DE2348471C3

DE2348471C3 - Verfahren zur Herstellung von in 2-Stellung substituierten 4 (R)-Hydroxycyclopentan-1,3-dionen

Info

Publication number: DE2348471C3
Application number: DE19732348471
Authority: DE
Inventors: Charles John Dr. Madison Wis. Sih (V.St.A.)
Original assignee: Wisconsin Alumni Research Foundation
Current assignee: Wisconsin Alumni Research Foundation
Priority date: 1972-09-29
Filing date: 1973-09-26
Publication date: 1976-04-15

Description

in der R ein WasserstofTatom oder eine Gruppe der allgemeinen Formel

-(CH₂)^-COOR'

bedeutet, wobei χ eine ganze Zahl von 2 bis 8 ist, oder eine Verbindung der allgemeinen Formel ven-, Fortpflanzungs-, Nieren- und Gastrointestinal-System von Tieren und Menschen ausüben.

Die Verfügbarkeit natürlicher Prostaglandine ist zur Zeit ziemlich begrenzt, und Verfahren zu ihrer Herstellung sind lange und mühsam und führen nur zu äußerst geringen Mengen der Verbindungen. Ein weiterer Nachteil der bekannten Verfahren zur Herstellung von Prostaglandinen und deren Analogen sind die häufigen Auftrennverfahren, die durchgeführt ίο werden müssen, um die gewünschten optischaktiven Verbindungen zu erhalten.

Es ist Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Herstellung von wichtigen Zwischenprodukten für die Synthese von Prostaglandinen und deren Analogen zu entwickeln, die die gewünschte optische Aktivität besitzen.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von in 2-Stellung substituierten 4-Hydroxy-cyclopentan-l,3-dionen, bei dem man Verbindungen der allgemeinen Formel

OCH₃

in der R ein Wasserstoffatom oder eine Gruppe der allgemeinen Formel

CH₂ -CH = CH- (CH₂),. — COOR'

ist, in der y eine ganze Zahl von 3 bis 5 und R' den Rest eines Alkanols mit 1 bis 6, vorzugsweise 1 bis 2 C-Atomen bedeutet, in Gegenwart eines Mikroorganismus der Gruppen Endomycetales, Mucorales, Moliliales und Eurotiales aus der Klasse der Ascomycetes unter sonst üblichen Bedingungen fermentiert und das gewünschte Reaktionsprodukt in üblicher Weise, wie durch Säulenchromatographie, abtrennt.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von in 2-Stellung substituierten 4-Hydroxy-cyclopentan-l,3-dionen„ die wichtige Zwischenprodukte zur Herstellung von natürlichen Prostaglandinen und deren Analogen sind.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von in 2-Stellung substituierten 4-Hydroxy-cyclopentan-l,3-dionen, das dadurch gekennzeichnet ist. daß man in 2-Stellung substituierte Cyclopentan-1,3,4-trione oder in 2-Stcllung substituierte 3-Alkoxy-2-cycIopcntcn-l,4-dione der fermentation enzymatischen Wirkung bestimmter Mikroorganismen aussetzt, wobei man die gewünschten optisch-aktiven Verbindungen erhält.

Die Prostaglandine, die cyclische, oxidierte C₂₀- Fettsäuren auf der Grundlage des Prostansäureskclettc sind, und deren Analoge haben große Bedeutung erlangt auf Grund ihres weiten physiologischen Wirkungsspektrums, das sie auf das cardiovascular (Kreislauf). Atmungs-, endocrine, hijmostalischc. Ner-

in der R ein WasserstofTatom oder eine Gruppe der allgemeinen Formel (CH₂)^ — COOR' bedeutet, in der χ eine ganze Zahl von 2 bis 8 ist, oder eine Verbindung der allgemeinen Formel

in der R ein WasserstofTatom oder eine Gruppe der allgemeinen Formel

CH₂ — CH = CH — (CH₂),. — COOR'

bedeutet, in der y eine ganze Zahl von 3 bis 5 ist, und R' jeweils der Rest eines Alkanols mit 1 bis 6, vorteilhaft 1 bis 2 Kohlenstoffatomen in Gegenwart eines Mikroorganismus der Gruppen Endomycetales, Mucorales, Moliliales und Eurotiales aus der Klasse der Ascomycetes unter sonst üblichen Bedingungen fermentiert und das gewünschte Reaktionsprodukt in üblicher Weise, wie durch Säulenchromalographie, abtrennt.

