DE2459350C2

DE2459350C2 - Wasserunlösliches Enzympräparat für die Gewinnung von 6-Amino-Penicillansäure

Info

Publication number: DE2459350C2
Application number: DE2459350A
Authority: DE
Inventors: Lawson William Worthing Sussex Powell; Thomas Adrian Steyning Sussex Savidge
Original assignee: BEECHAM GROUP Ltd BRENTFORD MIDDLESEX GB
Current assignee: BEECHAM GROUP Ltd BRENTFORD MIDDLESEX GB
Priority date: 1973-12-28
Filing date: 1974-12-16
Publication date: 1985-11-07
Also published as: US4230804A; PL94970B1; FI377074A; DK683574A; NL186396C; SE7415863L; NL186396B; FR2303021A1; FR2303021B1; IE41467L; DK153502C; US4001264A; JPS5095479A; DE2459350A1; NO144637C; CA1034523A; SU654170A3; SE420622B; IE41467B1; YU347174A

Description

Die Erfindung betrifft ein wasserunlösliches Enzympräparat, wie es im Patentanspruch angegeben Ist. Penlcillin-Acylasen (oder Desacylasen) werden seit 1961 zur Gewinnung von 6-Aminopenicillansäure aus Penicillinen verwendet Bei Verwendung von zellfreien oder zellgebundenen Enzymen entstehen jedoch Schwie rigkeiten, da das zellfreie Enzym nicht leicht aus dem Reaktionsgemisch abgetrennt und das zellgebundene Enzym nicht leicht wieder verwendet werden kann. Außerdem erzeugen beide Enzymarten 6-Amlnopeniclllansäure, die mit Spuren von bakteriellem Protein verunreinigt ist. Um diese Schwierigkeiten zu beheben, wurde vorgeschlagen, das Enzym an ein polymeres Substrat zu binden und es damit wasserunlöslich zu mache* (siehe GB-PS 11 93 918). Diese Enzympräparate sind jedoch mechanisch nicht sehr stabil, wenn man als Substrat ein for andere Zecke Im Handel erhältliches Polymerisat verwendet. Die als Substrat verwendeten Polymerisate müssen daher speziell angepaßt und hergestellt werden und sind daher besonders teuer. Bei der Gewinnung von 6-Aminopeniciiiansäure durch die Einwirkung von Penlciiiin-Äcylasen ist es außerdem notwendig, den pH-Wert des Reaktionsgemisches innerhalb sehr enger Grenzen zu halten; deshalb muß man während der Reaktion ständig eine Alkdiverbindung zugeben, um die aus der Penicillin-Seitenkette freigesetzte Carbonsäure zu neutralisieren. Ist das Enzym direkt fiber eine kovalente Bindung an das polymere Substrat gebunden, so muß man in der Wahl der zur Neutralisation verwendeten Alkallverbindung sehr vorsichtig sein; Natriumhydroxid kann man im allgemeinen nicht verwenden, ohne daß das Enzym schnell denaturiert. Verwendet man deshalb eine flüchtige Base, wie Ammoniak oder Triäthylamln, so muß man teure Umänderungen an der Anlage für die Gewinnung von 6-Aminopenicillansäure mit Hilfe von zellgenundenem Enzym vornehmen; beim zell gebundenen Enzym macht es hingegen keine Schwierigkeiten, Natriumhydroxid für die Neutralisation der frei gesetzten Seitenkettensäure zu verwenden.

Aus der DE-OS 21 43 062 ist bekannt, die PenlciÜin-Acylase dadurch wasserunlöslich zu machen, daß man sie mittels eines' wasserlöslichen Dialdehyds an eine feste wasserunlösliche adsorbierende Substanz bindet. Bei dlessm Präparat Ist das Enzym eher um das Substrat herum vernetzt als durch kovalente Bindungen darange bunden. Als feste adsorbierende Substanz wurden verschiedene Verbindungen vorgeschlagen, z. B. Anlonenaus- tauscherharze, d. h. Verbindungen mit basischen Gruppen, wie primäre, sekundäre oder tertiäre Aminogruppen oder entsprechende andere funktioneüe Stickstoffgruppen, Carbuxyrneihyiceüuiose oder neutrale Polymerisate, z. B. mit Estergruppen als funktionell Gruppen. Es wurde festgestellt, daß Substrate mit negativ geladenen funktionellen Gruppen Substraten mit positiv geladenen funktioneilen Gruppen aberlegen sind. So wurden Dl äthylamlnoäthylcellulose und Carboxymethylcellulose miteinander verglichen. Unter optimalen Bedingungen wurde die Penicillin-Acylase aus der gleichen Lösung an jedes der Substrate gebunden. Die Aktivität des Enzympräparats betragt 11 Prozent für die Diäthylaminoäthylcellulose und 42 Prozent für die Carboxymethylcellulose, bezogen auf die Anfangsaktivität der Enzymlösung. Die niedrigere Aktivität für das Dläthylamlnoäthylcellulose-Präparat beruht auf der geringeren Enzymadsorption des Substrats. Bei Wiederholung der Versuche mit verschiedenen Enzymlösungen beträgt die Aktivität 24 Prozent für Diäthylaminoäthylcellulose und 56

Prozent für Carboxymethylcellulose. Diese Enzympräparate sind jedoch mechanisch nicht sehr stabil [(siehe

auch D. L. Regan, P Dunhill und M. D. Lilly In »Biotechnology and Bioengineering« Band 16, Seiten 333 bis 343 (1974)].

