DE2308037A1

DE2308037A1 - Verfahren zur herstellung eines antiserums zur serologischen identifizierung von pathogenen arten von candida

Info

Publication number: DE2308037A1
Application number: DE19732308037
Authority: DE
Inventors: Yoshimura Fukazawa
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1972-07-04
Filing date: 1973-02-19
Publication date: 1974-01-24
Also published as: JPS516729B2; CH564352A5; JPS4926418A; FR2190424A1; NL7302127A; GB1411661A; FR2190424B1

Description

Priorität: 4. Juli 1972, Japan, Kr. 66 389/1972

Verfahren zur Herstellung eines Antiserums zur serologischen Identifizierung von pathogenen Arten von Candida

Die Erfindung betrifft die serologische Identifizierung von pathogenen Arten der Hefe-Candida und insbesondere ein Verfahren zur Herstellung von Antiseren zur Verwendung bei einer solchen Identifizierung.

Es ist bekannt, daß pathogene Arten und Stämme von Candida bei Menschen Infektionen bewirken, welche im allgemeinen als Candidiasis bezeichnet werden. Eine erfolgreiche medikamentöse Behandlung der Infektion macht eine Identifizierung des spezifischen pathogenen Mikroorganismus notwendig, welcher aus dem klinischen Material isoliert wird. Die morphologischen und biochemischen Tescs sind schwierig und zeitraubend. Es sind daher von T. Tsuchiya et al raschere und verläßlichere serologische Methoden vorgeschlagen -worden (Mycopathologia et Mycologia Applicata 26 1965, Fasel).

IÖ98Ö4/U34

ORIGINAL tNSf>ECT6D

Diese Methoden sind von Y. Fukazawa (Kensa, Japan, 3, März April 1972) weiterentwickelt worden. Alle Hefen werden serologisch in fünf Gruppen eingeordnet. Alle pathogenen Stämme von Candida gehören nun zu der Gruppe, deren Glieder mindestens einen mit Candida albicans gemeinsamen Antigen-Paktor besitzen. Die antigenen Strukturen von typischen Hefen, welche mit Candida albicans gemeinsame Antigen-Faktoren haben, sind in Tabelle I aufgeführt. Sie werden nach den von T. Tsuchiya et al entwickelten Kriterien identifiziert.

Zur serologischen Identifizierung von pathogenen Candida-Arten sind sieben Antiserum-Faktoren erforderlich, welche den Antigenen 6j 8, 9j 11* 1J5* l^b und ~}h in den Antigen-Formeln von Tsuchiya entsprechen. Es war daher bislang sehr schwierig, spezifische Faktor-Antiseren mit hohem Titer herzustellen, da die in Betracht gezogenen Hefen mehrere gemeinsame Antigene besitzen und komplexe Reaktionen zeigen.

Es ist bislang die allgemein übliche Praxis gewesen, ein Antiseruir. für Candida in einem Warmblütler zu induzieren, indem man mit den gesamten Hefezellen eine allmähliche Immunisierung vornimmt. Das aus dem Blut des immunisierten Tieres erhaltene Antiserum zeigt eine niedrige homologe Spezifizität. Um ein Antiserum, welches gegenüber einem Antigen-Faktor spezifisch ist, zu erhalten, war es daher notwendig, die Antikörper-Fraktion des Antiserums in Unterfraktionen aufzuteilen. Dies erfolgte durch Ionenaustausch, Chromatographie oder Gelfiltration. Das auf diese Weise hergestellte Antiserum mit einem spezifischen Faktor war aber zu teuer, als daß seine routinemäßige Verwendung in klinischen Laboratorien möglich gewesen wäre.

Es wurde nun gefunden, daß ein Antiserum mit einer hohen homologen ^Spezifizität hergestellt werden kann, wenn man nur das Zellwand-Mannan der Hefezellen verwendet und wenn man das Mannan mit einen heterologen Proteinträger verbindet, welcher "sich von einer anderen Quelle als Hefezellen herleitet.

30988WU34

Das angestrebte spezifische Antiserum wird gebildet, wenn der Mannan-Protein-Komplex parenteral, z.B. intravenös oder subkutan einem Warmblütler verabreicht wird und wenn das Serum aus dem Blut des immunisierten Tieres auf die herkömmliche Weise durch Entfernung der Blutkörperchen und des Fibrinogens gewonnen wird. Diese Arbeitsweise ist relativ billig.