Wenn auch die freien Säuren selbst angewandt werden können, so hat sich doch gezeigt, daß man bei Verwendung von Estern höhere Ausbeuten erhält. Die bevorzugten Ausgangsverbindungen sind solche, in denen ν = 6 und R' einen Alkylrest mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen bedeutet.

Einige Mikroorganismen besitzen Estcraseaktivität.

die die Teilhydrolysc der Estergruppe im Rest R verursachen kann. Diese Aktivität kann jedoch durch Zugabe einer kleinen Menge von Allylalkohol zu dem Fermentationsmedium vollständig gehemmt werden.

Es ist bekannt, daß die Kctofunklion in der 4-Stellung der oben angegebenen Verbindungen durch Hydrierung in Gegenwart eines Palladium-Kohlen-Kalalysators reduziert werden kann (vgl. R. Pappo.

ρ Collins und C. Jung, Annals of New York Academy of Sciences, Bd. 180, 64 [1971]). Die erhaltene Hydroxyverbindung ist jedoch ein Racemat. Im Gegensatz dazu kann durch Ausnutzung der fermentativen Wirkung eines Mikroorganismus gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren die Hydrierung der Oxo-Gruppe in 4-Stellung stereospezifisch durchgeführt werden, wobei man die 4(R)-Konfiguration (nach der Cahn-Ingold-Prelog-Bezeichnung) erhält Diese Konfiguration ist erforderlich für die Umwandlung der hergestellten Verbindungen in die natürlichen Prostaglandine. Ein Beispiel für eine solche Umwandlung, bei der das erhaltene Endprodukt Prostaglandin PGE₁ ist, ist im folgenden schematisch dargestellt:

(D

ι ο

erfindungsgemäß

CO₂CH₃

Q₁H₅COCIzN(C₂H₅).,

O — CO — QH₅

CO₂CH₃

(Uli

Na[AlH₂(OCH₂CH₂OCH₃I₂]

CO₂CH₃

(iv:

CO₂CH.,

(V)

HO

Die Umwandlung von IV in V kann leicht nach dem von Charles J. S i h u. a. in J. Amer. Chem. Soc, 94, 3643 (1972), beschriebenen Verfahren durchgeführt werden. Aus dem erfindungsgemäß hergestellten stereospezifischen 2-(6'-Carbomethoxyhexyl)-4(R)-hydroxy-cyclopentan-l,3-dion kann daher ohne Schwierigkeiten das dem natürlichen Prostaglandin E₁ entsprechende Produkt unter Aufrechterhaltung der bestimmten slereospezifischen Konfiguration hergestellt werden.

In den folgenden Beispielen wurde die Stereoisomerie der 4-Hydroxylgruppe durch Zirkular-Dichroismus-Analyse bestimmt. Das R-Epimere zeigt einen negativen Cotton-Effekt ([Θ] · 10 "³ -85°) bei /·281πΐμ und einen positiven Cotton-Effekt ([θ·10~³ +87°) bei /·262πΐμ, der charakteristisch ist für ein derartiges System.

Die Eignung eines bestimmten Organismus für die erfindungsgemäße Reduktion kann leicht nach dem folgenden Untersuchungsverfahren bestimmt werden.