Die nach der DE-OS 2143 062 hergestellten Enzympräparate, in denen das Substrat ein Polymerisat mit

so neutraler Reaktion Ist, sind In bezug auf Wiederverwendung und Aktivität nicht ganz zufrledensttaend. So Ist die Stabilität eines Penicillln-Acylase-Präparats, bei dem das Enzym an ein neutrales Substrat, wie Acrylsäure esterharz (Amberllte XAD-7) gebunden 1st, nicht zufriedenstellend. Nach einer 14täglgen Lagerung bei 37° C fiel die Aktivität um 66 Prozent.

UE-PS 37 05 084 beschreibt die Adsorption von Enzymen auf polymeren Oberflächen und Ihre folgende Vernetzung. Polymerisate und Copolymerisate der Methacrylsäure sind für diese Adsorption geeignet, sie

müssen jedoch die Adsorption fördernde Gruppen haben, wie Nltrilo-feN), Acidoamldo-(-CONHj) und

Ureldogruppen (-NHCONHi). Gemäß dieser Patentschrift müssen die im Polymerisat oder Copolymerlsal

vorhandenen Carboxylgruppen In eine dieser Gruppen umgewandelt werden.

Auch die GB-PS 12 57 263 beschreibt die Adsorption eines Enzyms an ein Substrat und deren In sltu-Vernet-

zung. Diese Patentschrift betrifft jedoch weder Penlcillin-Acylasen noch Methacrylsäure-Polymerlsate u-.id -Copolymerisate als Substrat; es findet sich auch kein Hinwels auf Substrate mit guter mechanischer Stabilität. Die Vernetzung des Enzyms um das Substrat erfolgt unter Verwendung von polyfunktlonellen Reaktionsmitteln, wie bls-Dlazo-o-dl-anlsldln. Es wurde nun festgestellt, daß man bei Verwendung von Polymerisaten oder Copolymerlsaten der Methacryl-

(>s säure als feste wasserunlösliche adsorbierende Substanz Enzympräparate erhält, die eine überraschend hohe Enzymaktivität besitzen und diese auch nach wiederholtem Einsatz zur Gewinnung von 6-Amlnopenlclllansäure nicht verlieren. Gegenstand der Erfindung Ist somit ein wasserunlösliches Enzympräparat für die Gewinnung von 6-Amlno-

penlcillansäure, bestehend aus einer Penlcillin-Acylas mit Spaltaktivität in bezug auf die Amidbindung von Penicillinkörpern, die mittels Glutaraldehyd, Glyoxal oder Formaldehyd an eine wasserunlösliche, feste, adsorbierende Substanz gebunden ist, das dadurch gekennzeichnet ist, daß die Penlcillin-Acylase über die Aldehydverbindung an ein wasserunlösliches Polymerisat oder Copolymerisal der Methacrylsäure als feste adsorbierende Substanz gebunden ist.

Als feste wasserunlösliche adsorbierende Substanz sind Polymerisate und Copolymerisate der Methacrylsäure in grobporiger und Gelform grobporigen und gelartigen Polymerisaten von Styrol, Acrylsäure oder Phenolfnrmaldehyd mit funktionellen Sulfonsäure-, Phosphorsäure- oder Carbonsäuregruppen deutlich Oberlegen. Die erfindungsgemäßen Enzympräparate sind auch sehr stabil. Penicillin-Acylase, die an ein im Handel erhältliches Methacrylsäure-Polymerisat in grobporiger Form (Amberlite IRC-50) gebunden ist, verliert bei einer Lagerung bei 37° C innerhalb 14 Tagen nur 5 Prozent ihrer ursprünglichen Aktivität. Dieses Ergebnis ist insofern gegenüber den Ergebnissen der US-PS 37 05 084 überraschend, weil nicht vorauszusehen war, daß Polymerisate und Copolymerisate der Methacrylsäuren ohne Umwandlung der freien Carboxylgruppen zu stabilen Penclllin-Acylase-Präparaten führen. Die erfindungsgemäßen Enzympräparate sind auch mechanisch stabiler als bisher bekannte Präparate. Da bei der Gewinnung von 6-Aminopenicillansäure das Reaktionsgemisch sehr stark gerührt werden muß, um einen einheitlichen pH-Wert zu gewährleisten und den alkalischen Abbau von Penicillin zu verringern, ist die mechanische Stabilität von großer Bedeutung. Außerdem kann das Reaktionsgemisch in einem Reaktionssystem moderner Bauart abgezogen werden, das unlösliche Enzympräparat wird von einem Sieb der geeigneten Größe im Reaktor zurückgehalten und ist sofort wieder verwendbar. Dadurch verringert sich der Aktlvitätsveriust des Enzyms, der normalerweise auftritt, wenn man das gesamte Reaktionsgemisch aus dem Reaktionsgefäß entfernt, das unlösliche Enzympräparat durch Filtrieren oder Zentrifugieren wiedergewinnt und dem Reaktionsgefäß wieder zugibt. Außerdem ist die mikrobielle Verunreinigung des Enzympräparats während des Handhabens unterbunden. Das Enzympräparat darf jedoch nicht mechanisch abgebaut werden, so daß Aktivitätsverluste wegen des Passierens des Präparats durch das Sieb auftreten. Regan, DunhIII und Lilly [In »Biotechnology and Bioenglne^ring«, Band 16, Seiten 333 bis 343 (1974)] zeigen, daß kleine, durch Zerreiben von Dläthylamlnoäthylcellulose entstandene Teilchen, an die /J-Galactosidase gebunden ist, eine höhere Aktivität haben als größere Teilchen. Der Verlust solcher kleinen Teilchen aus dem Reaktor bedeutet einen Verlust an Aktivität, der jedoch dem Gewicht des verlorenen Materials nicht entspricht.