Das Zellwand-Mannan wird von den Zellen einer Hefe abgetrennt. welche das gewünschte Antigen hat, d.h. einen der Antigen-Faktoren 6, 8, 9, 13, 13b und 34. Geeignete Hefen können ohne weiteres aus der Tabelle I ausgewählt werden. Die in Tabelle I aufgeführten Hefen finden sich in dem Katalog des "Centraal bureau voor Schimmelcultures, 27. Auflage, I96S¹¹. Diese Hefen sind von der Niederlegungsstelle in Delft, Niederlande, frei erhältlich.

Die Abtrennung des Mannans von den Zellwänden der gewählten Hefe kann nach bekannten Verfahrensweisen erfolgen. Wässrige alkalische Lösungen oder heißes Wasser lösen das Mannan auf, welches aus der resultierenden wässrigen Lösung durch ein geeignetes organisches wasserunmischbares Lösungsmittel ausgefällt werden kann. Dieses kann sodann durch Umwandlung in den Kupfer-Mannan-Kornplex gereinigt werden, welcher sodann zersetzt wird, um für die Zwecke dieser Erfindung angemessen reines Mannan zu liefern.

Das Zellwand-Mannan dient als Hapten, welches mit einem heterologen Proteinträger kombiniert wird, wobei sich das Protein von Jeder beliebigen Hefe-fremden Quelle herleitet, z.B.t-Globulin oder Albumin. Pur diese Zwecke wird geeigneterweise Rinder-/*- Globulin verwendet. Dieses Globulin wird bevorzugt. Das Mannan wird chemisch in an sich bekannter Weise an das Protein gebunden, wobei z.B. polychlorierte Triazine oder Bromacetylbromid verwendet werden kann. Der auf diese Weise erhaltene Mannan-Protein-Komplex wird beispielsweise durch Dialyse oder andere herkömmliche Methoden gereinigt, um Ausgangsstoffe und unerwünschte Reaktionspro dukte zu entfernen, um toxische Nebenreaktionen zu vermeiden, wenn

309884/-U34

der Komplex Wartnblütlern parenteral verabreicht wird, um diese Tiere durch Bildung eines Antiserums zu immunisieren. Das Antiserum wird auf herkömmliche Weise gewonnen, nachdem der gewünschte Titer erhalten worden ist. Die Bezeichnung "Titer" soll die maximale Verdünnung des Antiserums bezeichnen, welches die gewünschten serologischen Reaktionen ergibt.

Ein Antiserum, welches gegenüber einem der Tsuchiya-Faktoren spezifisch ist, kann erhalten werden, wenn man das ursprüngliche Produkt einer direkten Absorption auf Hefezellen unterwirft, welche heterologe Antigene besitzen, welche den Antikörper-Faktoren entsprechen, die aus dem Serum entfernt werden sollen. In den meisten Fällen wird die angestrebte Spezifizität mit den rohen erfindungsgemäß hergestellten Antiseren in einer einzigen Absorptionsstufe erhalten. Die Anzahl der darauffolgenden Absorptionen, die zur Unterdrückung einer weiteren Agglutinierung zwischen dem Antiserum und den Antigen-tragenden Zellen erforderlich ist, ist selbst bei ungünstigen Bedingungen geringer als bei dem bekannten Verfahren, welche die gleiche Arbeitsweise anwenden.

Es hat sich gezeigt, daß Kaninchen geeignete Wirtstiere zur Herstellung der erfindungsgemäßen Antiseren sind. Es können aber auch alle beliebigen anderen Warmblütler verwendet werden, welche dazu imstande sind, in Beantwortung auf die Antigen-Komplexe dieser Erfindung Antikörper zu bilden. Beispiele hierfür sind Geißen, Schafe, etc.

Die Erfindung wird in den Beispielen erläutert. Darin sind sämtliche Prozentangaben auf das Gewicht bezogen, falls nichts anderes angegeben ist.

Beispiel 1:

loo g gepackte Zellen von Candida pseudotropicalis NI 7494 wurden in 5oo ml 2^-iger KOH-Lösung suspendiert. Die Suspension wurde

2 Stunden auf loo°C erhitzt, auf einen pH-Wert von 6,ο eingestellt

30988WU34

und bei Raumtemperatur über Nacht stehengelassen. Sodann wurden die Zellen durch Zentrifugieren entfernt.