Allgemeines Untersuchungsverfahren

zur Bestimmung der Reduktiünswirkung

eines speziellen Organismus

Sabourauds Schrägagar oder andere für das Wachstum geeignete Medien auf Agarbasis wurden mit dem Mikroorganismus beimpft. Der beimpfte Schrägagar wurde in einen Inkubator gegeben, der auf 25 C gehalten wurde, und dort 1 Woche belassen. Anschließend wurde er entfernt, und 15 cm³ sieriles Wasser wurde zugegeben. Die Sporen und das pflanzliche Wachstum wurden mit einer sterilen Nadel aus dem Agar entfernt. Die Suspension wurde in einen Kolben gegeben, der 50 cm³ des unten beschriebenen Soja-Dextrosc-Mediums enthielt. Der Kolben wurde dann in einen Rotalionsschüttler in einem Inkubator gegeben, der auf 25° C gehalten wurde, und 24 Stunden mit 210 Umdrchungcn/Minute geschüttelt. Nach dieser Anfangszeit (erstes Impfmaterial) wurden 5 cm³ der submersen Kultur in jeden Doppelkolbcn mit 3 verschiedenen Medien gegeben, nämlich Soja-Dextrose, Cerelose-Edamin, und Dcxtrin-Maiswasscr, deren Zusammensetzung unten angegeben ist. Die Kolben wurden in eine Schüttelvorrichtung gegeben, und die Mikroorganismen konnten 24 bis 48 Stunden bei 25 C wachsen. Jeweils zu einem Kolben eines Paars wurden 25 mg in 2-Stellung substituiertes Cyclopentan-l,3,4-trien in 25cm³ Dimethylformamid als Substrat gegeben. Zu dem anderen Kolben jedes Paares wurden 0,25 cm³ Dimethylformamid als Vergleich gegeben. Alle Kolben wurden unter dem gleichen Bedingungen weitere 24 Stunden geschüttelt und dann aus der Schüttelvorrichtung entfernt. Die Wachstumseigenschaften und der pH-Wert wurden notiert, die gesamte Brühe wurde in jedem Kolben mit dn-HCl auf einen pH-Wert von 2,0 angesäuert und einmal mit einem Volumen Äthylacetat entsprechend dem Volumen der Fermentationsbrühe extrahiert. Das Lösungsmittel wurde von jedem Auszug durch Erwärmen in einem Wasserbad auf ungefähr 60 C entfernt. Die Reste wurden jeweils in 1 cm³ Aceton gelöst und mit Hilfe der Dünnschicht-Chromatographie analysiert.

Die untersuchten Proben wurden dann alle auf Platten mit Silikagel G unter Anwendung eines geeigneten Systems Chromatographien, wobei ein bevorzugtes Lösungsmittclsystem Älhylacetat-Essigsäu-

re-Isooctan-Η,Ο (110:20:50:100) war. Nach der Entwicklung wurden die Platten unter ultraviolettem Licht betrachtet. Man erhielt die folgenden Rf-Werte für die interessierenden Verbindungen.

CO₂CH₂CH,

Rf = 0,57

CO₂CH₃

O O Rf = 0.48

CO₂H

O O Rf = 0,32

CO₂CH₇CH

'₂<~J I₂^n,

HO O Rf = 0,18

HO O Rf =r 0,09

Dextrin-Maiswasser

Dextrin I⁽ⁱ ü

Maiswasaer SO g

KH₇PO₄ 1 g

NaCl 5 g

Wasser 11

pH-Wert 7,0

Autoklav 30 Minuten bei 1,1 kg cm³.

IO Das oben angegebene allgemeine Untersuchungsverfahren, die Nährmedien sowie das Fermentationsverfahren in den folgenden Beispielen sind nur beispielhaft und können in verschiedener Weise variier!

v/erden. So können andere Stickstoff- und Kohlenstoffquellen in den Nährmedien (z. B. Maismehl. Hafermehl, Fleischextrakt) oder andere Proteinhydrolysate oder Sacharose, Glukose. Maltose. Stärke. Molasse an Stelle von Dextrin angewandt werden.

Auch können andere bei Fermentationen übliche Modifikationen durchgeführt werden die Zugabezeit des Substrats nach der Zugabe des Mediums kann variiert werden, der Anfangs-pH-Wert für die Zugabe und die Umwandlung des Substrats kann von ungefähr 5,0 bis ungefähr 7,5 variiert werden, die Menge des Substrats und die Rührgeschwindigkeit können verändert werden.

Die in den folgenden Beispielen erhaltenen Produkte wurden mit Hilfe der Ultraviolett-, Infrarot- und kcrnmagnetischen Resonanzspektren und durch Dünnschicht-Chromalographie charakterisiert.

