermöglicht weiterhin den Zustand der Kopfhaut zu verbessern, wobei sie gleichzeitig die Haut der Hände von Personen schützt, die diese Zubereitungen auftragen.
Weiterhin wurde gefunden, daß die Superoxid-Dismutasen die Haut gegen Entzündungserscheinungen schützen, die durch Ultraviolettbestrahlungen verursacht werden.
Wegen dieser unterschiedlicher Eigenschaften sind die Superoxid-Dismutasen in kosmetischen Zubereitungen für die Haut und für die Haare verwendbar.
Aufgrund ihrer besonderen Oxidations-Reduktionseigenschaften übernehmen die Superoxid-Dismutasen weiterhin in den kosmetischen Zubereitungen eine Schutz- und Stabilisierungsfunktion, da sie Oxidationsphänomene oder die Autooxidation verhindern, die zum Abbau bestimmter Bestandteile kosmetischer Zubereitungen beitragen. So verhindern sie beispielsweise das Ranzigwerden der Fettgrundlage, die in zahlreichen kosmetischen Formulierungen vorhanden ist und darüberhinaus inhibieren sie im allgemeinen den Abbau aller oxidierbaren oder auto-oxidierbaren in der Zubereitung vorhandenen Bestandteile.
Es wurde im besonderen gefunden, daß die Superoxid-Dismutasen die Oxidation bestimmter stark oxidierbarer Verbindungen vor ihrer Verwendung inhibieren, im besonderen:

a) Bestimmte Farbstoffe oder Farbstoffprekursoren, die bei Oxidationsfärbungen verwendet und entweder durch ein üblicherweise verwendetes Oxidationsmittel (Wasserstoffsuperoxid, Persulfat, Harnstoffperoxid, Metallsalze usw.) oder durch den Sauerstoff der Luft entwickelt werden.

Diese Farbstoffverbindungen sind Basen, Kupplungsmittel oder Leukoderivate, im besonderen:

- Bestimmte Derivate von Orthoaminophenol, wie sie in der Französischen Patentschrift 13 74 983 und dem Zusatz 84.324 beschrieben sind;
- bestimmte Derivate von 5,6-Dihydroxyindol und verwandten aminierten Verbindungen, wie sie beispielsweise in den Französischen Patentschriften 11 33 594, 11 66 172 und 12 64 707 beschrieben sind;
- bestimmte Leukoderivate, wie sie in den Französischen Patentschriften 20 56 799 und 21 74 473 beschrieben sind;
- bestimmte Basen, wie sie in den Französischen Patentschriften 14 73 843, 20 17 995 und 20 16 123 beschrieben sind;
b) Bestimmte Reduktionsverbindungen, die zur Dauerformänderung der Haare verwendet werden, beispielsweise alkalische Sulfite, Mercaptane und ihre Derivate, im besonderen solche, wie sie in den Französischen Patentschriften 11 75 560 und 20 05 648 beschrieben sind.

Ohne Superoxid-Dismutase erfolgt die Oxidation des Sulfits in diesem Fall zu dem Superoxid-Anionenradikal nach dem folgenden Reaktionsablauf:
SO&sub3; 2^- + 2 O&sub2; → 2 O&sub2; + SO&sub3;.
Die Bestrahlung organischer Basen, im besonderen der tertiären Amine, wie Triäthanolamin, die zur Neutralisierung kosmetischer Zubereitungen verwendet werden, die saure Harze enthalten (beispielsweise Carboxyvinylharze des Carbopoltyps oder des Vinylacetat-Crotonsäuretyps oder Harze, die Maleinsäureanhydrid-Grundeinheiten des Gantrez-Typs enthalten, begünstigt in Gegenwart von Sauerstoff die Bildung von Superoxidionen. Die Zugabe von Superoxid-Dismutasen ermöglicht die Zerstörung dieser Ionen und man vermeidet auf diese Weise die durch diese Ionen hervorgerufenen Oxidationsreaktionen.
Titanoxid und Zinkoxid, die in zahlreichen kosmetischen Zubereitungen verwendet werden, leiten Oxidationsreaktionen ein, wobei sie Superoxidionen bei Bestrahlung bilden.
Die Gegenwart von Superoxid-Dismutasen ermöglicht, diese Oxidation zu vermeiden.
Die vorliegende Erfindung ermöglicht also die Anwendung von Superoxid-Dismutasen-Enzymen in dem kosmetischen Bereich.
Diese Anwendung ist in erster Linie dadurch gekennzeichnet, daß man hygienische oder kosmetische Zubereitungen für die Haut oder für die Haare, die die angegebenen Enzyme enthalten, herstellt.
Bei der Anwendung der Erfindung übernehmen die Superoxid-Dismutasen hauptsächlich den Schutz lebender Keratinsubstanzen, die die Haut und Haare bilden. Diese Schutzrolle besteht einerseits darin, daß die Integrität der natürlichen Keratinstruktur der Haut des Haarbodens (Kopfhaut) oder der Haare, sei es in preventiver Weise oder als Verzögerung des Abbaus, beibehalten wird oder daß andererseits die Eigenschaften der Haut oder der Kopfhaut ihre Zartheit, Geschmeidigkeit und Elastizität beibehalten oder verbessert wird und weiterhin die Haut gegen schädliche Einflüsse, deren Ursprung bestimmten, im besonderen entzündlichen Reaktionen von Ultraviolett-Strahlen zuzuschreiben ist, schützt.
Bei der Anwendung nach der Erfindung können die Superoxid- Dismutasen ebenso die Rolle von Schutzmitteln für oxidierbare oder autooxidierbare Substanzen, die in den kosmetischen Zubereitungen vorhanden sind, übernehmen.
Weiterhin können die Superoxid-Dismutasen in Formulierungen eingebracht werden, die stark autooxidierbare Verbindungen enthalten, um die angegebenen Formulierungen gegen Oxidation zu schützen:

- entweder während ihrer Konservierung oder
- wenn man sie mit Keratinfasern bzw. -fibrillen und/ oder mit der Haut in Kontakt bringt, selbst wenn eine spätere Oxidationsstufe notwendig ist.