Das überstehende Produkt wurde bei 45°C auf 5oml eingedampft und mit 2oo ml Methanol verdünnt, wodurch rohes Mannan ausgefällt wurde, welches durch Zentrifugieren abgetrennt wurde. Eine Lösung des Niederschlags in loo ml Wasser wurde 2 Stunden bei loc°C gehalten, um Verunreinigungen auszufällen welche durch Zentrifugierung entfernt wurden. Der Mannan-Kupfer-Komplex wurde aus der überstehenden Flüssigkeit ausgefällt, indem loo ml Fehlirig'sche Lösung zugefügt wurden. Der Niederschlag wurde durch Zentrifugieren abgetrennt und nacheinander mit wässriger Kaliurnhydroxid-Lösung und Methanol gewaschen. Das Produkt wurde in einer wässrigen Suspension mit kornförmigem Amberlite IR-12o, einem Ionenaustauscher-Harz zersetzt. Die HarzteJlchen wurden abfiltriert und das Filtrat wurde im Vakuum auf 2o ml eingeengt. Das Konzentrat wurde mit l9o rr.l Methanol vermischt und es wurden einige Tropfen konzentrierte Salzsäure zugegeben. Nach dem Stehenlassen über Macht war gereinigtes Mannan ausgefallen. Dieses wurde durch Zentrifugieren abgetrennt und nacheinander mit Methanol gewaschen und hierauf getrocknet. Das Gewicht des Produkts betrug 1,1 g.

2oo mg gereinigtes Mannan wurden in Wasser aufgelöst. Zu der Lösung wurden Io mg Cyanurchlorid gegeben. Die Lösung wurde sodann 1 Stunde bei ²I⁰C gerührt. 2oo mg Rinder-/-Globulin wurden getrennt in physiologischer Kochsalzlösung aufgelöst. Die beiden Lösungen wurden vermischt und das Gemisch wurde 1 Stunde bei 25⁰C gerührt. Sodann wurde es l8 Stunden bei 4°C stehengelassen. Sodann wurde es gegen Wasser dialysiert und mit Wasser auf loo ml verdünnt.

Io ml der dialysierten verdünnten Lösung wurden mit 1 ml lo^-iger Kaliumaluminiuinsulfat-Lösung vermischt. Der pH-Wert des Gemisches wurde durch Zugabe von lo^-iger Natriuncarbonatlösung auf 6,5 eingestellt. Der auf diese Weise gebildete Niederschlag wurde in

3 0 9 8 8 4/H 3 4 _ 6 -

NaCl-Lösung' suspendiert und homogenisiert. Das homogenisierte Material wurde mit physiologischer Kochsalzlösung verdünnt, wodurch eine Antigen-Suspension erhalten wurde, welche 67/u/ml Mannan enthielt.

Kaninchen wurden intravenöse Injektionen der Suspension in Intervallen von 5 Tagen verabreicht. Die Dosierung v/urde von o,5 rcl bei der ersten Injektion auf l,o ml in der zweiten Injektion und hierauf auf 2_} ο ml erhöht. Die Injektionen wurden fortgeführt, bis der Tuben-Agglutinin-Titer des aus dem Kariinchenblut hergestellten Antiserums über l:64o hinausging. Sodann wurde das Kaninchen von der Halsschlagarterie verbluten gelassen und ein Serum wurde auf die übliche Weise hergestellt.

Nach der gleichen Arbeitsweise wurde aus Kluyveromyces fragilis IFO o5^1 ein Mannan-J^-Globulin-Antiseruir. hergestellt. Aus loo g Zellen des letzteren Mikroorganismus wurden aber nur o,8 g gereinigtes Mannan erhalten. Beide Antiseren waren gegenüber dem Antigen-Paktor 8 spezifisch.

Zu Vergleichszwecken wurden GesamtzeJien-Antiseren aus C.paeudotropicalis NI 7^94 und K.fragilis IFO o5^;41 in herkömmlicher Weise hergestellt. In Tabelle II sind die Tuben-Agglutinin-Titer der Mannan-/'-Globulin- und Gesamtzellen-Antiseren für verschiedene Hefe-Antigene aufgeführt.

Beispiel 2;

Mannan wurde aus Zellen von Candida guilliermondii ATCC 9o5Ö abgetrennt. Wie im Beispiel 1 wurde ein Mannan-y^Globulin-Antiseruin hergestellt. Zu Vergleichszwecken wurde gleichfalls ein Gesamtzellen-Serum hergestellt.

In Tabelle III sind die Agglutinierungs-Titer der zwei Antiseren für homologe und heterologe Hefezellen zusammengestellt.