Beispiel 1

2 - (6' - Carbomethoxyhexyl) - 4(R) - hydroxy - cyclopentan-1.3-dion (II) wurde folgendermaßen hergestellt:

CO₂CH,

CO₇H

40

Die Zusammensetzung typischer Nährmedien, die Tür das oben angegebene Untersuchungsverfahren und die ansatzweise Fermentation in den folgenden Bei- »pielen geeignet sind, sind die folgenden:

Soja-Dexirose

Sojabohnenmehl 5 g

Dextrose 20 ti

NaCl 5 g

K₂HPO₄ 5g

Hefe 5 g

Wasser 11

pH-Wert 7,0

Autoklav bei 1,1 kg/cm¹ 15 Minuten.

S5

CO₂CH.,

Ccielosc-Iidamin

Cerelose 'rohe Dextrose) 50 g

Edamin*)

Maiswasser

Wasser

pH-Wert 7.0

*) Enzymalischcs Hydrolysat von Milchprolein.

A. Fermentation

Das Oberflächenwachstum von 1 Woche altem Schrägagar von Dipodascus uninucleatus wurde in 5 cm³ Salzlösung (0,85%) suspendiert. 2 cm³ Anteile dieser Suspension wurden angewandt, um 50 cm³ des oben angegebenen Sojabohnen-Dextrosc-Mcdiums in 250-cm³-ErIcnmeyerkolben zu beimpfen (F-I-Stufe). Die Kolben wurden 24 Stunden bei 25 C auf einem Rotationsschüttler (250 Umdrehungen Minute. Radius 5,1 cm) inkubiert und anschließend 10 Volumprozent davon zu jedem von vier 2-1-Frlenmcyerkolben (F-2-Stufe). enthaltend 500 cm³ des Sojabohnen-Dextrose-Mediums, gegeben. Nach 24stündiger Inkubation auf einem Rotationsschüttler wurden

250 mg 2 - (6' - Carbomethoxyhexyl) - cyclopentan-1,3,4-trion (I) (J.Katsube und M.Matsui, J. Agr. Biol. Chem., 33, 1078 [1969]) in 2 cm³ Dimethylformamid zu jedem Kolben gegeben. Die F-2-Kolben wurden dann weitere 24 Stunden unter den für die Inkubation der F-I-Stufe angegebenen Bedingungen inkubiert.

B. Isolierung

24 Stunden nach der Zugabe des 2-Carbomethoxyhexyl-cyclopentan-l,3,4-trions(I) wurden die Zellen abzentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde mit 6n-HCl auf einen pH-Wert von 2,0 gebracht und erschöpfend mit 1,51 Äthylacetat dreimal extrahiert. Das Äthylacetat wurde über Na₂SO₄ getrocknet und zu einem öl eingedampft. Dieser Rückstand wurde in 5 cm³ Benzol-Äthylacetat (1:1) gelöst und auf eine Säule (32 χ 2,5 cm) gegeben, die mit Kieselsäure-Diatomeenerde (85:15) beschickt war. Die Säule wurde mit einem Gradientensystem, bestehend aus 500 cm³ 50% Äthylacetat-Benzol in der Mischkammer und 50 cm³ reinem Äthylacetat in dem Vorratsbehälter eluiert und das Eluat in 7 cm³-Fraktionen gesammelt. Die Fraktionen 25 bis 104, die das gewünschte Produkt enthielten, wurden zusammengegeben und zur Trockne eingeengt, wobei man 1,2 g eines kristallinen Rückstandes erhielt. Beim Umkristallisieren aus Äthylacetat-Petroläther erhielt man 750 mg 2 - Carbomethoxyhexyl - 4(R) - hydroxy - cyclopentan-l,3-dion(ll),Fp.90bis92°C;[ <0" = +19,93" (C₁ = 1,02CHCl₃); /.[„■
[0] · 10~³ = -85° bei
+ 87° bei /. 262 πΐμ).

B e i s ρ i c 1 c 2 bis 67

Das Verfahren des Beispiels 1 wurde wiederholt, wobei jeweils der in der folgenden Tabelle angegebene Mikroorganismus angewandt wurde. Dabei erhielt man das gewünschte Produkt 2-Carbomethoxyhexyl-4(R)-hydroxy-cyclopentan-l,3-dion jeweils in der in der Tabelle angegebenen Ausbeute.

