DE2713536A1

DE2713536A1 - Verfahren zur herstellung von stickstoffhaltigen polysacchariden

Info

Publication number: DE2713536A1
Application number: DE19772713536
Authority: DE
Inventors: Takayoshi Fujii; Fumio Hirose; Yoshio Ohmura; Eiichi Takahashi; Saburo Ueno; Toshihiko Wada; Chikao Yoshikumi
Original assignee: Kureha Corp
Current assignee: Kureha Corp
Priority date: 1976-07-07
Filing date: 1977-03-26
Publication date: 1978-01-12
Also published as: BG33008A3; FR2361909A1; SE441893B; MX4255E; SE7703264L; GB1570538A; DK145424C; FR2361909B1; HU176828B; IN144759B; BE853178A; PL103468B1; YU39796B; IT1075830B; PL197371A1; YU76477A; AR217256A1; BR7704434A; ES457723A1; NL169197B

Description

DR. J.-D. FRHR. von UEXKÜLL DR. ULRICH GRAF STOLBERQ DIPL-ING JÜRGEN SUCHANTKE

Kureha Kagaku Kogyo ^ (Prio: 7. Juli 1976 Kabushiki Kaisha _{JA 8O665/1976} _ _138?8)

No. 8, Horidome-cho 1-chome,

Nihonbashi, Chuo-ku, Tokyo

Japan Hamburg, 24. März 1977

Verfahren zur Herstellung von stickstoffhaltigen Polysacchariden

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur vorteilhaften Herstellung eines stickstoffhaltigen Polysaccharids mit Antitumoraktivität durch Extraktion eines zur Gattung Coriolus der Klasse Basidiomycetes gehörenden Pilzes in mehreren Stufen unter Verwendung eines wässrigen Lösungsmittels.

Es ist bekannt, daß man ein Polysaccharid mit Antitumoraktivität erhalten kann durch Raffinieren des Extraktes eines Pilzes der Klasse Basidiomycetes mit einem wässrigen Lösungsmittel. Eine solche Verfahrensweise hat jedoch einen schwerwiegenden Nachteil, da die Extraktionseffektivität bezüglich der aktiven Komponente gering ist, was zu einem erheblichen Verlust an wertvoller Antitumorsubstanz führt. Deshalb hat ein solches Verfahren nur eine geringe praktische Verwertbarkeit. Dies gilt insbesondere hinsichtlich der Anwendbarkeit eines solchen Ver-

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fahrens für die industrielle Produktion von Antitumorsubstanz aus dem Pilz.

Es wurde gefunden, daß ein stickstoffhaltiges Polysaccharid mit Antitumoreffekt und verschiedenen anderen pharmakodynamischen Effekten in hoher Ausbeute erhalten werden kann, wenn ein zur Gattung der Coriolus Polyporaceae der Klasse Basidiomycetes gehörender Pilz zuerst mit Wasser oder einer verdünnten wässrigen alkalischen Lösung und dann schrittweise mit wässrigen alkalischen Lösungen allmählich zunehmender Konzentration extrahiert wird.

Dementsprechend liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur vorteilhaften Herstellung eines stickstoffhaltigen Polysaccharids mit einer ausgezeichneten Antitumoraktivität und verschiedenen anderen pharmakodynamischen Effekten aus einem zur Gattung Coriolus der Klasse Basidiomycetes gehörenden Pilz zu liefern.

Zur Lösung dieser Aufgabe wird ein Verfahren zur Herstellung eines stickstoffhaltigen Polysaccharids mit Antitumoraktivität durch Extraktion eines zur Klasse Basidiomycetes gehörenden Pilzes mit einem wässrigen Lösungsmittel vorgeschlagen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man einen zur Gattung Coriolus Polyporaceae gehörenden Pilz anfänglich mit Wasser oder einer

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verdünnten wässrigen alkalischen Lösung und dann in weiteren Extraktionsstufen mit wässrigen alkalischen Lösungen allmählich zunehmender Konzentration extrahiert.