3Q9884/U34 " ⁷ "

Das Mannan-Z'-Globulin-Serurn wurde an erwärmten Zellen von Candida albicans ATCC Io259 absorbiert. Durch eine erste Absorption wurde ein Serum mit einem spezifischen Faktor 9 erhalten. Der Agglutinin-Titer davon war höher als derjenige als des entsprechenden Gesamtzellen-Antiserums.

Beispiel J>:

Mannan-Z-Globulin-Antiseren und Gesamtzellen-Seren wurden aus ο

Candida parakrusel ATCC 6259 und Metschnikowia pulcherrima IFO 056I nach der Arbeitsweise des Beispiels 2 hergestellt. In der Tabelle IV sind die Tuben-Agglutinin-Titer der Antiseren für homologe und heterologe Hefezellen zusammengestellt.

Die Mannan-Z'-Globulin-Antiseren wurden an Candida albicans ATCC I0259 (Serotyp A) absorbiert. Durch eine erste Absorption wurde ein Faktor-13-Serum mit einem hohen Titer erhalten. Die Mannrn-J^Globulin-Antiseren waren für die direkte Verwendung als Faktor-lj5b-Seren ohne eine Absorption genügend spezifisch.

Beispiel hi

Mannan wurde aus Zellewänden von Torulopsis glabrata IFO 0005 hergestellt. Es wurde der entsprechende Mannan-Z^Globulin-Komplex gebildet. Nach der Arbeitsweise des Beispiels 1 wurden Antiseren für den Komplex und für die Gesamtzellen von T.glabrata hergestellt. In der Tabelle V sind die Tuben-Agglutinierungs-Tite: der Antiseren für homologe und heterologe Hefen zusammengestellt.

Ein Faktor-3^""Serum mit hohem Titer wurde aus dem Mannan-Z^Globulin-Antiserum durch eine erste Absorption an Candida albicans ATCC I0259 (Serotyp A) erhalten.

Beispiel 5;

Candida krusei NI 7492 und Pichia fermentans CBS I87 wurden anstelle der in Beispiel 1 genannten Hefen verwendet. Es wurden die Tuben-Agglutinin-Titer der Mannan-/"-Globulin-Antiseren und

309884/U34

der Gesamtzellen-Antiseren für die homologen und h£erologen Antigene der Hefezellen bestimmt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle VI zusammengestellt.

Die Mannan-J'-Globulin-Antiseren ergaben nach einer ersten Absorption auf Candida albicans ATCC Io259 ein Faktor-11-Anti serum.

Beispiel 6;

Candida albicans ATCC Io259 und Candida tropicalis ATCC 75^71 wurden beim Verfahren des Beispiels 1 verwendet. Unter Verwendung von Mannan-i^Globulin-Komplexen und Gesamtzellen der zwei Mikroorganismen wurden Kaninchen-Antiseren hergestellt und hinsichtlich ihrer Tuben-Agglutinin-Titer für homologe und heterologe Antigene von Hefezellen untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle VII zusammengestellt.

Ein Faktor-6-Antiserum wurde aus den Mannan-j^-Globulin-induzierten Antiseren durch eine erste Absorption an Candida stellatoidea ATCC Io264 erhalten.

3098 8 A / 1434 - 9 -

Fortsetzung Tabelle I

H.beijerinckii	3
H.murakli	5
H.saturnus	9
H.suavelolans	4
H.bimundalis	2
H.bim.v.americana	2
H.fabianii	2
H.pettersonii	2
H.silvicola	2
H.subpelliculosa	1
H.schneggii	3
H.pnomala	42
H.anom.ν.elferrii	7
C .pelliculosa •	4
C.pcll.v.cylindrica	1
H.Jadinii	1
C.utilis	6
T.utilis	1
H.minuta	CVJ
H.canadensis 1	2
H.wingei	4
H.beckii	1
T.Candida	3
D.subglobosus	1
D.coudertii	1

1,16,20,21,22 1,16,20,21 1,16,20,21 I,l6,2o,21 1,(16),2o,21 1,(16),2o,(21) 1,(16),2o, (21) 1,(16),2o,21

1,(16),2ο 1,16,2ο
1,16,2ο
1,16,2ο
1,16,2ο
1,16,2ο
1,(16)

1,(16)

1,5,45

1,5,18,25,48

1,9, (14),33

1,9,14,33

1,9,14

2, 14,15,(17) 2, 14,15,(17) 2, (14), (15), (17) 2, 14,15,(17) 2, 14, (15),17 2, 14,(15),17

ρ 2, 14 ,15,17

2,14(15).