In einem anderen, In der BE-PS 7 82 646 beschriebenen Reaktorsystem, wird das unlösliche Enzympräparat in einer Kolonne zurückgehalten, durch die die Reaktionslösung mit schneller Geschwindigkeit durchfließt, damit die pH-Einstellung In eip<;m vor· Enzympräparat getrennten Gefäß durchgeführt werden kann. Die absorbierende Substanz des Enzympräparats muß derart beschaffen sein, daß sie durch die hohen Drücke, die notwendig sind, um die schnelle Fließgeschv ndigkeit des Reaktionsgemisches aufrecht zu erhalten, mechanisch nicht abgebaut wird.

Man kann jedes dieser Reakiorsysteme so umbauen, daß man auch kontinuierlich arbeiten kann. Die J5 Probleme einer guten mechanischen Stabilität sowie der Enzymaktivität und -wiederverwendung bleiben jedoch bestehen.

Ein weiterer Vorteil der Methacrylsäure-Polymerisate und -Copolymerisate Ist ihre gute mechanische Stabilität. Ist die Aktivität der erfindungsgemäßen Enzympräparate nach wiederholter Verwendung im Reaktor auf einen unannehmbaren Wert abgefallen, so kann man daraus das Harz durch Behandeln des Enzympräparats mit heißem Alkali wiedergewinnen. An dieses Harz kann r«,an dann wieder frisches Enzym binden.

Es wurde auch festgestellt, daß man bei der Erzeugung von 6-Aminopenicillansäure mit den erfindungsgemäßen Enzym Präparaten bei der Wahl der Alkaliverbindung, die zur Neutralisation der freigesetzten Seltenkettensäure eingesetzt wird, nicht besonders vorsichtig sein muß. Man kann daher Natriumhydroxid verwenden, wie es bisher bei zellgebundenen Enzymen üblich war. Entsprechend müssen auch die bestehenden Anlagen zur Gewinnung von 6-Amlnopenlclllansäure nicht umgeändert werden, wie das mit flüchtigen alKallschen Verbindungen der Fall Ist, z. B. mit Ammoniak oder Triäthylamin.

Um die Überlegenheit von Methacrylsäure-Polymerisaten und -Copolymerisaten für Penicillin-Acylase-Präparate zu zeigen, wurden Peniclllln-Acylase-Präparate mit Polymerisaten von «-Aminocapronsäure (Nylon) und Urethan als Substrat hergestellt und mit einem erfindungsgemäßen Präparat, dessen adsorbierende Substanz ein Copolymerlsat von Methacrylsäure und Divlnylbenzol (Amberlite IRC-50) Ist, verglichen. Nylon und Polyurethan sind die bevorzugten Substrate der US-PS 37 05 084 und sind mittels Glutarajdehyd an das Enzym gebunden. Unter Berücksichtigung der verschiedenen Teilchengrößen der Enzympräparate wurde festgestellt, daß das erfindungsgemäße Enzympräparat zwei- bis dreimal aktiver ist als das Polyurethanpräparat und sogar elfmal aktiver als das Nylonpräparat (siehe auch Beispiele 22 und 23).

Das erfindungsgemäße wasserunlösliche Enzympräparat kann man durch Umsetzen In wäßriger Lösung einer Penlcillin-Acylase, einer festen, wasserunlöslichen adsorbierenden Substanz und von Glutaraldehyd, Glyoxal oder Formaldehyd herstellen, wobei man als feste wasserunlösliche adsorbierende Substanz ein Polymerisat oder Copolymerlsat der Methacrylsäure verwendet.

Vorzugswelse wird die Peniclllln-Acylase für die erfindungsgemäßen Enzympräparate aus Bakterien, z. B. W) Stämmen von Escherlchla coil, gewonnen, wenn sie für die Erzeugung von 6-Aminopenicillansäure aus Benzylpenicillin verwendet werden soll. Für die Gewinnung von 6-Aminopenicillansäure aus Phenoxymetiiylpenlclllln geht man vorzugsweise von Pilzen und Actlnomyceten aus.

Die enzymatische Aktivität der Peniclllln-Acylase wird Im allgemeinen a!s ihre Fähigkeit, aus Benzylpenicillin 6-Amlnopenlclllansäure zu produzieren, angegeben. Dementsprechend ist die Acylaseaktivltät die Menge an 6-Aminopenicillansäure In μΜοΙ, die aus einer Benzylpenlcllünlösung bei pH 7,8 und 37° C je Minute und je mg Enzymprotein produziert wird, wobei der Proteingehalt der Lösung gemäß dem Standardverfahren von Lowry bestlmml wird. Die enzymatische Aktivität der erfindungsgemäßen Enzympräparate wird entsprechend als die

Menge an 6-Aminopenicillansäure in μΜοΙ angegeben, die aus Benzylpenicillin bei pH 7,8 und 37° C je Minute produziert wird, jedoch bezogen auf das Gewicht des Enzympräparats in g.

Es wurde festgestellt, daß sowohl die Adsorption und die Bindung des Enzyms an das Substrat als auch dlcspezifische Aktivität des gebildeten wasserunlöslichen Enzympräparats mit der Reinheit des verwendeten Enzyms steigt. Über einer gewissen Enzymreinheit jedoch ist der Gewinn an Vorteilen für eine bestimmte Reinheitszunahme deutlich kleiner, so daß der erwünschten Enzymreinheit eine wirtschaftliche Grenze gesetzt.ist. Deshalb beträgt die Reinheit der Penlcillin-Acylase im allgemeinen 0,15 bis 50 μΜοΙ je Minute und je mg Protein, vorzugsweise 1,5 bis 30 μΜοΙ je Minute und je mg Protein.