Der beim erfindungsgemäßen Verfahren als Ausgangsmaterial dienende "zur Gattung Coriolus gehörende Pilz" ist eine bekannte Spezies der zu Polyporaceae der Klasse Basidiomycetes gehörenden Pilze. Solche Spezies sind beispielsweise Coriolus versicolor (Fr.) Quel., Coriolus hirsutus (Fr.) Quel., Coriolus consors (Berk.) Imaz., Coriolus conchifer (Schw.) Pat., Coriolus pubescens (Fr.) Quel., Coriolus pargamenus (Fr.) Pat. und Coriolus biformis (Klotz.) Pat. (siehe "Colored Illustrations of Fungi of Japan" von Rokuya Imazeki und Tsuguo Hongo, Band I, 1974, und Band II, 1975). Coriolus versicolor (Fr.) Quel. (FERM-P Nr. 2414), Coriolus consors (Berk.) Imaz. (FERM-P Nr. 988), Coriolus hirsutus (Fr.) Quel. (FERM-P Nr. 2711) und Coriolus pargamenus (Fr.) Pat. (FERM-P Nr. 2712) sind unter den in Klammern angegebenen Hinterlegungsnummern im Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology (Chiba-shi, Japan), hinterlegt. Unter der Bezeichnung "zur Gattung Coriolus gehörender Pilz" sind auch die Fruchtkörper (fruit bodies) und/oder die Mycelen der oben genannten Pilzspezies zu verstehen. Am meisten bevorzugt beim erfindungsgemäßen Verfahren sind die Mycelen, die man aus künstlichen Kulturen von Coriolus versicolor (Fr.) Quel. erhält.

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Um das gewünschte stickstoffhaltige Polysaccharid aus den als Ausgangsmaterial dienenden Basidiomycetes nach dem erfindungsgemäßen Verfahren zu extrahieren, wird das Ausgangsmaterial mehrfach Extraktionsbehandlungen (Mehrstufenextraktion) unterworfen, das heißt, das Ausgangsmaterial wird zuerst unter Verwendung von Wasser oder einem wässrigen eine geringe Menge an Alkali enthaltendem Lösungsmittel (eine verdünnte alkalische Lösung) und dann in mehreren Stufen unter Verwendung wässriger Lösungen mit allmählich ansteigender Alkalikonzentration extrahiert. Während dieses Extraktionsverfahrens ist es möglich, die Extraktion unter Verwendung einer Extraktionslösung gleicher Konzentration zu wiederholen. Das "wässrige geringe Mengen Alkali enthaltende Lösungsmittel" bedeutet eine wässrige Lösung, in der beim Mischen mit dem Pilz der pH-Wert der wässrigen Phase bei etwa 7 oder tiefer liegt. Diese Angabe beruht auf der Tatsache, daß beim Vermischen von reinem Wasser oder einer 0,01 η Natriumhydroxidlösung mit dem Pilz der pH-Wert einer solchen Lösung aufgrund der Pufferwirkung des Pilzes im Bereich von etwa 4 bis 7 verbleibt.

Hinsichtlich der beim erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten wässrigen alkalischen Lösungen mit allmählich ansteigender Konzentration wird es bevorzugt, die Konzentration dieser Lösungen so einzustellen, daß die maximale Konzentration etwa 2 η oder weniger ist. Der Grund hierfür ist, daß bei höheren Konzentra-

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tionen eine Zersetzung der aktiven Komponente eintreten könnte. Bezogen auf das Trockengewicht des Ausgangsmaterials wird das wässrige Lösungsmittel beim erfindungsgemäßen Verfahren in einem 5- bis 200-fachen Gewichtsüberschuß verwendet und gewöhnlich erfolgt die Extraktion 20 Minuten bis 5 Stunden lang bei 50 bis 1OO C. Es sei darauf hingewiesen, daß Extraktionstemperaturen von weniger als 50°C zu einer schlechten Extraktionseffektivität führen, während Extraktionstemperaturen von über 100⁰C eine Zersetzung des Endproduktes bewirken können. Die Anzahl der Extraktionen beträgt gewöhnlich 2 bis etwa 10 und vorzugsweise 3 bis etwa 8. Vorzugsweise soll die Erwärmungszeit auf die oben angegebenen Temperaturen zur Verhinderung der Zersetzung der aktiven Komponente unabhängig von der Anzahl der Extraktionen weniger als 20 Stunden betragen. Es ist ebenfalls empfehlenswert, daß die gesamte Erwärmungszeit zur Erzielung einer zufriedenstellenden Extraktionseffektivität nicht kürzer als 1 Stunde ist. Für das erfindungsgemäße Verfahren geeignete alkalische Verbindungen sind unter anderem Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Calciumhydroxid oder Ammoniak, wobei die Verwendung von Natriumhydroxid am üblichsten ist.