Es sind im besonderen zu erwähnen die Konservierung und die Verteilung von Farbzubereitungen auf den Haaren (Färbezubereitungen oder färbende Schampoonierungsmittel) auf der Basis von Verbindungen wie p. Phenylendiamin und seinen Derivaten, Ortho-aminophenolen (gegebenenfalls in Gegenwart von Direktfarbstoffen) um die vorzeitige Autooxidation zu vermeiden, die zu einem schlechten Eindringen der Pigmente in die Faser führt.
Es handelt sich im letzteren Falle darum, dieses Autooxidationsphänomen während der Verwendung der Zubereitung zeitlich zu verhindern und demgemäß zu verzögern.
In analoger Weise ermöglicht die Anwendung der Superoxid- Dismutasen nach der Erfindung den Schutz von Verbindungen des Leucoderivattyps und von Dihydroxyindolen vor der Endentwicklung der Färbung. Sie ermöglicht in gleicher Weise den Schutz der Reduktionsmittel auf Schwefelwasserstoffbasis bei ihrer Konservierung und ihrem Einsatz, die in der ersten Stufe bei der dauerhaften Formveränderung der Keratinfasern verwendet werden.
Die Erfindung betrifft in gleicher Weise hygienische oder kosmetische Mittel für die Haut oder für die Haare, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie wenigstens ein Superoxid-Dismutase-Enzym in einem geeigneten Excipienten enthalten.
Die nach der Erfindung verwendbaren Superoxid-Dismutasen- Enzyme können irgendeines Ursprungs, d. h. tierischen, bakteriellen- oder pflanzlichen Ursprungs sein.
Als Superoxid-Dismutasen, die nach der Erfindung verwendbar sind, sind im besonderen ohne Einschränkung zu erwähnen, die Extrakte von Bakterien, die Extrakte von Pilzen oder die Blutextrakte.
Als Superoxid-Dismutasen-Extrakte von Bakterien sind im besonderen zu erwähnen die Extrakte von Escherichia coli als Superoxid-Dismutasen-Extrakte von Pilzen sind im besonderen zu erwähnen die Extrakte von Pleurotus olearius und als Superoxid-Dismutasen-Extrakte von Blut sind im besonderen die Erythrocupreine zu erwähnen.
Weiterhin sind ebenso zu erwähnen die Superoxid-Dismutasen-Extrakte von Meerbakterienstämmen, wie beispielsweise Stämmen von Photobacterium phosphoreum, Photobacterium leiognathi und Photobacterium sepia.
Von den verschiedenen zur Verfügung stehenden Stämmen sind zu erwähnen die Stämme von Photobacterium phosphoreum ATCC 11040, von Photobakterium leiognathi ATCC 25521, Photobacterium sepia ATCC 15709, und Escherichia coli ATCC 15224.
Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Superoxid- Dismutasen können unter Verwendung der bereits in der Literatur beschriebenen Verfahren hergestellt werden.
Die Superoxid-Dimutasen-Extrakte von Meerbakterienstämmen können nach dem in der DE-OS 24 17 508 beschriebenen Verfahren hergestellt werden. Dieses Verfahren wurde oben beschrieben.
Die kosmetischen Mittel der Erfindung für die Haut sind im besonderen Lösungen des Lotionstyps, Emulsionen von liquider oder halbliquider Konsistenz des Milchtyps, die man durch Dispersion einer Fettphase in einer wäßrigen Phase oder umgekehrt, erhält, oder Suspensionen oder Emulsionen weicher Konsistenz in Form von Cremes oder Gelen.
Diese kosmetischen Mittel werden nach den üblichen Verfahren hergestellt. Sie sind im besonderen Cremes zur Reinigung, zum Schutz oder zur Pflege für das Gesicht, für die Hände oder für den Körper (beispielsweise Tagescremes, Nachtcremes, Abschminkcremes (Reinigungscremes), Cremes als Schminkunterlage, Sonnenschutzcremes), flüssige Schminkunterlagen, Milch zum Abschminken, Milch zur Körperbehandlung, zum Schutz oder zur Pflege Sonnenschutzmilch, Lotionen zur Reinigung, Sonnenschutzlotionen, Lotionen zur künstlichen Bräunung, Badezusätze oder Geruchsbeseitigungsmittel (Desodorantien, die ein bakterizides Mittel enthalten).
Die kosmetischen Mittel für die Haut nach der Erfindung können ebenso als feste Zubereitungen in Form von Seifen oder anderen festen Reinigungsmitteln dargeboten werden.
Die kosmetischen Mittel für die Haut, die flüssiger Natur sind, können in Form von Aerosolbehältern dargeboten werden, die ebenso ein Treibmittel unter Druck enthalten.
Die kosmetischen Mittel für die Haut nach der Erfindung enthalten außer den Superoxid-dismutasen Wirkstoffe oder Excipienten, die in üblicher Weise in den oben erwähnten Formulierungen verwendet werden, wie oberflächenaktive Mittel, Farbstoffe, Parfums, Konservierungsmittel, Emulgierungsmittel, flüssige Träger wie Wasser, Fettgrundlagen, wie natürliche oder synthetische Öle, die dazu bestimmt sind, die Fettphase der Milch oder der Cremes zu bilden, Harze des Carboxyvinyltyps oder des Maleinsäureanhydrids, die durch tertiäre Amine und im besonderen durch Aminoalkohole, wie Triäthanolamin usw. neutralisiert sind. Die Verbindungen, die dazu geeignet sind, eine Fettphase zu bilden, sind beispielsweise Mandelöl, "l&min;huile d&min;avocat", Olivenöl, Ester von Fettsäuren, wie Stearin, Glyzerinmonostearat oder "l&min;huile de Purcellin", Äthyl- oder Isopropylpalmitate, Alkylmyristate, wie die Propyl-, Butyl- oder Cetylmyristate. Man kann weiterhin Fettalkohole wie Cetylalkohol, polyoxyäthylierte Fettalkohole oder Wachse, wie beispielsweise Bienenwachs oder synthetische Wachse usw. zugeben.
Die kosmetischen Mittel für die Haare nach der Erfindung können in Form wäßriger, alkoholischer oder wäßrigalkoholischer Lösungen oder in Form von Cremes, Gels, Emulsionen oder weiterhin in Form von Aerosolbehältern, die ebenso ein Treibmittel unter Druck enthalten, dargeboten werden.
Sie beinhalten die Superoxid-Dismutasen entweder als hauptsächlichen Wirkstoff oder als Schutzmittel gegen die Oxidation der anderen Bestandteile.
Außer den klassischen Wirkstoffen können die Kosmetika verschiedene Adjuvantien enthalten, die üblicherweise in diesen Zubereitungen für die Haare enthalten sind, beispielsweise Träger in flüssiger oder in Gelform, Parfums, Farbstoffen, Konservierungsmitteln, Sequestrierungsmitteln, Eindickmitteln usw.
Sie werden beispielsweise dargeboten als Schampoos, Lotionen für Wasserwellen, Behandlungslotionen, Frisiercremes oder -gels, Färbungs- oder Tönungszubereitungen (im besonderen für Oxidationsfärbungen) gegebenenfalls in Form von Färbungs- oder Tönungsschampoos, Lotionen für angegriffenes Haar, Zubereitungen für Dauerwellen (insbesondere Zubereitungen für die erste Zeit einer Dauerwelle (Festiger) usw.
Die Zubereitungen der Erfindung sind beispielsweise:

- Schampoos, die außer einer Superoxid-dismutase ein kationisches, anionisches oder nicht-ionisches Detergens enthalten;
- Färbezubereitungen, die Schampoonierungsfarbstoffe enthalten, wobei diese wiederum Farbstoffe oder Farbstoffprekursoren enthalten, wie sie bereits erwähnt wurden, wie beispielsweise m-Diaminoanisolsulfat, o-, m- oder p-Aminophenol, Nitroparaphenylendiamin, Paraphenylendiamin, p-Toluoldiamin, 5,6-Dihydroxyindol usw.;
- Zubereitungen für die erste Zeit (Reduktionszeit) einer Dauerformänderung der Haare, die reduzierende Derivate wie Mercaptane, Sulfite usw. enthalten.