Gelegentlich Ist es wünschenswert, die Reinheit des Enzyms vor der Adsorption und dem Binden an das Substrat zu erhöhen. Man kann die Enzymlösung kurze Zeit, z. B. etwa 30 Minuten, auf etwa 50° C erhitzen und/oder ultrafiltrieren. Auch andere herkömmliche Verfahren der Enzymreinigung, z. B. fraktionierte Fällung oder Behandeln mit einem Ionenaustauscher, wie Cellulosen oder vernetzten! Dextran, sind geeignet.

Die als feste adsorbierende wasserunlösliche Substanz für die erfindungsgemäßen Enzympräparate verwendeten Methacrylsäure-Polymerisate oder -Copolymerisate enthalten freie Carboxylgruppen, die dem Polymerisat 'S eine saure Funktion verleihen. Grobporige Methacrylsäure-Polymerisate und -Copolymerisate werden den gleichen Produkten in Gelform bevorzugt.

Als Copolymerisate geeignet sind Copolymerisate von Methacrylsäure mit Divinylbenzol oder ein Diester eines Glykole mit Methacrylsäure, z. B. Äthylenglykol-bis-methacrylat. Auch andere Comonomere, wie Methacrylsäureester, können für die Herstellung von erfindungsgemäß verwendeten Copolymerisaten eingesetzt werden. Ein Vorteil der erfindungsgemäßen Enzympräparate ist die Verwendung von Polymerisaten als Substrat, die bereits im Handel für andere Zwecke erhältlich sind, insbesondere als schwachs^ore Kationenaustauscherharze. Als feste wasserunlösliche adsorbierende Substanz für die erflndungsgemäßen Euzympräparate bevorzugt ist ein Copolymerisat von Methacrylsäure und Divinylbenzol, im Handel unter der Bezeichnung »Amberlite IRC-50« erhältlich, und ein Copolymerisat von Divinylbenzol und Methacrylsäure, das einige Benzolsulfonylgruppen enthält, das unter der Bezeichnung »Zeokarb 227« bekannt ist.

Die in den erflndungsgemäßen Enzympräparaten verwendeten Polymerisate liegen vorzugsweise In Form von fein verteilten Partikeln oder Perlen einer solchen Größe vor, daß sie durch ein ASTM-Sieb Nr. 10 durchgehen, d. h. mit einer Teilchengröße unter 2,0 mm. Das erfindungsgemäße Enyzmpräparat sollte jedoch nicht so fein verteilt sein, daß es aus dem Reaktionsgemisch durch eine Siebflltratlon nicht abgetrennt oder in einem Kolon-3i nenreaktor nicht verwendet werden kann. Das heißt, das Polymerisat sollte eine Teilchengröße über 0,01 mm haben, bzw. von einem ASTM-Testsieb Nr. 800 zurückgehalten werden. Die Teilchengröße des Enzympräparats hängt dann schließlich von der Art des Reaktorsysteros ab.

Bevor die Penicillin-Acylase mit dem Polymerisat in Berührung gebracht wird, wird sie In wäßriger Lösung so lange dialyslert, bis die ionische Leitfähigkeit vom Normalwert von 5 bis 10 m Ohm"¹ auf 0,ί bis 5 m Ohm¹, vorzugsweise etwa 1 Ohm"¹, vermindert ist. Der pH-Wert der Enzymlösung Hegt vorzugsweise zwischen 4,5 und 7,0. Gelegentlich sind einige empirische Experimente notwendig, um das pH-Optimum Innerhalb dieses Bereiches zu bestimmen, um eine maximale Adsorption und eine lang andauernde Enzymaktivität zu gewährleisten. Dieses Optimum liegt Im allgemeinen zwischen pH 5,2 und 6,5. Das Polymerisat muß lang genug mit der Enzymlösung In Berührung gebracht werden, um eine maximale Enzymadsorption zu gewährleisten; diese Zelt beträgt im allgemeinen zwischen 2 und 16 Stunden.

Nach der Adsorption des Enzyms an das Substrat wird das Enzym in situ mittels Glutaraldehyd, Glyoxal oder Formaldehyd an das Substrat gebunden. Glutaraldehyd oder Glyoxal werden bevorzugt, da die mit Glutaraldehyd hergestellten Enzympräparate für tile Gewinnung von 6-Aminopenicillansäure sehr günstige Eigenschaften aufweisen. Das Vernetzungsmittel wird normalerweise in wäßriger Lösung In einer Menge von 0,} bis 15 Gewichtsprozent, vorzugsweise von 0,5 bis 5 Gewichtsprozent, verwendet.

Nach beendeter Vernetzungsreaktion muß eventuell nicht umgesetztes Vernetzungsmittel entfernt oder unschädlich gemacht werden. So kann überschüssiges Vernetzungsmittel mit Wasser oder mit einer Lösung einer Aminoverbindung, z. B. Harnstoff, ausgewaschen werden.

Die erflndungsgemäßen wasserunlöslichen Enzympräparate werden zur Erzeugung von 6-Amlnopenicillansäure aus Benzylpenicillin oder Phenoxymethylpenlcillln eingesetzt.