Die oben beschriebene Mehrstufenextraktion unter Verwendung wässriger alkalischer Lösungen mit allmählich ansteigenden Konzentrationen liefert eine höhere Ausbeute an Endprodukt als

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herkömmliche Verfahren und ist deshalb von großer Bedeutung hinsichtlich der industriellen Produktivität. Das heißt, die erfindungsgemäße Mehrstufenextraktion hat einen unvorhersehbaren Effekt hinsichtlich einer überraschend hohen Ausbeute im Vergleich zur wiederholten Extraktion unter Verwendung reinen Wassers allein oder einer wässrigen alkalischen Lösung mit immer gleicher Konzentration.

Der Mechanismus, der zu der hohen Extraktionseffektivität des erfindungsgemäßen. Verfahrens führt, ist noch nicht genau bekannt, aber es wird angenommen, daß das erfindungsgemäße Extraktionsverfahren nicht nur die Elution der löslichen Komponenten aus den Basidiomycetes sondern auch eine geringe Zersetzung der Basidiomycetes bewirkt und so die lösliche aktive Komponente freisetzt. Es wird also mit anderen Worten angenommen, daß das Ausgangsmaterial bei jeder Erhöhung der Alkalikonzentration der alkalischen wässrigen Lösung bei der Extraktion einer gewissen Zersetzung unterliegt und so eine wirksame Freisetzung der aktiven Komponente zuläßt.

Wenn andererseits die Extraktion unter Verwendung einer hochkonzentrierten wässrigen alkalischen Lösung von Beginn an ohne vorherige Wasserextraktion durchgeführt wird, ist die Extraktionsausbeute in der Tat in der ersten Extraktionsstufe verhältnis-

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mäßig hoch, aber die Ausbeute fällt in der zweiten und den folgenden Extraktionsstufen scharf ab. Hierfür wird folgender Grund angenommen. Die Fraktion (gewünschte Komponente), die normalerweise mit heißem Wasser oder einer verdünnten alkalischen wässrigen Lösung extrahiert werden soll, zersetzt sich unter den scharfen Bedingungen übermäßig und demzufolge geht das erwünschte hochmolekulare Polysaccharid in niedermolekulare Substanz mit einem Molekulargewicht von weniger als 5000 über.

Der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren wie oben beschrieben erhaltene Extrakt wird in herkömmlicher Weise mittels einer Mineralsäure wie verdünnter Salzsäure neutralisiert und dann einem Raffinierungsverfahren unterworfen. Entweder können die bei jeder Extraktionsstufe erhaltenen Extraktlösungen für sich raffiniert werden oder die in den jeweiligen Extraktionsstufen erhaltenen Lösungen können vereinigt werden und dann gemeinsam raffiniert werden.

Das Raffinieren kann nach verschiedenen Verfahren wie durch Ultrafiltration, Hyperfiltration, Gelfiltration, Aussalzen und Ausfällen unter Verwendung eines organischen Lösungsmittels erfolgen. Diese Verfahren können entweder allein oder in Kombination eingesetzt werden. Eine solche Raffinierungsbehandlung der Extraktlösung ist in der Lage, ein bevorzugtes stickstoffhaltiges Polysaccharid mit Antitumoraktivität zu ergeben.