Es ist darauf hinzuweisen, daß die kosmetischen Mittel nach der Erfindung sowohl gebrauchsfertige Zubereitungen als auch Konzentrate sind, die vor der Verwendung verdünnt werden müssen. Die kosmetischen Mittel die in Form von Konzentraten dargeboten werden, sind beispielsweise Schampoos und Badezusätze. Die Zubereitungen der Erfindung sind demgemäß nicht auf einen bestimmten Konzentrationsbereich hinsichtlich der Superoxid-Dismutasen eingeschränkt.
Es ist jedoch darauf hinzuweisen, daß im allgemeinen die gebrauchsfertigen Zubereitungen 0,01 bis 5 Gew.-% und insbesondere 0,05 bis 1 Gew.-% Superoxid-Dismutase enthalten.
In den Fällen wo der zu schützende oxidierbare Bestandteil einer beschleunigten Zersetzung in Gegenwart von Keratinfasern und/oder von Haut unterliegt, kann diese allein durch Superoxid-Dismutase in wäßrig verdünnter Lösung oder konzentriert oder in Komplexform oder Lyophilisatform konserviert werden, oder es kann die Superoxid-Dismutase den anderen Bestandteilen der Zubereitung zum Zeitpunkt der Verwendung zugegeben werden.
Gleichfalls kann, sofern die Superoxid-Dismutase zu dem Zweck verwendet wird, die Eigenschaften der Haut oder der Haare beizubehalten oder zu verbessern, diese der Zubereitung zum Zeitpunkt der Verwendung zugegeben werden.
Die Zubereitungen der Erfindung können demgemäß hinsichtlich der Konditionierungsform in mehreren Teilen dargeboten werden, wobei ein Teil die Superoxid-Dismutase und der andere Teil die anderen Bestandteile der Zubereitung enthält. Wie oben angegeben, kann die Superoxid-Dismutase beispielsweise in Form einer wäßrigen Lösung als Komplex oder Lyophilisat konserviert werden.
Die kosmetische Behandlung kann in der Weise durchgeführt werden, daß man die hygienischen oder kosmetischen Zubereitungen, wie oben definiert, nach den üblichen Verwendungsverfahren dieser Zubereitungen aufträgt. Beispielsweise durch Auftragen von Cremes, Reinigungsmilch (zum Entschminken) oder Sonnenschutzzubereitungen auf der Haut, Anwendung einer Haarlotion auf den angefeuchteten Haaren, Schamponieren usw.
Die kosmetische Behandlung findet in der Weise statt, daß man eine wirksame Menge Superoxid-Dismutase aufträgt, d. h. eine ausreichende Menge, um die gewünschte Schutzwirkung zu erzielen.
Diese kosmetische Behandlung hat das Ziel entweder die Keratinstruktur der Haut oder der Haare zu erhalten oder die Eigenschaften der Haut (ihre Zartheit, Geschmeidigkeit, Elastizität) beizubehalten oder zu verbessern oder die Haut gegen schädliche Wirkungen von ultravioletten Strahlen zu schützen.
Die nachfolgenden Beispiele erläutern die Erfindung, ohne sie dadurch einzuschränken. Die Beispiele 1-3 dienen ausschließlich dem Zweck, das Verfahren zur Herstellung von Superoxid-Dismutasen-Extrakten von Bakterien, die dem Meer entstammen, zu erläutern, Verfahren die in der DE-OS 24 17 508 beschrieben sind.

Beispiel 1

Man kultiviert Bakterien Photobacterium leiognathi, Stamm Nr. ATCC 25 521, auf einem synthetischen Medium, das in g pro Liter enthält:
°=c:100&udf54;&udf53;vu10&udf54;@I&udf50;@1NaCl@330¤g/l&udf50;@1NaÊHPOÈ, 12¤HÊO@318,7&udf50;@1KHÊPOÈ@3Æ2&udf50;@1MgSOÈ, 7¤HÊO@3Æ0,2&udf50;@1(NHÈ)ÊHPOÈ@3Æ0,5&udf50;@1Glucose@3Æ1,5&udf50;@1Glycerin@3Æ1,5&udf50;@1Trypticase@3Æ5&udf50;@1Hefeextrakt@3Æ5&udf53;zl10&udf54;@0
Man bringt das Medium mit Natriumhydroxid auf pH 7,2 und sterilisiert es 1 Stunde bei 110°C.
Man verwendet das Gemisch für eine Vorkultur von 1 Liter, bewegt diese über Nacht und teilt sie in 4 Erlenmeyerkolben auf, von denen jeder 250 ml Medium enthält, um damit einen Fermentationsbehälter mit 12 Liter Medium zu impfen.
Man hält die Kultur 12 Stunden bei 20°C unter starker Belüftung und erhält auf diese Weise 100 g Bakterien, wobei sich das Gewicht auf das angefeuchtete Produkt bezieht.
Man dispergiert 135 g (Naßgewicht) Bakterien, Photobacterium leiognathi, die aus mehreren Kulturen in 650 ml Wasser herrühren und läßt sie über Nacht bei 4°C stehen. Man gibt 2N Ammoniak zu, um den pH-Wert des Mediums auf 7,5 zu bringen und gibt danach 18 ml 3M KCl zu.
Man bringt das Gemisch auf 58°C und behält diese Temperatur 4 Minuten bei, wonach man auf 4°C abkühlt und 10 Minuten mit 10 000 UpM zentrifugiert. Während man immer bei 4°C arbeitet, stellt man die überstehende Schicht auf 35% Sättigung mit festem Ammoniumsulfat, pH 8, ein. Man zentrifugiert nochmals und bringt die überstehende Schicht auf 75% Sättigung mittels Ammoniumsulfat und läßt sie eine Nacht bei 4°C ruhen. Man gewinnt das ausgefällte Protein durch Zentrifugieren und lagert es in einer 75%igen Ammoniumsulfatlösung.
Die Aktivität einer Lösung von 9 mg Protein pro ml (Biuret) war 40 Einheiten/mg, während sie zu Vergleichszwecken 0 Einheit/mg für die Katalase von 9 mg Protein/ml in Lösung betrug.
Nach einer erneuten fraktionierten Ausfällung mit Hilfe von Ammoniumsulfat mit einem Konzentrationsgradient von 35-75% der Sättigung, erhält man eine Superoxid-Dismutase in Lösung mit 14,8 mg Protein/ml (Biuret) mit einer Aktivität von 134 Einheiten/mg bis 500 Einheiten/mg.
Man löst die Proteinausfällung in Phosphatpuffer pH 7,8 und dialysiert 48 Stunden bei 4°C. Man lagert das Superoxid-Dismutase-Enzym bei -20°C.
Um dessen Aktivität zu bestimmen, verwendet man ein Gefäß vor einem Photomultiplier und verschließt darin das nachfolgende Reaktionsgemisch: °=c:60&udf54;&udf53;vu10&udf54;@1Luminol@210°H^3°hM@30,3¤ml&udf50;@1Phosphatpuffer@210°H^3°hM pH 7,8@30,3¤ml&udf50;@1EDTA@210°H^3°hM@30,3¤ml&udf50;@1Wasser@31,0¤ml&udf50;@1Xanthinoxidase (1¤mg/ml)@30,050¤ml&udf53;zl10&udf54;@0
Man leitet die Reaktion dadurch ein, daß man in den Behälter 1 ml Hypoxanthin 3×10^-4M einspeist.
Dadurch wird ein Photonenfluß emittiert, der unter der Einwirkung des Photomultipliers einen Strom entstehen läßt, dessen Intensität man mit dem Picoamperemeter mißt, wobei man gleichzeitig die Änderungen der Intensität registriert.
Führt man in das Reaktionsgemisch nach Einleitung der Reaktion 5 µl einer Lösung von Superoxid-Dismutase, hergestellt wie vorausgehend angegeben, ein, so erhält man eine Inhibierung der Lichtemission und man kann in willkürlicher Weise festsetzen, daß die Einheit Superoxid-Dismutase-Enzym die Enzymmenge ist, die eine 50%ige Inhibierung der Lichtemission bewirkt.
Bei UV-Spektroskopie liefert das Superoxid-Dismutase-Extrakt das klassische Spektrum der nicht haematischen Proteine mit der Tryptophanschulter bei 290 mµ.
Um das Molekulargewicht zu bestimmen, verwendet man zwei bekannte Verfahren, wobei man im einen das Molekulargewicht durch Zentrifugation in einem Sacharosedichtegradienten bestimmt und bei dem anderen das Molekulargewicht durch Chromatographie über ein Sephadex® G 200 Gel bestimmt.
Hierzu wurden die folgenden Eichsubstanzen verwendet, deren Molekulargewicht (Mol-Gew.) bekannt ist. °=c:40&udf54;&udf53;vu10&udf54;@3Mol-Gew.&udf50;@1ADH aus Hefe@3150¤000&udf50;@1Rinderalbumin@3Æ66¤000&udf50;@1Peroxidase@3Æ40¤200&udf53;zl10&udf54;@0
Daraus ist auf ein Molekulargewicht von 40 000±2500 zu schließen. Um die Untereinheiten der Proteinstruktur des Enzyms zu bestimmen, führt man eine Elektrophorese in einem Polyacrylamidgel, dem 10% Natriumdodecylsulfat zugegeben wurden, durch.
Man beobachtet eine einzige Art von Untereinheiten mit einem Molekulargewicht von etwa 21 000. Das Molekulargewicht der erhaltenen Superoxid-Dismutase kann demgemäß mit 21 000×2=42 000 bestimmt werden.
Immer erhält man über dem Polyacrylamidgel eine rote Bande in Gegenwart von Bathophenanthrolin und Hydrazin, genau in der Höhe der Bande der Superoxid-Dismutase bei Entwicklung mit "Coomassie"-Blau.
Bei Durchführung einer kolorimetrischen Dosierung einer Proteinlösung erhielt man für das Eisen einen Wert, der bei Einschätzung des Molekulargewichts des Enzyms mit 42 000 etwa 2 Atome Eisen pro Molekül ergibt.
Durch eine Spektrometrie der Atomabsorption einer Proteinlösung von 0,2 mg/ml wurde dieser Wert bestätigt.
Man kann demgemäß mit Recht die Anzahl der Eisenatome pro Molekül dieser Superoxid-dismutase mit 2 bewerten.
Übrigens unterliegt der Enzymextrakt nach diesem Beispiel keinem merklichen Aktivitätsverlust nach 5 Minuten bei einer Temperatur von 70°C.
Eine Elektrofokussierung der Superoxid-Dismutase ermöglichte den pH oder den isoelektrischen Punkt dieses Enzyms mit 4,4 zu bestimmen.
Das Enzym wies eine maximale Aktivität bei einem pH-Wert von etwa 9,5 auf.
Man erhält ein ähnliches Enzym mit ähnlichen Eigenschaften, wenn man als Ausgangsmaterial einen Bakterienstamm von Photobacterium leiognathi Nr. ATCC 25 587 verwendet.