Vor der Verwendung der erflndungsgemäßen Enzympräparate zur Erzeugung von 6-Amlnopenlclllansäure wird der pH-Wert des Enzympräparats am Ende der Vernetzungsreaktion durch Zugabe einer Alkallverblndung vorsichtig auf den für das Verfahren notwendigen pH-Wert eingestellt. Dieser pH-fVert Hegt zwischen 6,0 und 9,0, Im allgemeinen zwischen 7,0 und 8,0, vorzugsweise bei 7,8. £lne wäßrige Lösung von Benzylpenicillin oder Phenoxymethylpenlclllln oder deren Salz wird bei diesem pH-Wert mit dem erflndungsgemäßen Enzympräparat umgesetzt. Die Reaktionstemperatur Hegt Im allgemeinen zwischen 30 bis 50° C, vorzugsweise bei 37° C. Während der Reaktion wird aus Benzylpencillln Phenylessigsäure und aus Phenoxymethylpenlclllln Phenoxyessigsäure freigesetzt, die ständig oder diskontinuierlich neutralisiert wird, um den pH-Wert der Lösung innerhalb des gewünschten Bereiches zu halten. Die Wahl der alkalischen Verbindung für diese Neutralisation Ist nicht kritisch. Natronlauge 1st sehr geeignet, man kann aber auch eine flüchtige Stickstoffbase, wie Ammoniak oder Trläthylamln, verwenden,

Die erflndungsgemäßen wasserunlöslichen Enzympräparate sind meistens so stabil, sowohl mechanisch als auch biologisch, daß man sie In einem diskontinuierlich arbeitenden Reaktor für mindestens 40 aufeinander folgende Penlclllln-Spaltreaktlonen verwenden kann.

μ Die Beispiele erläutern die Erfindung. In den Beispielen wird ein teilweise gereinigtes Penicillln-Acylass-Priiparai verwendet, das aus den Zellen eines Peniclllln-Acylase-produzlerenden Stammes von Escherichla coil mittels eines Homogcntsators gewonnen wurde. Die Zelltrümmer wurden nach dem Einstellen des pH-Wertes

auf 5,0 abflltrlert, die bnzymlösung wurde soweit notwendig welter gereinigt, um die gewünschte soezlflsche I

Aktivität von 1,5 bis 30 μΜοΙ je Minute und je mg Protein zu erreichen. Die Enzymlösung wurde dann dlalysieri, bis sie die gewünschte Leitfähigkeit von etwa 1 m Ohm"¹ hatte.

Beispiel 1

Portionen von 20 bis 25 g oder 50 g Im Handel erhältlicher Kationen- und Anionenaustauscherharze werden in etwa 100 bis 500 ml Wasser suspendiert; der pH-Wert wird bei kationischen Harzen auf 4,4 bis 6,3, bei anlonlschen Harzen auf 6,5 bis 9,0 durch Zugabe von Natronlauge oder Salzsäure unter starkem Rühren eingestellt. Die Harze werden durch Filtration wiedergewonnen, gut mit destilliertem Wasser gewaschen und In 60 bis 100 ml, 250 oder 500 ml einer Lösung einer teilgereinigten Penlcillln-Acylase mit einer spezifischen Aktivität von 3,85 bis 6,75 /iMol/Mln./mg Protein und einer Leitfähigkeit der Losung unter 1 m Ohm"¹ suspendiert. Die Enzymlösung wurde vorher auf den entsprechenden pH-Wert eingestellt. Die Menge an angebotenem Enzym variiert zwischen 71 und 308 μΜοΙ/Mln./g Harz. Die Enzymlösung und das Harz werden etwa 16 Stunden schwach gerührt, wobei der pH-Wert durch Zugabe eines Titrationsmittels gehalten wird. Das mit dem Enzym beladene Harz wird abfiltriert, in 100 ml 0,825- bis 3,3gewlchtsprozentlgem wäßrigem Glutaraldehyd suspendiert und 16 Stunden umgesetzt, wobei der pH-Wert durch 7ijg_ahp eines Tiiraiionsrniiie!» gehauen wird. Das entstandene Enzympräparat wird isoliert, dreimal mit destilliertem Wasser gewaschen und In Wasser oder 0,2 m Phosphatpuffer, pH 7,8, suspendiert. Die Lösung wird auf pH 7,8 eingestellt, I Stunde mit 100 ml 0,1 m wäßriger Harnsiofflösung, pH 7,8, behandelt und schließlich dreimal mit destilliertem Wasser gewaschen.

Die derart hergestellten Enzympräparate werden unter Standardbedingungen bei pH 7,8 und 37° C zur Erzeugung von 6-Aminopenicillansäure aus Benzylpenicillin verwendet. Die Aktivitäten der Enzympräparate sind In Tabelle I zusammengestellt; die Aktivitäten betreffen Präparate, die bei optimalem pH-Wert für Enzymadsorption und lang anhaltende Enzymaktivität hergestellt worden sind.

Zum Vergleich sind in Tabelle I auch Enzympräparate angegeben, die mit anderen Im Handel erhältlichen Harzen hergestellt wurden.

Tabelle I

Versuch	Matrix und funktionell Gruppen des Harzes	Handels bezeichnung	Physikalische Form des Harzes	Spezifische Aktivität des Enzympräparats beim pH-Optimum μΜοΙ/Mln./g μΜοΙ/Μΐπ./g (Feuchtgewicht) (Trockengewicht)	-	-	7,ί6	32,4	-	8,3
3	Siyrol-i\|üäfiarcs Arnrrionium	Ämberlite IRA-938	grobporig	10,4	19,3	37,0	-	39,3	19,8
b	Styrol-quartäres Ammonium	Amberllte IRA-401	Gel	-	-	-8,0	10,1	-
C	Acrylat-quartäres Ammonium	Ämberlite IRA-458	Gel	4,71	-	7,0	30,7	-	30,l⁴)
d	Styrol-Polyamin	Lewatit MP62	grobporig	15,1	-	-8,0	5,8	—	88,8
e	Styrol-Polyamin	Ämberlite IR-45	Gel	2,3	4,01	-24,0')
f	Acrylat-Polyamin	Ämberlite IRA-68	Gel	9,9	13,9
g	Styrol-SO3H	Lewatit SP120	grobporig	-17,1')
h	Styrol-SOjH	Lewatit SlOO	Gel
i	Styrol-SOiH	Zerolit 325	Gel
j	Siyrol-SO,H	Amberlit IR-120	Gel
k	Phenol-Formaidehyd-SOjH	Bio-Rex 40	Gel
1	Styrol-SO,H	Bio-Rad AG/MP/50	grobporig
m	Styrol-PO,H₂	Bio-Rex 63	Gel
π	SiYr₀I-CHr-N(CH₂-COOH)₂	Chelex 100	grobporig
O	Methacrylat-COOH	Amberllte IRC-50	grobporig
I P	Acxryiat-COOH	Amberiite IRC-72	grobporig
I ⁴	Acxrylat-COOH	Ambedite IRC-84	Gel
E r	Acxrylat-COOH	Zerolit 236	Ge!