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no

Die Elementaranalyse des so erhaltenen stickstoffhaltigen PoIysaccharids ergibt, daß es hauptsächlich aus Kohlenstoff, Wasserstoff, Stickstoff und Sauerstoff zusammengesetzt ist. Der Stickstoffgehalt des Produkts schwankt je nach Stickstoffgehalt im Ausgangsmaterial, aber es wurde festgestellt, daß das Produkt gewöhnlich mehr als 2 Gew.% und in den meisten Fällen 3 bis 5 Gew.% Stickstoff enthält.

Mit der in der oben beschriebenen Weise erhaltenen Substanz wurden verschiedene Farbreaktionen durchgeführt, deren Ergebnisse in der folgenden Tabelle 1 zusammengefaßt sind.

c^-Naphthol-Schwefelsäurereaktion (Molish-Reaktion)

Indol-Schwefelsäurereaktion (Disch-Reaktion)

Anthron-Schwefelsäurereaktion

Phenol-Schwefelsäurereaktion

Tryptophan-Schwefelsäurereaktion

Lowry-Folin-Verfahren

Ninhydrin-Reaktion nach Hydrolyse mit Salzsäure

Tabelle 1

Farbe

purpur

braun

Ergebnisse

Saccharide nachgewiesen

Saccharide

grünlich blau	Saccharide
braun	Saccharide
purpur braun	Saccharide
blau	Peptid- bindungen
purpur blau	OC -Amino säuren

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Die Ergebnisse dieser Farbreaktionen zeigen, daß das beim erfindungsgemäßen Verfahren erhaltene Endprodukt ein stickstoffhaltiges Polysaccharid mit hauptsächlich peptid-gebundenem Stickstoff ist.

Mit Hilfe der Säulenchromatographie wurde festgestellt, daß das Molekulargewicht der erfindungsgemäß erhaltenen Substanz im Bereich von etwa 5000 bis 300.000 liegt und das mittlere Molekulargewicht gemessen durch Ultrazentrifugation im Bereich von 10.000 bis 100.000 liegt. Die niedermolekularen Fraktionen mit Molekulargewichten von weniger als 5.000, die bei der oben genannten Raffinierungsbehandlung verworfen werden, besitzen nahezu keine Inhibitionswirkung gegen feste Sarcoma-180-Tumore in Mäusen bei intraperitonealer Verabreichung, schmecken außerdem bitter, riechen unangenehm und zeigen Nebenwirkungen. Deshalb tragen diese niedermolekularen Substanzen nicht zu den pharmakodynamischen Wirkungen des erfindungsgemäß erhaltenen stickstoffhaltigen Polysaccharids bei sondern haben eher eine entgegengesetzte Wirkung.

Das erfindungsgemäß erhaltene stickstoffhaltige Polysaccharid zeigte nicht nur eine hohe Antitumoraktivität mit hoher Hemmwirkung gegen festen Sarcoma-180-Krebs in Mäusen bei intraperitonealer Verabreichung sondern erwies sich auch bei oraler Verabreichung als wirksam. Dies zeigt die gute Eignung des

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erfindungsgemäß erhaltenen stickstoffhaltigen Polysaccharids als orales Antitumormittel an und in der Tat bestätigte sich die genannte Wirkung in einer Vielzahl von Experimenten. Die Nützlichkeit der erfindungsgemäß erhaltenen Substanz beschränkt sich nicht nur auf die Eignung als orales Antitumormittel sondern zeigt auch eine hohe Immunität-Rekonvaleszenz-Aktivität beim Patienten. Das heißt, sie ist nicht nur wirksam zur Verhinderung von Nebenwirkungen bei der Chemotherapie von Krebs oder einer Steigerung der Empfindlichkeit bei der Radiotherapie sondern auch zur Verhinderung der Verringerung der Immunität und der physischen Stärke des Patienten nach einer Operation oder einer Bluttransfusion und zur Vorsorge oder zum Schutz gegen Infektionskrankheiten durch Viren oder Bakterien aufgrund der Abnahme der Immunität oder der physischen Stärke. Die orale Verabreichung der erfindungsgemäß erhaltenen Substanz ergab außerdem eine ausgezeichnete Wirkung hinsichtlich der Verbesserung der Leberfunktion, der Zunahme des Appetits, der Beseitigung von Darmstörungen und der Förderung der Harnabgabe. Ferner ist die erfindungsgemäß erhaltene Substanz auch wirksam bei der Behandlung von Lepra.