2,14,15

2,14,(15),(17)

2,14,15,(17)

2,14,15

(c) (2),14,17

C (2), (14),17

(c) (2),14,17

2,17,31

2,17,31 • 2,3,4

2,3,4 ,

2,3,4

OJ O 00 O CO

Fortsetzung Tabelle I

T.famata 5

D.kloeckeri 12

D.marama 1

D.nicotianae 4

D.hansenii 12

T.globosa 2

H.matritensis 2

Schw.occidentalis 2

t^ C.guilliermondii 68

C<?uil.v.membranaefac. 1

» C.melibiosi 2

*«. C. cenuis 3

^ C.rreylanoides 2

** H.liclstii 2

*- T.ornbbii 1

C.parapsilosis 84 (C p&^akrusei)

C.par.v.intermedia 3

C.pulcherriaia 4

D.castellii 1

D.cantarellii 1

S.rosel 18

T.stellata 2

T.stel.v.carnbresieri 1

S.ferrcentati 1

T.colliculosa 5.

1,(9), (14) 1.(9). (14) 1,9,(14)

1.(9), (14)

1.(9). 14

1,9,14

1,9,(14)

1,9,14

1,9

1,13

1,(13)

1,13

1,13,13b

1,13

1,4,24

	2,3,4	*	(14),	(5),(	(15)	O	15
	2,3,4		(14),		(15)
	2,3,4		(14),		(15)		TSJ
	2,3,4		14,		(15)		Os)
	2,3,4		2,3,(5),14,		(15)		O
	2,3,4	17	2,(3),				CO
	2,3,4		3			O
J	2,3,4		3			co
	2,3,4
	2,3,4		3
	2,3,4		3 ^:
	2,3,5
(a),	c,h 2,3,4,		3

C
C
C
d
a
		2,3, (14), (15)
	2,3,5,
	2,3,5,
	2,3,5,
	2,3,5,

Fortsetzung Tabelle I

	D.franciscae	1
	D.globosus	2
	T.glabrata	162
	S.delbrueckii	17
	S.delb.v.mongolicus	4
	S.bisporus	4
	S.acidifaciens	5
	S.exiguus	7
	T.homii	5
	G/r ovina	1
ο	C.stellatoidea	6
	T.sake	1
	G.tropicalis	2ol
JT*	G.rrop.v.Iambica	1
	u.claussenii	3
0»	G dlbicans (I) (oerotyp A)	1485
	G.albicans (II) (Serotyp A)	5
	C.albicans (III) (Serotyp B)	21
	Sm.ludwigii	2
	C.intermedia	2
	K.magna	W
	K.africana	4
	K.corticis	1

1,24,27

1,6,3^

1,^,6,23

1,4,6,23

1,4,26

1,4,6,26

1,(4),6,26

1,4,39

1,4

1,4,6

1,4,6,7

1,4,6 1,4,13b

1,4,6,(7) 1,4,6,38 l,6,(7),4o l,6,(7),4o 1,6, (7),4o

3,lo· 3,io 3,5,(lo) 3,5,(lo) 3,lo 3, (lo) 3,(5),lo,32 3, (5),10,32 2,3,lo,32 2,3,5,lo,32 2,3,5 2,3,5 2,3,5 2,3,5 2,3,5

2,3,5 2,3,5

.2,3,5 2,3,5,24 2,3,5 2,3,5 2,3,5 s

K) CO O OO O

Fortsetzung Tabelle I

O CD OO 00

K.antillarum	2
Hs.csmophila	1
Hs.vineae	2
K. javanica	2
K.jensenii	1
K.lafarii	2
K.apiculate	2
K.japonica	1
Hr. .valbyensis	1
Hs.uvalum	1
H^.guilliermondii	1
S.irarxianus	Io
O .rracedoniensis	4
S.fragilis	2
C.p^eudotropicalis	15
C.ps.v.lactosa	3
Z. i.'i?uctuuni	1
S.microellipsodes	1
S.rr.ellis	1
S.bailii	1
S.ro-axii	14
3.roux.ν.polymorphus	1
S.carlsbergensis	7
S.pastoriznus	1
S.elegans	1
S.veronae	1

l,6,(7),4o

1,6, (7Mo

1,6, (7),io,28,4o

l,6,(7),lo,28,4o

1,6, (7), lo,28,4o

l,lo,28

1,10,28

l,lo,28

l,lo,28 l,lo,28

.l,(lo),28 1, (lo),28 l,(lo),28

l,lo,28

2,3,5

2,3,5,8

a 8,31 (a) 8,31 a 8,31 a' 8,31 a 8,31

2,8,14,31

(2),8, (14),31

(8), (3D, (32)