Fortsetzung

Versuch Matrix und funktioneile Grippen des Harzes

Handels- Physikalische Spezifische Aktivität des

bezelchnung Form des Harzes Enzympräparat beim pH-Optimum

μΜοΙ/Mln./g μΜοΙ/Mln./g

(Feuchtgewlcht) (Trockengewicht)

+¹J-COOH

+²)-C00H Phenol-Formaldehyd'

Methacrylat"⁰⁰⁰⁹'* -SOiH

-LUUH

Lewatlt CHP-80

Lewatlt CHP Zerllt 216

grobporig

grobporig Gel

Zeokab 227 Gel

15,2

25,9

36,5

57,0

') Ergebnisse variieren, die nicht angegebenen Werte sind die Mittelwerte einiger Bestimmungen.

') Polymerlsatslruktur nicht bekannt.

') Harz Im Handel nicht erhaltlich.

⁴) Lichte Maschenwelte: 0,15 bis 0,074 mm gegenüber 1,35 mm bei den anderen Harzen.

Harze a bis c sind stark anionisch - Harze g bis I sind stark kationisch. Harze d bis f sind schwach anionisch - Harze ο bis u sind schwach kationisch. Beispiel 2 bis 5

Tabelle II zeigt die Wirkung verschiedener Reinheiten der Penlclllln-Acylase während der Adsorption an das Harz. Es wird gemäß der Arbeltswelse von Beispiel 1 verfahren, das Enzym wird bei pH 5,7 adsorbiert, der Enzym-Harzkomplex wird mit 3,3prozentlgem wäßrigen Glutaraldehyd behandelt. Als Harz wird ein Dlvlnylbenzol-Methacrylsäure-Copolymerlsat (Amberlite IRC-50) verwendet, das mit Alkall und dann mit Säure gewaschen wurde. Die spezifischen Aktivitäten der erhaltenen Enzympräparate sind In Tabelle II zusammengefaßt. Die Ergebnisse zeigen, daß mit steigender Reinheit des Enzyms die spezifische Aktivität des Enzympräparats st. Igt.

Tabelle II Beispiel

Spezifische Aktivität des Enzyms allein μΜοΙ/Mln./mg Protein

Angebotene EnzymakUvltS! μΜοΙ/Mln./g Harz

Spezifische Aktivität des EnzymprSparais μΜοΙ/Mln./g Feuchtgewlcht

2	4,64
3	7,87
4	20,5
5	18,2

216 38,1

463 72,0

1160 124,0

586 109,0

Beispiele 6 bis 15 Das Enzym wird bei verschiedenen pH-Werten an das Harz adsorbiert.

(a) 5 Portionen von 50 g Dlvlnylbenzol-Methacrylsäure-Copolymerlsat (Amberlite IRC-50) werden auf pH 4,9, 5,1, 5,3, 5,5 und 5,7 eingestellt, getrocknet und dann mit 95 ml einer teilgereinigten Penicillin-Acylaselösung mit einer Aktivität von 60,9 μΜοΙ/Mln./mI, 16,8 mg Proteln/ml und einer Leitfähigkeit von 0,55 m Ohm"¹, die auf ein Endvolumen von 200 ml aufgefüllt wurde, behandelt. Nach einer 16st0ndigen Adsorption bei dem entsprechenden pH-Wert wird das Enzympräparat gemäß Beispiel 1 aufgearbeitet.

(b) 5 weitere Portionen desselben Harzes werden auf die gleiche Weise behandelt, mit dem Unterschied, daß die Adsorption bei einem pH-Wert von 5,7 bis 6,5 erfolgt. Diese Harze werde dann mit 105 ml einer Enzymlösung mit einer Aktivität von 54,7 μΜοΙ/Min./ml, 9,03 mg Proteln/ml und einer Leitfähigkeit von 0,75 m Ohm"¹ umgesetzt.

Die Ergebnisse sind in Tabelle III zusammengefaßt; sie zeigen, daß das pH-Optimum für die Adsorption zwischen 5,2 und 5,8 liegt.

Tabelle III

Spezifische Aktivität des Enzympräparats Beispiel pH μΜοΙ/Mln./g Feuchtgewicht

6	4,9	30,2
7	5,)	21,2
8	5,3	40,8
9	5,5	49,0
10	5,7	57,2
11	5,7	44,4
12	5,9	13,0
13	6,1	8,4
14	6,3	5,6
15	6,5	5,6

VWiMfIWIf IW MIlU I'

Es wird das gleiche Harz verwendet, jedoch mit verschiedenen Teilchengrößen. Verwendet wird ein Dlvinylbenzol-Methacrylsäure-Copolymerlsat mit einer Teilchengröße von 0,074 bis 0,149mm, d.h. die Teilchen passleren ein ASTM-Sleb Nr. 100, werden von einem ASTM-Sleb Nr. 200 jedoch zurückgehalten (Amberlite CG-50 Typ 1).