Die in der Tabelle angegebenen Abkürzungen Tür die Hinterlegungsstelle bedeuten:

WB = Professor Kenneth B.R a per, Dept. of

Bacterology, University of Wisconsin, ^4S Madison, Wis. 53 706 USA. ATCC = American Type Culture Collection, 12 301

Parklawn Dr., Rockville, Md. USA. CBS = Centraalbureau voor Schimmelcultures, Baarn, Holland.

NRRL = Nothein Regional Research Labs, U. S. D. A., Peoria, III. USA.

Beispiet

Hinlerlegungs-Nr.

Organismus

Ordnung - - Endomycetales

Ausbeute

WB 1125 Byssoclamys fulva 57%

WB 1629 Dipodascus 70%

uninucleatus

ATCC 14625 Dipodascus aggrcgatus 17%

ATCC 12934 Dipodascus albidus 11 %

WB Y 22 Zygosaccharomyces 50%

priorianus

WBYl 598 Zygosaccharomyces 19 % ashbya

Beispiel

16 17

18

²⁷² ™μ (' 23 500); CD, /. 281 π\μ und [fi>] · 10"³ =

19 20 21

25

55

32 33 34 35 36 37

60 Hinlcrlegungs- Organismus
Nr.

Ordnung hndomveciales

38 39 WB 1304
WB X196
WB 1839
WB 1489

WB 1593
WB 1554

CBS 317

CBS 320
ATCC 4798
WBY87
WBY301
WB 1828

WB 1752

WB1118
WB 1695
WB 10045
WB 1982
WB 1085
WB 5057

WB 5058
WB 4896

Ausbeute

WBY24 Saccharomyccs

cerevisiae
ATCC 10607 Saccharomyces

cerevisiae var. odessa WBY610 Saccharomyces ■-

cerevisiae fragilis
WBYlOIl Saccharomyces —

cerevisiae acidifaciens WB Y1140 Saccharomyces —

cerevisiae lactis

WB Y1974 Saccharomyces

cerevisiae dobzanskii

WB Y 25 Endomycopsis fibuliger 44% WB Y1483 Endomycopsis 38%

javaanesis

WB Y 37 Hansenula anomala 38% CSS 352 Schizosaccharomyces 31% pombe

WBY854 Schizosaccharomyces 27% octosporum

Bei- Hinterlegungs- Organismus Ausspiel Nr. beute

Ordnung Mucorales

Absidia blakesleeana Absidia regnieri
Mucor rammannianus Zygorhynchus
heterogamus (±)
Phascolomyces
articulosus
Phycomyces
blakesleeanus

Ordnung-Molilialcs

Rhodotorula
aurantiaca
Rhodotorula pallida Geotrichum candidum Torulopsis pulcherrima Candida krusei
Gliocladium
fimbriatum
Gliocladium
vermoeseni
Paecilomyces varioti Stachybotrys lobulata Trichoderma viride Memnoniella echinata Gliocladium roseum Fusarium
decemcellulare
Alternaria tenuis
Gliocladium
catenulatum

609 616/300

Io

Bei	Hinterlcgungs-	Organismus	Aus
spiel	Nr.		beute
		Ordnung Burotialcs
40	WB717	Pcnicillium striatum	37%
41	WB 2031	P. claviforme	21",,
42	WB 5680	P. pseudostromaticuin	19':,,
43	WB 4717	P. roqueforti	22%
44	WB 874	P. cascicolum	3%
45	WB 973	P. expansum	17%
46	WB 1061	P. purpurogenum
47	WB1115	P. varioti

20"/,,

15%

16% 38% 26"/,, 15% 25"/,, 7% 14%

I I

40",, oxy-2-cyclopcntcn-l,4-dion als Substrat für die Umwandlung in das gewünschte Produkt angewandt wurde.