Beispiel 1

2OO g trockene Mycelen (Feuchtigkeitsgehalt: 9,9 %) von Coriolus versicolor (Fr.) Quel. (FERM-P Nr. 2414), die aus einer künstlichen Kultur erhalten wurden, und 3 Liter Wasser wurden in

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einen mit einem Rührer ausgerüsteten 5-Liter-Kolben gegeben. Die Mischung wurde in einem siedenden Wasserbad gerührt und drei Stunden unter diesen Bedingungen bei einer Innentemperatur von 95 - 2 C gehalten. Dann wurde die Mischung gekühlt und in einem Buchner-Trichter abgenutscht, um den Pilz und die Extraktlösung zu trennen. Die zurückgebliebenen Mycelen wurden mit etwa 1 Liter Wasser gewaschen und das Waschwasser wurde mit der Extraktlösung vereinigt. Es wurden etwa 3,5 Liter vereinigte Lösung erhalten. Der pH-Wert der Extraktlösung betrug 5,8. Die zurückgebliebenen. Mycelen wurden wieder mit 2 Litern Wasser vermischt und dann wieder zwei Stunden lang extrahiert. Es wurde wiederum mit 1 Liter Wasser gewaschen, so daß 3 Liter Extraktlösung erhalten wurden. Der resultierende Pilzrückstand wurde wiederum mit 2 Litern 0,1 η Natriumhydroxidlösung vermischt und bei 95 - 2°C 2 Standen lang extrahiert. Anschließend wurde gekühlt, mit 2 η Salzsäure neutralisiert und abgenutscht, um die Extraktlösung und den Pilzrückstand zu trennen. Nach erfolgter Trennung wurde der Rückstand mit etwa 500 ecm Wasser gewaschen und das Waschwasser wurde mit der Extraktlösung vereinigt. Es wurden 2,5 Liter vereinigte Lösung erhalten. Die Extraktion des Rückstandes wurde wiederholt, wobei jeweils 2 Liter 0,2 n, 0,3 η und 0,4 η Natriumhydroxidlösungen und 0,5 Liter Waschwasser verwendet wurden, so daß jeweils 2,5 Liter Extraktlösung erhalten wurden.

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Die sechs erhaltenen Extraktlösungen (insgesamt 16,5 Liter) wurden vereinigt und im Vakuum mittels eines Rotationsverdampfers bei 60 C auf 700 ecm eingeengt. Dann wurde die Lösung in einem dialytischen Zelluloseschlauch (Visking Tube der Union Carbide Corp.) bei 5°C 72 Stunden lang dialysiert. Die erhaltene Lösung wurde weiter konzentriert und dann gefriergetrocknet. Es wurden 60 g leberbraunes Pulver mit einem Feuchtigkeitsgehalt von 7 % (Ausbeute: 31,1 %) erhalten. Die Elementaranalyse dieses Pulvers ergab: 40,3 % Kohlenstoff, 6,2 % Wasserstoff, 2,9 % Stickstoff und 50,6 % Sauerstoff. Das durch Säulenchromatographie bestimmte Molekulargewicht dieser Substanz betrug etwa 10.000 bis 250.000 und das mittlere durch Ultrazentrifugation unter Verwendung von Wasser als Lösungsmittel bestimmte Molekulargewicht betrug 94.000. (Der oben angegebene Sauerstoffgehalt wurde durch Ergänzung auf 100 % erhalten.)

Verschiedene nach Auflösen des Pulvers in Wasser durchgeführte Farbreaktionen ergaben die in Tabelle 1 angegebenen Ergebnisse. Damit bestätigte sich, daß die pulvrige Substanz ein stickstoffhaltiges Polysaccharid ist. Das Inhibitionsverhältnis dieser Substanz gegen feste Sarcoma-160-Tumore in Mäusen betrug 90 % bei intraperitonealer Verabreichung und 7O % bei oraler Verabreichung.