Beispiel 2

Man unterwirft eine Bakterienkultur von Photobacterium sepia, Stamm Nr. ATCC 15 709, einer Lyse, wozu man sie in kaltem Wasser rührt, im Verhältnis von 1 g Naßgewicht Bakterien pro 4 ml Wasser. Dann zentrifugiert man mit 16 000 UpM 20 Minuten bei 4°C. Man gibt zu dem klar-gelben Überstehenden KCl 3M bis zu einer Endkonzentration von 0,1M zu.
Dann erhitzt man die Lösung 3-4 Minuten in einem auf 60°C gebrachten Wasserbad. Man kühlt die Lösung dann auf 4°C ab und klärt sie durch Zentrifugieren.
Man unterwirft die überstehende Schicht einer fraktionierten Ausfällung durch Zugabe von festem Ammoniumsulfat. Die aktive Fraktion fällt man mit einer Sättigung zwischen 45 und 75% in Ammoniumsulfat aus und trennt sie durch Zentrifugieren ab; man löst sie erneut in einem minimalen Volumen K&sub2;HPO&sub4; 5×10^-3M, pH 7,8 und dialysiert über Nacht gegen den gleichen Phosphatpuffer. Das Produkt dieser Dialyse führt man dann in eine Säule mit Sephadex® G 100 oder G 200 ein, equilibriert mit Phosphatpuffer 5×10^-3M, pH 7,8. Man konzentriert die eluierte aktive Fraktion mit Hilfe einer Ultrafiltrationsmembrane Diaflo PM-10 und dialysiert dann über Nacht gegen K&sub2;HPO&sub4; 5+10^-3M, pH 7,8.
Man absorbiert das Superoxid-Dismutase-Enzym auf eine DEAE-Sephadex® A-50 Säule, gepuffert mit K&sub2;HPO&sub4; 5×10^-3M, pH 7,8, eluiert dann das Protein mit einem linearen Gradienten K&sub2;HPO&sub4;, pH 7,8 (von 5×10^-3M bis 3×10^-1M). Die Superoxid-Dismutase eluiert man auf diese Weise bei einer Phosphatkonzentration von 1,4×10^-1M und konzentriert dann. Man führt eine erneute Chromatographie unter denselben Bedingungen wie vorausgehend beschrieben, mit einer DEAE-Sephadex® A-50 Säule durch. Auf diese Weise eluiert man das Enzym bei einer Phosphatkonzentration von 1,6×10^-1M, wonach man konzentriert.
Das auf diese Weise extrahierte und gereinigte Protein liefert eine einzige Bande bei der Elektrophorese in Acrylamidgel (100 µg Protein in einem Gel).
Man erhält auf diese Weise 3 mg reine Superoxid-Dismutase von 20 g gefrorenen Zellen von Photobacterium sepia als Ausgangsmaterial mit einer Superoxid-Dismutase-Aktivität von 250-5000 Einheiten/mg.
Das aktive Enzym hält sich über eine längere Zeitdauer, wenn man es in einer Lösung von 70-80% (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; bei 4°C lagert.
Das Molekulargewicht des gereinigten Enzyms wurde mittels Ultrazentrifugation bei 45 000 Upm während 16 Stunden bei 4°C bestimmt. Die Geschwindigkeit der Sedimentation wurde nach dem Verfahren von Martin und Ames mit einem linearen Sacharosegradienten von 5-20 (Gew./Volumen) gemessen, wozu man eine Beckman-Spinco-Vorrichtung Modell L2-65B mit einem Rotor SW 65K verwendet. Gefunden wurde ein Sedimentationskoeffizient von 3,2 für diese Dismutase gegen einen Koeffizienten von 4,82 bzw. 7,4 für Dehydrogenasenalkohole von Pferdeleber und Hefepilzen. Auf der Basis dieser Sedimentationskonstanten wurde dann das Molekulargewicht des Superoxid-dismutase-Extraktes mit etwa 42 500 errechnet.
Andererseits wurde festgestellt, daß das Molekül dieses Proteins 2 Atome Eisen enthält.
Die Elektrophorese in Acrylamidgelen lieferte für Dismutase eine einzige Bande, die einem Molekulargewicht von 20 000 bis 20 500 entspricht, woraus sich ergibt, daß das Proteinmolekül aus zwei gleichen Untereinheiten zusammengesetzt ist.
Es wurde im übrigen festgestellt, daß die Superoxid-Dismutase sehr widerstandsfähig ist gegen die proteolytische Wirkung von Trypsin, da eine 60 Minuten-Behandlung von 150 µg dieser Superoxid-Dismutase mit 10 µg Trypsin bei 20°C keine Änderung der enzymatischen Aktivität, auch nicht hinsichtlich der elektrophoretischen Mobilität des nicht dissozierten Proteins ergab.
Das erhaltene Enzym war sehr stabil gegenüber Wärme. Es trat kein enzymatischer Aktivitätsverlust nach 30 Minuten bei 20°C, 30°C oder selbst 40°C ein; nach 15 Minuten bei 50°C tritt eine Verringerung der Aktivität von 28% auf; nach 30 Minuten bei 50°C war der Aktivitätsverlust noch immer nur 50% und nur 10% und 50% nach 3 bzw. 10 Minuten bei 60°C.
Eine Elektrofokussierung der Superoxid-Dismutase ermöglicht den isoelektrischen Punkt dieses Enzyms mit 4,1 zu bewerten.
Es wurde festgestellt mittel seiner O&sub2;-Ionenlösung, die auf elektrolytischem Wege hergestellt wurde, daß das Enzym eine maximale Aktivität bei einem pH-Wert von 8,5 bis 10 mit einem Optimum bei pH 9,5 aufwies.