8,32

(8),32

8,32

4,5,8,(52)

2,8,14,(32)

OJ CD CO O

Fortsetzung Tabelle I - i4 -

T.dattila 1 I,lo,28,l8 ■ 31,32

S.italicus 1 1,10,28,(18) (2),(3),8,14,31

S.chevalier! 3 I,(lo),l8 2,3, (8), (14),31

S.heterogen!cus 1 Ι,ΐο,ΐδ 2,3,14,(31)

S.diastaticus 2 I,lo,l8 2,3,14,31

S.ouiformis 1 l,lo,18 2,3,14,31

S.bayanus 2 l,lo,18 2,3,14,31

S.logos 3 Ι,ΐο,ΐδ 2,(3),14,31

S.uvarum 3 l,lo,18 2,3,14,31

I₁J S.florentinus 1 l,lo, 18 2,3,14,31

g N.coryli 2 I₄(Io),18 2,3, (l4),31

£» S.cerevisiae 12 I,lo,l8 a,e 2,3,(l4),31

*- S.ccr.V.ellipsoideus 9 I,lo,l8 a,e 2,3,(l4),3l

_^ C.robusta Io I,lo,l8 a,e 2,3, (l4),31 ^

£ S,wj,llianus 6 Ι,ΐο,ΐδ (a), (e) 2,3, (l4),31

*■* S.sieineri. 1 I,lo,l8 e 2,3,14,31

^lretis 1 1,10,18,42 2, (3), 14, (31)

af.fluorescens 1 I,lo,l8,43 2,(3),l4,31

T.gropergiesseri 1 l,lo,35,46 η (2)

T.rnagnoliae 5 l,lo,35 2

T.lactis-condensi 2 l,(lo),35 (2)

T.anomala 1 l,lo,35,36

T.versatilis 3 1,(lo),35,36 K)

D.tamarii 1 35,44 a ' (2) £j

Die arabischen Zahlen und die Buchstaben bedeuten thermostabile und thermolabile - I^ - 5~?

Antigene, welche die Hefen besitzen. ,

Tabelle I

Art	Untersuchte	1,5,11
	Stämme	1,5,11
P.-f ermentans	5	1,5,(11),
P.krusei	1	1,5,11
C.krusei	138	1,5,11
C.catenulata	3	1,5,11,12
D.fluxorum	2	1,5,11,12
P.membranaefaciens	6	1,5,11,12
n.mycoderma	8	1,5,(11),(12)
to C.trigonopsoides	1	1,(5), (η), (12)
°T.inconspicua	3	1,11,19
⁰⁰ C.reukaufii OO	2	1, 19
*·». O.rugosa	12	1, 29
_4 O.brumptii	4	1, 25
ft P.farinosa co	2	1,5, 25
*- S.postori	1	1,5,11,25
C.meIinil	4	1,(5),11
T.pinus	1	1,5,11,12,47
H.angusta	4	1,5,11,13,37
H.capsulata	1	1,5,11,12,18
C.solanii	3	1,5,11,12,18
C.fi.iietaria	1	1,16,20,21,22
P.terricola	1
ri.oalifornica	2

(Antigenes Schema von Hefe, welche mit C.albicans gemeinsame antigene Faktoren besitzt)

Antigene

	2	3,	3,	4	17,24	rs: (< ^
b	2				,17	CC
b	2	3,		4	(17)	O
b	2	(3),	3,	4,	(17)	CO
m	2	2,		Io
	2	2,			2o,21
	2	2,			,31
	2	2,		4	,(15), (17)
	2	2,			,(15), (17)
b,f	2	2,		14
g	2,	2,		14
	2	2,		14
	2,