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Die Antitumorwirkung dieser Substanz wurde nach einem herkömmlichen Verfahren bestimmt, das im folgenden kurz beschrieben wird.

Sarcoma-180-Tumorzellen wurden in die Bauchhöhlen von Mäusen transplantiert. Nachdem die Zellen sieben Tage lang ausreichend gewachsen waren, wurden 10 dieser Zellen weiter unter die Haut der Achselhöhle anderer Mäuse zur Bildung fester Tumore transplant iert. Die Verabreichung des zu testenden Produkts begann 24 Stunden nach der Transplantation. Bei intraperitonealer Verabreichung wurden 20 Tage lang jeden zweiten Tag 10 mg/kg entsprechend einer Gesamtdosis von 0,2 ml je 20 g Körpergewicht der Maus verabreicht. Bei oraler Verabreichung wurde das erhaltene Produkt in Dosen von 1000 mg/kg 20 Tage lang täglich verabreicht, was einer Gesamtdosis von 0,2 ml je 20 g Körpergewicht der Maus entsprach. Am 25. Tag nach erfolgter Transplantation wurden die Tumore herausgenommen und das Inhibitionsverhältnis bezüglich des Tumorwachstums wurde aus dem mittleren Tumorgewicht bei den behandelten Mäusen und dem mittleren Tumorgewicht bei nicht behandelten Kontrollmäusen berechnet.

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it

Die Ergebnisse entsprechender Extraktionsversuche unter Verwendung von Wasser allein als Lösungsmittel sind in Tabelle 2 wiedergegeben. Bei diesen Versuchen wurden alle Extraktionsund Waschstufen durchgeführt, indem die gleichen Mengen Wasser anstelle der oben angegebenen Lösungsmittel verwendet wurden. Jede erhaltene Extraktlösung (gemischt mit Waschwasser) wurde im Vakuum konzentriert, dialysiert, gekühlt und getrocknet, um die Ausbeute in jeder Extraktionsstufe zu bestimmen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 wiedergegeben. Wie daraus hervorgeht, fällt die Extraktionsausbeute nach der zweiten Extraktionsstufe scharf ab und es ist kaum möglich, die gewünschte Substanz durch wiederholte Extraktion in hoher Ausbeute zu gewinnen.

Tabelle 2

Extraktions stufe	Extraktions lösung (1)	Waschlösung (D	Ausbeute an trocke nem Pulver (Gew.%)
1	3	1	7,0
2	2	0,5	2,1
3	2	0,5	0,8
4	2	0,5	0,3
5	2	0,5	0,1
6	2	0,5	0,1
Summe	13	3,5	10,4
Anmerkung: Die	Menge der als	Ausgangsmaterial

verwendeten Mycelen betrug 200 g. Extraktionstemperatur: 95 - 2°C.

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Beispiel 2

Unter Verwendung der gleichen Vorrichtung wie in Beispiel 1 wurden 2OO g trockene Mycelen (Feuchtigkeitsgehalt: 8,8 %) von Coriolus versicolor (Fr.) Quel. (FERM-P Nr. 2414) mit jeweils 2 Litern 0,05 n, 0,1 n, 0,2 η und 0,4 η Natriumhydroxidlösung extrahiert. Die Extraktionstemperatur betrug 90 bis 95°c und die Extraktionszeit betrug in jeder Extraktionsstufe 2 Stunden. Nach jeder Extraktionsstufe wurde die Mischung gekühlt, mit 2 η Salzsäure neutralisiert und dann abgenutscht, um den Pilzrückstand und. die Extraktlösung voneinander zu trennen. Der Rückstand wurde jeweils mit 500 ecm Wasser gewaschen und die Waschlösung wurde mit der entsprechenden Extraktlösung vereint.

Die Extraktlösungen jeder Extraktionsstufe wurden im Vakuum konzentriert, dialysiert, wiederum konzentriert und gefriergetrocknet. Dies geschah in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 und es wurde ein leberbraunes Pulver erhalten.

Die Ergebnisse der jeweiligen Extraktionsstufen sind in Tabelle wiedergegeben.