Beispiel 3

Man behandelt einen Bakterienstamm Nr. ATCC 11040 Photobacterium phosphoreum, die Meerbakterien sind und demzufolge eine starke interne Salzlösungskonzentration haben.
Die Lyse erfolgte spontan in einer Lösung von EDTA 10^-3M, pH 7,8.
Man entfernt die Zellbestandteile durch 20 Minuten langes Zentrifugieren mit 16 000 UpM bei 0°C.
Die vorbereitenden Untersuchungen haben gezeigt, daß das Superoxid-Dismutase-Enzym bei 50°C stabil war und man entfernt demgemäß die anderen Proteine, die als solche thermolabil sind, wozu man das Lysat 3 Minuten auf 50°C nach Zugabe von KCl bis zu einer Molarität von 0,1 bringt und man trennt die denaturierten Proteine durch klassisches Zentrifugieren ab.
Man arbeitet dann bei 4°C. Bei dieser Temperatur führt man eine fraktionierte Ausfällung mit Hilfe von Ammoniumsulfat in einer solchen Menge durch, daß das behandelte Gemisch oder der behandelte enzymatische Extrakt auf einem Konzentrationsgradient von 0 bis etwa 30% der Sättigung bei 4°C gebracht wird. Man entfernt die ausgefällte Fraktion durch 45 Minuten langes Zentrifugieren mit 16 000 UpM bei 0°C.
Dann gibt man zu dem Überstand die erforderliche Ammoniumsulfatmenge, um eine 75%ige Sättigung bei 4°C zu erhalten. Die ausgefällte Fraktion vereinigt man wieder durch ein wie oben beschriebenes Zentrifugieren.
Zur Reinigung der so erhaltenen Superoxid-Dismutase löst man die gesammelte Ausfällung in ein wenig Phosphatpuffer 5×10^-3M, pH 7,8 und dialysiert gegen den gleichen Puffer 48 Stunden bei 4°C, wodurch man ein Extrakt (A) erhält.
Die noch vorhandenen Proteine trennt man entsprechend der Größe ihrer Moleküle mit Hilfe eines Sephadex® G 100 Gels dessen Kornvernetzung eine solche ist, daß sie Proteine mit einem Molekulargewicht über 100 000 ausschließt, die demgemäß sehr schnell am Säulenende austreten. Die Moleküle, deren Molekulargewicht geringer ist, dringen in das Gel ein und werden mehr oder weniger schnell entsprechend ihrer Größe eluiert.
Um dies zu erreichen, läßt man das Sephadex-Harz 3 Stunden in Wasser quellen, entgast und filtriert über ein Büchner-Filter, um das Wasser zu entfernen; man gibt das Harz in Chromatographiepuffer und gießt es in eine Säule mit einer Länge von 50 cm und einem Innendurchmesser von 3 cm. Die Säule equilibriert man mittels Durchleiten von 2 Liter Puffer.
Vorausgehend hat man den enzymatischen Extrakt (A), wie er von der Dialyse anfällt, über eine Diaflo-Milliporemembrane (Mol-Gewicht -10) unter Stickstoffdruck auf ein Volumen von 5 ml konzentriert. Dieses Konzentrat gibt man auf die, wie oben angegeben, vorbereitete Säule und eluiert mittels Durchleiten von 500 ml Phosphatpuffer 5×10^-3M, pH 7,8. Die Durchflußleistung beträgt ein Tropfen alle 8 Sekunden und man sammelt die Fraktionen von 2,5 ml, die, da sie eine hervorragende Aktivität haben, vereinigt und über eine Diaflo-Membrane konzentriert werden. Man erhält auf diese Weise einen konzentrierten Extrakt (B).
Man führt eine neue Reinigungsstufe mittels Chromatographie über ein Ionenaustauscherharz auf der Basis von DEAE Sephadex® durch, ein Harz, über dem die Proteine entsprechend ihrer Ladung durch Puffer zunehmend ionischer Stärke eluiert werden.
Um die Säule herzustellen, läßt man das Harz in Wasser quellen, führt dann eine Entgasung durch und wäscht in den folgenden Lösungen: °=c:30&udf54;&udf53;vu10&udf54;@1NaOH@20,5¤M&udf50;@1KHÊPOÈ@20,5¤M&udf50;@0&udf53;vu10&udf54;wobei man das Harz zwischen jeder Stufe mit destilliertem Wasser spült, bis man einen pH nahe der Neutralität erreicht. Nach Filtrieren über ein Büchner-Filter bringt man das Harz in Phosphatpuffer 0,1 M, pH 7,8 in Suspension und gibt es in eine Säule von 30 cm Länge mit 3 cm Innendurchmesser. Die Säule equilibriert man dadurch indem man 300 ml Puffer 0,1 M durchleitet.
Man gibt den konzentrierten Extrakt (B) über die so hergestellte Säule. Nach dem dieser Extrakt vollständig absorbiert ist, eluiert man ihn mit 500 ml Phosphatpuffer pH 7,8, wobei dieser gebildet ist aus 250 ml Phosphatpuffer 0,1 M, dem man fortschreitend 250 ml Phosphatpuffer 0,5 M zugibt. Die Durchflußleistung ist ein Tropfen alle 5 Sekunden und das Volumen der gesammelten Fraktionen beträgt 2,5 ml. Die aktiven Fraktionen gibt man zusammen, fällt sie mittels Ammoniumsulfat aus und lagert sie in dieser Form bei -18 bis -20°C.
Die Reinheit des Superoxid-Dismutase-Enzyms wurde durch Elektrophorese in Polyacrylamidgel geprüft.
Eine Bestimmung des Molekulargewichts des Enzyms mit Hilfe einer Eluierungsuntersuchung nach einer Filtrierung über Sephadex® G 200 ermöglicht, mit Hilfe der Gleichung Log(Mol-Gewicht)=f (Elutionsvolumen) und bekannter Eichsubstanzen dem Superoxid-Dismutase-Extrakt ein Molekulargewicht von etwa 40 000 zuzuteilen.
In gleicher Weise wurde dieses Molekulargewicht durch eine Zentrifugation in einem Saccharosedichtegradienten festgestellt.
Man gießt Saccharosegradienten von 5 bis 20% in Phosphatpuffer 5×10^-3M, pH 7,8, wobei man fortschreitend 2,60 ml der 20%igen Lösung zu 225 ml der 5%igen Lösung in einer geeigneten Vorrichtung mischt.
In diese Saccharosegradienten gibt man unterschiedliche Proteineichsubstanzen mit bekannten Molekulargewicht und die Superoxid-Dismutase. Man stellt das Gleichgewicht her durch Zentrifugieren mit 45 000 UpM bei 5°C während 22 Stunden. Dann durchlöchert man die Röhrchen am Boden und sammelt Fraktionen von 10 Tropfen, bei denen man die durch die unterschiedlichen verwendeten Eichsubstanzen vorliegende enzymatische Aktivität mißt. Nach dem man die Gerade, die die Änderung des Molekulargewichts als Funktion der Zahl der Eluierungsfraktion angibt, aufgezeichnet hat, bewertet man das Molekulargewicht des Superoxid-Dismutase-Extrakts von Photobacterium phosphoreum mit etwa 40 000, was das voraus erhaltene Ergebnis bestätigt.
Um das Molekulargewicht der Proteinuntereinheiten zu bestimmen, unterwirft man dieses sowie Eichsubstanzen, deren Molekulargewicht der Untereinheiten bekannt sind, einer elektrophoretischen Wanderung in Polyacrylamidgel in Gegenwart von Natriumdodecylsulfat. Die grafische Darstellung der gefundenen Werte ermöglicht, als Molekulargewicht jeder Untereinheit des Superoxid-Dismutase-Moleküls einen Wert von 20 000 zuzuteilen.
Es wurde festgestellt, daß dieses noch bei 50°C sehr stabil ist und eine maximale enzymatische Aktivität bei einem pH-Wert von etwa 9,5 aufweist.
Eine Elektrofokussierung der Superoxid-dismutase führte zu einem pHi oder isoelektrischen Punkt dieses Enzyms von 4,2.
Eine colorimetrische Untersuchung, wie sie vorausgehend beschrieben wurde, ermöglichte, die Gegenwart von zweiwertigem Eisen in dem Protein festzustellen, wobei ein rosa Ring in der Höhe der Proteinbande in dem elektrophoretischen Migrationsgel, dem vorausgehend Bathophenanthrolin zugegeben wurde, erschien. Die Anzahl der zweiwertigen Eisenatome pro Molekül wurde praktisch mit 2 bewertet.