Beispiel 69

2 - (6' - Carboäthoxyhexyl) - 4(R) - hydroxy - cyclopentan-l,3-dion (IV) wurde folgendermaßen hergestellt:

IS

48 NRRL 2033 P. frequenlans

49 WB 2020 P. duclauxi

50 WB 2059 P. multicolor

51 WB 2074 P. sclerotiorum

52 WB 2036 P. granulatum

53 WB 2099 P. vermiculatum

54 NRRL 2067 P. terlikowskii

55 WB1900 P. italicum

56 WB 1974 Aspergillus ustus

57 WB 154 A. restriclus

58 WB 216 A. ungins

59 WB 265 A. terreus

60 WB 356 A. luchensis

61 WB 2254 A. clavatus

62 WB 2256 A. ornaHis

63 WB 2276 A. miyakoensis

64 WB 2292 A. citrisporus

65 WB 1787 A. janua

66 WBA952 Dactylomyces

thermophilus

67 WB 1697 Thiclavia

sependonium

Beispiel 68

2 - (6' - Carbomcthoxyhcxyl) - 4(R) - hydroxy - cyclopenlan-1.3-dion wurde entsprechend dem im Beispiel 1 angegebenen Verfahren hergestellt, mit der Ausnahme, daß 2-(6'-Carbomethoxyhcxyl)-3-meth-

40

CO₂C₂H₅

(III)

CO₂C₂H₅

(IV)

A. Fermentation

Das Oberflächenwachstum von einer Woche alten Agarschragen von Sehizosaccharomyces pombe (CBS 352) wurde in 5 cm³ 0,85%iger Kochsalzlösung suspendiert. 2 cm³ Anteile dieser Suspension wurden angewandt, um 50 cm³ des oben angegebenen Sojabohnen-Dextrose-Mediums in 250 cm³ Erlenmeyerkolbcn (F-I) zu beimpfen. Die Kolben wurden 24 Stunden bei 25 C in einem Rotationsschüttler (250 Umdrehungen/Minute. Radius 5,1 cm) geschüttelt und anschließend 10 Volumprozent in einen 2-1-Erlenmeycrkolben (F-2) gegeben, der 500 cm³ des Sojabohnen-Dextrose-Mediums enthielt. Nach 24stündiger Inkubation auf einem Rolationsschüttler wurden 250 mg 2 - (6' - Carboäthoxyhexyl) - cyclopenian -1.3. 4-trion (111) (J. K a t su be und M. M a t s u i. J. Anr. Biol. Chem. [Japan] 33, 1078, [1969]) in 2 cm³ Dimethylformamid zu dem Kolben gegeben. Der F-2-Kolben wurde dann weitere 24 Stunden unter den für die Inkubation des F-1-Kolbens angegebener Bedingungen inkubiert.

B. Isolieruni;

24 Stunden nach der Zugabc des Trionsubstrais(lll) wurden die Hefezellen abzentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde mit 6n-HCl auf einen pH-Wert von 2 gebracht, erschöpfend mit 500 cm³ Älhylacetal dreimal extrahiert. DieÄthylaeetatschichl wurde über Na₂SO₄ getrocknet und eingedampft, wobei man einen öligen Rückstand erhielt. Der Rückstand wurde in 2 cm³ Benzol-Älhylacetat (1 : 1) gelöst und auf eine Säule von 2,5 χ 25 cm gegeben, die mit Kieselsäure-Dialomcencrde (85:15) beschickt war. Die Säule wurde mit einem Gradicnlensystcm eluiert.

bestehend aus 300 cm³ Äthylacctat-Benzol (1:1) ii der Mischkammer und 300 cm³ Äthylacetat in den Vorratsbehälter, und es wurden 7-cm³-Fraktionei aufgefangen. Die Fraktionen 19 bis 31 wurden zu sammenaeceben und einceensit. Man erhielt 39 mi IV: Fp. iLVbis 85 C: [«]'? +14 (C₁ = 0.47. CHCl₃J >.^^OH 272 mal.· 20 000).

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren erhält ma die optischaktiven, in 2-Stellung substituierten 4-H> droxy-cyclopentan-l,3-dione in hohen Ausbeuten, wc bei eine 70- bis 80%ige Umwandlung möglich is

Claims

Patentanspruch:

Verfahren zur Herstellung von in 2-Stellung substituierten 4(R) - Hydroxy - cyclopentani,3-dionen, dadurch gekennzeichnet, daß man in 2-Stellung substituierte Cyclopentan-1,3,4-trione der allgemeinen Formel