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	-	pH bei der Extraktion	2713536
		9,0
	Tabelle 3	11,5
Extraktions stufe	Natriumhydroxid konzentration	12,5	Ausbeute an trockenem Pulver (Gew.%)
1	0,05 η	13,0	1O,1
2	0,1 η	3,5
3	0,2 η	6,8
4	0,4 η	6,6

Die Gesamtausbeute betrug 27 % und die Elementaranalyse der jeweils erhaltenen Produkte ergab folgende Ergebnisse: Kohlenstoff 41,0 %; Wasserstoff 6,3 %; Stickstoff 3,7%; Sauerstoff 49,0 %.

Auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel 1 beschrieben wurde sichergestellt, daß das erhaltene Pulver ein stickstoffhaltiges Polysaccharid mit einem Molekulargewicht von 1O.O00 bis 250.0OO und einem mittleren Molekulargewicht von 10O.000 war. Das Inhibitionsverhältnis gegen festen Sarcoma-18O-Tumor in Mäusen betrug 93 % bei intraperitonealer Verabreichung und 73 % bei oraler Verabreichung.

Zu Vergleichszwecken wurden die gleichen Versuche wie in Beispiel 1 durchgeführt, wobei 1 η und 0,4 η Natriumhydroxidlösungen eingesetzt wurden. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle wiedergegeben. Wie daraus zu ersehen, nahm die Ausbeute bei

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Wiederholung der Extraktion mit einer Extraktionslösung gleicher Konzentration stark ab und es erwies sich als sehr schwierig, eine hohe Ausbeute wie beim erfindungsgemäßen mehrstufigen Extraktionsverfahren zu erreichen.

Tabelle 4

Extraktionsstufe	Ausbeute (Gew.%) bei der Extraktion mit 1 η NaOH	Ausbeute (Gew.%) bei der Extraktion mit 0,4 η NaOH
1	10,5	13,8
2	2,4	2,9
3	1,1	2,0
4	0,5	1 ,5
Summe	14,5	20,2

Beispiel 3

Unter Verwendung der gleichen Vorrichtung wie in Beispiel 1 wurden 200 g trockene Mycelen (Feuchtigkeitsgehalt: 9,9 %) von Coriolus versicolor (Fr.) Quel. (FERM-P Nr. 2414) zuerst mit 3 Litern Wasser bei 95 - 2°C 3 Stunden lang extrahiert. Nach Kühlen und Trennen der zurückgebliebenen Mycelen und der Extraktlösung durch Abnutschen wurden die zurückgebliebenen Mycelen mit 1 Liter Wasser gewaschen und das Waschwasser mit der Extraktlösung vereinigt, so daß 3,5 Liter Extraktlösung erhalten wurden.

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Dann wurden die zurückgebliebenen Mycelen mit 2 Litern 1 η Natriunhydroxidlösung versetzt und 0,5 Stunden bei 90 bis 95°C extrahiert. Anschließend wurde gekühlt, mit 2 η Salzsäure neutralisiert, abgenutscht und mit 1 Liter Wasser gewaschen. Es wurden auf diese Weise 3 Liter Extraktlösung abgetrennt vom Pilzrückstand erhalten.

Alle erhaltenen Extraktlösungen wurden vereinigt und im Vakuum konzentriert, dialysiert, nochmals konzentriert und dann gefriergetrocknet. Alles dies geschah in der gleichen Weise wie im Beispiel 1 beschrieben. Es wurden 33 g leberbraunes Pulver mit einem Feuchtigkeitsgehalt von 7 % erhalten (Ausbeute: 21,0 %) Das Ergebnis einer Elementaranalyse dieses Pulvers ergab: 41,7 % Kohlenstoff, 6,4 % Wasserstoff, 3,9 % Stickstoff und 48 % Sauerstoff. Durch die gleichen Versuche wie in Beispiel 1 beschrieben, wurde sichergestellt, daß die erhaltene Substanz ein stickstoffhaltiges Polysaccharid mit einem Molekulargewicht von 10.000 bis 300.000 und einem mittleren Molekulargewicht von 98.000 war.