Beispiel 4

Untersuchung der Photoschutzwirkung

Diese Untersuchung wurde mit einem XENON, U. V. Solar Simulator durchgeführt, der von der Solar Light Company, Philadelphia, USA, auf den Markt gebracht wird.
Das Licht wird von einer XENON-Lichtbogenlampe 250 W mit einem der Sonne ähnlichen Spektrum erzeugt. Die Wellenlängen liegen im Bereich von 285 nm bis 410 nm.
Die Bestrahlung mit dem Spektrum ermöglicht ein Solarerythem zu reproduzieren. Man bezeichnet als MED (minimale Erythemdosis) die minimale Bestrahlungszeit, die 24 oder 48 Stunden nach Aussetzen ein Erythem liefert. Dieser Wert wird in Sekunden angegeben.
Die Bestrahlung wird auf Teilen der Rückenhaut von Versuchspersonen vorgenommen.
Durch Abstufen der Belichtungszeit bestimmt man zunächst die MED.
Jede Person unterwirft man dann einer Bestrahlung von 5 MED, wobei bestimmte bestrahlte Zonen der Haut vorausgehend durch die Aufbringung des zur Untersuchung vorgesehenen Produkts behandelt wurden, das mit einem Excipienten zur Bildung einer Creme gemischt wurde. Bestimmte bestrahlte Teile der Haut wurden in der Weise behandelt, daß man ausschließlich den Excipienten aufträgt. Gleichzeitig bewirkt man die Bestrahlung eines Teils unbehandelter Haut.
Das zur Untersuchung vorgesehene Produkt ist eine Superoxid-dismutase, wie man sie nach Beispiel 1 erhält.
Man bewertet subjektiv die Intensität des Erythems durch Ablesen 24 oder 48 Stunden nach Belichtung.
Ein schwaches Erythem bezeichnet man mit + und ein intensives Erythem mit ++. Das Fehlen eines Erythems wird mit 0 angegeben. Die erhaltenen Ergebnisse sind der nachfolgenden Tabelle zu entnehmen: °=c:90&udf54;H&udf53;vu10&udf54;&udf53;ta1,6:12,6:21,6:30,6:37,6&udf54;&udf53;tz5,5&udf54; H@&udf53;tw,4&udf54;&udf53;sg8&udf54;\Behandlung\ nicht behandelte Haut\ Excipient allein\ untersuchtes Produkt&udf50;+ Excipient&udf53;tz5,10&udf54; &udf53;tw,4&udf54;&udf53;sa21&udf54;&udf53;sg9&udf54;\Person 1\ ++\ ¸+\ 0&udf53;tz&udf54; \Person 2\ ++\ ++\ +&udf53;tz&udf54; \Person 3\ ++\ ++\ +&udf53;tz&udf54; &udf53;te&udf54;@0&udf53;vu10&udf54;

Beispiel 5

Autooxidation von p-Phenylendiamin

Man stellt eine wäßrige Lösung, 10^-3 molar, von p-Phenylendiamin in Phosphatpuffer pH 8,6 her. Die optische Dichte der gemessenen Lösung bei 520 nm nach 2 Stunden ist 0,07. Die gleiche Lösung hat, wenn sie 10 Einheiten pro ml Enzym, hergestellt wie in Berlin 1, enthält, eine optische Dichte von 0,036, was einer 49%igen Inhibierung entspricht.

Beispiel 6

Autooxidation von 5,6-Dihydroxyindol

Man stellt eine Lösung, 6,7×10^-5 molar, von 5,6-Dihydroxyindol in Phosphatpuffer, pH 7,8 her. Die optische Dichte der Lösung, gemessen bei 330 nm, nimmt um 0,1 Einheiten pro Minute zu. In Gegenwart von 407×10^-9 g pro ml Enzym, wie in Beispiel 5 angegeben, erhöht sich die optische Dichte um 0,062 Einheiten pro Minute, was einer 38%igen Inhibierung entspricht.

Beispiel 7

Autooxidation von 1,2,4-Trihydroxybenzol

Man stellt eine 10^-3 molare wäßrige Lösung von 1,2,4-Trihydroxybenzol her. Man gibt 1 ml dieser Lösung zu einem ml Phosphatpuffer, pH 7,8. Die optische Dichte dieser Lösung, gemessen bei 480 nm, erhöht sich mit 0,375 Einheiten pro Minute.
Durch Zugabe von:

2×10^-6 g pro ml Enzym, wie in Beispiel 5 definiert, erhöht sich die optische Dichte um 0,09 Einheiten pro Minute, was einer 76%igen Inhibierung entspricht. 4×10^-6 g pro ml Enzym, erhöht sich die optische Dichte um 0,064 Einheiten pro Minute, was einer 83%igen Inhibierung entspricht.
40×10^-6 g pro ml Enzym, erhöht sich die Dichte um 0,023 Einheiten pro Minute, was einer 96,5%igen Inhibierung entspricht.