15 g dieses Harzes werden 3 Stunden bei pH 6,3 mit 200 ml einer Enzymlösung mit einer Aktivität von 23,7 μΜοΙ/Min./ml und 3,86 μΜοΙ/Min./mg Protein behandelt. Der Enzymkomplex wird Isoliert, mit 200 ml O,825prozentlgem Glutaraldehyd 16 Stunden lang behandelt und gemäß Beispiel 1 aufgearbeitet. Das Produkt (21 g) hat eine Aktivität von 114,5 μΜοΙ/Mln./g Feuchtgewicht und wird mit dem Produkt des Beispiels 2 verglichen. In diesem Präparat Ist das Substrat eine Dlvlnylbenzol-Methacrylsäure-Copolymerlsat mit einer Teilchengröße von 0,297 bis 1,41 mm, d. h. die Teilchen passleren ein ASTM-Sleb Nr. 14, werden jedoch von einem ASTM-Sleb Nr. 50 zurückgehalten (Amberlite IRC-50). Da dieses Präparat eine Aktivität von nur 38,1 μΜοΙ/Mln./g Trockengewicht hat, erhält man mit Haraen mit einer kleineren Teilchengröße bessere Ergebnisse.

Der Versuch mit einem Dlvlnylbenzol-Methacrylsäuie-Copolymerlsat mit einer Teilchengröße von < 0,037 bis 0,149 mm, d. h. die Teilchen passleren ein ASTM-Sleb Nr. 100, werden jedoch von einem ASTM-Sleb Nr. 500 zurückgehalten (Amberlite IRP-64), wiederholt. Das Harz wird Del pH 6,3 mit einet Enzymlösung mit einer Aktivität von 3920 μΜοΙ/Mln./g Harz bzw. einer spezifischen Aktivität von 17,4 μΜοΙ/Min./mg Protein behandelt. Der Enzymkomplex wird gemäß der Arbeltsweise von Beispiel 1 mit 3,3prozentlgem wäßrigen Glutaraldehyd behandelt. Das entstandene Enzympräparat hat eine spezifische Aktivität von 478,4 μΜοΙ/Mln./g Feuchtgewicht.

Beispiel 18 «

Der pH-Wert eines Dlvlnylbenzol-Methacrylsäure-Copolymerlsats mit einem Teilchendurchmesser von 0,297 bis 1,41 mm (Amberlite IRC-50) wird auf einen pH-Wert von 5,5, entweder durch Waschen mit 0,2 m Phosphatpuffer, pH 5,5, oder durch Aufschlämmen in destilliertem Wasser und Zugabe von Natronlauge eingestellt. Das Harz wird weiter mit destilliertem Wasser gewaschen, bis sich die Leitfähigkeit des Wassers nicht mehr ändert.

100 g feuchtes Harz werden zu einer Peniclllin-Acylaselösung mit einer spezifischen Aktivität von 5,25 μΜοΙ/Min./mg Protein in 500 ml 0,02 m Phosphatpuffer, pH 5,5, zugegeben und 20 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Der Feststoff wird abfiltriert, in 500 ml 0,25pro7entigem Glutaraldehyd In Phosphatpuffer suspendiert und weitere 20 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das entstandene Enzympräparat wird abfiltriert, mit 0,2 m Phosphatpuffer, pH 7,8, gewaschen, bis das Harz bei diesem pH-Wert im Gleichgewicht ist.

Mit 15 g dieses Enzympräparats werden 200 ml einer 6,25prozentigen wäßrigen Benzylpenlcillinlösung in 0,02 m-Phosphatpuffer bei pH 7,8 2 Stunden lang bei 37° C gespalten. Das Enzympräparat kann leicht wiederverwendet werden, die mechanische und biologische Stabilität ist so, daß das Präparat mindestens 25mal wieder eingesetzt werden kann.

' Beispiel 19

Es wird ein Enzympräparat mit einem Divinylbenzol-Methacrylsäure-Copoiymerisat mit einer Teilchengröße von 0,297 bis 1,41 mm (Amberlite IRC-50) hergestellt. Das Präparat hat eine Aktivität von 26,3 uMol/Min./g «> und wird zur Spaltung von 40 Liter einer 6,5prozentigen Benzylpenlcillinlösung In 0,02 m-Phosphatpuffer verwendet. Das Enzympräparat wird In dem Reaktionsgefäß mittels eines Drahtsiebs zurückgehalten. Nach beendeter Reaktion wird die 6-Aminopenicillansäurelösung abfiltriert, das Präparat wird mit Wasser gewaschen und sofort weiter verwendet. Der durchschnittliche Umwar.dlungsgrad zu 6-Aminopenicillansäure von 50 aufeinander folgenden Versuchen, jeder von 6stfendiger Dauer, beträgt 95 Prozent. *⁵

Beispiel 20

Die mechanische Stabilität eines gemäß Beispiel 1 hergestellten Enzympräparats, In dem das Substrat ein Dlvlnylbenzol-Methacrylsäure-Copolymsrlsai (Anberlite IRC-50) ist, wird mit einem In entsprechender Welse hergestellten Präparat verglichen, In dem das Substrat ein vernetzter Acrylsäureester mit neutraler Reaktion (Amberllte XAD-7) Ist.