C
C

- "Sl -

308037

Tabelle II

	Tuben-Agglutinin-Titer	. K.frag.	1:1	O	von Antiseren	K.frag.
•	Mannan-^-Globulin	O	I:l6o	Gesamtze1len-Serum	l:8o
	Antiserum	O		l:4o
Antigen	C.pseud.	O	C.pseud.	l:2o
ATCC I0259 C.albicans (Serotyρ Α)	O	l:128o	l:lo	l:64o
NIH B-792 C albicans (Serotyρ B)	O	l:12o	1:1	l:2o
ATCC 73^7 C. tropicalis	O	l:8o l:128o	O	I:l6o
ATCC Io264 C. stellatoidea	O	l:8o	l:128o
ATCC 9058 C. guilliermondii	O	l:4o	I:l6o
ATCC 6259 C. parakrusei	O	1:1	l:64o l:256o
NI 7^94 C. pseudotropic.	l:64o	l:128o
NI 7^92 C. krusei	O	l:8o
IFO 0005 T.glabrata IFO 05²U K.fragilis	O	l:64o

309884/ U34

- 16

Antigen

Tabelle III

Tuben-Agglutinin-Tlter von Antlseren Mannan-AGlobulin Gesamtzellen-Serum

	Antiserum
ATCC Io25 C.albicans (Serotyp A)	1:64ο
NIH B-792 C.albicans (Serotyρ B)	1:64ο
ATCC 7347 C.tropicalis	1:64ο
ATCC Io264 C.stellatoidea	1:32ο
ATCC 9058 C.gulliermondii	1:128ο
ATCC 6259 C.parakrusei	1:1
NI 7^92 C.krusei	ο
NI 7494 C.pseudotropi calls	1:1ο
IPO 0005 r.glabrata	1:64ο

1:256ο

1:256ο 1:256ο 1:128ο 1:256ο 1:64ο

1:8ο

1:16ο

1:256ο

- 17 -

30988A/1434

230803?

Tabelle IV

	Tuben-Agglutinin-Titer	M.pulch.	von Antiseren
	Mannan-J^-Globulin Antiserum	l:8o	Gesamtzelien-Serum
Antigen	C.paräkr.	l:8o	C.paräkr. M.pulch.
ATCC I0259 C.albicans (Serotyp A)	l:64o	O	l:64o l:128o
NIH B-792 C.albicans (Serotyp B)	l:64o	O	l:64o l:128o
ATCC 7247 C.tropicalis	O	O	I:j52o l:32o
ATCC Io264 C.stellatoidea	I:l6o	!:32ο	l:32o l:128o
ATCC 9058 C.guilliermon- dii	l:8o	O	l:52o l:64o
ATCC 6259 C.parakrusei	l:128o	l.lo	l:128o l:256o
NI 7492 C.krusei	l.lo	I:l6o	l:lo l:2o
NI 7494 C.pseudotropic	l:4o	l:64o	l:4o l:64o
IFO. 0005 T.glabrata	l:4o	1,380 1O20
IFO 0561 M.pulcherrima		1:2560

309884/U34

- 18 -

-Ί8 -

Tabelle V Tuben-Agglutinin-Titern von Antiseren

Mannan-/-Globulin Gesamtzellen-serum

Antiserum

mibx&eii ATCC I0259 C.albicans (Serotyp A)	1: 32ο
NIH B-792 C.albicans (Serotyp B)	1:1ο
ATCC 73^7- C.tropicalis	1:32ο
ATCC Io264 C.stellatoidea	1:1
ATCC 9058 C.guilliermondii	1:ΐ6ο
ATCC 6259 C.parakrusei	ο
NI 7^92 C-krusei	0
NI 7494 C.pseudotropicalis	1:1ο
IFO 0005 T.glabrata	1:128ο

1: 256ο

1:32ο 1:64ο 1:64ο 1:128ο 1:1ο 1:1

1:32ο 1:256ο

- 19 -

309884/U34

Tabelle VI

Tuben-Agglutinln-Titer von Antiseren

Mannan-^*"- Globulin _t Gesamtzellen-Serum Antiserum

Antigen	C.krusei	P.ferment.
ATCC Io259 C.albicans .	l:8o	l,*o
NIH B-792 C.albicans	I:l6o	I:l6o
ATCC 75^7 C.tropicalis	1:1	1-Λο
ATCC Io264 C.stellatoidea	l:8o	l:8o
ATCC 9058 C.guilliermondii	l:2o	l:4o
ATCC 6259 C.parakrusei	I:l6o	I:l6o
NI 7^92 C.krusei	l:128o	l:128o