Beispiel 8

Autooxidation von ortho-Aminophenol

Man stellt eine wäßrige Lösung 5×10^-3 molar Orthoaminophenol her. Man stellt eine Lösung her, die

1 ml zweimal destilliertes Wasser
1 ml der oben angegebenen Lösung, und
1 ml Phosphatpuffer pH 9,2

Man folgt der optischen Dichte dieser Lösung bei 430 nm; nach 15 Minuten ist sie 0,22.
Durch Zugabe von 2,7×10^-6 g pro ml Enzym, hergestellt wie in Beispiel 1, ist die optische Dichte nach 15 Minuten 0,02, was einer 91%igen Inhibierung entspricht. Nach Zugabe von 27×10^-6 g pro ml, ist die optische Dichte 0,01= 96%ige Inhibierung.

Beispiel 9

Inhibierung der Autooxidation von Triäthanolamin.

Triäthanolamin ist eine der organischen Basen, die häufig zur Neutralisierung von kosmetischen Zubereitungen verwendet werden, die saure Harze, beispielsweise Acrylsäurepolymerisate enthalten.
Die tertiären Amine dieser Art bilden Ladungsübertragungskomplexe mit Sauerstoff und diese Komplexe dissozieren unter Einwirkung von Lichtstrahlen unter Bildung bedeutender Mengen von Superoxidionen. Diese Ionen können Peroxidationen in den kosmetischen Formulierungen, die sie enthalten, hervorrufen. Diese Peroxide, im besonderen sofern sie von ungesättigten Fettlipoiden abstammen, die häufig in den kosmetischen Zubereitungen vorhanden sind, beispielsweise Oleinalkohol, haben eine toxische Wirkung und es ist wünschenswert ihre Bildung zu inhibieren.
Verwendet man als Superoxidionen-Entwicklungsmittel Nitrotetrazolium Blau (NBT), wie von I. Friodovich und CH. Beauchamp in Analytical Biochemistry 44, Seite 276 (1971) beschrieben, so ist festzustellen, daß man durch Zugabe von Superoxid-Dismutase (abgekürzt: SOD) zu einer wäßrigen Lösung von Triäthanolamin wesentlich die Bildung von Superoxidionen inhibieren kann. Die verwendete SOD ist die von Beispiel 1.
Die Inhibierung der Bildung von Superoxidionen bewertet man durch Messen der optischen Dichte bei 560 nm und ihre Entstehung als Funktion der Bestrahlungszeit. Bei einer Konzentration von 0,4% Triäthanolamin beobachtet man eine bedeutende Inhibierung bei Konzentrationen an SOD in der Größenordnung von 10^-2 bis 10^-1 mg/cm³. Man erhält die gleichen Ergebnisse, wenn man das in Beispiel 1 erhaltene SOD durch eine äquivalente Menge SOD-Extrakt von Eschierichia coli oder pleurotus olearius ersetzt.

Beispiel 10

Inhibierung der Autooxidation von TiO&sub2;

Bestimmte Verbindungen von Titanoxid oder Zinkoxid führen bei Bestrahlung zur Bildung von Superoxidionen.
Dies trifft zu, wenn man eine Suspension von TiO&sub2; in einer Lösung, die Nitrotetrazolium Blau enthält, mit Sonnenlicht bestrahlt, wobei eine intensive blaue Färbung die Bildung von Superoxidionen an der Oberfläche der Pigmentkörner erkennen läßt. Wenn man die gleiche Suspension im Dunkeln hält, behält sie ihre Anfangsfarbe.
Wenn man aber der gleichen Suspension eine Lösung von Superoxid-Dismutase zugibt, erhält man nach Bestrahlung eine sehr deutliche Inhibierung der Blaufärbung.
Für diesen Versuch wurde eine Suspension von 100 mg TiO&sub2; in 5 cm³ einer Lösung von N. B. T. in einer Konzentration von 8 · 10^-5M verwendet.
Zugegebenes SOD (erhalten nach Beispiel 2) 5 · 10^-2 mg
Bekannt ist die Bedeutung von Mineralpigmenten, wie TiO&sub2; und ZnO in kosmetischen Zubereitungen, die im Licht verwendet oder gelagert werden (Zubereitungen zum Abschminken, Sonnenschutzzubereitungen usw.). Die Einführung von SOD in diese Zubereitungen ermöglicht die Bildung von Superoxidionen und den von ihnen eingeleiteten Abbau zu intensivieren.
Man erhält die gleichen Ergebnisse, wenn man das SOD von Beispiel 2 durch eine äquivalente Menge SOD Extrakt von Blut (Erythrocuprein) ersetzt.

Beispiel 11

Inhibierung der Autooxidation von Riboflavin

Die kosmetischen Zubereitungen zur Pflege oder zur Behandlung der Haut enthalten häufig Riboflavin (Vitamin B2). Die Gegenwart dieses Vitamins ist zur Erhaltung der normalen Funktionen der Haut erforderlich.
Es ist allgemein bekannt, daß nach Bestrahlung in Gegenwart von Sauerstoff das Riboflavin Superoxidionen bildet. Dieses wiederum kann Peroxidationen in den Emulsionen hervorrufen, die das Riboflavin enthalten und es ist demgemäß wünschenswert, eine Superoxid-Dismutase zur Inhibierung dieses Phänomens zuzugeben.

Beispiel 12

Schäumendes Farbschampoo

Man mischt 50 g dieser Formulierung mit der gleichen Menge Wasserstoffsuperoxid mit 20 Volumen und trägt das erhaltene Gel auf die Haare auf. Nach 30 Minuten Pause spült man und trocknet die Haare.
Auf braunen Haaren erhält man eine dunkelblonde Farbtönung.
In der oben angegebenen Zubereitung kann man das SOD nach Beispiel 3 durch eine äquivalente Menge SOD nach Beispiel 1 oder 2 ersetzen. Beispiel 13 Geträgerte Farbcreme (zur Oxidationsfärbung) @1Cetylstearylsulfat von Natrium@4¸3¤g&udf50;@1Cetylstearylalkohol@4Æ10¤g&udf50;@1Oleindi¿thanolamid@4¸4¤g&udf50;@1Ammoniak mit 22&ijlig; Be@4Æ10¤ml&udf50;@1m-Diaminoanisolsulfat@4¸0,048¤g&udf50;@1Resorcin@4¸0,420¤g&udf50;@1m-Aminophenolbase@4¸0,150¤g&udf50;@1Nitro-p-phenylendiamin@4¸0,085¤g&udf50;@1p-Toluylendiamin@4¸0,005¤g&udf50;@1Natriumbisulfit °K(d°k¤=¤1,32)@4¸1,2¤g&udf50;@1Superoxid-dismutase von Beispiel 1@4¸0,1¤g&udf50;@1Wasser q.¤s.¤p.@4100¤g&udf53;zl10&udf54;@0
Man mischt 30 g dieser Creme mit 45 g Wasserstoffsuperoxid mit 20 Volumen und trägt die erhaltene glatte Creme auf die Haare auf. Nach ausreichender Zeit spült man und trocknet die Haare.