1,6 kg Enzympräparat werden in 8 Liter 0,2 m-Phosphatpuffer, pH 7,8, bei 37° C suspendiert und 72 Stunden bei 200 UpM in einem Fermentator mit Staublechen gerührt. Alle 4 Stunden werden Proben entnommen und visuell auf das Zerbrechen von Harzperlen untersucht. Die Acrylsäureesterharz-Perlen brechen wesentlich ίο schneller als die Copolymerlsat-Perlen, so daß eine Probe dieses Harzes nach 64 Stunden einer Probe des Acrylsäureesterharzes nach 8 Stunden gleicht. Diese Ergebnisse zeigen die wesentlich größere mechanische Stabilität des Dlvlnylbenzol-Methacrylsäure-Copolymerlsats.

Beispiel 21

Gemäß der Arbeltswelse von Beispiel 1 werden 235 g eines Enzj mpräparats mit einer Aktivltäi von 39/, μΜοΙ/Mln./g hergestellt und zur Spaltung einer 6,25prozentlgen Kallumbenzyipenlclllln-G-Lösung In 10 aufeinander folgenden Versuchen verwendet. Jeder Versuch wird mit einem Liter Kaiiurribsnzyipcniciülri-Lösung bei

μ 37° C uns¹ F-H 7,8 während 2,5 Stunden durchgeführt. Nach jedem Versuch wird das Harz abfiltriert und mit destllllei-ftm Wasser gewaschen. Das Tlltrat und die Waschwasser werden In einem Umlaufverdampfer unter vermindertem Druck konzentriert, die konzentrierte Lösung wird mit einem entsprechenden Volumen Methyl-Isobutylketon vermischt, auf 4 bis 10° C abgekühlt und angesäuert. Dabei fällt dlle 6-Amlnopenlclllansäurp. aus, die mit wenig destilliertem Wasser gewaschen., mit Aceton gespült und Im Ofen getrocknet wird. Die durchschnittliche Ausbeute an 6-Aminopenicillansäure nach 10 Versuchen beträgt 91,3 Prozent.

Beispiel 22

JO Polyäthylentellchen (< 4M) μ.) mit einer niederen Dichte werden mit einem Urethan-Polymerisat (»Urlthane 641W«) überzogen und 10 Tage getrocknet. Dieses Material wird dann 1 Stunde lang mit 20prozentlgem wäßrigen Aceton gewaschen und eingehend mit destilliertem Wasser gespült. Portionen von 5 g dieses Polymerisats werden mit 125 ml einer Enzymlösung mit einer Aktivität von 54,0 μΜοΙ/Mln./mI und 3,80 μΜοΙ/Mln./mg Protein 5 Stunden bei einem pH-Wert von 4,8 bis 9,0 behandelt. Die urethanüberzogenen Teilchen werden abflltriert, mit 75 ml 3,3prozentlgem wäßrigen Glutaraldehyd 3 Stunden behandelt und gemäß Beispiel 1 auf pH 7,8 eingestellt. Obwohl die urethanüberzogenen Teilchen kleiner sind als die Dlvlnylbenzol-Methacrylsäure-Copolymertsatteilchen, erhält man Enzympräparate mit einer 2- bis 3mal kleineren Aktivität als die der erfindungsgemäßen Präparate.

ph Aktivität

μΜοΙ/Mln./g Feuchtgewicht

4,8	11,3
5,2	14,0
5,6	16,4
6,0	13,2
6,4	13,6
7,0	12,3
7,5	7,8
8,0	10,0
8,5	9,0
9,0	12,2
	Beispiel 23

ε-Amlnocapronsäure-Polymerisat mit einem Teilchendurchmesser < 30 μ (Nylon 6) wird 1 Stunde mit 65prozentiger wäßriger Ameisensäure gewaschen und Intensiv mit destilliertem Wasser gespült. Portionen von

10 g dieses Polymerisats werden mit 100 ml einer Enzymlösung mit einer Aktivität von 50,9 μΜοΙ/Min./ml und 4,7 μΜοΙ./Min./mg Protein 16 Stunden bei pH 4,8 bis 9,0 behandelt.

Das Polymerisat wird abfiltriert, 3 Stunden mit 100 ml 3,3prozentigem wäßrigen Glutaraldehyd behandelt und gemäß Beispiel 1 aufgearbeitet. Die höchste Aktivität erhält man bei pH 4,8, sie beträgt 41,7 μΜοΙ/Mln./g Feuchtgewicht und ist einem erfindungsgemäßen Präparat vergleichbar. Berücksichtigt man jedoch die verschledenen Teilchengrößen, so ist das erfindungsgemäße Präparat wesentlich aktiver. Bei Kupplung von PeniciHin-Acylase mit einem Divinylbenzol-Methacrylsäure-Copolymerisat mit einer Teilchengröße von 0,037 bis 0,149 mm erhält man Enzympräparate mit einer spezifischen Aktivität von 478 μΜοί./Μίη.^ Feuchtgewicht, d. h. 11 mal mehr als mit einem Enzym-Nylon-Präparat.

ph Aktivität

μΜοΙ/Min./g Feuchtgewicht

4,8	47,7
sa	36,1
5,6	26,9
6,0	22,9
6,4	15,7
7,0	17,6
7,5	17,6
8,0	21,3
8,5	15,7
9,0	9,3

Claims

Patentanspruch:

Wasserunlösliches Enzympräparat für die Gewinnung von 6-Amlnopeniclllansäure, bestehend aus einer Penicillin-Acylase mit Spaltaktivität In bezug auf die Amidbindung von Penlciliinkörpern, die mittels Glutaraldehyd, Glyoxal oder Formaldehyd an eine wasserunlösliche, feste, adsorbierende Substanz gebunden ist, dadurch gekennzeichnet, daß die Penicillin-Acylase Ober die Aldehydverbindung an ein wasserunlösliches Polymerisat oder Copolymertsat der Methacrylsäure als feste adsorbierende Substanz gebunden Ist.