Das Inhibitionsverhältnis dieser Substanz gegen feste Sarcoma-180-Tumorzellen in Mäusen betrug 94 % bei intraperitonealer Verabreichung und 68 % bei oraler Verabreichung.

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-ja-

Beispiel 4

Unter Verwendung der gleichen Vorrichtung wie in Beispiel 1 wurden 200 g trockene Fruchtkörper von Coriolus versicolor (Fr.) Quel. (FERM-P Nr. 2414) mit einem Feuchtigkeitsgehalt von 8,7 % zuerst mit 2,4 Litern Wasser drei Stunden lang bei 95 - 2°C extrahiert und das Produkt wurde dann nach Abkühlen abgenutscht, um den Rückstand und die Extraktlösung zu trennen. Der Rückstand wurde mit 500 ecm Wasser gewaschen und das Waschwasser mit der Extraktlösung zu insgesamt 2,5 Litern Extraktlösung vereint.

Der Rückstand wurde dann 1 Stunde bei 9O - 2°C mit O,4 η Natriumhydroxidlösung extrahiert, anschließend gekühlt, mit 2 η Salzsäure neutralisiert, abgenutscht und mit 500 ecm Wasser gewaschen, um 2,5 Liter Extraktlösung und den Rückstand voneinander zu trennen. Die gleiche Extraktion wurde mit 2 Litern 1 η Natriumhydroxidlösung bei 80 - 2°C 1 Stunde lang wiederholt, wobei ebenfalls 2,5 Liter Extraktlösung erhalten wurden.

Alle erhaltenen Extraktlösungen wurden vereinigt, im Vakuum konzentriert, dialysiert, wieder konzentriert und gefriergetrocknet. Dies alles geschah in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 beschrieben. Es wurden 43,4 g leberbraunes Pulver mit einem Feuchtigkeitsgehalt von 7,5 % (Ausbeute: 22 %) erhalten. Die Elementaranalyse ergab folgendes Ergebnis: 42,3 %

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Kohlenstoff, 6,5 % Wasserstoff, 2,2 % Stickstoff und 49,0 % Sauerstoff. Außerdem wurde auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel 1 beschrieben sichergestellt, daß die erhaltene Substanz ein stickstoffhaltiges Polysaccharid mit einem Molekulargewicht von 10.000 bis 300.000 und einem mittleren Molekulargewicht von 110.000 war.

Das Inhibitionsverhältnis dieser Substanz gegen feste Sarcoma-180-Tumorzellen in Mäusen betrug bei intraperitonealer Verabreichung 96 % und bei oraler Verabreichung 75 %.

Zu Vergleichszwecken wurde ein entsprechendes Extraktionsverfahren durchgeführt, bei dem jedoch nur Wasser allein als Extraktionslösungsmittel verwendet wurde. Die Ausbeute an der gewünschten Substanz betrug nur 7,6 %.

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Claims

Patentansprüche ,.Y\ Verfahren zur Herstellung eines stickstoffhaltigen PoIysaccharids mit Antitumoraktivität durch Extraktion eines zur Klasse Basidiomycetes gehörenden Pilzes mit einem wässrigen Lösungsmittel, dadurch gekennzeichnet, daß man einen zur Gattung Coriolus Polyparaceae gehörenden Pilz anfänglich mit Wasser oder einer verdünnten wässrigen alkalischen Lösung und dann in weiteren Extraktionsstufen mit wässrigen alkalischen Lösungen allmählich zunehmender Konzentration extrahiert.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Pilz natürliche oder künstliche Fruchtkörper und/ oder Mycelen verwendet.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Pilz Coriolus versicolor (Fr.) Quel. verwendet.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Extraktion bei einer Temperatur von 50 bis 10O⁰C durchführt.

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5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Konzentration der wässrigen alkalischen Lösung stufenweise bis maximal 2 η erhöht.
6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Extraktion drei- bis achtmal wiederholt.
7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man 1 bis 20 Stunden lang extrahiert.
8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als wässrige alkalische Lösungen Natriumhydroxidlösungen verwendet.

ka:kö

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