C.pseudotropicalis 1:1

CBS 187

P.fermentans

l:2o

l:128o l:128o C.krusei P.ferment

I:l6o

l:32o

I:l6o

l:64o

l:128o

30988A/U34 - 2o -

- 2ο -

Tabelle VII

	Tuben-Agglutinin-Titer	C.tropic.	von Antiseren	C.tropic.
	Mannan-Z^-Globulin Antiserum	l:128o	Oesamtzellen-Serum	l:128o
Antigen	C.albic.	1,32ο	C.albic.	l:32o
ATCC I0259 C.albicans	l:128o	l:128o	it 1280	l:128o
NIH B-792 C.albicans	1.32O	I:l6o	l:32o	X OZo
ATCC 7347 C.tropicalis	l:128o	l,64o	l:128o	1,64ο
ATCC Io264 C.stellatoidea	l:32o	O	l:32o	1.32O
ATCC 9058 C.guilliermondii	1:6*0	O	l:64o	l:8o
ATCC 6259 C.parakrusei	O	l:32o
NI 7492 C.krusei	O	l:4o

NI
C.pseudotropicalls

l:8o

I:l6o

ATCC: American Type Culture Collection: Rockville, Maryland, U.S.A.

NI:

Nagao Institute: Setagaya, Tokyo, Japan

CBS: Centralbureau voor Schimmelcultures: Baarn, Netherlands

IFO: Institute for Fermeriation: Osaka, Japan

NIH: National Institute of Health: Bethesda, Maryland, U.S.A.

- Patentansprüche -

30988 WU34

- 21 -

Claims

Patentansprüche

1. Verfahren zur Herstellung eines Antiserums für die serologische Identifizierung von pathogenen Arten von Candida, dadurch gekennzeichnet, daß man

(a) Zellwand-Mannan von einer Hefe abtrennt, welche mit Candida albicans mindestens einen gemeinsamen Antigen-Paktor besitzt,

(b) dieses Mannan an ein Hefe-fremdes Trägerprotein bindet, um einen Hapten-Trägerkomplex herzustellen, wobei das Mannan in dem Komplex das Hapten darstellt,

(c) den erhaltenen Komplex einem Warmblutler in einer genügenden Menge parenteral verabreicht, daß die Bildung eines Antiserums induziert wird, welches Antikörper enthält, die gegenüber der homologen Hefe in dem Blut des Tieres spezifisch sind und daß man

(d) das Blut gewinnt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das Mannan an das Protein durch Umsetzung mit polychlorierten Triazinen oder mit Bromacetylbromid bindet.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Protein Rinder-/^-Globulin verwendet.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5* dadurch gekennzeichnet, daß man als Warmblutler Kaninchen verwendet und daß man den Komplex den Kaninchen durch intravenöse

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Injektion verabreicht;

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzei chnet , daß man die Blutkörperchen und das Fibrinogen aus dem Blut entfernt, um das Antiserum herzustellen.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5* dadurch gekennzei chne t , daß das Antiserum Antikörper enthält, welche gegenüber einer Vielzahl von Antigen-Paktoren reaktiv sind und daß man das Antiserum mit einer Hefe mit weniger als allen der Antigen-Faktoren in "Berührung bringt, bis die gegenüber den Antigenen der Hefe reaktiven Antikörper durch die Hefe im wesentlichen vollständig absorbiert sind.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß man als Hefe Candida albicans oder Candida tropicalis verwendet und daß das Antiserum einen Antikörper enthält, der gegenüber dem Antigen 6 spezifisch ist.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß man als Hefe Candida pseudotropicalis oder Kluyveromyces fragilis verwendet und daß das Antiserum ein Antikörper enthält, der gegenüber dem Antigen 8 spezifisch ist.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß man als Hefe Candida guilliermondii verwendet und daß das Antiserum ein Antikörper enthält, welcher gegenüber dem Antigen 9 spezifisch ist.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch

jpara gekennzei chnet, daß man als Hefe Candida ^ Krusei oder Metschnikowia pulcherrima verwendet und daß das Antiserura einen Antikörper enthält, welcher gegenüber'dem Antigen lj> spezifisch ist.

30988WU34 - 23 -"

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet , daß man als Hefe Candida parakrusei oder Metschnikowia pulcherrima verwendet und daß das Anti serum einen Antikörper enthält, der gegenüber dem Antigen Ij5b spezifisch ist.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet , daß man als Hefe Pichia fermentans verwendet und daß das Antiserum einen Antikörper enthält, der gegenüber dem Antigen 11 spezifisch ist.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch

gekennzeichnet, daß man als Hefe Torupsls glabrata verwendet und daß das Antiserum einen Antikörper enthält, welcher gegenüber dem Antigen 3^ spezifisch ist.

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ORIGINAL INSPECTBD