Beispiel 14

Moussierendes Gel oder eingedickte Lösung

Diese Zubereitung trägt man auf die Haut auf. Sie kann in gleicher Weise verwendet werden unter Zugabe eines künstlichen Bräunungsmittels, wie Dihydroxyaceton zur Bildung einer künstlichen Bräunungszubereitung der Haut.
Man erhält eine analoge Zubereitung, wenn man das SOD von Beispiel 2 durch eine äquivalente Menge SOD nach Beispiel 3 ersetzt.

Beispiel 15

Creme (für den Körper)

Man erhält eine analoge Creme, wenn man in der oben angegebenen Zubereitung das SOD nach Beispiel 3 durch eine äquivalente Menge SOD nach Beispiel 1 oder SOD-Extrakt von Pleurotus olearius gillet ersetzt.

Beispiel 16

Creme (für den Körper)

Man erhält eine analoge Creme, wenn man in der oben angegebenen Zubereitung des SOD von Beispiel 1 durch eine äquivalente Menge SOD-Extrakt Escherichia coli Nr. ATCC 15224 ersetzt.

Beispiel 17

Milch zur Körperpflege (lait de beaute)

Man erhält eine ähnliche Milch zur Körperpflege, wenn man das SOD von Beispiel 1 durch eine äquivalente Menge SOD-Extrakt von Blut (Erythrocupreine) ersetzt.

Beispiel 18

Verbesserung des Zustandes der Haut in vivo

Den Versuch nimmt man bei weiblichen Ratten vor, deren Zustand der Haut man experimentell modifiziert durch die Wirkung von Testosteronpropionat und die man durch örtliche Anwendung von Superoxid-Dismutase behandelt.
Die Wirkung der Superoxid-Dismutase bewertet man durch klinische Prüfung der Haut und durch verschiedene biochemische Bestimmungen.

1) Experimenteller Versuch

Vier Versuchsreihen mit 8 weiblichen Ratten im Alter von 40 Tagen wurden verwendet.

1. Reihe:
Die Ratten erhielten intra-peritoneal eine Implantation von 30-40 mg Testosteronpropionat.
2. Reihe:
Gleiche Behandlung wie bei der ersten Versuchsreihe, aber weiterhin eine tägliche Verabfolgung von 15 Einheiten Superoxid-Dismutase in 0,3 ml physiologischem Medium auf den voraus geschorenen Rücken, 5 Tage pro Woche.
3. Reihe:
Kontrolle ohne Behandlung

Die Tiere werden 20 Tage nach Beginn des Versuchs zu biochemischen Untersuchungen getötet.

2) Klinische Prüfung

Das den weiblichen Ratten verabfolgte Testosteronpropionat provoziert Hautmodifikationen, die sich in einer Erhöhung der Zellaktivität in der Höhe der Malpighischicht, einer Erhöhung der Stärke der Epidermschichten und einer besonders bedeutenden Versperrung der Talgdrüsen manifestiert.
Die Haut wird dick und spröde und gleichzeitig weniger elastisch bei Berührung.
Dies ist bei der Reihe Nr. 1 zu beobachten.
Die Beobachtungen wurden von 3 verschiedenen Personen, unabhängig voneinander, gemacht. Im Gegensatz dazu hatten die Ratten der zweiten Reihe eine Haut, die der der Ratten der Kontrollreihe Nr. 3 entsprach, nämlich eine weiche, geschmeidige und bei Berührung elastische Haut.

3) Biochemische Bestimmung

Die mit Hauptfragmenten erhaltenen Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle angegeben.
Sie sind ausgedrückt in Millieinheiten pro Minute und pro cm² Haut oder ebenso in Millieinheiten pro Minute und pro Milligramm Proteine, die in dem Hautfragment vorhanden sind. Tabelle Biochemische Hautänderungen als Folge der Behandlung von weiblichen Ratten mit Testosteronpropionat, wobei in einem Falle SOD örtlich verabfolgt wurde. &udf53;ta1,6:14,6:22,6:30,6:37,6&udf54;&udf53;tz5,5&udf54; &udf53;tw,4&udf54;&udf53;sg8&udf54;\\ Kontrolle\ Testosteron\ Testosteron&udf50;+SOD&udf53;tz5,9&udf54; &udf53;tw,4&udf54;&udf53;sa21&udf54;&udf53;sg9&udf54;\¸mÓ/min/cm¥\ Æ6¤600\ 6¤500\ 10¤400&udf53;tz&udf54; \Cytox&udf53;tz&udf54; \¸mÓ/min/mgProt\ 13¤100\ 9¤500\ 13¤700&udf53;tz10&udf54; &udf53;te&udf54;H@0&udf53;sg8&udf54;Cytox: Cytochrom-oxidase.&udf53;zl&udf54;&udf53;vu10&udf54;&udf53;sg9&udf54;
Die Prüfung dieser Ergebnisse zeigt, daß die Superoxid-Dismutase örtlich verabfolgt, eine deutliche Wirkung auf die von den Proteinen beeinflußte Cytochromoxidase ausübt. Obwohl das Testosteron eine starke Verringerung provoziert, ermöglicht die Behandlung mit SOD den gleichen Wert zu erreichen, wie bei den Kontrolltieren.
Es ist bekannt, daß die Cytochromoxidasen ermöglichen, die Zellatmung zu charakterisieren.
Die Superoxid-Dismutasen verbessern die Hautzellenatmung und die Eigenschaften der Haut, ihrer Weichheit beim Berühren, ihre Geschmeidigkeit und Elastizität.

Claims

1. Kosmetische Mittel, dadurch gekennzeichnet, daß sie Superoxid-Dismutasen enthalten.

2. Kosmetische Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Superoxid-Dismutasen aus Extrakten von Bakterien, Pilzen und/oder Blut ausgewählt sind.

3. Kosmetische Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Superoxid-Dismutasen aus Extrakten von Photobacterium phosphoreum Nr. ATCC 11040, Photobacterium leiognathi Nr. ATCC 25521, Photobacterium sepia Nr. ATCC 15709, Escherichia coli Nr. ATCC 15224 ausgewählt sind.

4. Kosmetische Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß 0,01 bis 5 Gew.-% Superoxid-Dismutasen enthalten sind.

5. Kosmetische Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie in Milchform oder Cremeform vorliegen.

6. Verwendung der kosmetischen Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man diese Mittel zur Behandlung von Haut und Haaren verwendet.

7. Verwendung der kosmetischen Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man diese Mittel zum Beibehalten der Integrität der Keratinstruktur der Haut oder der Haare und zum Beibehalten oder Verbessern der Hauteigenschaften, nämlich der Geschmeidigkeit, der Elastizität und der Weichheit verwendet.

8. Verwendung der kosmetischen Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man diese Mittel zum Schutz der Haut gegen schädliche Einflüsse durch Ultraviolettstrahlen verwendet.

9. Verwendung der kosmetischen Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Superoxid-Dismutasen als Schutzmittel gegen die Oxidation von im Mittel vorhandenen oxidierbaren oder autooxidierbaren Bestandteilen verwendet.

10. Verwendung der Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man diese Mittel entweder zum Schutz oxidierbarer Bestandteile gegen Oxidation während ihrer Konservierung oder zur Verzögerung der Oxidation während der Verwendung verwendet.